带状疱疹病毒

带状疱疹病毒（精选10篇）

带状疱疹病毒 篇1

摘要：目的 观察抗病毒联合清开灵治疗带状疱疹的疗效。方法 将57例带状疱疹患者分成两组, 观察组在抗病毒的基础上加用中药制剂清开灵注射液, 对照组常规抗病毒治疗。观察两组疗效。结果 观察组带状疱疹有效率、治愈率显著提高, 症状、病程、结痂时间等明显缩短。结论 常规抗病毒联合清开灵治疗带状疱疹可缩短病程, 提高治愈率, 且方便简单, 值得社区基层医院推广使用。

关键词：带状疱疹,抗病毒,清开灵,治疗结果

带状疱疹是春季最易流行的一种病毒感染性皮肤病, 由水痘-带状疱疹病毒感染后, 潜伏在体内再发, 造成沿神经支配的皮肤区出现带状排列的成簇疱疹, 伴随神经痛。儿童、老人及免疫力低下的人为高危人群。侵犯胸腰部位的带状疱疹占本病发病率的60%以上, 因此民间把这种病称作“串腰龙”, 文献上叫“缠腰火丹”。 这种病还可侵犯头、面、耳及上下肢等部位。由于这种病毒有亲神经的特点, 发病总是沿神经走向, 呈条带状, 故称“带状疱疹”。皮损为沿神经分布的带状成群簇集的粟粒状绿豆大小的丘疱疹, 迅速演变为水疱。自觉症状多为疼痛, 成年患者在皮疹出现时或消失后常伴有神经痛, 年老体弱者本病愈后易遗留严重的神经痛, 可持续数月甚至更长时间[1]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取某社区门诊2010—2011年就诊的带状疱疹患者57例, 其中, 男37例, 女20例, 年龄11～60岁, 平均47.3岁。其中疱疹发生在胸腰部36例, 四肢17例, 头面部4例。病程1～21d, 平均9d。随机分为观察组 (30例) 和对照组 (27例) 。两组患者性别、年龄、病变部位、病程等具有可比性。

1.2 方法

两组均以抗病毒治疗为主, 5%葡萄糖注射液+阿昔洛韦粉针剂抗病毒治疗;维生素B1注射液+维生素B12注射液营养神经, 可视病情多肌注一段时间;局部用炉甘石搽剂涂抹, 有收敛止痛的作用。观察组辅以清开灵注射液+5%葡萄糖注射液, 7d为1个疗程。有感染者加用抗生素, 克林霉素+0.9%氯化钠注射液。神经痛剧烈患者给予芬必得胶囊。

1.3 疗效判定标准

依据国家中医药管理局发布的《中医病症诊断疗效标准》[2]。痊愈:疱疹全部结痂或消退疼痛消失;显效:疱疹基本结痂, 疼痛明显缓解, 且无新增疱疹;有效:疱疹基本消退, 有轻微疼痛及少量新发疱疹;无效:有新发疱疹且疼痛未减轻。

1.4 统计学方法

计量资料以$(\overline{x}\pm \text{s})$表示, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组疗效比较差异有统计学意义 (P<0.05, 见表1) 。治疗8d后, 观察组的体征、症状消退时间较对照组明显缩短, 差异有统计学意义 (P<0.05, 见表2) 。

3 讨论

带状疱疹是春季最易流行的一种水痘-带状疱疹病毒感引起的染性皮肤病, 幼儿时期感染后可以发生水痘或长期潜伏于神经后根或神经元内, 当精神紧张、失眠、劳累等引起机体免疫功能减退时可复发, 造成沿神经支配的皮肤区出现带状排列的成簇疱疹, 伴随神经痛。机体免疫功能的紊乱或缺陷是带状疱疹发病的主要诱因[3]。为社区常见病、多发病之一。由于治疗不及时或方法不得当, 常发生带状疱疹后遗神经痛 (PHN) , 特别60岁以上老年患者PHN的发生率高达50%～75%。老年带状疱疹的好发部位依次为胸部、面部三叉神经、腰骶部及四肢。且疱疹症状不明显, 多数以局部疼痛为首发症状。极易被误诊、漏诊。带状疱疹应做到早期诊断、早期治疗, 避免遗留神经痛的后遗症。其治疗原则是抗病毒、减少疼痛、预防继发感染、缩短病程。中医将带状疱疹称为“蛇串疮”、“缠腰火丹”等。主要是由于外感温热毒邪或内伤肝郁化火, 湿热火毒蕴积肌肤, 阻碍经络, 气血不通所致。治疗方面以“热者清之, 实则泻之”为原则, 以清热凉血、泻火解毒通络止痛为法[4]。清开灵注射液的主要成分为牛黄、水牛角、金银花、黄芩、栀子等的提取物。现代药理研究表明, 牛黄、黄芩、金银花、栀子都具有清热解毒、镇痛、抗炎、抗病毒的作用[5,6]。金银花对疱疹病毒有抑制作用[7]。在西医抗病毒治疗的基础上, 加用清开灵注射液可明显的抑制疱疹扩散, 缩短病程、减少神经痛后遗症的产生。清开灵注射液使用方便, 价格经济, 而且在基层社区中应用较广泛, 因此, 抗病毒制剂联合清开灵注射液治疗带状疱疹值得基层社区医疗机构推广应用。

参考文献

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单纯疱疹病毒性脑炎研究进展 篇2

【关键词】单纯疱疹病毒 单纯疱疹病毒性脑炎 中枢神经系统感染

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0674-01

1、发病机制 HSE的发病机制尚未完全清楚，其中HSV的病毒蛋白基ICP34.5在HSE中的作用日益受到重视，研究发现病毒基因产物ICP34.5产物主要通过抑制内源性干扰素（The type I INF response）影响HSV的神经毒性，HSV-1ICP34.5通过与四种细胞蛋白结合抑制内源性干扰素的合成，分别是Beclin-1[1]、TANK结合激酶1（tank-binding kinase 1，TBK-1）[2]、蛋白激酶（protein phosphatase 1α，PP1α）及翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）[3]；此外凋亡与抗凋亡机制[4]及其介导的氧化损伤[5]均在HSE的发病中起重要作用。

2、实验室诊断技术 由于HSE具有病情重、死亡率高，能造成严重神经系统损害的特点，故HSE的早期诊断尤为重要。脑脊液的病原学检查对确诊很有意义。①HSV抗原的检测 主要检测方法为ELISA，若脑脊液中抗原为阴性则可以排除HSE。②HSV抗体的检测 抗体检测的方法主要包括中和试验，补体结合试验及ELISA法等，其中ELISA法的敏感性特异性最强可达90%。其特异性为IgM、IgA升高，第二、三次测定脑脊液抗体滴度比第一次升高4倍以上或出现血清转化，此外，血清和脑脊液抗体滴度比小于20也提示单纯疱疹病毒脑感染[6]。③HSV-DNA的检测 近年来，PCR技术的广泛应用不仅使HSE的早期诊断成为可能，由于PCR方法准确敏感，使之成为HSE诊断的金标准；单纯疱疹病毒DNA在单纯疱疹病毒性脑炎发病后1天即可在CSF中检测出，在抗病毒药物治疗的最初5天，CSF中的单纯疱疹病毒DNA可能会升高，这或许是由于在抗病毒药物的干扰县，病毒复制产生许多小片段NDA所致，而在抗病毒药物治疗6-21天后，CSF中病毒DNA开始逐渐被消除，大部分病人在治疗结束前几乎不能检测。而由于CSF中抗病毒抗体在其DNA清除后仍持续存在，因此抗体的血清学方法了在回顾性诊断中发挥作用[7]。

