伪狂犬病病毒gE抗体（精选4篇）
伪狂犬病病毒gE抗体 篇1
伪狂犬病 (Pseudorabies, PR) 是由伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus, PRV) 引起的多种家畜和野生动物感染的一种急性传染病, 也是严重危害规模养猪场的主要传染病之一。猪伪狂犬病是《国家中长期动物疫病防治规划 (2012-2020) 》中优先防治和重点防范的动物疫病, 并纳入重点疫病净化考核内容。疫苗免疫是有效防治猪伪狂犬病的关键措施, 目前, 国内外普遍采用伪狂犬病病毒基因缺失疫苗对该病进行免疫预防, 配套使用相应的抗体酶联免疫吸咐试验 (ELISA) 检测试剂盒对猪血清中PRV野毒抗体进行检测, 从而能有效监测猪群中PRV野毒感染情况[1,2], 并据此确定下一步的PR控制和净化措施, 因此, PR抗体检测的准确性显得尤为重要。PRV基因组为线性双链DNA, 可编码70~100种蛋白质, 糖蛋白有11种, 即g B、g C、g D、g E、g G、g H、g I、g K、g L、g M和g N, 其中g E为病毒复制非必需的糖蛋白, 与病毒在神经系统中的侵袭和扩散密切相关, 是影响PRV生长的功能成分[3], 并作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染。目前市场上有不同厂家生产的PRV g E抗体检测试剂盒, 本研究选取2种进口PRV g E抗体检测试剂盒, 对相同的猪血清样品分别进行检测, 比较2种试剂检测的一致性。
1 材料与方法
1.1 猪血清1 100份猪血清, 采自5个规模猪场。
1.2 检测试剂
猪伪狂犬病病毒g I (g E) 抗体检测试剂盒, IDEXX生产, 批号:CL456;猪伪狂犬病病毒g E抗体检测试剂盒, ID.vet生产, 批号:716。
1.3 检测方法
猪伪狂犬病病毒g I (g E) 抗体检测试剂盒:猪血清用试剂盒自带稀释液稀释2倍后, 平行加样各2孔 (100 u L/孔) , 反应同时设阳性和阴性对照各2孔。室温下孵育60 min, 洗涤3次后, 加酶标抗体100 u L, 室温下孵育20 min后再洗涤, 加底物液100 u L, 室温避光显色15 min, 加50 u L终止液终止反应, 用酶标仪于650 nm波长测定OD值并计算S/N值 (S/N=样品OD值/阴性对照平均OD值) , 其中S/N≤0.6为阳性, >0.7为阴性, 0.6<S/N≤0.7为可疑。
猪伪狂犬病病毒g E抗体检测试剂盒:每孔加入试剂盒自带稀释液20 u L后平行加样各2孔 (50 u L/孔) , 同时加阳性和阴性对照各2孔, 37℃孵育90 min, 洗涤3次后, 加酶标抗体100 u L, 室温下孵育30 min后再洗涤, 加底物液100 u L, 室温避光显色15 min, 加100 u L终止液终止反应, 用酶标仪于450 nm波长测定OD值并计算S/N%值 (S/N%=样品OD值/阴性对照平均OD值*100) , 其中S/N%≤60%为阳性, >70%为阴性, 60%<S/N≤70%为可疑。
如同份样品检测结果不一致, 再进行1次检测, 最终结果取2次相同的判定结果。
1.3 统计方法
检测数据采用EXCEL处理, 使用SPSS20.0做统计分析, 对2种试剂盒检测的结果一致性应用Kappa检验 (值) , 检验水准为=0.05。值≤0.40时, 表明一致性较差;0.40<值≤0.60时, 表明中度一致;0.60<值≤0.80时, 表明有较高的一致性;值>0.80, 表明有极好的一致性[4]。符合率指2种试剂定性为相同结果样本数之和除以检测总数。
2 结果与分析
对2种试剂盒的可重复性进行评价。IDEXX猪伪狂犬病病毒g I (g E) 抗体检测结果显示1 100份样品中有9份样品平行结果不一致, ID.vet g E抗体检测结果显示1 100份样品中有5份样品平行结果不一致。分析发现这14份样品的检测结果都是介于阳性和阴性之间, 见表1。
