鸭肠炎病毒（共7篇）
鸭肠炎病毒 篇1
鸭病毒性肠炎又称鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的一种急性、热性传染病。本病一年四季均可发生, 不同品种和年龄的鸭均可感染, 但发病率和死亡率有一定的差异, 成鸭的发病率高于幼鸭, 20日龄内的雏鸭较少流行本病。其临床特征表现为高热、双目流泪、脚软、有的跛行, 排绿色稀粪, 有的病例出现头颈部肿大, 因此称为“大头瘟”。
1 预防
(1) 切断病源, 实行自繁自养。不到疫区购鸭, 新购进鸭苗应隔离7~10d饲养观察, 待鸭群无疫情时方可入群饲养。
(2) 鸭群中一旦发生少数鸭患该病, 应将患鸭隔离治疗, 并立即采取消毒、紧急接种疫苗等措施。
(3) 强化免疫。肉鸭:在l~7日龄经皮下注射0.5mL鸭瘟鸡胚化弱毒苗, 其免疫力能保持至上市。蛋鸭:在20日龄进行首免, 每只鸭经肌肉注射0.5mL, 2个月后加强免疫1次, 60日龄以上鸭每只肌肉注射1mL, 免疫期为6个月。
2 治疗
(1) 高免血清疗法:给病鸭每只颈背皮下注射高免血清1mL。
(2) 高免卵黄疗法:给病鸭每只颈背皮下注射高免卵黄2mL, 同时口服高免卵黄液2mL。
(3) 鸭鸡胚化弱毒苗紧急接种法:对病鸭同群的受威胁的鸭子每只注射鸡胚化弱毒苗1mL, 要做到一鸭一针。
(4) 干扰素疗法:每只成鸭肌注1mg聚肌胞, 1次/3d, 连用2~3次。
(5) 用板蓝根注射液1~4mL, VC注射液l~3mL, 地塞米松1~2mL, 一次肌肉注射, 2次/d, 连用3~5d。
(6) 三氮唑核苷2~4mL, VC注射液l~3mL, 丁胺卡那霉素2mL, 一次肌肉注射, 2次/d。
(7) 口服补液盐 (ORS) 疗法。配方:氯化钾1.5g、氯化钠3.5g、小苏打25g、葡萄糖20g, 温开水1000mL。溶解后, 供病鸭自由饮用, 不限量, 3次/d, 连用3d后改用常水。此法能纠正脱水、调节机体水电解质平衡、改善微循环障碍、缓解中毒性休克、提高病鸭机体免疫功能, 增强抗病能力、减少病死率。
鸭病毒性肠炎的症状与防治 篇2
鸭病毒性肠炎, 是由鸭瘟病毒引起的鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性、热性、败血性传染病, 俗称“大头瘟”, 也叫鸭瘟。病理特征主要是呈败血症经过, 血管损伤导致出血、淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化。本病流行广、传染快, 发病率和死亡率高, 往往对受传染的鸭群造成毁灭性打击, 严重威胁着养鸭业的发展。
1 病原
鸭瘟病毒属于疱疹病毒, 能在9~12日龄鸭胚中生长繁殖和继代, 也能在发育的鸭胚、鹅胚和鸡胚细胞培养物上生长繁殖, 引起细胞病理变化。病毒56℃, 10min即死亡, 0.1%汞10~20min, 75%酒精5~30min, 0.5%漂白粉30min失去活性, p H3和p H11时病毒也迅速死亡。
2 流行特点
本病主要危害鸭, 各种年龄的鸭都易感染, 但成年鸭的发病率较雏鸭高, 鹅也易感染, 但发病率较鸭低, 病鸭是主要传染源, 感染途径主要是消化道;发生与流行无明显季节性, 春、秋两季为多发和流行。在潮湿的多水地区, 发生和流行较严重。
3 症状及病变
本病的潜伏期一般为3~4d。病初体温43~44℃, 持续不退, 精神萎靡, 少吃或不吃, 口渴, 两脚麻痹无力, 走动困难, 完全麻痹时, 伏卧不起, 病鸭排绿色、灰绿色稀粪。流泪和眼睑水肿是鸭瘟的一个特征症状, 病初流出浆性分泌物, 以后变成粘性或脓性分泌物。部分病鸭的头颈部肿胀, 鼻分泌物增多, 叫声嘶哑, 常衰竭死亡。急性病例, 病程一般为2~5d, 致死率在90%以上。少数不死的转为慢性, 表现消瘦, 生长发育不良, 特征性的症状为角膜混浊, 严重的形成溃疡, 多为一侧。
剖检除败血症的一般性病变外, 还可见到一些特征性的病变, 食道黏膜有纵横排列的灰黄色假膜覆盖或小出血斑点, 假膜易剥离, 剥离后留有溃疡斑痕。泄殖腔粘膜表面覆盖一层灰褐色或绿色的坏死痂, 粘着很牢固, 不易剥离, 黏膜上有出血斑点和水肿。肝脏不肿大, 肝表面和切面有大小不等的坏死斑点, 少数坏死点中间有小点出血, 外周有环状出血。
4 诊断
根据流行病学特点、临床病理特征可作出初步诊断, 但在该病的初发地区, 要求采取肝、脾等组织进行进一步实验室检验和诊断。
5 治疗