3、临床诊疗 ①抗病毒治疗 阿昔洛韦是目前公认治疗单纯疱疹病毒性脑炎的首选药物，其抗病毒谱广，50%可通过血-脑屏障，对正在细胞内复制的病毒有抑制其DNA合成的作用[8]，主要通过一下两种方式抑制病毒复制：一是通过干扰病毒DNA多聚酶抑制病毒的复制；二是在DNA多聚酶的作用下，与增长的DNA链结合，引起DNA链的延伸中断；由于预后与开始诊疗时间有很大关系， HSE时，应立即予阿昔洛韦治疗。但近年来，由于对阿昔洛韦耐因此一旦临床怀疑药的HSV已经从复发性生殖器疱疹、癌化疗和骨髓移植等患者中分离出来，使得阿昔洛韦抗病毒治疗单纯疱疹病毒性脑炎面临新的挑战。②免疫治疗 干扰素是细胞被病毒感染后产生的一组高活性糖蛋白，抗病毒活性广而对宿主細胞的损害极小，此外还具有免疫调节功能，此外Wintergerst等使用合成人类INF-a B/O联合阿昔洛韦治疗HSE发现INF-a B/O可增加阿昔洛韦疗效[9]。静脉大剂量免疫球蛋白治疗HSE，可能与免疫抑制和免疫调节双重作用有关，Dalai证实人类免疫球蛋白IgG可预防和治疗HSV1的感染、潜伏和复发，作为增加阿昔洛韦治疗HSE时有时效性[10]。转移因子可将正常淋巴细胞致敏而转化为具有免疫功能的淋巴细胞。③肾上腺皮质激素 由于皮质类固醇激素具有一定的免疫抑制作用，可能会导致病毒的复制和扩散[11]，因此临床治疗上仍有争议。陈兆红等对小鼠的实验证实糖皮质激素联合阿昔洛韦治疗小鼠单纯疱疹病毒性脑炎较单纯抗病毒治疗生存率显著提高，临床症状减轻[12]。④全身支持治疗 主要包括维持营养、保持水电解质平衡、保持呼吸道通畅、预防和控制继发感染；对于高热、抽搐、精神症状和颅内压高的患者，可分别予降温、抗癫痫、镇静和脱水降颅压等治疗。

参考文献

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-4280-3-4.

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带状疱疹病毒 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年3月至2012年1月将来我院收治的带状疱疹患者150例随机分为两组, 其中治疗组75例, 年龄32～78岁, 平均55岁, 病程2d～3.5周;对照组76例, 年龄29～79岁, 平均54岁, 病程3d～4周。两组病例在病情、年龄、病程等方面均无明显差别, 有可比性。

1.2 治疗方法

1.2.1 西米替丁联合病毒唑治疗 (治疗组)

(1) 药品选择。一是选择西米替丁注射液, 化学名称为:N’-甲基-N”-[2[[ (5-甲基-1H-咪唑-4-基) 甲基]硫代]乙基]-N-氰基胍。分子式:C10H16N6S, 相对分子质量:252.34;批准文号:国药准字H32026751;生产厂商:南京先声东元制药有限公司。二是选择利巴韦林注射液 (病毒唑注射液) , 化学名称为:1-b-D-呋喃核糖基-1H-1, 2, 4-三氮唑-3-羧酰胺。分子式:C8H12N4O5, 相对分子质量:244.21;批准文号:国药准字H20056078;生产厂商:陕西省秦光制药厂。 (2) 治疗。西米替丁600mg+生理盐水250ml静滴, 1次/d, 病毒唑600mg+生理盐水250ml静滴, 1次/d。

1.2.2 病毒唑治疗 (对照组)

仅采用病毒唑注射液治疗, 药物使用剂量与用法同治疗组。

1.3 疗效评定标准

带状疱疹的疗效标准主要有:显效, 有效, 无效。显效:皮疹大部分消退, 局部疼痛有明显减轻;有效:皮疹有部分消退, 疼痛减轻;无效:皮疹仅有小部分消退, 疼痛无减轻。显效与有效两者的总和算为总有效率。

1.4 安全性评价

在此次治疗过程中患者如果出现不适反应或者客观检查指标如果出现异常变化, 都需要进行详细的记录, 并且要如实的记录发生不良反应时的表现、发生的时间、持续的时间、应对的措施等, 实事求是地检查异常者出现的情况并且需要追踪至其恢复正常为止。主要检查指标内容包括血常规 (Hb+WBC+DC+P1) 、肾功能 (Bun+Cr) 、尿常规、肝功能 (ALT+AST+ALP) , 治疗前和治疗后分别进行检测1次。

1.5 统计学处理

观察两组数据进行结果并比较, 进行卡方检验, 应用SPSS 16.0统计分析 (SPSS的全称是:Statistical Program for Social Sciences) 来完成数据的统计处理。若P<0.05, 说明有显著差异, 具有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效评定结果

见表1。

观察两组数据并进行结果比较, 卡方检验, 应用SPSS16.0软件完成对数据的统计学处理。*P<0.05, 说明有显著差异, 有统计学意义。

2.2 安全性评价

治疗组全部带状疱疹患者接受西米替丁联合病毒唑治疗后, 有4例发生不良反应, 其中出现腹胀、腹泻、口干反应3例, 出现有头晕、头痛1例, 不良反应发生率为5.33%, 经过分析可能与治疗的药物有关, 对症治疗后不良反应很快消失。患者在治疗前后的体温、呼吸、肝肾功能、心率及收缩压、舒张压、尿、血均无明显改变。

3 讨论

带状疱疹病原体为呈长方形或球形的DNA病毒, 即水痘-带状疱疹病毒[2], 该病毒具有亲神经性。近年来研究证实, 本病毒原发感染为水痘。病毒通过呼吸道感染侵入体内, 以潜伏形式存在脊神经后根神经节或其它发病部位的神经细胞中。这种病毒平时可不发病, 当存在诱发因素如机体发热、系统性疾病造成免疫力低下时, 病毒可被激活, 并大量繁殖, 使受累的神经节发生炎症或者坏死。同时病毒可沿神经通路向下传递, 到达神经所支配的皮肤后, 皮肤就会发生节段性水疱, 导致神经受到损伤, 从而使感觉出现异常, 感觉过敏或神经痛。该病发病后终身免疫, 且极少复发。带状疱疹在临床常表现为数个簇集疱疹群, 并排列成带状, 沿周围神经分布, 多呈单侧性, 一般不会超过体表的正中线, 常呈不规则带状分布, 多见于腰背、胸腹、颜面部, 局部皮肤有灼热感, 并伴有神经痛。该病在发病之初, 主要表现为全身疲倦无力, 食欲不振, 轻度发烧, 然后很快发病部位就感觉灼热, 跳着疼痛。如果发生在腰部或胸部, 常被误诊为心脏病或急腹症等。西米替丁是的H2受体的拮抗剂, 主要作用于壁细胞上的H2受体并起竞争性抑制组胺作用, 其不仅可以抑制基础胃酸分泌, 还抑制由食物、咖啡因、组胺胃泌素与胰岛素等刺激所引起的胃酸分泌。近年来发现西米替丁还具有止痛止痒, 抗病毒, 改善机体免疫功能的作用, 其止痛止痒作用与西米替丁的药理作用相关, 因为西米替丁是一种H2受体的拮抗剂, 它能够抑制细胞释放组胺, 从而使组胺释放减少, 由此可缓解组胺所导致的过敏反应, 从而可减轻带状疱疹过敏引起的不适症状;其也可改善机体免疫功能, 它能增强人体 (特别是细胞免疫功能受到抑制的患者) 由细胞介导的免疫反应[3]。机制与也其抗组胺作用有关, 组胺能够诱导T抑制细胞活性, 从而抑制了T淋巴细胞的增殖和转化, 最终抑制迟发型超敏反应和细胞毒作用的产生。因此, 西米替丁具有抗病毒作用和免疫调节的新用途。病毒唑即利巴韦林为抗广谱病毒药, 其并不改变病毒吸附、侵入和脱壳, 也不诱导干扰素的产生。该药进入被病毒感染的细胞后可迅速磷酸化, 其产物为病毒合成酶的竞争性抑制剂, 可抑制流感病毒RNA聚合酶、肌苷单磷酸脱氢酶和mRNA鸟苷转移酶, 从而导致细胞内的鸟苷三磷酸减少, 损害病毒RNA和蛋白质的合成, 使病毒的复制与传播受抑[3]。临床上采用西米替丁联合病毒唑治疗带状疱疹的治疗效果比较显著, 尽管对照组仅采用病毒唑对治疗带状疱疹也具有73.34%的有效率, 但治疗组的有效率 (90.67%) 明显高于对照组 (73.34%) , 由此可见差异显著, 具有统计学意义 (P<0.05) 。本文介绍采用西米替丁联合病毒唑治疗带状疱疹收到了较为理想的效果。由于西米替丁和病毒唑联合作用可增强抗病毒作用, 西米替丁免疫调节作用和病毒唑抑制病毒合成作用相辅相成, 不仅增加了治疗带状疱疹的疗效, 还可缩短神经痛的时间, 从而使神经痛后遗症发生的概率减小。且未见明显副作用发生。总之, 西米替丁联合病毒唑增强了两种药的抗病毒作用, 在治疗带状疱疹时起效快, 疗程短, 疗效显著, 不良反应轻微并且可逆, 止疱时间、结痂时间、止痛时间都短于单用病毒唑。本文表明联合用药效果更佳, 其在临床上的效果和作用会越来越重要, 值得推广。