2 种试剂盒联合检出928份阳性和149份阴性, 符合率为98.2%。根据Kappa一致性检验, Kappa值为0.929 (95%置信区间:0.899~0.959) , 表明2种试剂盒的一致性为极好, 见表2。在2种试剂检测结果不相符的20份样品中, 差异也主要集中在判定结果位于临界值附近的样品, 其中IDEXX的S/N值在0. 4 3 6~0.873, ID.vet的S/N%值在44.3%~89.5% (见表3) 。
3 讨论
Kappa检验是用于检验分类变量资料一致性和重现性的统计指标, 可以研究不同诊断方法结果间或不同观察者评定结果间的一致性, 近年人们常用Kappa分析评价2种检测方法、2名检验人员或者2种设备检测结果的符合程度, 以及用同一种方法进行多次测定的结果能否重现的问题。Kappa统计量通常是将观察的一致性与偶然一致性进行比较, 取值范围介于-1和+1, 如值<0, 表示由机遇所致一致率大于观察一致性, 2次检查的结果很不一致, 但在实际应用中无意义;值=0, 表示观察一致率完全由机遇所致, 如值>0, 说明观察一致性大于因机遇所致一致的程度, Kappa值越大, 表明2种结果可靠程度越高。除了Kappa检验外, 国际上还可以依据美国临床实验室标准化协会 (CLSI) EP12-A2文件对2种定性检测方法的一致性进行比较[5], 按照EP12-A2文件的公式, 把检测结果定性为阴性和非阴性, 计算出这2种试剂盒检测PRV g E抗体一致程度的95%可信区间为98.1%~99.4%。
本试验中发现2种试剂检测结果的差异主要集中在判定结果位于临界值附近的样本, 而临界值浓度是ELISA定性试验唯一的决定水平。临界值浓度样本具有多次重复检测出现阴、阳性概率各占50%的特点, 并且在临界值浓度范围95%区间的样本都不易得到稳定的检测结果[6], 而大大超过临界值水平的阴、阳性样本的结果却较为稳定。因此, 如果样本浓度在临界值浓度附近, 会出现相同试剂多次检测同一样本结果不一致的现象。
目前猪场普遍使用PRV g E基因缺失弱毒苗防控PR, PRV g E抗体试剂盒的应用为PR的控制和净化创造了有利条件, 并已成为PR诊断和评价PR防治效果及疫病净化的有效手段。试验结果表明, 2种试剂检测结果高度一致, 均可应用于临床检测。
参考文献
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[6]杨有业, 张秀明.临床检验方法学评价[M].北京:人民卫生出版社, 2008:296-312.
伪狂犬病病毒gE抗体 篇2
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清:
2013年7—9月份在豫东6个县 (市、区) 未进行伪狂犬病疫苗免疫的镇、村养猪场随机采集了210份血样, 分离血清, -20℃保存备用。随机抽取了156份进行试验。
1.1.2 诊断试剂:
酶联免疫试剂盒购自郑州中道生物技术有限公司。试剂盒包括:PRV-coated板、阴阳性对照血清、显色剂A液、B液、TMB终止液、样品稀释液、酶标记物等。
1.1.3 仪器及材料:
酶标仪 (Elx800型) 、冰柜、台式高速低温离心机 (Universal 32R型) 、电子天平、电热恒温干燥箱、高压灭菌锅、超纯水系统、稀释样品的玻璃或塑料管等。
1.2 方法
采用间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) [5]对分离的血清进行检测。ELISA方法具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点, 且能自动化操作, 并能迅速地检测大量样品, 在PR诊断中日益受到人们的重视, 现已成为国际上检测猪PR的常规方法之一[6]。
1.2.1 样品的制备:
用血清样品稀释液将被检样品血清稀释2倍。
1.2.2 洗涤液的制备:
浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用去离子水或蒸馏水10倍稀释 (例如:每块板用浓缩液180 m L加水20 m L) 。