一旦爆发疫情, 应严格封锁现场, 立即用鸭瘟鸡胚弱毒疫苗进行紧急预防接种, 同时被污染的饲料要经高温消毒, 饮用水可用碘化类消毒药消毒, 对病鸭进行扑杀加工处理, 防止病毒传播。治疗在发病初期可用抗鸭瘟高免血清或鸭瘟康复鸭的血清, 肌肉注射0.5ml/只, 有一定疗效。或用聚肌胞进行早期治疗, 成年鸭肌肉注射1mg/d, 3d 1次连用2~3次可收到良好的防治效果。或采用下述中草药配方进行治疗:川芎15g、滑石20g、银花10g、千里光10g、连翘10g、艾叶10g、郁金12g、花椒8g、肉桂20g、党参15g、蜈蚣3条、干姜30g、生姜15g、神曲12g、桂枝15g, 水煎0.5h后, 倒至10kg大米再与药混煎5~10min, 去除药渣, 取白酒250g拌入混匀, 此量喂鸭100只, 分2次内服, 一般服药1~2剂 (治疗2~4次) 即愈。
6 预防
鸭肠炎病毒 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
DEV GZ株、质粒pET32a、大肠杆菌DH5α和BL21等,由贵州大学预防兽医学专业实验室提供。
1.1.2 试剂:
DUltraPureTM质粒DNA提取试剂盒和UltraPureTMPCR产物回收试剂盒购自北京赛百盛公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、BamHⅠ、HindⅢ和T4 DNA连接酶等购自大连宝生物公司;IPTG、PVDF膜和蛋白质Marker等购自上海生工;HRP标记山羊抗兔IgG及DAB显色液等购自华美生物工程公司;兔抗DEV-IgG由作者实验室自制;其它试剂均为进口分析纯。
1.1.3 仪器:
电泳仪(Bio-Rad)、PCR仪(Biometra)、台式高速冷冻离心机(Beckman)、电子天平(Shangping)和凝胶成像系统(Bio-Rad)等。
1.2 方法
1.2.1 NP基因的获取:
参考GenBank上的NP基因序列(登陆号为DQ072725)设计一对引物,即P1(含BamHⅠ位点):5'-TTGGATCCATGTTAGCTTTTATCTC CAG-3'和P2(含HindⅢ位点):5'-CGAAGCTTTTAGACGGCTACCAACG-3'。以病毒的鸭胚成纤维细胞培养物为材料,提取病毒基因组,采用P1/P2引物进行PCR扩增后,取扩增产物于10g/mL琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察结果。
1.2.2 NP基因的克隆与推导蛋白序列分析:
回收目的基因,连接pMD18-T载体,转化DH5α菌,经蓝白菌落筛选,提取重组质粒,经PCR和酶切鉴定后,取阳性重组质粒进行测序,采用SAPS program 软件和DNAstar Protein程序进行分析。
1.2.3 NP基因原核表达质粒的构建、筛选与鉴定:
采用BamHⅠ和HindⅢ双酶切处理重组质粒pMD18-NP,回收目的DNA片段,以T4 DNA连接酶到同样处理的pET32a上,转化DH5α菌,提取重组质粒pET32-NP,经PCR和双酶切鉴定后,-20℃保存备用。
1.2.4 重组NP蛋白的诱导表达与抗原性鉴定:
取阳性重组表达质粒,转化DL21菌,接种AMP+LB培养基,振摇培养至OD600值约为0.4时,加IPTG至终浓度为1mmol/L,诱导表达5h,收获培养液经12 000r/min离心2min,取沉淀物加适量1×SDS上样缓冲液,混匀后水浴煮沸5 min,取10μL进行SDS-PAGE分析。同时以含空载体的DL21菌和未转化DL21菌为对照。将PAGE分离后的表达产物经电转移至PVDF膜,用兔抗DEV-IgG进行Western Blotting,确定NP基因表达产物的反应原性。
2 结果与分析
2.1 NP基因的PCR扩增与克隆结果
经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后,可见一条大小约为760bp的特异DNA片段(见图1),与预期结果相一致。提取重组质粒pMD18-NP进行PCR反应,可扩增出特异的目的DNA片段;以HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切,可见大小约2 700bp的质粒片段和约760bp的目的片段(见图2),说明已成功地将目的基因插入到pMD-T载体上。
M:200bp DNAMarker;1:DE control;2~4:DEVGuizhou strain;5:ddH2O.