参考文献

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带状疱疹病毒 篇4

【摘要】运用三仁汤加减治疗单纯疱疹病毒性角膜炎，效果明显。现总结出治疗单纯疱疹病毒性角膜炎重在宣畅气机、清热利湿临证验案二则，为三仁汤的临床应用提供参考。

【关键词】三仁汤；单纯疱疹病毒性角膜炎；聚星障

【中图分类号】R772.21 【文獻标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0047-01

单纯疱疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK）是由单纯疱疹病毒（HSV）感染所导致的一种严重的感染性眼病，是目前主要的致盲眼病之一，大约25%的患者在2年内复发一次，若反复发作，会严重危害视功能[1]。中医中的“聚星障”是因外感风邪，挟热化火，致黑睛上始生细小星翳，或为串珠、树枝、地图样，同时伴有涩疼、畏光、流泪、视力下降的眼病，与西医学HSK相类似[2]。目前西药最常用的是阿昔洛韦、更昔洛韦和细胞因子，然而在抗HSK复发方面并没有有效药物。近年来，传统中医药在治疗顽固性HSK表现出一定的优势，目前用于治疗的中药方剂主要有解毒明目方、清热解毒汤、玉屏风散等，通过提高机体抗病毒能力来治疗单纯疱疹病毒性角膜炎[3]。但根据《中医眼科常见病诊疗指南》[2]，“黑睛星翳，反复发作，缠绵不愈”等症状属于聚星障湿热蕴蒸的范畴，理应化湿清热。

笔者临床治疗此病也常从湿热入手，多用三仁汤加减，效果颇佳，现摘取笔者临床诊治单纯疱疹病毒性角膜炎案例两则，以飱读者。

1 验案举隅

案例一：王某，男，45岁，主诉左眼红痛，视物模糊反复发作5年，于2014年3月7日初诊，患者5年来左眼反复红痛，视物不清，曾在多家医院诊断为“单纯疱疹病毒性角膜炎”，给予0.25%氯霉素滴眼液、1%阿托品、结膜下注射庆大霉素、理疗等治疗效果差，病情反复，遂求治于余，症见：面色萎黄，头重，溲黄便溏，口粘，舌暗红，苔黄腻，脉濡，查视力右眼0.8，左眼0.1，右眼（-），左眼睫状充血、角膜树枝状混浊、KP（+）、房闪（++），余窥不清。西医诊断：角膜炎；中医诊断：聚星障（风湿夹热），治以清热利湿，活血化瘀退翳，方用三仁汤加减。处方杏仁、白蔻仁、半夏、淡竹叶各10g，桃仁、红花、肿节风、蜂房、橘红各15g，薏苡仁20g。每日一剂，水煎服。二诊：服7剂后病情好转，左眼充血明显减轻，刺激症状基本消失，舌淡、苔薄白，脉缓，故在原方基础上加青葙子、密蒙花各15g，又服7剂，眼部充血症状及刺激症状彻底消失，视力恢复良好。随访半年无复发。

按：湿热蕴蒸，邪毒留恋于黑睛而致聚星障。前人尝以“如油入面，难分难解”来形容湿热蕴蒸症候之复杂和顽固性，认为湿邪非燥之不能化，热邪非清之不能解，故治疗当以三仁汤清热化湿。本方中，杏仁、白蔻仁、薏苡仁开上宣中利下，芳香化浊，淡竹叶、薏苡仁淡渗利湿，半夏、橘红健脾燥湿，桃仁、红花活血化瘀，肿节风、蜂房祛风除湿，后期加入青葙子、密蒙花以加强清热退翳明目之功。

案例二：刘某，女，62岁，2015年3月7日来诊，右眼球结膜反复发红，黑睛生白翳。在外院诊为角膜炎，先后以抗病毒药液及激素类药物滴眼治疗，红赤未消，仍有涩痛，畏光流泪而须带眼罩。来诊症见神疲身重，右眼红肿不适，分泌物较多，口苦，小便黄，大便溏，舌红苔黄腻，脉濡，查视力：右0.4，左1.2。右眼球结膜睫状充血（++），中度刺激症状，角膜中下方有点状及片状灰白色混浊，荧光素染色（+）。西医诊断：右眼单纯疱疹性角膜炎。中医诊断：聚星障（湿热蕴结），治以清热利湿，明目退翳，处方为三仁汤加减，具体方药为：杏仁、白蔻仁、厚朴、法夏、滑石各10g，枸杞、蒺藜、密蒙花、蜂房、蝉蜕各15g，薏苡仁20g，合欢花30g。每日一剂，10剂水煎服。二诊：服10剂后，患者自觉症状明显好转，刺激症状消失，睫状充血轻度，角膜萤光素染色浅，右眼视力恢复至0.8。为防眼病复发，守原方再服10剂以巩固疗效。后随访一年半未见复发。

按：本案患者感受湿热邪毒蕴积风轮，病程反复，胶着难愈，而见黑睛受腐生出细小星翳，伴神疲身重，口苦便溏，脉滑等症，故以三仁汤化湿清热、通利三焦为主，加以合欢花、蒺藜、密蒙花清热退翳，枸杞、蜂房、蝉蜕退翳明目。诸药配合，可使三焦宣畅、湿热得泄、白翳得除，诸症获愈。

2 讨论

三仁汤出自《温病条辨》，由“杏仁五钱，飞滑石二钱，白通草二钱，白蔻仁二钱，竹叶二钱，厚朴二钱，生薏苡仁六钱，半夏五钱”组成。现代名医秦伯未先生对三仁汤理解颇妙，其认为方中杏仁辛宣肺气，以开其上；蔻仁、厚朴、半夏苦辛温通，以降其中；苡仁、通草、滑石淡渗湿热，以利其下，共奏“宣上、畅中、渗下”之功，以化湿清热、通利三焦，是治疗湿温初起，邪在气分，湿重于热的常用方剂[4]。三仁汤用于治疗眼科疾病的经验较少，然而笔者却常用此方治疗单纯疱疹病毒性角膜炎，效果颇佳。笔者认为其临床辨证“眼目”为：“眼睛沙涩疼痛，畏光流泪，抱轮红赤或红赤不显；黑睛骤起翳障，如针尖或称星大小，色灰白或微黄，伴有口苦，头重，便溏，便后不爽，大便黏腻，舌苔黄腻。”如具上述诸症，确为湿热阻滞之证型，投以三仁汤加减，确能取得良好疗效。

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锦鲤疱疹病毒的鉴定及预防思考 篇5

锦鲤疱疹病毒主要由病毒感染引起, 是一种普通的框镜鲤由病毒感染之后, 具有高度传染性, 一旦感染就会致死。该病主要出现在春秋季节, 水温为18~28℃之间, 这水温是病毒流行最佳水温。随着时间的推移, 病毒在低温环境下蔓延的趋势加强。KHV感染范围比较狭小, 只会感染鲤鱼、锦鲤以及一些普通的鱼种。同锦鲤鱼种类似, 都喜欢在合适的水温下生长, 也不会感染上疾病。一些成鱼和幼鱼就会容易感染。成鱼相对幼鱼而言, 死亡率较高。从2003年以来, 我国东北地区的普通锦鲤感染病毒的概率越来越高, 死亡率高达90%。进行PCR检测发现KHV呈阳性。KHVD病毒在我国锦鲤和匡锐鲫蔓延较为严重, 导致我国经济损失。

1 病毒效价测定及动物感染试验

1.1 毒价测定

把病毒液进行稀释, 稀释量为10倍之上, 将其分别接种入96孔板下进行培养, 获得锦鲤单层细胞, 每个稀释度再进行8孔重复。放置在22℃下进行培养, 安置上阳性对照孔, 对没有稀释的细胞毒以及阴性对照孔分析, 记录下CPE, 再使用Karber法计算出TCID50效价。

1.2 动物感染试

使用的是体积较轻的健康锦鲤作为实验对象, 数量为30条, 在实验室里观察了28d, 没有发现任何病症。将病毒培养液注射到实验鱼体内, 数量为20条, 每一条注射量为1m L, 水温维持在20~24℃之间。另外, 一组数量为10条的;锦鲤作为对照鱼, 考试观察实验现象。临床表现出, 在有症状的鱼组中提取出了DNA病毒, 进行PCR鉴定。同时, 病毒锦鲤的组织进行切片检查。

