血液病毒抗体

血液病毒抗体（精选7篇）

血液病毒抗体 篇1

EB病毒(EBV)是疱疹病毒科 γ 亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒,也是最早被确定的人类肿瘤病毒,它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞[1]。EB病毒感染是儿科比较常见的病毒感染性疾病,根据血清学调查,我国3~5岁儿童EB壳抗原 (VCA)抗体(VCA-lg G)阳性率达90%以上[2],幼儿感染后多数无明显症状,或引起轻症咽炎和上呼吸道感染。 传统的血清学方法是检测患者近期或曾经感染EBV的常用方法,但血清学检测的结果不能反映EBV的活动状况。测定EBV-DNA量是直接和客观反映EBV感染活动与否的指标[3]。由于方法学的差异,在同一患者身上这2种指标检测结果并不完全一致,我们采用酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链的反应 (PCR)分别检测呼吸道感染的儿童患者血液中EBV-Ig M与EBV-DNA感染率,并对两者检测结果进行对比分析。

1对象与方法

1.1对象2013年7月—2014年6月我院儿科以呼吸道感染伴发热收住院的1 157例住院患儿, 其中男593例,女564例,年龄1月龄 ~13岁;病程2~30 d。

1.2标本采集所有研究对象在用药之前,于清晨空腹抽取外周静脉血(3 ml非抗凝血和2 ml枸橼酸钠抗凝血),封闭送检。

1.3检验方法

1.3.1 EBV-Ig M血清学检测将采集的3 ml非抗凝血离心分离血清。严格按照Beier公司的EB病毒壳抗原 (VCA)Ig M抗体检测试剂盒(ELISA法)定性检测血清中的EB病毒VCA-Ig M抗体。结果判定以样本吸光度值(A值)≥临界值(Cut off)为VCA-Ig M抗体阳性。临界值的计算:Cut off=0.10+ 阴性对照A值。

1.3.2 EBV-DNA检测采用淋巴细胞分离液对2 ml枸橼酸钠抗凝血进行中间层淋巴细胞的分离沉淀,提取DNA后进行PCR反应和荧光检测。试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供,检测方法按照说明书进行。使用ABI Prism7300型荧光定量PCR仪收集DNA数据。增长曲线呈S型曲线且Ct值 <30,判定为阳性结果,结果以基因拷贝 /ml表示。

1.4统计学分析应用统计软件SPSS11.5,率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 EBV-Ig M与EBV-DNA感染率比较1 157例患者血清EBV - Ig M检测 ,阳性率为4 . 93 % ;全血E BV-DNA检测,阳性率为30.42%,二者阳性率比较, 差异有统计学意义(χ2=258.46,P<0.01)。

2.2不同年龄组EB感染率分析根据年龄将患儿分为4组, 3~6岁组EBV-Ig M和EBV-DNA阳性率高于其他各年龄组,EBV-DNA阳性率与其他各年龄组相比差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表1。

2.3不同月份EB感染率按季度统计儿童患者EBV感染率 ,1—3月份EBV-Ig M和EBV-DNA感染率都明显高于其他3个季节,差异均有统计学意义 (均P<0.05)。见表2。

2.4不同性别患 儿EB感染率分 析EBV-Ig M和EBV-DNA感染率在不同性别间差异均无统计学意义 (均P>0.05)。见表3。

3讨论

EB病毒在人群中普遍易感,主要是引起传染性单核细胞增多症的病原体,但研究表明,该病原体引起呼吸道感染在逐年增多,一旦侵入人体,以持续感染或携带状态存在,并引起其他疾病或并发症[4]。

机体感染病毒后以体液免疫为主,而Ig M是机体在受到抗原刺激后产生体液免疫应答过程中最早产生的抗体,所以血清中特异性Ig M含量增高提示有近期感染,有助于临床早期诊断[5],而EBV-DNA是检测EBV的抗原,目前荧光定量PCR是临床实验室诊断EBV感染最有效的方法,近年被广泛应用[6,7]。由于小儿的免疫系统还未完善,病毒进入机体内很难像成人一样刺激机体产生相应的能够达到检测下限的病毒抗体,所以EBV-Ig M检出率明显低于EBV-DNA阳性率。 两种方法均是实验室常用的EBV的检测方法,方法学有差异,因此患者同时检测两种指标并不完全一致。

本研究结果显示,本地区儿童患者EBV感染全年均存在,但1—3月有1个发病高峰,提示EBV感染在本地区存在季节特点。分析原因可能与本地区季节气候变化有关,本地区为海洋气候,春季温度湿度都是病毒传播的有利因素,而且春季气候变化比较多样, 造成儿童的免疫力适应较差,也是造成本地区在1-3月EBV感染高发的主要原因。

本研究结果显示,3~6岁是本地区儿童EBV感染率最高的年龄段,<3和 >6岁EBV感染率相对较低,分析原因可能是:<3岁儿童免疫系统发育处于不完善阶段,对感染的免疫应答比较低[8];而随着年龄的增长,患儿的自我防御渐强,在病毒感染初期即已用药使之还没有机会进入血液循环,因此感染率较低。而3~6岁小儿患病数多,感染率也高,可能因为这个阶段正是大多数儿童好动的年龄,群体生活更为病毒的播散提供了方便;而且这个年龄段儿童的自我保护意识较弱,无法很好地自我防护。

有文献报道,EBV感染率与不同地区、年龄分布及该地区的经济水平有关[9],免疫防御功能低下和免疫机能发育尚不成熟的儿童以及患免疫缺陷性疾病者容易感染EBV[10,11]。所以应重视对儿童的预防。