1.2.3 操作步骤:
使用前所有试剂应恢复至室温, 试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。取1个autigencoated plates, 并在Herdchek上记录下样品的位置。在A1、A2、A3中置入阴性对照血清100μL (稀释成1∶2) 。在A4、A5中置入阳性对照血清100μL (稀释成1∶2) 。每孔置入稀释了的样品100μL, 在常温下作用1 h或于2~7℃置放1夜。弃去酶标板孔中液体, 每孔加入洗涤液300μL (使用前将洗涤液做10倍稀释并恢复至室温) 洗涤3~5次, 每次每孔均应彻底装满和清洗干净, 最后1次用吸水纸拍干。每孔加入辣根过氧化物酶标记抗PRV gpi抗体, 在室温下作用20 min。依照前面洗涤酶标板的方法, 重复洗涤。置入TMB底物100μL于每个测试孔中, 在室温下作用15 min。置入终止液50μL于每个孔中使反应停止。调整酶标仪, 测量并且记录被检样品和对照的A (650) , 计算出结果。
1.2.4 试验成立所需的条件:
阴性对照A (650) 的平均值减去阳性对照A (650) 的平均值必须≥0.3试验方能有效。如果试验无效, 试验操作可能有误, 试验应重做, 并应详细阅读说明书首先通过计算每个样品的S/N值, 判定其g E抗体的有无。
1.2.5 结果的判定:
(1) 如果S/N值≤0.60, 样品应判定为PRV g E抗体阳性。 (2) 如果0.60<S/N值≤0.70, 样品应重测;如果实验结果不变, 间隔一段时间重新采样、检测。 (3) 如果S/N值>0.70, 样品应判定为PRV g E抗体阴性。
1.2.6 计算方法:
(1) 阴性对照平均值:NCX=Al A (650) +A2A (650) +A3A (650) /3。 (2) 阳性对照平均值:PCX=A4A (650) +A5A (650) /2。 (3) 样品/阴性对照比率:S/N=样品A (650) /NCX。
2 试验结果
156份被检血清的检测结果为:阳性血清32份, 阳性率20.51%。其中兰考县阳性率最低, 为19.05% (4/21) ;民权县阳性率最高, 阳性率为23.53% (4/17) , 见表1。
3 小结
目前猪伪狂犬病是1种没有特效药治疗的病毒病。本试验采用间接ELISA方法检测非免疫猪群中的伪狂犬病病毒血清抗体结果:伪狂犬病病毒血清抗体阳性率为20.51% (32/156) , 表明豫东地区猪群中普遍存在伪狂犬病病毒的隐性感染, 并有随时爆发的风险。为预防豫东地区6县 (市、区) 猪伪狂犬病的发生, 提出以下建议。
3.1 建立合理免疫程序
猪场所有猪群都应注射疫苗, 后备母猪在配种前注射伪狂犬病灭活苗, 怀孕母猪在产前1个月注射伪狂犬病灭活苗;种公猪每年春秋各注射1次;仔猪出生后1月用活苗滴鼻, 4~6周后再加强1次。猪伪狂犬病弱毒冻干苗和灭活油乳剂苗在控制伪狂犬病流行方面起了重要作用, 但不能完全预防感染发生和强毒扩散, 致使伪狂犬病难以控制与根除[7,8]。
3.2 建立严格的消毒制度
猪场地面、墙壁及用具等要定期消毒, 不留死角, 最好使用2%烧碱或酚类试剂, 一旦发生疫情2~3天要消毒1次。粪便要进行发酵处理, 猪场内进行定期灭鼠, 防止鼠类带毒传播疾病的危害。
3.3 培育健康猪群
对猪群要定期进行血清学检测, 阳性猪及时淘汰。坚持自繁自养, 不从疫区购种猪, 对引进猪要严格进行g E抗体检测, 阴性作为引种对象。
3.4 加强饲养管理
提供品质优良的全价饲料, 实施全进全出的饲养方式, 对病猪及时隔离处理, 严禁与猪场无关人员随意进场, 禁止外来猪场养殖人员串门、探访, 拒绝不同种类的动物混养, 控制犬、猫及禽类进入猪场。
参考文献
[1]蒋红, 龚建军, 尹晨辉.规模猪场成年公猪伪狂犬野毒感染抗体 (gPI抗体) 的检测结果初报[J].湖南畜牧兽医, 2011, 162 (2) :18~19.