1.3 PGR鉴定分析

1.3.1 对病毒基因开展鉴定工作

把ORF25基因进行PCR拓增实验, 得出的产物胶电泳检测结果, 发现特异片大量的衍生而出。将其连接到p MD]8-T载体中, 进行科学的鉴定。

1.3.2 序列测定和分析

将测序结果同KHV序列结果对比, 结果显示出, 在OQF25基因中, 有病毒的侵蚀, 病毒类型为KHV-1, 同源病毒符合度高达99.9%, 锦鲤类型定位为KHVcj。氨基酸序列分析显示:当KHVcj氨基酸位置发生变动后, 则有一个稳定的突变位点存在。实验显示, 当期在第239位时, 突变从E变化为K。氨基酸抗原性分析得出, 该距离的抗原性水平高。

1.4 病毒毒价测定

开启病毒毒价测定, 经过检测发现, KHVcj第2代细胞培养物TCID效价为10。当锦鲤感染上病毒之后, 鱼活动减少, 表现为反应迟钝, 食欲不振, 鱼表面皮肤泛白, 有斑点。体表黏液分泌量增多, 有些病鱼腹部底部有出现迹象。随着时间推移, 白色斑点增多。随着感染时间增加到8d开始死亡。实验发现, 当感染病毒在30d内, 发病率达100%。而, 对照鱼组没有任何变化。进行PCR鉴定发现, 取出了临床症状实验鱼之后, 锦鲤肾脏组织被病毒破坏, PCR扩展增大, 而849bp特异性目的片段增多。在病毒感染到3d之后, 实验鱼的鳃薄片急速减少, 炎症扩散, 扩散到整个鱼体周边, 整条鱼的血管充满血。

2 锦鲤疱疹病毒思考

研究建立适宜于锦鲤养殖场新进厂区苗种、亲鱼、苗种和养殖场养殖环境中疱疹病毒的分子检测技术体系, 提高了养殖场苗种病毒检疫能力。为了有效预防病毒发生, 需做好预防工作。

2.1 在生态防控技术层面

加深对生态防控理念的认识, 在养殖进程中, 借助微生态剂, 全面开展养殖水体体制监控。养殖区采用生态防控措施。这里的生态指的是, 池塘水体表面同大气接触的横截面, 这个横截面是池塘鱼类交换气体重要场所, 是进行呼吸通道。同时, 这个界面也是水产动物的肠道, 这是个形象的比喻, 池塘内的锦鲤的呼吸和吸收, 都是经过该界面实现, 是能量转接平台。另外, 也是气-水界面关注藻相。从鱼类病毒感染情况上看, 这些病毒可以分类为应激性病毒、营养性病毒等等。在生态防控体系中, 每一道体系落实到位之后, 才能有效地防止鱼类受到病毒侵害。一般而言, 生态防控中的“控”, 是针对水生动物健康而言的, 是控制水生病毒有效防道。

2.2 引入中草药消毒

众所周知, 中草药具有天然、高效以及无毒副作用功效, 不仅能够起到抵抗病毒功效, 还能调节动作机体免疫能力。提高动作免疫功能, 激发鱼类的抗应激作用。项目组基于分析发现, 引入大黄蒽醌及其大黄素中药材提取物, 能对水体中的污染物进行清理, 提升感染效应。另外也可以建立起防御消毒管理制度, 健全养殖管理体系。从对锦鲤材料的引入, 换水以及疾病预防等等层面着手分析。定期开展鱼塘换水工作, 提升防御效应。同时, 我国水产科技研究院需加快研究力度, 针对性建立起锦鲤疱疹病毒病防控关键技术研究与示范”区, 对病毒出现、传播、控制进行研究。

2.3 建立起一套科学养殖体系, 制定出养殖规范

在规范下开展养殖, 能获得良好养殖效益。病毒的发生是可控的, 在平时养殖活动进行中, 加强观察, 对应锦鲤疱疹病毒病出现特征分析, 确定出锦鲤疱疹病毒病后, 需加快选择应对措施, 将损失控制住。一般而言, 病毒的发生非常危险的, 平日的养殖预防工作要落实到位, 做好换水, 预防工作。这在一定程度上, 有效杜绝病毒的发生, 为更好的养殖锦鲤开辟健康环境, 为获得良好的养殖经济收入奠定基础。当下, 养殖业将锦鲤养殖作为首要养殖对象, 那么对锦鲤疱疹病毒病诊断和预防显得至关重要, 需加强控制, 提升养殖经济效益。

3 结束语

锦鲤养殖是养殖业发展趋向, 但是锦鲤疱疹病毒对锦鲤带来的危害较大。开展养殖业时, 需做好锦鲤锦鲤疱疹病毒诊断工作, 及时采取有效应对措施, 将病毒控制住, 提升养殖业生产效应。

参考文献

[1]周井祥, 李新伟.锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析[J].水产学报, 2011, 35 (12) :1780-1786.

[2]王好, 王秋举锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF126基因的原核表达及免疫试验研究[J].中国兽医杂志, 2014 (12) :70-73.

[3]孟庆峰.锦鲤疱疹病毒Taq Man荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用[J].吉林农业大学学报, 2012, 34 (3) :339-342.

[4]尹伟力.液相芯片技术同时检测真鲷虹彩病毒和锦鲤疱疹病毒方法的建立[J].水产科学, 2014, 33 (3) :157-162.

疱疹病毒性青光眼概述 篇6

1 病原学

疱疹病毒家族包括单纯疱疹病毒 (herpes simplex virus, HSV) 、水痘带状疱疹病毒 (varicella-zoster virus, VZV巨细胞病毒 (cytomegalovirus, CMV) 和EB病毒。

HSV分为Ⅰ、Ⅱ两型, Ⅰ型主要累及腰部以上的皮肤、黏膜组织;Ⅱ型主要引起生殖器疱疹。超过90%的成年人携带Ⅰ型单纯疱疹病毒, 一般情况下并不发病。其病毒颗粒可存在与虹膜、房水及角膜。一旦病毒被激活, 在眼部可引起睑缘炎、结膜炎、角膜炎及葡萄膜炎, 并可以引起继发性高眼压或青光眼[1~3]。VZV感染呈双相型年龄分布。儿童感染可引起水痘, 当水痘痊愈后病毒可长期潜藏在感觉神经节内, 由于细胞免疫随时间逐渐减退, 因此到老年时形成第二个发作高峰。三叉神经眼支是三支中最长受累的分支, 一旦被激活, 可引起睑缘炎、结膜炎、巩膜炎、角膜炎、前葡萄膜炎、玻璃体炎和视网膜炎[2]。CMV感染非常常见 (40岁以上的成年人中80%~85%感染) , 但免疫功能正常的人极少出现症状[4~6]。免疫抑制者则可能出现类似于单核细胞增多症的表现, 在眼部主要表现为视网膜炎。EB病毒与眼部疾病的关系未见报道。

2 临床表现

2.1 早期表现

疱疹病毒在眼部可引起角膜炎和前葡萄膜炎, 且二者常伴发。疱疹病毒性角膜炎可表现为角膜上皮炎、角膜基质炎和角膜内皮炎。其中角膜内皮炎分为盘状、弥漫性和线性的。当病毒侵犯虹膜基质和/或闭塞性血管炎, 虹膜会出现萎缩, 而萎缩的形态可以在一定程度上提示为何种疱疹病毒感染, 如扇形萎缩最常见于HSV葡萄膜炎。疱疹病毒性前葡萄膜炎常单侧发病, 慢性病程易复发, 常伴有眼压升高、角膜炎、内皮炎、基质虹膜萎缩[7,8]。

HSV和VZV所引起的角膜炎可分为两型:α外生型和β内生型。前者先累及角膜上皮表层, 后侵犯深层组织。后者炎症始于角膜内皮层, 逐渐累及实质层, 到炎症后期可侵犯上皮层。当机体免疫功能下降时, 疱疹病毒被激活、繁殖, 遂引起组织水肿、变性[9~11]。

带状疱疹性角膜炎往往难与单疱性角膜炎相鉴别。前者常引起基质层及前葡萄膜病变, 基质层混浊往往较重, 后者则常累及角膜上皮。皮肤疤疹为特征性病变, 应仔细询问以往有无单侧颜面皮疹病史。另外还可以对结膜囊分泌物或皮疹水泡液体作病毒分离, 测定血清抗体以及用荧光抗体染色法进行鉴别。带状疤疹性角膜病变累及基质深层时往往并发较严重前葡萄膜炎, 而且容易复发。