作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

血液病毒抗体 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料将2011 年1 月—2013 年5 月来我科就诊的180 例疑似丙型肝炎患者依据检验方法不同分为胶体金法检验组 (90 例) 和ELISA法检验组 (90 例) 。胶体金法检验组中共有丙型肝炎患者90 例, 其中男45 例, 占50.0%, 女45 例, 占50.0%;患者年龄在15 岁~67 岁之间, 平均年龄为 (36.3±13.11) 岁;有50 例的丙型肝炎患者以急诊方式入院, 占55.56%, 有40 例的丙型肝炎患者以平诊方式入院, 占44.44%。ELISA法检验组中共有丙型肝炎患者90 例, 其中男46 例, 占51.1%, 女44 例, 占48.9%;患者年龄在15 岁~68 岁之间, 平均年龄为 (36.7±12.99) 岁;有51 例的丙型肝炎患者以急诊方式入院, 占56.67%, 有39 例的丙型肝炎患者以平诊方式入院, 占43.33%。2 组患者在性别、年龄、病情方面差异均无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 方法

1.2.1 血清采样方法使用伴随分离胶的丙型肝炎病毒抗体检测专用管采取患者空腹时的静脉血5 m L, 及时做好离心工作, 将分离好的血清存储于-80°冰箱中保存, 以备检测用。

1.2.2 不同检测方法的判断标准对于胶体金检测法来说, 如果不论是检测线, 还是对照线, 同时伴随紫红色的条带时, 或者在检测线的地方都伴随不大明显的紫红色条带时, 即可将患者检测结果定为阳性;如果仅仅在对照线的位置伴随紫红色条带, 则将患者检测结果定为阴性;如果不论是检测线, 还是对照线, 同时都不出现任何变化时, 说明检测结果无效。

对于ELISA检测法来说, 当标本吸光度值S与标本临界值CO的比值大于或者等于1 的时候, 即可将患者检测结果定为阳性;当标本吸光度值S与标本临界值CO的比值小于1 的时候, 则将患者检测结果定为阴性。相对特异性以及灵敏性和准确性的相关计算参照文献中的方法[1,2]。

1.3 统计学方法计量资料用±s表示, 组间比较用t检验P<0.05 说明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法结果及对比2 组检测方法结果见表1。其中, 两种方法均阳性为54 例, 而仅前者阳性为8 例, 仅后者阳性为2 例。

2.2 两种检测方法时间及费用对比胶体金法检验组检查时间 (22.37±1.99) min、检测费用 (6.01±1.22) 元, 明显低于ELISA法检验组的检查时间 (117.88±1.64) min、检测费用 (16.71±2.32) 元, 上述两项指标的差异均有统计学意义 (t1=5.886, P1<0.05;t2=3.724, P2<0.05) 。

3 结果

丙型肝炎 (HCV) 是近年来临床上发病概率较高的一种肝类慢性疾病, 其发病原因是丙型肝炎病毒感染, 主要传播途径是血液[3,4,5]。经常伴随肝脏纤维化的症状, 有的甚至坏死。如果不及时对其进行控制, 很容易发展为肝硬化, 更有甚者发展为肝癌, 对患者身体健康和生活造成很大影响。因而探讨此症的有效检验方法从而在第一时间对其控制十分重要。目前, 临床上对此症的检验方法主要有胶体金法与ELISA法, 但二者的检验效果, 不同学者有着不同看法。有学者经过研究认为前者不仅便捷方便, 其灵敏度和特异性与后者相比差异也不大[6,7], 但也有学者认为, 前者在应用于临床的时候会受到时间、环境以及血样量的影响而致使结果不准, 在临床上应该以后者为主要检测方法, 将前者作为参考, 从而避免一些不必要的医疗纠纷发生[8]。

在本次研究中, 与ELISA法检验组检验方法相比, 胶体金法检验组的相对特异性是96.43% (54/56) , 相对灵敏性是79.41% (27/34) , 相对准确性为90.00% (81/90) 。胶体金法检验组检查时间 (22.37±1.99) min、检测费用 (6.01±1.22) 元, 明显低于ELISA法检验组的检查时间 (117.88±1.64) min、检测 (16.71±2.32) 元 (P<0.05) 。可见, 两种检验方法各有优缺点。

综上所述, 胶体金法与ELISA法应用于丙型肝炎患者的检验各有优缺点:前者检测费用低, 检测时间快;后者检测结果准确率高, 因而在临床上应该结合患者实际情况选择合理的检测方法。

摘要：目的 探讨胶体金法与酶联免疫吸附 (ELISA) 法应用于丙型肝炎患者血液病毒抗体中的检测效果。方法 将2011年1月—2013年5月来我科就诊的180例疑似丙型肝炎患者依据检验方法不同分为胶体金法检验组 (90例) 和ELISA法检验组 (90例) 。结果 胶体金法检验组的相对特异性是96.43% (54/56) , 相对灵敏性是79.41% (27/34) , 相对准确性为90.00% (81/90) 。胶体金法检验组检查时间 (22.37±1.99) min、检测费用 (6.01±1.22) 元, 明显低于ELISA法检验组的 (117.88±1.64) min、 (16.71±2.32) 元, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。结论 采用胶体金法与ELISA法应用于丙型肝炎患者的检验各有优缺点, 在临床上应该结合患者实际情况选择合理的检测方法。

关键词：丙型肝炎,血液病毒抗体,胶体金法,ELISA法,对比

参考文献

[1]肖三平.不同检验方法用于丙型肝炎检验临床对比分析[J].医药前沿, 2014, 7 (11) :2984-2985.