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[3]曾新斌, 王隆柏, 陈小权, 等.福建省部分规模猪场诸位狂犬病野毒抗体检测及后备母猪的初步净化[J].福建畜牧兽医, 2011, 33 (3) :74~77.
[4]戴爱玲, 李晓华, 黄思琼, 等.福建省龙岩市规模化猪场伪狂犬野毒感染的血清学调查[J].龙岩学院学报, 2011, 29 (2) :80~83.
[5]邱德新, 陈焕春, 何启盖, 等.间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体[J].中国兽医学报, 2002, 22 (2) :149~152.
[6]Sc hoenbaum M A, Beran G W, M urpky D P.A study comparingthe immunologic responses of swine to pseudorabies viral antigensbased on the EllSA.serum virus neutralization, and latex agglutination[J].J Vet Diag Invest, 1990, (2) :129~134.
[7]何启盖, 陈焕春, 邱德新, 等.乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病血清抗体的研究[J].中国兽医科技, 1999, 29 (1) :7~9.
伪狂犬病病毒gE抗体 篇3
目前,PRV gB蛋白的结构已经比较清楚,在gB蛋白的59 ~126 aa、214 ~279 aa、540 ~734 aa处存在线性和构象优势抗原位点[11]。由于PRV的G + C含量高达73%[12],难于扩增,因此截取含有gB蛋白抗原表位的基因片段进行扩增、表达。
试验旨在将PRV gB基因克隆到原核表达载体中,筛选出稳定表达的菌株,经IPTG诱导表达后纯化表达产物,以纯化的表达产物为免疫原制备针对gB蛋白的特异性单克隆抗体( McAb) ,为今后检测、诊断猪伪狂犬病奠定了基础。
1材料与方法
1. 1菌种、质粒和病毒株
E. coli菌株DH5α、pET - 32a( + ) 表达载体以及PRV S株,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪病分子诊断实验室保存; Transetta ( DE3) ,购自Transgen Biotech公司。
1. 2试验动物
Balb / c雌性小鼠,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
1. 3主要试剂
KOD Fx Neo DNA聚合酶,购自TOYOBO公司; T4 DNA连接酶、限制性内切酶和pMD18 - T载体,购自TaKaRa公司; IPTG,购自上海华舜生物工程有限公司; Ni - NTA His·Bind树脂,购自Novagen公司; 鼠抗His标签单克隆抗体,购自艾美捷科技有限公司; 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、50 × HAT、50 × HT、矿物油, 购自Sigma公司; 胎牛血清,购自Theromo公司; 辣根过氧化物酶( HRP) 标记的山羊抗小鼠IgG( HRP - IgG) 、FITC标记的羊抗鼠IgG,购自北京中杉金桥生物技术有限公司; SBA ClonotypingTMSystem / HRP抗体亚类鉴定试剂盒,购自Southern Biotechnology公司。
1. 4重组gB蛋白的制备