一般情况下, 由巨细胞感染所引起的视网膜炎、前葡萄膜炎主要见于免疫缺陷的患者。然而免疫功能正常者患巨细胞性前葡萄膜炎的病例也有报道, 共同特征为单侧、慢性、复发性的前葡萄膜炎病程, 合并有角膜后沉着物 (KP) 和局部角膜混浊、水肿 (角膜内皮炎) 。眼压升高在葡萄膜炎的活动期发生, 2例 (总7例) 仅用激素治疗有效, 5例需要抗青光眼药联合治疗或口服缬更昔洛韦, 其中1例须手术治疗以控制眼压[12]。

2.2 高眼压/继发性青光眼

病毒性前葡萄膜炎最常见的并发症就是继发性青光眼[13]。高眼压与疱疹病毒性炎症的关系已有不少报道。Van der Lelij A等报道, 约90%患者在病毒性虹膜炎的活动期或发生眼压升高, 由于极少发现有前方细胞, 因此小梁炎症可能是发生高眼压的主要原因。Falcon等分析了50例发生了继发性高眼压的单疱病毒性角膜葡萄膜炎, 其高眼压发生于原发疾病几周至30年不等。其原发病包括了盘状角膜葡萄膜炎 (44%) 、基质角膜葡萄膜炎 (36%) 、盘状角膜炎 (10%) 、基质性角膜炎 (4%) 、巩膜角膜炎/角膜缘炎 (2%) 和变态疱疹性溃疡 (4%) 。在随访的4年时间里, 患者高眼压的发生频率平均为2次, 不规则基质角膜炎比盘状角膜炎发生高眼压的频率高 (分别为2.4次和1.8次) , 一旦发生高眼压, 可持续1周至124周, 平均为8周。

有研究称, HSV与青光眼睫状体炎危象 (PSS) 的发生可能相关。据Yamamoto等报道, 他们从3例PSS患者的房水中用PCR的方法检测到了HSV的基因片段, 巨细胞病毒、带状疱疹病毒基因片段阴性;而对照组的3例白内障手术者的房水中3种病毒DNA都未检测到。这说明HSV可能引起小梁网的感染, 而使眼内压升高, 引起PSS。但是此项研究无法证明HSV的DNA在眼中的准确位置。而另有研究发现PSS与巨细胞病毒、带状疱疹病毒感染可能有一定联系[14]。

3 病理机制

疱疹病毒性角膜葡萄膜炎患者发生青光眼的病理机制尚存争论。一些学者认为高眼压是由炎症所导致, 而另一些学者认为是激素治疗的结果[4]。最早研究这一机制的是Hogan等, 他们通过解剖发生了青光眼的单纯疱疹病毒性角膜葡萄膜炎的眼球, 发现其前节发生了广泛而严重的病变。角膜上皮弥漫性水肿、小泡形成, 上皮与前弹力膜分离并含有慢性炎症细胞。前弹力膜多有缺失, 而被水肿型瘢痕或肉芽组织取代。角膜基质弥漫性水肿并伴有血管化, 基质被含有炎症细胞的液体充填而层状分离, 局部坏死产生肉芽组织。内皮水肿, 局部缺失。淋巴细胞性角膜后沉着物 (KP) 及纤维蛋白粘附于残存的内皮及后弹力膜上。小梁带水肿变厚, 纤维蛋白与慢性炎症细胞的混合物阻塞了小梁间的流出通道。虹膜增厚、水肿, 含有大量的淋巴细胞和浆细胞。虹膜可发生广泛的后粘连, 而前部晶体出现白内障的征象。此外, 前部睫状体也有慢性炎症的表现。这些发现说明, 单疱病毒性角膜葡萄膜炎继发青光眼主要是由于小梁阻塞或小梁网的炎症。炎性细胞、纤维蛋白、血浆蛋白可以在小梁网处形成机械性阻塞, 角膜后膜形成并阻塞房角, 增厚水肿的小梁带阻碍房水外流, 而虹膜后粘连可以引起瞳孔阻滞和继发性闭角型青光眼。然而, 单疱病毒性角膜葡萄膜炎继发的青光眼并非都是闭角型, Thygeson提出治疗单疱病毒性角膜葡萄膜炎是使用的局部激素也可以增高眼内压。但是另一项研究表明, 激素治疗之前眼压升高就已经发生。因此单疱病毒性角膜葡萄膜炎继发的高眼压或青光眼可能包含上述两方面的机制[15]。

4 诊断

疱疹病毒性角膜葡萄膜炎患者伴发青光眼者的比例并不低, 但一般只在患者出现明显青光眼症状时, 行眼压检查才发现眼压升高。因此, 凡疱疹病毒性角膜葡萄膜炎患者在出现青光眼症状及体征前就应常规做眼压检查, 以便及时发现眼压升高。选择非接触式眼压计可避免交叉感染及对角膜上皮的损伤。

各种疱疹病毒性角膜葡萄膜炎的症状常常相似, 因此要想甄别具体为哪一种病毒需要做病原体的检测。相对于血清学检查, 前房穿刺以检测房水中病毒DNA及局部抗体的检查更为可靠。需要注意的是, 在病程的不同阶段需要多次检查以防漏检, 且病毒常在活动期开始时查到, 而抗体是一直存在的。

5 治疗

继发性青光眼是病毒性角膜葡萄膜炎的常见并发症预后良好, 很少需要青光眼滤过手术治疗。治疗单时主要致力于控制病毒感染并防止感染复发。

抗病毒方面, 国外主要使用曲氟尿苷滴眼液及口服抗病毒药物 (阿昔洛韦、伐昔洛韦) , 曲氟尿苷可在房水内达到药物有效浓度, 提示可能有益于治疗基质、虹膜受累的深部疱疹感染。在应用抗病毒治疗的基础上, 皮质激素可以迅速有效地发挥抗炎症作用, 尤其是缓解眼内炎症, 使得眼内压在几天内显著下降[16]。而国内医师常首选无环鸟苷, 联用滴宁眼药水 (干扰素) 。无环鸟苷对疱疹病毒, 尤其对带状疱疹病毒的复制有很强的抑制作用, 对树枝状/地图状角膜炎治疗效果显著。干扰素可以通过干扰信使RNA使病毒繁殖受限, 治疗病毒性角膜炎有很好的疗效。因此, 滴宁眼药水联合无环鸟苷眼药水可有效治疗带状疱疹性角膜葡萄膜炎及其继发的青光眼[17,18,19,20,21,22]。

激素对此类疾病是有效的。由于角膜基质及内皮细胞来源于中胚叶, 相对于角膜上皮细胞, 对疱疹病毒的易感性较差, 因此, 角膜基质及内皮病理改变不是细胞的增殖和变性, 而是对病毒抗原迟发型超敏反应, 所以在抗病毒的基础上使用皮质类固醇, 可有效抑制超敏反应, 从而有利于炎症的消退。

6 小结

疱疹病毒能够引起角膜葡萄膜炎和继发性青光眼。眼内压升高的机制可能与小梁阻滞或小梁炎症相关。治疗时应以抗病毒治疗为主, 在此基础上使用皮质激素可以有效抑制炎症反应, 出现高眼压时应使用抗青光眼药以控制眼压而一般不需要手术治疗。

治疗疱疹病毒的天然中药提取物 篇7

技术特点

利用不同的提取方法 (水提取和醇提取) 对该中药进行提取、浓缩和除菌;采用组织培养技术, 对中药提取物进行体外抗单纯疱疹病毒实验;采用抑菌环实验和营养肉汤稀释法对其进行最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MBC) 测定实验。

应用范围

通过体外抑菌和抗单纯疱疹病毒实验, 临床上用于治疗由抗单纯疱疹病毒引起的病毒性疾病 (病毒性脑炎、病毒性角膜炎以及生殖器疱疹病毒感染等疾病) ;用于治疗临床上常见的细菌感染, 特别对临床上耐药菌株有较强的抑制和杀灭作用。随着研究的深入, 逐步应用到体内外抗其他病原微生物的实验研究和临床应用。大大提高中药药用价值和经济效益, 极具开发价值。