M:200bp DNA Marker;1:The pMD18-NP;2~4:The pMD18-NP of Guizhou strains
2.2 NP基因推导蛋白的序列分析结果
测序结果显示GZ株NP基因的全长为759bp,可编码252个氨基酸,与参考株同源性达100%。经SAPS program软件分析,NP基因推导蛋白的分子质量为27.1kDa,理论等电点pI为5.89;用DNAStar Protein程序分析(见图3),综合显示推导蛋白肽链的第10～15、88～92和182～186区段及其附近,可能是NP蛋白的B细胞抗原表位优势区域。
2.3 NP基因原核表达质粒的构建与鉴定结果
提取重组质粒pET32-NP,经PCR扩增可得到预期相一致的DNA条带(见图4);经双酶切可见2条特异的DNA条带(见图5),说明已成功构建出重组原核表达载体pET32-NP。
2.4 重组NP蛋白的诱导表达与抗原性鉴定结果
将重组质粒pET32-NP转化BL21菌,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE后,在约48kDa处可见一条特异蛋白带,而对照pET32在约20kDa处可见蛋白带(见图6),为环氧硫蛋白。Western Blotting显示,兔抗DEV-IgG能特异地识别48kDa处的蛋白带(见图7),说明表达的重组蛋白NP具有良好的反应原性。
3 讨论
DVE是目前危害我国养鸭业最为严重的疫病之一,近年来国内很多学者对DVE进行了多方面的研究并取得了一定的进展。程安春等[8]发现与鉴定DEV的NP基因,但尚未对该基因及其编码蛋白进行研究。本试验对DEV NP基因进行了原核表达研究,经克隆与序列表明,不同地区DEV分离株NP基因的核苷酸序列同源性100%,提示NP基因在DEV基因组中高度保守。
Alpha,a-螺旋;Beta,β-折叠;Turn,转角;Coil,无规则卷曲;Hydrophilicity,亲水性;Flexible regions,柔韧区域;Antlgenic Index,抗原指数;Surface probability,表面可及性。
M.DL2000 DNAMarker;1.pET32a-NP;2.pET32a.
M.λDNA/HindⅢ;1.pET32a-NP/HindⅢ;2.The pET32a-NP/Bam HⅠ;3.TpET32a-NP/HindⅢ+BamHⅠ;4.pET32a-NP/HindⅢ.
M:Protein Marker;1:pET32a control;2:pET32a-NP expression;3:BL21(DE3)control.
M:Protein Marker;1,3:pET32a-NP expression;2,4:pET32a expression.