[2]徐德全.酶联免疫和胶体金法对丙型肝炎病毒抗体检测的对比分析[J].航空航天医学杂志, 2012, 23 (5) :557-558.

[3]付晓琳, 王小东, 路立业, 等.ELISA与GICA在丙肝病毒抗体检测中的比较[J].中华全科医学, 2013, 11 (9) :1368-1369.

[4]杨荣昌.丙型肝炎病毒抗体两种检测方法的比较[J].检验医学与临床, 2010, 7 (3) :263-264.

[5]丁华, 何维娜, 陈望.3种检测方法在丙型肝炎诊断中的临床评价[J].国际检验医学杂志, 2014, 34 (24) :3387-3388.

[6]蒋峻峰, 周雪莲.胶体金法与酶联免疫法检测丙型肝炎病毒抗体的对照研究[J].检验医学与临床, 2014, 11 (19) :2728-2729.

[7]吴超良.胶体金法与酶联免疫法检测丙型肝炎病毒抗体的比较[J].临床医学工程, 2011, 18 (5) :701-702.

浅谈犬狂犬病毒IgG抗体检测 篇3

1 原理及用途

本品是由预包被纯化狂犬病毒抗原的微孔板和抗犬Ig G酶标记物及其它组分配套组成, 应用间接酶联免疫法 (ELISA) 原理检测犬血清或血浆中抗狂犬病毒Ig G抗体, 适用于犬狂犬病毒的免疫效果监测和抗体水平调查。

2 试剂盒组成

包括:预包被狂犬病毒抗原的微孔板 (96孔) 1个;狂犬病毒Ig G抗体酶标记物、阳性对照、临界对照、阴性对照各1支;显色液A和显色液B以及终止液、浓缩洗涤液 (10倍) 各1瓶;样品稀释液2瓶。

3 实验所需器材

(1) 精确地单道微量移液器和多道微量移液器, 适用于吸取10~1000ul的液体。操作步骤中所要求的试剂移取体积要求移液器的误差不超过±5%。

(2) 一次性移液器吸头, 2ml离心管。

(3) 配制洗涤液用的500ml量筒。

(4) 96孔酶标仪, 带有450nm单波长的滤光片。

(5) 37℃的恒温箱。

(6) 滤纸、移液槽、振荡器、密封反应板的封膜、可盛放液体和消毒液的容器。

(7) 防护物品:防护服、口罩、手套等。

4 样品要求

犬血清样品必须无菌, 新鲜、清亮、透明、无溶血、无腐败, 不能反复冻融, 血清体积100ul。

5 实验步骤

(1) 将试剂盒从冰箱中取出放置室温平衡30min左右, 将试剂通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。

(2) 洗涤液的稀释:浓缩洗涤液 (10倍) 恢复室温且充分混合确保结晶盐溶解。用蒸馏水或去离子水进行10倍稀释, 如:200ml的洗涤液需用20ml的浓缩洗涤液和180ml的去离子水充分混合配制而成。

(3) 稀释样品:将待检犬血清用样品稀释液做1:10稀释, 即取50ul犬血清加入到0.5ml样品稀释液中, 轻弹反应板或放在振荡器上震荡, 使之充分混合。

(4) 加样:取所需要量的预包被微孔板条固定于板架上, 依次加入稀释好的样品, 每孔加100ul;然后将阳性、阴性对照各加1孔, 临界对照加3孔, 每孔均加100ul;另留一空不加样品作空白对照孔。注意:加样的同时记录好各样品和阴阳对照及空白孔的次序或位置。剩余的板条放入密封袋中保存, 以备用。

(5) 样品的孵育:样品加完后, 用封板膜覆盖板条, 以免孔内液体蒸发或水珠滴入, 然后置于37℃的恒温箱中孵育30min。

(6) 洗板:从恒温箱中取出, 甩净孔中液体, 用稀释好的洗涤液加满每孔 (约300ul) , 停留1min后甩净、拍干反复洗板3次。

(7) 加酶:除空白对照外, 其余各孔垂直滴加酶标记物50ul (约1滴) , 混匀、封膜, 置于37℃的恒温箱中孵育30min。

(8) 显色:重复步骤6洗板3次, 拍干后每孔 (含空白孔) 垂直滴加显色液A﹑B各50ul (约1滴) 置于37℃的恒温箱避光显色10min。

(9) 终止和测定:每孔 (含空白孔) 立即加入终止液50ul (约1滴) , 混合后以空白孔调零, 用酶标仪450nm波长测定A值。

6 结果判定

(1) 在酶标仪上, 以空白孔调零, 450nm波长测定A值。实验成立条件:阴性对照值应≤0.10, 临界对照A值应>0.15, 否则实验不成立。

(2) 判定标准:若样品孔A值≥临界对照A值的平均值则判为阳性, 达到抗体保护水平;反之为阴性。

7 注意事项

(1) 本品仅用于体外诊断用, 供一次性使用。

(2) 处理样品和试剂盒的地方 (实验室) 禁止饮食和吸烟。

(3) 显色溶液对眼睛、呼吸系统、皮肤都有刺激作用, 在使用过程中避免接触眼睛和皮肤。穿防护服、戴防护眼罩及口罩。

(4) 不同批号的试剂不得混用。

(5) 待检血清染菌、严重溶血或高血脂可能引起错误结果, 应重新采样。

(6) 避免强光照到显色液, 或接触到氧化剂。盛放显色液的容器要用干净的玻璃或塑料器皿。

(7) 所有试剂一律放置2~8℃保存。用前恢复至室温 (约30min) , 用完后返回到2~8℃冰箱, 以便下次使用。

(8) 没有用完的微量反应板应贮存于自封带中, 于2~8℃冰箱中存放。

(9) 严格按照操作程序, 仔细地吸液、计时、充分洗涤, 对于获得精确和准确的结果是非常必要的。每个样品使用不同的吸头。洗板过程中, 甩水以及在吸水材料上扣板要轻, 否则易将板条甩掉。吸干后, 应尽快加入下1个试剂, 避免孔壁变干, 影响实验效果。