1. 4. 1引物的设计根据参考文献[11],以GenBank中登录的伪狂犬病毒glycoprotein B GⅡ ( gB) ( AF257079.1) 基因序列为模板,采用Oligo 7.0软件设计能够扩增含有gB主要抗原表位基因的引物( 由华大基因科技有限公司合成) ,序列为上游引物5' - CCG-GAATTCATGATCCAGGCGCACGTGAAC - 3',下游引物5' - CCCAAGCTTCTACTGGTTGCGGCGCTGGAT - 3', 下画线部分分别为限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点。
1. 4. 2重组gB蛋白表达载体的构建以PRV S株为模板,利用合成的引物进行PCR扩增,胶回收目的片段,并进行末端加“A”,由T4连接酶于16 ℃过夜连接到pMD -18T载体,转化进入大肠杆菌DH5α,经酶切和测序鉴定无误,阳性克隆载体命名为pMD - gB。对pMD - gB进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,采用上述方法进行克隆,最终将目的片段连接到原核表达载体pET - 32a ( + ) 上,转化进入感受态细胞Transetta ( DE3) ,重组质粒再经酶切和测序鉴定,阳性载体命名为pET - gB。
1. 4. 3重组gB蛋白的表达、纯化和鉴定挑取单个阳性菌落,在37 ℃条件下摇床培养至菌液OD600值达到0. 6 ~0. 8,加入0. 2 mmol/L IPTG诱导4 h; 收集菌液,超声破碎处理,离心后经SDS - PAGE确定该表达蛋白以包涵体形式存在。根据His·Tag融合蛋白纯化操作手册( Merk) 进行纯化,纯化后的蛋白经SDS - PAGE鉴定,并利用Western - blot分析重组蛋白的抗原性。
1. 4. 4重组gB蛋白的活性分析利用间接ELISA鉴定重组gB蛋白的活性。取纯化后的重组gB蛋白,以0. 5 μg/孔包被ELISA反应板,以适当比例稀释的PRV感染猪的阳性血清作为一抗,辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG为二抗,DAB作为底物显色液。
1. 5单克隆抗体的制备
1.5.1动物免疫取纯化的gB蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合充分乳化,以100μg/只的剂量免疫6~8周龄的雌性Balb/c小鼠,此后每间隔2周,用等体积抗原与弗氏不完全佐剂乳化进行第2,3次免疫,第3次免疫后的第7天测定效价,血清效价达到1∶20 000时进行一次加强免疫,在加强免疫后的第3天进行细胞融合,融合方法参照参考文献[13-14]。
1.5.2杂交瘤细胞株的制备及筛选融合后用选择性培养基HAT重悬,并加入到前一天做好的饲养层中,于37℃、5%CO2培养箱进行培养,第5天用50×HAT半换液,第10天用50×HT半换液,每天观察,待克隆细胞长到一定数量时,用纯化的gB蛋白包被ELISA反应板,利用间接ELISA方法检测有融合细胞孔中的上清液,进而筛选阳性细胞株。将获得的阳性细胞株用有限稀释法连续克隆3~5次,并用间接ELISA法检测,直至得到能稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株,然后对该杂交瘤细胞株进行扩大培养并冻存。
1. 6单克隆抗体的生物活性鉴定
1. 6. 1单克隆抗体的亚型鉴定用SBA Clonotyp- ingTMSystem / HRP抗体亚类鉴定试剂盒按说明书中的方法进行鉴定。
1. 6. 2单克隆抗体的特异性检测以实验室现有的副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒作为抗原包被ELISA反应板,筛选得到的单克隆抗体上清液为二抗,利用间接ELISA进行交叉试验, 检测获得的单克隆抗体的特异性。
1. 6. 3 McAb腹水的制备将矿物油以500 μL / 只腹腔注射Balb/c小鼠,7 d后将杂交瘤细胞以6 × 105个/只腹腔注射小鼠,待小鼠腹腔明显胀大时抽取腹水,离心取上清液即为McAb腹水。