生物信息学分析可获得目的基因核苷酸序列及推导蛋白氨基酸序列中所蕴含的重要信息,如抗原表位或与抗原表位相关的信息等[9]。本试验采用SAPS program软件和DNAstar Protein程序首次对NP基因推导蛋白的进行了综合分析与预测,显示该编码蛋白的肽链第10～15、88～92和182～186区段及其附近区域可能存在B细胞表位优势区,这为基于NP蛋白的诊断方法与免疫控制等方面的研究提供了重要信息。
用于外源基因的表达系统较多,但由于原核表达系统具有诸多的优越性,至今仍是表达外源基因的首选。本试验选用的原核表达质粒pET32a是一种带有T7启动子的融合表达载体,使外源基因与硫氧环蛋白基因一起进行融合表达,以增加表达目的蛋白的可溶性,利于高效稳定表达。本试验构建NP基因的重组载体pET32a-NP后,经SDS-PAGE显示,表达产物在48kDa处显示出一条蛋白带,与理论推导的NP蛋白分子量相一致;经Quantity One软件分析,表达重组蛋白约占菌体总蛋白的18.4%,表明NP基因可在原核表达系统中得到有效的表达;Weatern Blotting提示NP基因原核表达产物具有良好的免疫反应性,这为NP 蛋白功能的深入研究奠定了基础。
摘要：目的:对DEV贵州分离株NP基因进行克隆与序列分析,构建NP基因的原核表达载体,分析NP基因原核表达产物的免疫反应性。方法:根据GeneBank登载的DEV NP基因序列设计引物,对DEV贵州分离株进行PCR扩增、克隆和测序,采用生物信息学软件程序分析NP蛋白的氨基酸序列;将该基因插入到原核表达载体pET32a上进行原核表达和Western Blotting分析。结果:DEV贵州分离株NP基因全长759bp,核苷酸序列与参考株一致;NP基因编码蛋白相对分子量为27.1kDa,理论pI为5.89,肽链上第1015、8892和182186区段及其附近区域可能是B细胞表位优势区;构建得到的重组质粒pET32-NP可表达出一条大小约为48kDa的蛋白,且能与兔抗DEV-IgG发生特异性结合。结论:NP基因在DEV基因组中高度保守,其原核表达产物具有良好的免疫反应性。
关键词：鸭肠炎病毒,核衣壳蛋白基因,序列分析,原核表达
参考文献
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[7]李玉峰,欧阳文军,周秋平,等.鸭瘟病毒部分基因的克隆与序列分析[J].中国兽医杂志,2007,43(3):5-7.
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鸭感染肠炎沙门氏菌的诊治 篇4
1 发病情况、临床症状及病理变化
该场购进樱桃谷鸭3 200羽, 先后有540羽鸭发病, 死亡103羽。主要临床症状:病鸭精神沉郁, 羽毛失去光泽, 食欲减退或废绝, 呼吸困难, 腹泻, 脚软, 可视黏膜苍白, 静立一隅。病理变化:将病死鸭剖检, 可见气囊炎;肝脏表面覆盖着一层白色薄膜, 肝脏呈黄绿色;心包积液, 表面有黄白色纤维素性渗出物。
2 实验室诊断
2.1 病料采集及细菌分离培养
无菌采集病死鸭的心脏、肝脏及脑共30份病料送检。将病料分别接种于普通琼脂平板培养基、麦康凯平板培养基, 37 ℃培养24 h后观察。结果:普通琼脂平板培养基上生长良好, 菌落呈圆形、隆起且光滑, 直径2 mm;麦康凯平板培养基上形成与培养基颜色一致的淡红色菌落。将培养物涂片进行革兰氏染色镜检, 见散在、两端钝圆的革兰氏阴性短小杆菌。
2.2 生化鉴定
挑取纯培养菌落进行生化试验, 37 ℃培养24 h后观察, 结果见表1。
注:“+”表示糖发酵产酸或生化试验阳性;“-”表示不发酵糖或生化试验阴性。
2.3 诊断
根据病、死鸭的发病情况、临床症状、病理变化, 以及分离细菌染色镜检和培养特性, 结合生化试验结果, 对照伯杰细菌鉴定手册[2], 判定从30份病料中所分离到的病原菌均是肠炎沙门氏菌, 该养鸭场樱桃谷鸭发生的疾病是肠炎沙门氏菌病。
2.4 药敏试验
按常规药敏纸片法测定10种抗菌素对分离菌株的抗药谱, 敏感度根据杭州微生物试剂有限公司提供的标准进行判定。结果表明, 氟甲砜霉素、链霉素对所检菌株均为高敏;痢特灵、先锋霉素Ⅵ和四环素对所检菌株均为中敏;利福平、复方新诺明、庆大霉素、青霉素和卡那霉素对所检菌株均不敏感。
3 治疗
(1) 选用高敏药物氟甲砜霉素口服进行治疗, 每千克体重25 mg, 2次/天, 连用2天。 (2) 中药制剂:泻心汤 (大黄10 g, 黄连、黄芩各5 g) , 按生药计每千克体重1 g煎汤, 混水饮服, 连用3天。通过采取中西药治疗措施, 疫情得到控制。
4 讨论
4.1 肠炎沙门氏菌属于无宿主特异性而有侵害性的病原菌之一, 可由人传染给动物, 也可由动物传染给人, 即所谓“人畜共患病原体”。肠炎沙门氏菌不仅能引起家禽发病死亡, 造成严重的经济损失, 而且被污染的家禽产品作为肠炎沙门氏菌的携带者, 还严重危害人类健康。据报道, 日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40%~80%是由禽沙门氏菌引起的, 其中主要病原为肠炎沙门氏菌。由肠炎沙门氏菌引起人的急性胃肠炎 (食物中毒) 在世界各国有增加的趋势, 已成为国际公共卫生的一个重要课题[3]。
4.2 鸡感染肠炎沙门氏菌的病例已有许多相关的报道, 该病可通过空气从呼吸道或经口由消化道感染, 也有报道由蛋传播。近年来, 国内从水禽中分离到肠炎沙门氏菌的病例有所增加[4], 结合我地从樱桃谷鸭分离到致病性肠炎沙门氏菌, 说明肠炎沙门氏菌在我地水禽中也有感染, 应当引起养殖户的重视。
参考文献
[1]陆承平.兽医微生物学 (第三版) [M].北京:中国农业出版社, 2001.342~343.