(10) 样品稀释时, 应先将稀释液移入离心管中, 然后再将待检血清移入盛有稀释液的离心管中。切记不要颠倒。

(11) 终止液加完后, 要立即进行酶标仪测定, 不要间隔时间过长, 以免影响实验效果。

(12) 使用处理各个试剂时要小心操作, 严防对试剂的污染以及对环境的污染。

(13) 在检测中, 试剂的准备应用蒸馏水或去离子水配置。

(14) 任何样品都应作为具有传染性样品对待, 用过的材料要进行无害化处理, 处理时遵照当地以及国家有关规定。

(15) 使用前应详细阅读使用说明书, 在有效期内使用, 这是最重要的一点。

血液病毒抗体 篇4

1 材料和方法

1.1 血清

从湖南地区A、B 2个规模化猪场收集的190份猪血清样品, 包括1~14周龄的各阶段猪血清、肥猪以及母猪血清。其中A场猪群中40%的8~10周龄猪有PMWS。

1.2 试剂

猪圆环病毒2型Ig G/Ig M联合检测试剂盒 (能够检测猪血清中抗PCV2的Ig G和Ig M抗体) , INGENASA公司产品 (产品批号为311005) 。1.3操作方法按试剂盒操作说明书进行。所有试剂用前恢复到室温, 各加100μL阴性对照和阳性对照血清到2个检测孔中, 其它检测孔加入100倍稀释的检测血清100μL, 封板, 37℃孵育60min;每孔加300μL洗涤液洗涤4次, 最后一次在吸水纸上拍干;每孔加100μL抗原, 37℃孵育30min;洗板4次;每孔加PCV2特异性酶标抗体100μL, 37℃孵育30min;洗板4次;每孔加100μL底物溶液, 室温孵育5min;每孔加100μL终止液终止显色反应, 立即用酶标仪在450nm波长下测OD值。1.4结果判定先分别判定Ig G、Ig M是阴性还是阳性, 再按照下面的方法进行判定:如Ig M为阳性, Ig M值>Ig G值, 表示样品来自病毒正处于活跃期感染的猪, 反之表示样品来自近期感染 (1~2个月前) 的猪;如Ig M为阴性, Ig G为阳性, 则表示样品来自以前发生过感染的猪或者是具有母源抗体的仔猪, 如Ig M为阴性, Ig G也为阴性, 表示样品来自阴性猪。

2 结果

所检测的190份血清中, A场106份, B场84份。从检测结果来看, A场直到第9周龄才检出Ig M阳性, 9周龄以前的血清样品中Ig M阳性率为0 (0/56) , Ig G阳性率10.71% (6/56) ;9~13周龄猪血清样品中, Ig M和Ig G阳性率分别是70.83% (17/24) 和58.33% (14/24) ;13周龄以上猪血清样品中, Ig M和Ig G阳性率分别是15.38% (4/26) 和84.62% (22/26) 。

B场直到第12周龄才检出Ig M阳性, 9周龄以前的血清样品中Ig M阳性率为0 (0/39) , Ig G阳性率15.38% (6/39) ;9~13周龄猪血清样品中, Ig M和Ig G阳性率分别是45.00% (9/20) 和40.00% (8/20) ;13周龄以上猪血清样品中, Ig M和Ig G阳性率分别是28.00% (7/25) 和76.00% (19/25) 。

从体液免疫产生抗体的前后关系来看:A、B两场Ig M抗体转阳之前的Ig G抗体为母源抗体;A、B两场Ig M抗体转阳时, 所有Ig G阳性血清同时都为Ig M阳性, 但Ig M值>Ig G值, 说明正处于病毒活跃期;13周龄以上猪血清样品中, Ig M阳性血清同时都为Ig G阳性, 但Ig M值

3分析

从目前的各地的流行病学调查情况来看, PCV2感染普遍, 基本上没有阴性猪场, 有的猪场阳性率甚至高达80%以上, 但这些数据大部分是来自对育肥猪以及母猪Ig G抗体的检测结果的统计, 由于猪感染PCV2后会持续带毒且长时间保持较高的Ig G抗体水平, 所以针对这一年龄段的猪进行Ig G抗体水平检测, 阳性率一般都较高, 至于断奶前后的猪感染率以及临床上猪群一般在什么年龄段感染PCV2这一问题, 目前研究的还较少。由于Ig G的产生一般在感染后较长的时间出现, 所以不适于做早期诊断, 加上仔猪的母源抗体也是Ig G类抗体, 无法将其与感染后免疫应答产生的Ig G区分开来, 因此, 仅检测Ig G一个指标并不能准确的说明猪群感染PCV2的情况。本研究采用的Ig M和Ig G抗体联合检测的方式既能判定动物是否处于感染中, 还可以判断动物是最近感染的、过去感染还是从未接触过病毒。通过对猪群中不同年龄段的猪进行PCV2抗体水平检测, 我们可以了解猪群在感染后抗体开始转阳的时间, 推断出猪群感染PCV2的时机。结果表明:A、B两个猪场Ig M抗体转阳的时间分别是在9周龄和12周龄左右, 从Ig M抗体转阳的时间我们大致可以推测A、B两个猪群感染PCV2的时间大致是在7~8周龄和10~11周龄左右。从检测结果来看:A、B两个猪群的PCV2感染率都比较高, 各阶段感染情况相似, A、B两个猪群最大的区别就是抗体转阳的时机不同, A场要比B场早3周左右。而从临床表现来看:A场存在明显的PMWS, 主要发生在10周龄左右猪, 发病率40%左右, 这一时间段正好是猪群感染PCV2后Ig M抗体转阳之后;B场没有明显的PMWS。由此我们可以推测猪早期感染PCV2更容易导致PMWS的发生, 这很可能与这一时期猪体质较弱, 抵抗力差, 加上转群、免疫刺激或者其它环境因素的影响有关。