市场预测

天然药物中的许多活性成分具有抗病毒的作用, 尤其是我国的中草药 (包括中药、民族药和草药) 是祖国医药的宝库, 这类天然药物的研究开发大有可为。有关该中药提取物抗病毒、抗细菌方面的实验研究, 国内外尚未见详细的报道。该中药可综合利用, 既可利用中药的营养价值, 又可以大力开发中药的药用价值, 还可以开发研制不同剂型的系列保健品和抗病原微生物的医药用品, 这必将带动医药和精细化工业的同步发展, 其前景非常广阔。

合作形式

技术转让或者合作开发。

单位:山东大学科技开发部

地址:山东济南山大南路27号

邮编:250100

检测锦鲤疱疹病毒方法的研究进展 篇8

关键词：锦鲤疱疹病毒,检测方法,分子生物学

锦鲤疱疹病毒 (KHV) 的诊断主要有细胞分离、电镜观察等传统的检测方法, 但是这些方法特异性不强, 用于早期诊断价值有限, 很难达到快速检测病原并根据病原进行相关控制的要求。随着分子生物学及相关科学领域的快速发展, 有些研究人员将聚合酶链式反应技术 (PCR) 应用于检测锦鲤疱疹病毒, 其检测方便、快捷, 但具有一定的局限性, 如气溶胶污染、操作需有相关的配套技术等, 锦鲤感染疱疹病毒后, 临床表现与一些细菌和寄生虫感染相似, 所以不能仅从临床症状就判定为锦鲤疱疹病毒感染, 必须通过实验室诊断加以佐证。目前, 锦鲤疱疹病毒已严重影响了淡水养殖业的发展;因此, 找到快速、准确的诊断检测方法对有效控制该病具有重要意义。

1 病原电镜检测

该方法通过电镜观察病毒结构、形态便可进行初步确诊, 在病原检测方面, 电子显微技术一直被广泛关注。在不知道病原体的情况下, 电镜诊断仍然是比较快捷而可靠的检测手段。通过电镜可以观察病毒的膜蛋白参与病毒的吸附和传入过程, 以及病毒从核膜出芽并释放的过程[1]。S.G.Grimmett等[2]利用电子显微镜观察死亡锦鲤被感染的细胞, 可以确定锦鲤的死亡与锦鲤疱疹病毒有关。通过电镜技术还可以确定锦鲤疱疹病毒的分类地位及其分子生物学的研究方向。电子显微镜检测锦鲤疱疹病毒虽然可直接观察到病原, 但方法繁琐、仪器操作较为专业, 不能满足快速检测的目的, 只能用于病原体的鉴定。

2 病原分离鉴定

锦鲤疱疹病毒的分离主要采用细胞培养分离技术, 此技术是最准确的诊断方法, 国际兽疫局 (OIE) 将其推荐为首选方法。研究表明, 锦鲤疱疹病毒具有种属特异性, 只能在原始宿主细胞上生长, 即只能在锦鲤鳍细胞 (KF) 上生长, 并产生特征性病变, 锦鲤疱疹病毒的这种特性, 可作为一种诊断方法。锦鲤鳍细胞系是美国的研究人员在1997年建立起来的[3], 锦鲤疱疹病毒在锦鲤鳍细胞上的适宜培养温度为15～25 ℃, 最适培养温度为20 ℃。P.R.Calle等[4]研究表明, 常用的鱼细胞都很难分离到病毒, 锦鲤疱疹病毒只能在锦鲤鳍细胞、宿主细胞及鱼脑中增殖[5], 再通过细胞培养的方法对临床受感染鱼体进行病毒分离。刘荭等人的研究也证实, 该病毒不可能在草鱼性腺细胞系 (CO) 、鲤鱼上皮细胞 (EPC) 和鲤鱼肾 (CK) 细胞上生长。朱霞等[6]将鲤鱼肾细胞和单层框镜鲤鱼鳍条细胞共同培养, 培养5～6 d后出现典型的细胞病变, 这是国内首次分离到的锦鲤疱疹病毒。然而, 能够分离病毒的细胞系有其自身的局限性;因此, 细胞培养分离法在检测锦鲤疱疹病毒DNA时并不像PCR方法那样敏感, 不能作为一种可靠的检测方法来进行考虑[7]。还有研究表明, 从死亡稍长或冰冻的感染锦鲤组织中很难分离到病毒, 若想分离病毒需用新鲜的肾脏做病毒培养, 因为肾脏是锦鲤疱疹病毒增毒最高的组织[8,9]。

3 抗原检测

3.1 免疫荧光检测

锦鲤疱疹病毒可以通过肝脏、肾脏及感染鱼类脑部的接触印痕及涂片, 利用免疫荧光法进行鉴定。应用免疫荧光法在肾脏中可以收获到较高水平的病毒阳性荧光。研究表明, 在感染早期应用免疫荧光法可以在肾脏印痕中检测到病毒[10]。

3.2 酶联免疫吸附试验

应用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 在感染器官中直接检测锦鲤疱疹病毒抗原的方法在很多实验室中都尚未发展成熟, 一些相关试验还有待于进一步研究。目前, 以色列的研究人员建立了在鱼类排泄物 (粪便) 中检测锦鲤疱疹病毒的ELISA方法[11]。

4 抗体检测

研究人员抽取鱼的血液进行抗体检测, 发现产生抗体的细胞需要一段时间才能激活, 而且一旦激活多种鱼类将会产生永久性免疫[12,13,14,15]。鱼体在感染锦鲤疱疹病毒时, 其自身免疫状态 (特异性免疫与非特异性免疫) 在抵御疱疹病毒入侵时起着至关重要的作用;当水温在18 ℃以上时鱼类的免疫应答处于最佳状态, 此时鲤鱼感染病毒后机体所产生的抗体可以抵抗病毒。研究表明, 机体在感染病毒3周后, 其血清中可以通过ELISA方法检测到抗体的存在, 而自然感染病愈1年后的鲤鱼也能检测到这些抗体。虽然, 含有锦鲤疱疹病毒抗体的锦鲤血清能与鲤鱼疱疹病毒1型出现交叉反应, 但研究人员发现, 通过ELISA方法仍能检测到具有较低含量的锦鲤疱疹病毒抗体;因此, 免疫学方法可以检测外观十分健康的初期感染者, 由于PCR方法在病毒含量较低时容易出现阴性反应, 所以免疫学方法检测抗体也许是唯一有效的监测手段。但是, 对鱼类病毒感染的免疫学方法研究较少, 相信随着血清学诊断技术的日臻完善, 应用免疫学方法在假定健康的鱼群中筛选病毒初期感染者将会成为可能。

5 分子生物学诊断技术

5.1 PCR方法

PCR是比较准确的诊断锦鲤疱疹病毒的方法;因此, 国际兽疫局将其列为推荐方法之一。截止到2006年, 运用PCR技术确诊的锦鲤疱疹病毒感染的阳性病料在德国有45例、英国16例以上、荷兰1例、美国2例, 以色列确诊的病例也是应用此技术完成的。有人用锦鲤疱疹病毒的1个保守片段建立PCR方法, 可用来区分锦鲤疱疹病毒、鲤鱼疱疹病毒 (CHV) 和海峡鲶鱼病毒 (CCV) 。2004年, T.Ishioka等[16]运用PCR技术对发生在日本的43份锦鲤疱疹病毒可疑病例进行了分子流行病学检测, 之后又利用锦鲤疱疹病毒的主要囊膜蛋白基因和聚合酶基因的核苷酸序列设计了相应引物, 并进行PCR扩增。结果表明, 有37份样品检出阳性, 检出率为86%。有研究人员认为, ORF25编码的蛋白在病毒的突变位点不易发生变化, 属于较为保守的基因序列[17];因此, 利用该基因进行PCR检测特异性较高。H.Bercovier等[18]用锦鲤疱疹病毒的胸苷激酶基因建立的PCR方法可区分锦鲤疱疹病毒、海峡鲶鱼病毒和鲤鱼疱疹病毒。2002年在广东省爆发的疑似锦鲤疱疹病毒病原感染中, 刘荭等人建立的检测方法发挥了积极的作用, 同时也预示着我国同样存在受贸易往来所导致的锦鲤疱疹病毒爆发的风险, 并提前为我国预防和控制该病提供了技术支持。乌日琴等[19]分别利用2种方法抽提组织中锦鲤疱疹病毒的DNA, 证实蛋白酶K-酚/氯仿抽提法不能达到从组织中抽提锦鲤疱疹病毒DNA的目的, 同时也评价了2套引物检测的特异性, 初步建立了反应快速、操作简便、灵敏度高的检测锦鲤疱疹病毒的PCR方法。孟庆峰等[20]通过使用靶基因序列合成的相关引物检测锦鲤疱疹病毒。结果表明, 所用靶基因均可用于锦鲤疱疹病毒的检测及其确证试验。但是, PCR检测方法也有自身的局限性, 它只能从出现临床症状的病鱼体内检测到锦鲤疱疹病毒, 还不能预知潜在的病毒感染, 同时假阳性、假阴性及气溶胶污染等也给PCR方法带来一些弊端。