[2]R.E.布坎南.伯杰细菌鉴定手册 (第八版) [M].北京:科学出版社, 1984.382~389, 833~844.
[3]刘佑民.樱桃谷鸭感染肠炎沙门氏菌的病原分离鉴定[J].动物医学, 2004, 21 (9) :54~55.
鸭病毒性肝炎概述 篇5
1 病原
鸭肝炎病毒包含小核糖核酸病毒科、星状病毒科和嗜肝病毒科3个病毒科的4种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎,其对鸭没有显著的致病性;星状病毒科引起Ⅱ型鸭肝炎,目前为止仅英国有发病报道;小核糖核酸病毒科主要引起Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎。Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎在临床症状和病理变化上类似,但中和试验和荧光抗体试验证实二者无共同抗原成分,且Ⅲ型鸭肝炎病毒的致病力不如Ⅰ型鸭肝炎病毒,对雏鸭的致病率很少超过30%。通常所说的鸭肝炎主要是指Ⅰ型鸭肝炎,其病毒致死性最强,呈世界性分布,主要发生于雏鸭,临床表现为发病急、死亡快,剖解病变特征主要为肝脏有明显的出血点、出血斑,是一种具有急性、高度接触性和致死性的传染性疾病,给养鸭业造成很大的危害。
1.1 Ⅰ型鸭肝炎病毒
属于小RNA病毒科(Picornaviridae),肠道病毒属(Enteroviurs),病毒呈球形或类球鞋形,直径为20～40nm,为二十面体对称核衣壳,没有囊膜,衣壳上有32颗壳粒,胞浆内繁殖。其基因组为不分节段的单股正链RNA。该病毒具有较强抵抗力:对胰酶,硫酸铵等有抵抗力;对乙醚、氯仿、甲醇等有机溶剂也有抵抗力;能耐pH3.0的酸性环境;耐热,56℃仍有部分病毒存活,62℃、30min可全部灭活;在自然环境中,病毒可在未清洗的污染孵化器内存活10周,在阴凉处的湿粪中可存活37d以上。在4℃条件下可存活2年以上,在-20℃条件下则可长达9年。对常用消毒剂也有明显的抵抗力;Ⅰ型DHV不能凝集任何动物的红细胞,也不具有红细胞吸附特性。可在鸭胚、鸡胚和鹅胚的绒毛尿囊腔内增殖,可在鸡胚组织中增殖,但不产生病变,在鸭肾细胞中增殖可以出现细胞病变。但不能在经胰酶消化过的组织上增殖;鸡胚致弱后的DHV能在鸡胚成纤维细胞中生长,而且犊牛血清对其生长有明显抑制作用。在我国流行的DVH的病原为Ⅰ型DHV。但林世棠等发现我国也有1型变异株存在,其实验结果与Sandhu报道相似:该变异株可使雏鸭从7日龄开始发病,15～20日龄为发病高峰,病死率为30～40%,青年鸭多在15～45日龄发病,病死率为40～50%
1.2 Ⅱ型鸭肝炎病毒
Ⅱ型鸭肝炎病毒(DHV typeⅡ)属于星状病毒科(Astrovirus),在电子显微镜下,病毒颗粒形状呈特征性的带有顶角的形状,直径约28～30nm。可耐受氯仿,pH3.0和50℃6min,甲醛等消毒剂对其有效。Ⅱ型DHV经尿囊腔接种鸡胚盲传几代后,可在鸡胚中增殖,但不能在鸭和鸡的细胞培养物中增殖。
1.3 Ⅲ型鸭肝炎病毒
Ⅲ型鸭肝炎病毒(DHV typeⅢ)在鸭肾细胞中呈晶格状排列,病毒粒子直径约30nm。Ⅲ型DHV同样耐受氯仿,pH3.0,但50℃6min能杀灭一定量的病毒。鸭胚初次接种,死亡无规律性,一般在接种后8～9d死亡,传代可是毒力增强,死亡时间缩短。被感染鸭胚绒毛尿囊膜水肿,比正常时增厚约10倍,病灶表面有干酪样物质,胚体发育不良,水肿皮肤表面出血,肝,肾和脾肿胀,鸭胚或雏鸭的肝或肾可以用于增殖病毒。
2 鸭病毒性肝炎的流行病学特征
2.1 Ⅰ型DVH