虽然猪群中PCV2感染率很高, 但是PCV2相关疾病 (PCVD) 的发生是多因素作用的结果, 这其中包括其它病原的协同作用、疫苗及免疫刺激剂的诱导等, 所以对于PCVD的防治, 主要是加强饲养管理, 减少各种刺激, 尤其是猪群Ig M抗体转阳前后这段时间, 是暴发PCVD的危险期, 要特别注意对其他疾病的控制以及制定合理的免疫程序减少免疫刺激。由此可见, 对猪群进行抗体水平监测可以帮助我们预测猪群感染PCV2的时机和猪群可能发生PCVD的潜在危险期, 对PCV2相关疾病的防治具有重大意义。

参考文献

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血液病毒抗体 篇5

1 材料与方法

1.1 待检血清

血清来源于我县3个蛋鸡种鸡场, 9个批次鸡苗血清, 于2014年5月6日出壳当日进行免疫注射。免疫21日龄时采集小鸡心脏血液, 经离心分离提取的血清。样品共157份。

1.2 检测的试剂及方法

采用鸡马立克氏病病毒抗体检测试剂盒。深圳真瑞生物科技有限公司生产的 (批号:201405, 生产日期:20140508, 有效期至:20150508) 。方法按照鸡马立克氏病病毒抗体检测试剂盒使用说明上的间接ELISA法, 在酶标板微孔上预包被纯化的鸡马立克氏病病毒。

2 判定标准

以空白对照调零用酶标仪于450nm读取吸光度A值。实验成立的条件是阳性对照孔A450值大于或等于0.6, 阴性对照孔A450值必须小于0.15。样品A450值大于0.2+阴性对照孔均值, 判断为阳性, 样品A450值小于0.2+阴性对照孔均值, 判断为阴性。

2.1 实验结果

共检测157份血清样本, 检出阳性117份, 阴性40份, 见表1、表2、表3。

3 结果分析

3.1 检测结果, 1号养殖场共计检测血清样品53份, 阳性25份, 阴性28份, 合格率47.1%。2号养殖场共计检测血清样品60份, 阳性51份, 阴性9份。免疫抗体合格率85%。3号养殖场共计检测血清样品44份, 阳性41份, 阴性3份, 免疫抗体合格率93.2%。

3.2 三个养殖场的检测结果, 说明养殖场都全面开展了鸡马立克氏病病毒的免疫注射工作。其中2号、3号两个养殖场每批次鸡苗的免疫效果均达到70%群体保护标准, 为受免鸡群提供了坚强的保护力;1号养殖场每批次鸡苗的免疫抗体均达不到70%群体保护标准, 一旦出现应急状况或者病毒侵入, 发生马立克氏病的风险较大。

3.3 免疫效价出现不均衡原因分析。 (1) 可能液氮苗不及时补充液氮, 疫苗在液氮上面, 使疫苗效力减弱或失效; (2) 未掌握好鸡苗注射疫苗的时限, 即出壳24h内注射疫苗达到抗体保护价, 24h后注射疫苗抗体保护价降低; (3) 注射时操作失误。如未等疫苗溶解, 未注意针头、胶管阻塞。 (4) 未按要求保存和运输、使用。如拿出液氮罐的疫苗必须1h用完, 资料表明, 稀释1h的疫苗, 其蚀斑数由原1500个降至700个, 2h后降低为450个, 因此马立克氏病疫苗的注射必须严格遵守操作规程; (5) 在采集、分离、运输血清时由于操作不当, 使血清受到污染, 影响检测效果。

4 结论

血液病毒抗体 篇6

1 对象和方法

1.1 研究对象我院于2004年8月在市疾控中心的督导下, 开展了H IV抗体检测工作, 检测对象为:

孕妇、性病患者、吸毒人员、外出打工者、长途司机等高危人群以及自愿要求检测者。重点监测科室为:妇产科、皮肤科、传染科、感染科、门诊自愿要求检测者, 截止到2006年检测人数已达5 000人。