5.2 探针检测

对于公布的单循环PCR方法, 最近被认为是从临床患病的鲤鱼体内采取新鲜器官样品中检测锦鲤疱疹病毒DNA最为敏感的, 该规程同样可以应用于检测具有亚临床症状的病毒, 首先应用TK探针发展该规程的是以色列希伯来大学-Hadassah医学院的研究人员。其后日本学者也对此进行了相关研究, 并对其进行了改进。研究表明, 若使用的器官样品有腐烂迹象, 则需要用探针位点靶向基因组的稍短区域。

5.3 环介导等温扩增技术 (LAMP)

环介导等温扩增技术是一种新型的恒温核酸扩增方法, 它能特异性识别靶核苷酸上6个位点的4对引物及具有链置换活性的DNA聚合酶, 在60～65 ℃条件下进行核酸的指数式扩增, 其扩增效率在1×10-9～1×10-10数量级上, 其反应的原理是在扩增的过程中产生茎环结构, 以保证引物和模板杂交后启动新一轮的扩增反应, 反应的副产物焦磷酸镁沉淀是肉眼可见的, 若反应中添加显色剂, 通过扩增过程颜色的变化, 还可以目测整个反应过程。该方法的优点是快速、简便、廉价、肉眼可观测到反应的发生, 并且不需要特殊的PCR反应仪器, 非常适合现场诊断;因此, 该方法有很好的应用前景。H.Soliman等[21]通过设计的3对引物建立了锦鲤疱疹病毒的环介导等温扩增技术, 该方法在90 min内即可完成, 省时、省力并且直观。I.Gunimaladevi等[22]利用锦鲤疱疹病毒胸苷激酶基因设计引物建立的环介导等温扩增技术, 其灵敏度与普通PCR方法相当。

6 结语

带状疱疹病毒 篇9

【关键词】脑炎脑膜炎症候群；单纯疱疹病毒；特异性IgM

【中图分类号】R742.9 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01248-02

脑炎脑膜炎症候群是一组急性起病，并以脑炎或脑膜炎为主要临床表现的中枢神经系统感染性疾病。在可引起脑组织炎症的病原体中，病毒最为常见，如乙型脑炎病毒。单纯疱疹病毒（HSV）也是目前病毒性脑炎最常见病因之一，约占美国全部脑炎的10%一20%[1]，治疗不及时病死率超过70%，并且预后差[2]。为了解昆明脑炎脑膜炎症候群的病原谱构成，本文对2010年来源于昆明哨点医院脑炎脑膜炎症候群病例的HSV 1+2型IgM抗体检测结果进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 脑炎脑膜炎症候群病例定义：

急性起病，具有发热、头痛、呕吐等症状，伴有不同程度的意识障碍、瘫痪、神经麻痹、肌肉疼痛、肌群松弛和萎缩或脑膜刺激征等症状之一，或临床诊断疑似脑炎脑膜炎患者均作为监测病例。

1.2 病例资料和标本来源：

由昆明云南省第一人民医院、昆明医学院第一附属医院、昆明医学院第二附属医院和昆明市儿童医院提供。时间自2010年1至12月。采集急性期血液标本分离血清，放置-20℃冰箱保存。

1.3血清学检测：

检测试剂盒为德国赛润ELISA classic 单纯疱疹病毒1+2 IgM检测试剂盒（批号SDC.BB）。严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2010年哨点医院共监测96例病例，每个病例收集1份急性期血液标本。其中，男性58人（60.4%），女性38人（39.6%），男女比例为1.5：1。年龄范围3个月至62岁。小于18岁的59人（61.5%）。各年龄组（<1、1-5、6-10、11-15、16-17、18-岁）人数分别为3、35、15、4、2和37人。病例分布在除3月以外的11个月中。4至9月分别有病例11、17、12、29、10和8人，其余5个月共有9人。

病例共检出HSV IgM抗体16人，阳性比例16.7%。男性和女性各8人。1-10岁12人（75%），20-30岁4人（25%）。4、7、8、9、11和12月中分别有病例3、7、1、2、1和2人。7、8和9月共10人（62.5%）。

3 讨论

脑炎脑膜炎症候群的病原包括病毒、细菌和寄生虫。仅病毒就有100多种可引起病毒性脑炎[3]。在我国，只有流行性乙型脑炎和流行性脑脊髓膜炎被列为法定传染病并常规监测，其它相关疾病报告多是临床资料的分析，缺少系统监测。在哨点医院建立监测系统开展症候群监测，对于全面了解病原谱的构成及其流行病学特征具有重要意义。

2010年昆明监测病例中男性多于女性，年龄范围包括了从婴儿到老年人的各人群，18岁以下占总人数的61.5%。发病时间集中在4至9月，7月病例最多，占30.2%。济南监测到的数据也显示发病人群以小年龄儿童为主，时间集中在5～9 月，7～9 月为高峰，男性多于女性[4， 5]。石家庄的监测也报告了相似的结果[6]。病例中HSV阳性比例为16.7%，其中10岁及以下占75%，共有62.5%的病例出现在7至9月。国内较常检出的病毒有乙脑病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒和HSV等[4-6]。广州报道病毒性脑炎的主要病原体是疱疹病毒和肠道病毒[7]。单纯疱疹病毒性脑炎具有散发性，但若治疗不及时病死率较高[2]。加强症候群疾病的监测和病原学的诊断，有助于疾病的治疗并减轻所带来的沉重负担。

致谢：感谢文中哨点医院及所有参与本工作的人员。

参考文献：

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[2] Tyler KL.Herpes Simplex Virus Infections of the Central Nervous System： Encephalitis and Meningitis， Including Mollaret’s. Herpes 2004， 11（Suppl 2）：57A-64A.

[3] Whitley RJ， Gnann JW.Viral encephalitis： familiar infections and emerging pathogens. Lancet 2002， 359（9305）：507-513.

[4] 冯蕾， 刘桂芳， 宋立志， 等.急性脑膜炎/脑炎症候群哨点监测病例7种病毒特异性IgM抗体血清学诊断结果分析.中国疫苗和免疫 2010（06）：523-527.

[5] 张先慧， 徐胜平， 刘翀. 2006～2009年济南市急性脑炎、脑膜炎病例流行病学分析.预防医学论坛 2012（07）：551-553.

[6] 郭建花， 周吉坤， 张世勇， 等.石家庄市急性腦炎、脑膜炎病例监测结果分析.现代预防医学 2012（01）：145-147.

带状疱疹病毒 篇10

该病的主要临床症状是精神沉郁,食欲废绝;行为上无方向感的游泳,甚至停止游泳;皮肤上出现苍白的块斑和水泡;鳍、鳞片、口腔、腹部出血或充血;患病鱼出现症状后1~2 d内死亡。

该病毒适合培养温度为21℃,只对锦鲤鳍细胞系敏感,产生细胞病变。目前国内有效的监测和诊断方法不多,主要用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR方法和细胞培养技术是OIE推荐的KHV诊断方法。目前,很多流行病的诊断都采用一种新技术——荧光定量PCR方法,该方法以其敏感性、特异性高,污染少,可定量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中的主要方法。本研究利用锦鲤疱疹病毒VR52标准株建立荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法,利用一对特异性引物和探针建立一种特异的实时定量PCR方法,以期为KHV感染提供快速、特异的诊断方法。

1 材料和方法

1.1 毒株

KHV标准毒株VR52购自ATCC R公司。鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒由深圳出入境检验检疫局馈赠。

1.2 试剂和仪器

组织基因组DNA提取试剂盒(DV811A),Taq DNA聚合酶,PCR反应试剂盒,质粒提取试剂盒,PMD-18T Vector,Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,Takara Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0,DNA分子量Marker,DNAgreen,焦磷酸二乙酯(DEPC)均购自宝生物工程(大连)有限公司,其他试剂均为国产或进口分装。核酸蛋白分析仪Gene.specv为Hitachi Naka Instruments Co.Ltd公司产品。荧光PCR仪ABI7000 Sequence Detection Systems为ABI公司、普通PCR仪PTC-200 Peltien Thermal Cycler为MJ Research公司产品。凝胶成像仪Gel Doc TMXR为BIO-RED公司产品,高速冷冻离心机3K30为德国SIGMA公司。