1. 6. 4间接免疫荧光试验培养PRV S株细胞,以副猪嗜血杆菌单克隆抗体制备的腹水,培养的SP2/0细胞上清液作为阴性对照,将获得的杂交瘤细胞制备的腹水作为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG ( 1∶ 200) 作为二抗,用显微镜观察荧光信号。
2结果
2. 1重组gB蛋白的表达载体的构建结果
克隆载体pMD - gB经PCR扩增后,得到了大小约为588 bp的目的片段,见图1。表达载体pET - gB经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,获得了预期的目的基因片段,见图2。
M.DL-2 000 Marker;1.gB基因的PCR扩增产物;2.阴性对照。
1.pET-gB双酶切产物;2.pET-32a(+)空载体双酶切产物;M.DL-6 000 Marker。
测序结果显示,PRV S株540 ~734 aa的DNA序列与GenBank中登录的PRV glycoprotein B GⅡ( gB) 基因序列( AF257079. 1) 完全一致,说明获得了pET - gB重组质粒。
2. 2重组gB蛋白的表达、纯化和鉴定结果
将重组gB基因克隆至原核表达载体中,转化到表达菌Transetta( DE3) 中,经IPTG诱导表达,表达产物过Ni - NTA柱纯化,经SDS - PAGE分析,可见1条明显的44 ku的表达蛋白带,见图3; 经Western - blot检测,纯化的重组蛋白能够与His标签特异性识别,约44 ku,见图4。
2. 3重组gB蛋白的活性分析结果
以纯化后的gB蛋白包被ELISA反应板,以感染PRV的猪血清作为一抗,辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG作为二抗,ELISA反应结果显示为阳性,说明表达、纯化后的重组gB蛋白具有抗原性。
2. 4单克隆抗体的筛选结果
将重组gB蛋白免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合、亚克隆,同时利用间接ELISA筛选,最终获得2株能稳定分泌抗PRV - gB McAb的杂交瘤细胞株,命名为CG7、BD8。
1.未诱导的pET-gB蛋白;2.IPTG诱导的pET-gB蛋白;M.蛋白质量标准。
1.纯化后的pET-gB蛋白;2.未纯化的pET-gB蛋白;M.蛋白质量标准。
2.5单克隆抗体亚型的鉴定结果
SBA ClonotypingTMSystem / HRP抗体亚类鉴定试剂盒鉴定显示获得的CG7、BD8单克隆抗体均为IgG1亚类,轻链均为 κ。
2. 6单克隆抗体的特异性检测结果
CG7、BD8与副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、伪狂犬病毒包被的反应板进行ELISA试验,结果表明,该杂交瘤细胞与PRV以外的毒株均不反应, 表明该单克隆抗体具有良好的反应特异性。
2. 7腹水效价的检测结果
杂交瘤细胞制备的腹水与纯化的gB蛋白包被的反应板,经间接ELISA检测,结果表明,腹水的效价达到1∶ 20 000。
2. 8间接免疫荧光试验结果
接种PRV S株的细胞与CG7、BD8制备的腹水呈阳性反应,而与副猪嗜血杆菌单克隆抗体制备的腹水和SP2/0细胞上清液的两组试验均为阴性,表明McAbs为PRV杂交瘤细胞,见图5。
3讨论
PRV gB蛋白是一种重要的囊膜组分和免疫原, 属于PRV的必需糖蛋白。gB蛋白能介导细胞膜与病毒囊膜的融合,促使病毒穿过; 能使感染的细胞膜与未感染的细胞膜融合; 能诱导免疫学反应抵抗PRV感染。PRV不仅是引起新生仔猪神经症状、高死亡率和种猪繁殖障碍的重要因素,还是诱发猪繁殖与呼吸系统综合征的重要病原,PRV与其他病毒在猪群中的交叉持续感染使猪病更加难以预防和控制。 1999年,娄高明等[15]报道伪狂犬病已分布在包括香港和台湾在内的25个省( 市) ,近年来爆发形势不断加剧,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失; 因此, 建立切实、有效的诊断检测方法对控制和消灭猪的伪狂犬病具有重要的意义。本试验表达的蛋白和制备的单克隆抗体为以后建立检测和诊断PRV的方法提供了先决条件。