1.2 方法选择2004年8月—2006年8月门诊工作日

登记本与相关皮肤科、妇产科、传染科、感染科艾滋病抗体登记本内容作为调查对象。

2 结果

大部分接受检测人群H IV抗体初筛试验为阴性, 其中有4例H IV抗体初筛试验为阳性:妇产科2例, 传染科1例, 内科门诊1例。

3 管理措施

虽然大部分参与检测的人群初筛为阴性, 但并不能代表其中无H IV抗体感染者, 因为艾滋病潜伏期长, 平均为6年～8年, 艾滋病抗体检测经酶联免疫吸附法做初筛试验, 再做免疫印迹法试验后, 方可进行确诊[1]。而从4例初筛阳性检测者存在的问题中, 却暴露了医院H IV抗体检测管理存在的许多薄弱环节:门诊工作日志以及重点检测科室艾滋病抗体检测登记本登记不健全, 有漏登、未登现象;患者的地址、联系方式不具体, 其结果是出现H IV抗体初筛阳性者无法与患者及时取得联系, 也无法对出现艾滋病抗体阳性者进行追踪检测、直至确诊, 其结果是造成疫情的蔓延和传染源的扩散;艾滋病H IV抗体检验单填写不规范, 采集血标本不记录时间, 标本有溶血、血量不足的现象发生, 其危害是增加患者的精神负担, 不能及时进行对高危人群进行检测, 影响正常的检测结果。针对以上薄弱环节特制订的管理措施如下。

3.1 加强领导以法治之。

首先, 成立由分管副院长负责, 医务科、传染科、保健科组成的传染病领导小组, 负责对重点监测科室进行监控管理。医务科组织全院医务人员学习新的《传染病防治法》, 提高医务人员对H IV抗体检测工作的重视, 遇到疫情做到早发现、早干预、早治疗。

3.2 制订行之有效的安全防护制度, 规范门诊工作日志,

重点科室设专人负责、专人管理, 重点检测人群建立登记本, 登记联系电话, 以便发现疫情及时控制传染源, 防止传染源的蔓延与扩散。

3.3 将门诊工作日志登记本、重点检测科室登记本纳入医院目标管理中, 并定期检查, 确保登记真实可靠。

3.4 重点科室的管理:

(1) 妇产科门诊给就诊的孕妇建立保健手册, 向患者做好H IV抗体检测的解释工作, 取得患者的合作, 再到检验科抽取血液标本检查后, 方可回妇产科做进一步的妇科检查诊疗工作, 杜绝携带艾滋病病毒母婴垂直传播发生。 (2) 皮肤科做好性病、吸毒人员的互动检测工作, 并为性病患者做好保密工作, 劝导他们洁身自好, 保持忠诚单一的性关系。指导他们正确地使用质量可靠的安全套, 以减少艾滋病性传播的发生几率, 并在性病门诊设立咨询电话, 实行保护性医疗措施, 为性病患者提供人性化的服务。 (3) 检验科做好采集血标本、输血前后的H IV抗体的检测工作, 杜绝院内H IV通过输血途径感染的发生。 (4) 感染科门诊做好外出务工人员、自愿检测者的H IV抗体的检测登记工作。 (5) 保健科及时掌握全院疫情动态, 及时准确进行防疫直报工作。 (6) 参加主动监测科室的一线人员必须加强自我防护, 提高采集血标本的准确穿刺率, 杜绝标本溶血、血量不足现象发生。医护人员发生针刺伤现象, 按艾滋病职业暴露办法常规消毒处理。

综上所述, 只要我们医护人员密切配合, 人人参与, 群防群控, 医院H IV抗体检测及其管理将逐步趋于完善, 更加健全, 从而充分发挥医疗单位在抗击艾滋病工作中的核心主导作用。

参考文献

血液病毒抗体 篇7

BVDV属于黄病毒科瘟病毒属的成员[5]。根据BVDV 5'非编码区(5'UTR)的不同可以分为BVDV-1型和BVDV-2型两个基因型[5]。不同基因型又包含不同的亚型。根据接种细胞后能否产生病变,BVDV分为致细胞病变型(CP)和非致细胞病变型(NCP)。若怀孕母牛感染NCP型BVDV后,会导致胎儿免疫耐受,胎儿或继续发育或流产,即使顺利产出也会成为持续感染(PI)牛,可持续向外界排毒,成为BVDV主要的传染源[6]。

BVDV基因组包括5'非翻译区(5'UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3'非编码区(3'UTR)。ORF编码多聚蛋白,后期加工为病毒的各种结构和非结构蛋白[7]。其中p80蛋白是BVDV非结构蛋白之一,在CP型BVDV和NCP型BVDV中有不同的存在形式,即在NCP型BVDV中以NS2/3(p125)形式存在,而在CP型BVDV中以NS3(p80)形式存在。p80蛋白是CP型BVDV的分子标志[8]。p80蛋白大约有680个氨基酸残基,分子质量约为80 ku,具有三种酶活性,分别为丝氨酸蛋白酶活性、NTP酶活性和RNA解旋酶活性。p80蛋白在瘟病毒属中非常保守,是一种免疫优势蛋白,在自然感染和弱毒活疫苗免疫后的动物中都可以产生针对p80的抗体,具有重要的诊断价值。本研究用大肠杆菌对BVDV的p80蛋白进行了表达,制备了8株针对p80的单克隆抗体(MAb),为BVDV的检测提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒株、质粒和细菌株

BVDV BA株、原核表达载体质粒p ET30a、克隆菌DH5α和表达菌大肠杆菌BL21(DE3),由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛呼吸道病研究组保存。

1.2 试验动物和细胞

6~8周龄Balb/c小鼠,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心;SP2/0细胞与牛肾细胞(MDBK),由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛呼吸道病研究组保存。

1.3 主要试剂

RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒,均购自AXYGEN公司;蛋白质纯化试剂盒,购自Novagen公司;聚乙二醇(PEG,MW1450)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)、HAT、HT、HRP-羊抗鼠Ig G、HRP-山羊抗兔Ig G、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠Ig G,均购自Sigma公司;DAB显色液,购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Prime Script Rtase,购自Ta KaRa公司;DNA聚合酶Mixture,购自Thermo公司;TMB,购自北京泰天和生物技术公司;MAb抗体亚类试剂盒,购自Southern Biotech公司。