1.3 FQ-PCR标准品的制备

1.3.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank上公布的AB375391 KHV胸苷激酶(TK)基因的保守序列,利用Premier5.0引物设计软件设计两条引物,送上海生工合成。引物序列如下:

上游引物TK1为:5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′下游引物TK2为:5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′

1.3.2 TK基因的扩增

将KHV标准毒VR52接种KF细胞,待出现细胞病变收获细胞毒。用组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞毒的核酸,做为扩增的模板。提取过程按照说明书进行操作。PCR扩增体系如下:25 L的体系,DNA模板3 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,引物TK11 L(10 p M),引物TK21 L(10 p M),Taq酶(5U/L)0.2 L,DEPC处理水补到25 L。反应条件为94℃5 min;95℃1 min,52℃1 min,72℃1 min,40个循环;72℃10 min;4℃保温。扩增片段大小为409 bp,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。

1.3.3 TK基因的克隆与鉴定

利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将TK基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书),将回收的产物与PMD-18T Vector连接16 h。连接体系:PMD-18T Vector 1 L,PCR产物1 L,DEPC处理水3 L,连接液5 L。将连接产物转化到DH5感受态细胞,加入IPTG和X-Gal,涂在Amp+琼脂平板上,次日挑取4个白色单个菌落,分别进行PCR鉴定。将阳性克隆菌落接种到Amp+LB液体培养基中,37℃摇床过夜,利用质粒小量提取试剂盒提取质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.4 质粒标准品浓度的计算

将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260 nm与280 nm波长下的OD值,判断其纯度(OD260nm/OD280nm>1.8者为纯品),然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:每微升质粒拷贝数=(质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/L)×1 L]×10-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×1023个/mol),其中:6.02×1023是阿佛加德罗常数;660是每个碱基的平均分子量;重组质粒的总长度为3101bp。标准品作10倍梯度稀释,–20℃保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.4.1 引物和Taq Man探针的设计与合成

以1.3中PCR扩增的片段为模板,利用Beacon Designer 5.0软件设计了1对特异引物和Taq Man探针,引物和探针均由大连宝生物有限公司合成,探针的5′端用荧光基团FAM标记,3′端用淬灭基团TAMRA标记。引物及其Taq Man探针序列见表1。扩增长度为116bp。

1.4.2 荧光定量PCR反应体系及条件

反应体系:25 L的总体系,DNA模板5 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,上游引物1 L(10 p M),下游引物1 L(10 p M),探针0.8 L(10 p M),Taq酶(5 U/L)1 L,DEPC处理水补到25 L。置荧光定量PCR仪中,反应条件为94℃3 min;94℃15 s,60℃30 s,72℃1 min,5个循环;94℃10 s,60℃40 s,40个循环,收集荧光信号。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。

1.4.3 标准曲线的制备

将KHV标准品质粒做10倍系列稀释,采用优化好的条件进行实时荧光定量PCR。根据质粒拷贝数和对应的Ct值,利用SDS1.2分析软件得到标准曲线。

1.4.4 FQ-PCR特异性试验

用建立的荧光定量PCR反应体系同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒,检测KHV引物和探针的特异性。

1.4.5 FQ-PCR重复性试验

对FQ-PCR模板进行10倍系列稀释,并做2组平行样,检测其重复性。

2 结果

2.1 KHV TK基因特异性片段的扩增

目的片段大小为409 bp,经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

2.2 KHV标准阳性质粒的构建与鉴定

将目的片段与PMD-18T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5,经过Amp+的琼脂平板的培养,挑取阳性克隆菌,提取质粒,并测序。经0.8%琼脂糖凝胶电泳,质粒大小为3 101 bp,结果如图2所示。测序结果显示,质粒中含有目的片段。以质粒为模板,进行常规PCR鉴定,扩增出409 bp的目的片段,如图3所示,说明质粒构建成功,取2号管对应的质粒做标准品,用于荧光定量PCR方法的建立。

2.3 重组质粒浓度的测定

提取的质粒经核酸蛋白分析仪测定,其质量浓度为32.85 g/m L,OD260nm/OD280nm比值为1.825,符合纯度要求。根据每个阳性质粒含3101bp,所提质粒DNA溶液浓度可换算为1.6×1010个拷贝/L。

2.4 引物和探针最佳使用浓度的确定

以相同浓度的阳性核酸为模板,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用浓度。在模板量相同的情况下,以循环阈值(Ct值)最小,荧光强度增加值(Rn)最大,若两者不一致,优先以Ct值为准,矩阵法优选后,引物和探针的最佳浓度分别为0.4 p M和0.32 p M。

2.5 FQ-PCR标准曲线的建立和回归方程的确定

对标准阳性质粒10倍系列稀释,以优化的条件进行Taq Man FQ-PCR扩增。利用SDS1.2分析软件,以Ct值为纵坐标,质粒DNA拷贝数的对数为横坐标,获得一条标准曲线,如图4所示。可见,在1.6×10~1.6×105拷贝之间,测得的数值基本在一条直线上,与Ct值有良好的相关性,相关系数R2=0.992,说明各个浓度组相关性非常好,可以对病毒进行可靠的定量检测,此阳性质粒可作为FQ-PCR的标准品。质粒在稀释到10-9仍能检测到荧光信号,对应16个拷贝数,该方法检测的灵敏度为16个病毒拷贝数,灵敏度较高。图中,标准曲线的斜率为-3.09,截距为20.96,可以得出拷贝数N与Ct值之间的线性关系表达式即回归方程:Ct=-3.09Ig N+20.96。待测样品的Ct值可直接从仪器中读取,通过回归方程,可确定样品中核酸的含量。

2.6 FQ-PCR重复性试验

将KHV核酸做梯度稀释,做两组重复样,结果如图5所示,重复样Ct值之间相差0.1左右,重复性较好。

2.7 FQ-PCR特异性实验

分别对IHNV、SVCV、IHNV、KHV阳性质粒,用建立好的KHV FQ-PCR的反应体系,进行扩增。如图6所示,只有KHV有扩增曲线,呈现出良好的特异性。

3 讨论

目前对锦鲤疱疹病毒病的诊断方法主要有Soliman等[3]、Gunimaladevi等[4]报道采用LAMP法能高度灵敏、快速、省力的检测出KHV病毒;乌日琴等[5]、刘荭等[6]也初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法。这些方法只能作为定性分析的手段。而本文建立的FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于荧光探针的使用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性、光谱技术的高精确性和实时监测的特点;FQ-PCR克服了常规PCR的许多缺点,如普通PCR需要琼脂糖凝胶电泳来观察结果,费时费力,并且紫外线和溴化乙锭对人体又有害,这些复杂的过程增加了假阳性的机会,FQ-PCR具有扩增与自动分析一体化,缩短了检测时间。本文建立的FQ-PCR检测方法,具有高灵敏性、高特异性、操作时间短,可做为KHV检测首选的方法。

本文FQ-PCR标准品的构建是荧光定量PCR方法建立的基础,本文选用6个稀释度的标准阳性质粒模板,建立的标准曲线,相关系数为0.992,表明拷贝数与Ct值相关性良好,本试验最低可检出16个病毒拷贝,说明灵敏度较高。因此本研究构建的检测KHV的标准品可用于FQ-PCR检测。

由于FQ-PCR可定量检测病毒数量的特点,可做为判断病毒在体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除、新药的药效学等方面研究提供有力的参考,有很好的应用前景和研究价值。

参考文献

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[2]张立峰,刘晶,苏世敏.一种新发现的鱼类病毒KHV在国外的流行和研究现状[J].中国动物检疫,2003,20(2):41~43.

[3]Soliman H,El-Matbouli M.An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus(KHV)infection by loop-mediated isothermal amplifi cation[J].J Virol,2005,17(2):83.

[4]Gunimaladevi I,Kono T,Venugopal M N,et al.Detection of koi herpesvirus in common carp,Cyprinus carpio L.,by loop-mediated isothermal amplification[J].J Fish Dis,2004,27(10):583~589.

[5]乌日琴,刘中勇,黄宝春.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因[J].检验检疫科学,2005,15(2):6~8.