在自然条件下,Ⅰ型DVH仅发生于雏鸭。即使在污染的环境中,成年的种鸭也无临诊症状,产蛋率不受影响。经研究又发现,在感染后出现症状未死的雏鸭直肠粪便和肝脏中未检测到DHV,而出现症状死亡雏鸭的肠道和肝脏均检出DHV,在感染后的雏鸭脑组织中均能检测出DHV。雏鸭从出现典型症状到死亡一般只有几分钟到几个小时,因此认为被感染的雏鸭从出现症状即向外排毒。DHV强毒在肝脏中大量繁殖并损伤肝脏,经胆道进入肠道并排出体外,成为重要传染源。无论是接种或同居感染DHV强毒的成年鸭,在其直肠粪便和肝脏中均能测出DHV。这是成年鸭与雏鸭感染DHV的一个重大区别。认为DHV强毒对雏鸭有致病能力是因为病毒能进入雏鸭脑组织。成年鸭感染DHV强毒不发病是由于病毒不能进入脑组织。该病一年四季均可发生,雏鸭的发病率为100%,1周龄雏鸭的发病率可达95%,而1～3周龄的雏鸭病死率为50%或更低,4～5周龄雏鸭的发病率和死亡率都很低。Toth等证实该病一般不经垂直感染。
2.2 Ⅱ型DVH
Ⅱ型DVH只能感染鸭,感染可通过口腔、泄殖腔和皮下注射发生。雏鸭感染后ld内死亡,幸存鸭感染后至少排毒1周。野禽、鸥和其它野鸟可能是其媒介。
2.3Ⅲ型DVH
Ⅲ型DVH不如Ⅰ型DHV感染严重,病死率很少超过30%。Ⅲ型DHV一般只感染雏鸭。
流行病学调查研究表明,在中国广泛流行的毒株绝大多数为DHV-1及其变异株和N-DHV,二者之间基本没有交叉保护,用于制作疫苗或抗体的毒株一般仍为DHV-1,可能是当前鸭病毒性肝炎得不到有效控制的主要原因。加之细菌病和病毒病并发的情况不断发生,鸭肝炎发病率和死亡率均呈上升趋势,养鸭比较集中的地区都遭受了巨大的经济损失和严重的威胁。
3 鸭病毒性肝炎的诊断
3.1 临床诊断
本病多发于1～3周龄雏鸭,以发病快、传播快、死亡率高为主要特点,典型的角弓反张死征和特征性的肝脏出血可作初步诊断。近年来,临床上出现在较大日龄鸭群或已免疫接种的鸭群发生本病时,常缺乏典型的病理变化,仅见肝脏稍肿大、瘀血,表面有末梢毛细血管扩张破裂而无严重的斑点状出血,易造成误诊漏诊,须经病原分离与鉴定来确诊。临床上诊断鸭病毒性肝炎还应注意与曲霉菌病、雏鸭副伤寒、禽霍乱等鉴别。
3.2 实验室诊断
3.2.1 病原分离
采病死雏鸭肝脏经处理后接种于10日龄鸭胚、14日龄番鸭胚、9日龄的鸡胚以及鸡鸭胚的成纤维细胞进行病毒分离。但是Ⅰ型DHV不能凝集任何动物的红细胞,在成纤维细胞中可以增殖又不容易引起细胞病变,因此必须通过一系列的实验室检测来确定是否分离到该病毒。
3.2.2 抗原检测
用于检测DHV抗原最直接的方法是利用电镜检测,该方法对病毒纯度要求非常高。可用梯度离心方法,把含病毒的尿囊液先1000rpm离心30min,取上清液再25000rpm离心90min,沉淀后用双蒸水重悬得到较高纯度病毒。此外,血清学方法也可以进行抗原检测,如ELISA、琼脂扩散试验、荧光抗体等。
3.2.3 抗体检测
采用血清学方法检测DHV抗体。秦智锋等建立了鸡胚中和试验和雏鸭中和试验,结果表明高免血清中和保护率为100%。周学利等(1998)利用SPA能与鸭血清中IgG分子Fc段结合的特点,用酶标SPA分别进行斑点免疫,斑点ELISA及鸡胚中和试验,该方法的进一步研究有较大的应用价值。杨奎等采用过碘酸钠法将辣根过氧化酶标记纯化的DHV上,建立检测DHV抗体的Dot—ELISA法,该方法特异性好,与鸭瘟和小鹅瘟血清没有交叉反应,重复性高,与间接ELISA方法的符合率达100%。
4 防治
4.1 被动免疫