A.抗gB的CG7腹水;B.抗gB的BD8腹水;C.SP2/0培养上清液对照;D.副猪嗜血杆菌单克隆抗体的腹水对照。
摘要：为了研究伪狂犬病毒gB基因的原核表达并制备其单克隆抗体,试验采用含有伪狂犬病毒(PRV)gB蛋白抗原表位的基因作为模板进行扩增,得到大小为588 bp的扩增产物,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化表达菌Transetta(DE3),经诱导表达得到目的蛋白;以纯化后的重组gB蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞。结果表明:表达的重组gB蛋白约为44 ku,以包涵体形式存在,具有良好的反应原性;获得的2株杂交瘤细胞均能够稳定分泌抗gB蛋白的特异性单克隆抗体(McAb)。
伪狂犬病病毒gE抗体 篇4
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
伪狂犬病抗体检测试剂盒 (gB-ELISA) 、伪狂犬病gE抗体试剂盒 (gE-ELISA) , 均为美国艾迪氏公司生产。
1.1.2 试验动物
广东某规模化猪场怀孕母猪30头及其所产仔猪30头。
1.1.3 疫苗
国产猪伪狂犬病病毒gE基因缺失弱毒疫苗 (下简称A苗) , 进口猪伪狂犬病病毒gE基因缺失弱毒疫苗 (下简称B苗) 。
1.2 方法
1.2.1 试验动物的分组与免疫
将选取的30头健康怀孕母猪随机分成2组, 每组15头。第1组接种进口猪伪狂犬病病毒gE基因缺失弱毒疫苗 (B苗) , 第2组接种国产猪伪狂犬病病毒gE基因缺失弱毒疫苗 (A苗) , 各组猪按统一的饲养管理方法分栏进行管理。各组免疫程序见表1。
1.2.2 血清样品的采集和处理
各组怀孕母猪于产前10天 (免疫前) 分别采血, 每头1份, 每组15份;免疫后10, 20, 30, 60, 120, 150天采血, 每次每头1份, 每组15份。上述所有血清用于检测猪伪狂犬病病毒疫苗免疫抗体, 各组猪于免疫前和免疫后150天采血清检测猪伪狂犬病病毒野毒抗体。
随机选择各组每头母猪所产仔猪1头, 于1, 10, 30, 60, 80日龄采血, 每次每头1份, 每组15份, 检测仔猪母源抗体;同时对10, 60, 80日龄的所采血清进行伪狂犬病病毒野毒抗体检测。
1.2.3 疫苗免疫抗体的检测
被检血清的稀释:用样品稀释液按1︰2的比例稀释待检血清。每份样品更换吸嘴, 样品加到酶标孔内之前混合均匀, 静置, 待检。
疫苗免疫抗体ELISA的检测程序:参照伪狂犬病病毒gE抗体试剂盒 (gE-ELISA) 检测程序进行。
结果判定:S/N比值小于或等于0.60的样品判为伪狂犬病病毒gE抗体阳性;S/N比值小于或等于0.7, 大于0.6的样品重新检测;S/N值大于0.7, 则该样品中没有抗伪狂犬病病毒gE的抗体, 判为阴性反应。注意:为了确证结果, 所有的阳性样品重复检测1次。
1.2.4 野毒抗体的检测
被检血清的稀释:用样品稀释液按1︰20的比例稀释待检血清。每份样品更换吸嘴, 在样品加到酶标孔内之前混合均匀, 静置, 待检。
野毒抗体ELISA的检测程序:参照伪狂犬病病毒抗体试剂盒 (gB-ELISA) 检测程序进行。
结果判定:S/P比值小于0.4的样品判为伪狂犬病病毒抗体阴性;S/P比值大于或等于0.4的样品判为伪狂犬病病毒抗体阳性。
在该试验中定为阳性的样品应再用伪狂犬病病毒抗体确认试剂盒来进一步证明其阳性的真假。
2 结果
2.1 疫苗免疫抗体的检测结果
2.1.1 接种疫苗前和接种疫苗后母猪疫苗免疫抗体的检测结果
各组母猪接种前和接种后10, 20, 30, 60, 120, 150天母猪疫苗免疫抗体检测结果见表2。