1.4 重组p80蛋白的表达与鉴定

1.4.1 引物设计、目的基因克隆及重组质粒的构建

参照BVDV的VEDEVAC株的p80基因序列(GenBank登录号为AJ585412)设计扩增p80目的基因的引物,序列为:反转录引物5'-GCTGGTAAGTCT-TCAGAGATAAGT-3',上游引物5'-ACACCAT-GGGTGGGGAATTTACATGTGTCACTGCAT-3',下游引物5'-GCGAAGCTTATTACAAGCTGTCCTCCTCG-TACAGGCT-3'(下画线部分分别为NcoⅠ和HindⅢ酶切位点)。PCR扩增片段长度约为1 293 bp,为p80蛋白基因的415~1 695 bp编码序列,对应的氨基酸残基为139~565位,编码427个氨基酸。引物由吉林库美生物公司合成。

用BVDV BA株接种MDBK单层细胞,待细胞病变达到80%时收毒。反复冻融3次后,用RNA提取试剂盒抽提病毒RNA。以提取的RNA为模板,用反转录引物按照RT-PCR反应试剂盒说明书进行反转录制备c DNA。取5μL的c DNA为模板,利用上、下游引物进行PCR,反应程序为:94℃预变性3 min;94℃预变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸90 s,共32个循环;72℃延伸10 min;4℃终止反应。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收目的片段,对其进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切后插入同样双酶切的p ET30a载体中,挑选阳性菌落,提取重组质粒并酶切鉴定后进行序列测定,取鉴定正确的重组质粒p ET30a-p80用于转化表达菌BL21(DE3)。

1.4.2 p80蛋白的表达与纯化

将重组阳性质粒p ET30a-p80和空载体质粒p ET30a分别转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,挑取单个菌落接种于5 m L含有卡那霉素的LB培养基中,37℃摇菌过夜;次日将菌液按照1%的比例接种含有卡那霉素的新鲜LB培养基中,37℃摇床培养大约2 h,当菌液的OD600值达到0.6~0.8时,加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L,诱导培养6 h;离心收集菌液,超声后高速离心,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE。

1.4.3 重组蛋白的Western-blot分析

将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE,转移至硝酸纤维素膜上,将膜置于5%脱脂乳中4℃封闭过夜;以BVDV兔源多抗为一抗,37℃孵育1 h;以HRP标记的山羊抗兔的Ig G为二抗,37℃孵育1 h,用DAB显色。

1.4.4 重组蛋白的纯化与鉴定

按照蛋白纯化试剂盒说明书对蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western-blot对纯化的蛋白进行鉴定,利用紫外分光光度计测定其浓度并分装备用。

1.5 MAb的制备

1.5.1 小鼠的免疫与细胞融合

取BVDV培养液于4℃、5 000 r/min离心30 min,利用透析袋和PEG20000对上清液进行10倍浓缩。以浓缩的病毒液免疫Balb/c小鼠,按照100μg/只的剂量免疫,首免用弗氏完全佐剂与浓缩BVDV液等体积乳化,二免和三免用弗氏不完全佐剂与浓缩的BVDV液等体积乳化,免疫间隔为2周,三免后第5天对小鼠进行断尾采血测抗体效价。对效价高的小鼠三免后7天用浓缩的BVDV液进行加强免疫,加强免疫后第3天取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合。

1.5.2 间接ELISA的建立

用纯化的重组p80蛋白作为包被抗原,以免疫后小鼠的血清为阳性对照,未免疫小鼠的血清为阴性对照,按照阳性血清OD值接近1.0、阴性血清OD值小于0.2,并且阳性/阴性比值(P/N值)大于2.1作为阳性判定标准。

1.5.3 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆纯化

利用建立的间接ELISA法检测杂交瘤细胞的上清液。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆纯化。

1.6 MAb生物学特性的鉴定

1.6.1 MAb亚类的鉴定

按照抗体亚类鉴定试剂盒说明书进行操作。

1.6.2 腹水的制备及效价的测定

取10周龄Balb/c小鼠按参考文献[9]提供的方法制备腹水。将杂交瘤细胞株腹水按1∶10进行倍比稀释,以SP2/0腹水作为阴性对照,用BVDV病毒液包被,ELISA法检测其效价。

1.6.3 MAb的间接免疫荧光(IFA)检测

用BVDV接种MDBK单层细胞,接毒72 h后用4%多聚甲醛进行固定,以1∶100倍稀释的MAb为一抗,37℃孵育1 h;以1∶100倍稀释的FITC标记的兔抗鼠Ig G为二抗,37℃孵育1 h,用倒置荧光显微镜观察。

1.6.4 MAb与猪瘟病毒交叉反应的IFA检测

用猪瘟病毒(CSFV)接种PK15细胞,72 h后用4%多聚甲醛进行固定,按1.6.3所述的方法检测MAb与CS-FV的反应,以确定本试验制备的8株单克隆抗体与猪瘟病毒是否存在交叉反应。

2 结果

2.1 目的基因的扩增与p ET30a-p80重组质粒的构建结果

目的基因p80的RT-PCR产物经过琼脂糖核酸电泳后,在1 300 bp左右出现目的条带,大小符合预期结果。构建的重组质粒p ET30a-p80经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后出现2条带,分别为目的基因1 300 bp条带和p ET-30a条带(图略)。