在此病开始发生时可用抗血清及卵黄抗体进行紧急被动免疫及治疗。抗血清可利用将屠宰的废鸭作二次免疫后采集。卵黄抗体来自高免种鸭所产的蛋的卵黄以生理盐水制成1:2的悬液。以上制品及供制造制品的鸭需严格检疫,以免制品带有病原微生物。
4.2 主动免疫
康复鸭具有坚强的免疫力,在一定时期内带毒。
4.2.1 弱毒疫苗
这类疫苗一般是将DHV通过鸡胚或鸭胚传代而使其对鸭的毒力减弱而成。当本病开始发生时,在抗血清缺乏的情况下,可将其用于紧急预防。弱毒苗有排毒现象。存在的问题是疫苗毒株通过雏鸭传代可使其毒力返强。
4.2.2 灭活疫苗
鸭肠炎病毒 篇6
近年来随着PCR技术的发展与推广, 为疾病诊断方面提供了有力的技术支持。等温核酸扩增技术 ( 即NASBA) 即由此发展而来, 与传统的PCR诊断方法相比, NASBA在特异性和敏感性方面具有一定的优势, 同时由于NASBA不需要扩增仪, 相对操作更加简便, 具有较好的发展前景[1]。目前来讲, 在一些病毒的诊断方面 (如禽流感、口蹄疫等) 已经得到了广泛的使用[2]。就鸭肝炎病毒 (DHV) 的NASBA检测来看, 国内尚无报道。本文旨在建立DHV的NASBA的检查方法, 为DHV的检测诊断提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验毒株
鸭病毒性肝炎JL11 株由本课题组保存。
1.1.2 试剂
总RNA提取试剂盒购自上海宝生物公司, DNA提取试剂盒购自OMEGA公司, 相关反应酶均购自takara试剂公司。
1.1.3 仪器
移液器, 水浴锅, 无菌操作台, PCR仪, 高速离心机, 电泳仪等。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成
应用Bio Edit和Blast N进行设计, 根据Gen Bank中JL11 株 (登录号KJ577601.1) 基因保守序列设计NASBA引物及探针。
S: 5’-TGGGCTAATGGTCTTCGT-3’
tm:53.2 cg:50.0
A: 3’-GTCTGGAGCAATCGCAAC-5’
tm:53.8 cg:55.6
探针:TGATGCAAGGTCGCATATGAG
1.2.2 病毒总RNA的提取
Trizol法提取
1.2.3 NASBA扩增体系的建立
经过多次试验调整, 最终确定优化后的20 μL反应体系如表1 (其中酶混合物包括BSA 2.6 μg、核糖核酸酶H 0.2 u、T7 RNA聚合酶40 u, AMV反转录酶8 u) :
其中, 酶混合物需待其他试剂均加入并65 ℃反应5 min, 41 ℃反应5 min后加入, 之后混匀41 ℃水浴2 h[3]。进行琼脂糖电泳加以鉴定。
1.2.4 特异性试验
阅读RNA提取试剂盒, DNA病毒提取试剂盒使用说明, 按步骤分别提取DHV、GPV、新城疫lasota、鸭瘟及鸭胚普通尿囊液中的总RNA或DNA。使用上述RNA及DNA作为模板进行NASBA的特异性实验, 其中DHV作为阳性对照。
1.2.5 敏感性试验
将提取的DHV总RNA进行10 倍梯度稀释, 将这4 个自100 ~ 103 稀释倍数模板分别进行RT-PCR和NASBA检测, 来判定NASBA方法相对PT-PCR方法的敏感性。
1.2.6 重复性试验
提取的DHV总RNA, 按NASBA方法进行10次检测, 来判定NASBA方法的稳定性。
1.2.7 临床样品检测
将实验中保存的鸭病毒性肝炎病料30 份, 提取总R N A , 使用病毒分离法、RT-PCR方法、NASBA方法分别进行检测[4], 验证其实际应用情况。
2 结果
2.1 特异性试验
根据实验结果可知, 仅有2 泳道鸭肝炎阳性对照扩增出明显条带, 大小为250bp。