2.1.2 母猪接种疫苗后所产仔猪抗体的检测结果
各组母猪分别于产前10天接种, 所产仔猪1日龄 (初生) 和10, 30, 60, 80日龄抗体的检测结果见表3。
2.2 伪狂犬病病毒野毒抗体的检测结果
2.2.1 接种疫苗前和接种疫苗后母猪伪狂犬病病毒野毒抗体的检测结果
各组母猪于接种疫苗前和接种疫苗后150天的伪狂犬病病毒野毒抗体的检测结果见表4。
2.2.2 母猪接种疫苗后所产仔猪伪狂犬病病毒野毒抗体的检测结果
母猪接种疫苗后所产仔猪不同时间的伪狂犬病病毒野毒抗体的检测结果见表5。
3 讨论
3.1 母猪产前10天接种两种猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒苗对其所产仔猪抗体的影响
由表2、表3可知:产前10天免疫接种B苗组母猪免疫后10天 (产期) 母猪抗体阳性率为86.7%, 免疫后20天母猪抗体阳性率为93.3%, 30～120d达到峰值。其所产仔猪10～60日龄抗体达93.3%以上, 推断母猪若提前至产前20天免疫, 其仔猪出生时获得的母源抗体水平可能会更高, 并能保证仔猪在哺乳前期通过初乳获得良好的被动免疫。由表2、表3还可知免疫接种A苗组结果也同样显示此种情况, 但免疫接种B苗的免疫效果较A苗好。
综上所述, 母猪接种B苗和A苗免疫后20天母猪抗体阳性率都达到或接近峰值时, 此时所产的仔猪抗体阳性率较高, 其母源抗体对仔猪的保护效果较好, 且持续时间可至60日龄左右。
3.2 母猪产前10天接种两种猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒苗对其所产仔猪实际抗感染的影响
由表4、表5可知:产前10天免疫接种B苗组母猪免疫前伪狂犬病病毒野毒抗体检测阳性率为26.7%, 免疫接种后150天时母猪伪狂犬病病毒野毒抗体检测阳性率下降为13.3%, 其所产仔猪10～60日龄猪伪狂犬病病毒野毒抗体检测阳性率为0, 持续时间可达60天。产前10天免疫接种A苗组母猪免疫前伪狂犬病病毒野毒抗体检测阳性率为26.7%, 伪狂犬病病毒野毒感染处于较高水平, 免疫接种后150天时, 母猪伪狂犬病病毒野毒抗体检测阳性率下降为20%, 其所产仔猪10日龄、60日龄时猪伪狂犬病病毒野毒抗体检测阳性率为6.7%、13.3%。
综上所述, 母猪产前接种B苗或A苗是必要的。免疫接种A苗或B苗都能显著减少母猪伪狂犬病毒野毒的排放, 降低感染其他猪只的机会, 提高对仔猪伪狂犬病病毒野毒感染的保护率, 控制仔猪伪狂犬病毒野毒的感染。但是, 使用B苗抗猪伪狂犬病病毒野毒感染的效果较A苗好, 疫苗保护力强。
3.3 目前临床疫苗的选用
有学者通过对国内4种主要的灭活苗免疫效果进行监测, 发现猪伪狂犬灭活苗免疫效果参差不齐, 难以诱导有效的体液应答反应[4]。调查结果显示, 目前多数猪场使用传统弱毒疫苗, 虽然在伪狂犬病防制方面有较强的免疫效果, 但是, 其主要毒力基因没有缺失, 故其毒力有很大返强的可能性, 导致疾病的流行;而且, 未经充分致弱或过度致弱的疫苗株, 不仅不能诱导满意的免疫保护反应, 反而有可能引起疾病及免疫抑制。此外, 传统弱毒疫苗还可建立潜伏感染, 并存在散毒的可能, 在部分接种猪血清中虽然存在中和抗体, 但其排毒期却可持续数年, 可见盲目使用弱毒疫苗不可取, 也不安全。许多国家已禁止使用传统弱毒疫苗, 而以基因缺失疫苗取而代之。许多试验证明, 基因缺失疫苗对猪是安全的, 并能提供有效的保护。
参考文献
[1]白挨泉, 王晓清, 甄劲松, 等.广东部分集约化猪场猪伪狂犬病毒野毒感染的血清学调查[J].中国畜牧兽医, 2005, 32 (3) :55-57.
[2]母安雄, 谷根林, 蒋建一, 等.规模猪场主要疫病抗体水平监测及免疫效果分析[J].畜牧与兽医, 2002, 34 (3) :29-30.
[3]沈强, 卫秀余, 金爱华, 等.伪狂犬病弱毒株的分离鉴定及生物学特性的研究[J].中国兽医杂志, 2000, 26 (9) :5-8