2.2 重组p80蛋白的表达与鉴定结果

用p ET30a-p80重组质粒转化BL21(DE3)表达菌,挑单个菌落,37℃摇床增菌培养后,用IPTG诱导。诱导后的菌液经过离心浓缩和超声处理后高速离心,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE,结果表明,p80蛋白得到了表达,分子质量为44 ku,以包涵体的形式存在(见图1)。

1.诱导后的p ET30a菌液;2,3.分别未诱导的重组质粒p ET30ap80菌液超声后沉淀和上清液;4,5.分别为诱导后的重组质粒p ET30a-p80菌液超声后沉淀和上清液;M.标准蛋白Marker。

2.3 重组p80蛋白的纯化与Western-blot分析结果

按照蛋白纯化试剂盒对重组p80蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和染色脱色处理,可以看到比较纯的重组p80蛋白(见图2A)。Western-blot分析结果表明,该重组p80蛋白与BVDV兔源多抗具有良好的反应性(见图2B)。

2.4 杂交瘤细胞株的筛选、MAb亚类鉴定及腹水效价测定结果

以纯化的p80蛋白为包被抗原的间接ELISA法筛选得到8株单克隆抗体,分别为3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11。单克隆抗体亚类检测结果表明,8株单克隆抗体均为Ig M,轻链为κ链。8株单克隆抗体3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11的腹水效价分别为1×105、1×106、1×105、1×107、1×107、1×105、1×106和1×106。

2.5 MAb间接免疫荧光检测结果

间接免疫荧光试验结果表明,8株单克隆抗体的腹水与BVDV感染的MDBK细胞产生明亮的特异性绿色荧光,正常的未接种病毒的MDBK细胞结果为阴性,见273页彩图3。同时所制备的8株单克隆抗体与CSFV无交叉反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性(图略)。

3 讨论

BVDV的感染呈世界性分布,主要流行于养牛业比较发达的国家。我国关于BVDV的研究起步较晚。自从李佑民首次于1980年分离到该病毒后,在新疆、内蒙古、甘肃、河北等地的牛中也陆续分离到BVDV[8]。一些研究发现BVDV不仅感染牛,山羊、绵羊和鹿等也会感染BVDV[10]。近年来,猪感染BVDV的报道显著增加。此外,BVDV是组织细胞培养及生物制品中最为常见的外源性病毒。因此,BVDV抗原的有效检测是各国研究人员关注的一个焦点,已有的研究表明MAb具有良好的特异性,有多株MAb用于BVDV抗原的检测。

本研究对p80蛋白基因的抗原区、亲水区及表面展示概率进行了分析,扩增了该基因的415~1 695位核苷酸,将截短的p80基因定向克隆到p ET30a中,构建了p ET30a-p80重组表达质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经增菌培养并诱导后成功表达了截短的p80蛋白。SDS-PAGE检测结果表明,该重组蛋白以包涵体形式存在;Western-blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的反应性。利用浓缩的BVDV培养液免疫Balb/c小鼠,用纯化的重组p80蛋白包被的间接ELISA筛选到了8株能稳定分泌抗BVDV的p80蛋白MAb的杂交瘤细胞株,即3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11。IFA试验结果表明,8株MAb可与BVDV的天然p80蛋白反应,与CSFV无交叉反应,具有良好的反应性和特异性。p80蛋白是BVDV的非结构蛋白之一,是BVDV中最保守的蛋白之一,是一种免疫优势蛋白,在牛体内能引起强烈的体液免疫反应,是检测持续感染牛即PI牛的目标抗原之一[11]。

目前,国内尚无可靠的检测BVDV抗原的检测试剂和方法,检测BVDV的试剂盒主要依赖进口,价格昂贵,不适合国内大面积使用。本研究制备出了8株抗BVDV p80蛋白的单克隆抗体,单克隆抗体亚类检测结果显示8株单克隆抗体均为Ig M,轻链为κ链。初步的检测结果表明其具有良好的反应性和特异性。Ig M是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体,是初次免疫应答中最早出现的抗体,而最近二十多年的研究使得Ig M成为一类潜在的治疗和诊断的生物活性物质[12]。本研究制备的p80 MAb将具有较好的应用前景,为建立BVDV抗原的ELISA检测方法奠定了基础。

摘要：为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)p80蛋白单克隆抗体,试验采用BVDV接种牛肾细胞(MDBK),提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增出BVDV的p80基因,将其定向克隆到原核表达载体p ET30a,得到重组表达质粒p ET30a-p80。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,挑选单菌落并扩大培养,经IPTG诱导和SDS-PAGE以及Western-blot分析表明重组蛋白p80获得了表达,分子质量约为44 ku。同时用浓缩的BVDV培养液免疫6~8周龄的Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。利用纯化的重组蛋白p80作为检测抗原的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆后对获得的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光(IFA)和抗体亚类鉴定及腹水的制备和效价的测定。结果表明:重组p80蛋白具有很好的反应性;获得8株稳定分泌针对BVDV p80蛋白的杂交瘤细胞株,分别为3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11;8株杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠制备腹水,采用BVDV作为包被原的间接ELISA方法测得其效价为1×105~1×107;8株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性;8株单克隆抗体的抗体亚类均为IgM/κ。说明制备的重组p80蛋白单克隆抗体可试用于建立检测BVDV抗原的诊断方法。

关键词：牛病毒性腹泻病毒,RT-PCR,p80蛋白,免疫印迹试验,单克隆抗体,IgM,间接免疫荧光试验

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