2.2 敏感性实验
根据图2、图3 电泳结果, 使用同一DHV模板, NASBA可以检测到104 倍稀释度, 而PCR可以检测到102 倍稀释度, 说明该方法于PCR方法相对比, 敏感性更高。所示采用NASBA其最小检出量为10 ng/μL, RT-PCR的检出量为100 ng/μL。
2.3 重复性实验
使用NASBA方法对相同鸭病毒性肝炎病毒模板进行重复性试验, 结果表明, 连续10 次试验, 均得到相同的结果, 说明NASBA检测方法具有良好的稳定性。
2.4 临床样品检测
如表2 所示, 在检测的30 份病料中, 使用病毒分离法, 可以得到25 份疑似阳性病料 (83%) , 使用RT-PCR法, 可以检测出20 份阳性病料 (66%) ;NASBA检测出24 份阳性病料 (80%) 。结果显示NASBA与病毒分离的相同结果数百分比为96%, NASBA与RT-PCR的符合率为100%, NASBA方法检出率高于RT-PCR法。
3 讨论
本研究建立的NASBA检测方法能检测到标准品最小值为10 ng/μL, 与常规的RT-PCR法相比, 敏感性是其10 倍;该方法对鸭病毒性肝炎病毒的检测, 结果稳定为阳性, 而对其它常见动物病毒基因的检测, 结果稳定为阴性, 表明本法在特异性方面, 具有良好的表现。使用NASBA方法与传统病毒分离鉴定阳性符合率为96%, 与RT-PCR法比较, 阳性符合率为100%, 验证了本检测方法在实际样品检测中的准确性, 且NASBA检测方法在检出率上明显高于RT-PCR法。
NASBA检测方法反应灵敏度高, 耗时短, 特异性强, 出现假阳性结果几率较低。本方法在鸭病毒性肝炎病毒的检测方面, 具有高效、灵敏、特异等特点, 在一些临床诊断较困难的情况下, 如潜伏期、持续性感染等, 本方法具有实际应用价值。相对于常规的RT-PCR方法, NASBA检测不需要扩增仪, 且用时更短, 这在实际操作也更易被人们所接受, 也便于其在基层推广。
参考文献
[1]高闪电, 等。NASBA (依赖核酸序列的扩增) 技术及其在病毒检测中的应用[J], 中国生物工程杂志, 2009, 29 (1) .
[2]张荣升, 等。NASBA技术及其在畜禽病毒检测中的应用[J], 动物医学进展, 2011, 32 (7) .
[3]张英英, 等。核酸序列依赖性扩增技术 (NASBA) 概述[J], 重庆医科大学学报, 2008, s1-0105~02;
鸭肠炎病毒 篇7
1材料与方法
1.1试验材料I型鸭肝炎病毒标准毒株购自中国兽药监察所;抗I型鸭病毒性肝炎病毒标准阳性血清由福建农林大学动科学院动物保健研究所惠赠;SPF鸡胚购自山东SPF种鸡场;雏番鸭购自莆田某鸭场1日龄非免疫雏番鸭。
1.2待检病料取自洛江区某2家番鸭养殖场1~14日龄死亡雏番鸭的肝脏, 肝脏呈现肿大、出血点、出血斑的典型症状, 临床诊断为疑似鸭病毒性肝炎病毒感染。命名为MJ株和HS株。
1.3病料处理无菌采取病死雏番鸭肝组织, 剪碎后放入研钵中, 加入PBS研磨后, 加入双抗, 将悬液4 000 r/min离心30 min, 取上清液, 0.22μm滤器过滤, 分装过滤液 (病毒液) 于-70℃保存备用。
1.4细菌分离无菌取病死雏鸭肝脏, 接种于普通琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板, 置37℃恒温箱和CO2培养箱48 h, 观察细菌生长情况。
1.5鸡胚接种每次取0.2 m L病毒液接种10枚9日龄SPF鸡胚尿囊腔, 每天照蛋观察3次, 连续3~5 d, 收获24 h后死亡鸡胚尿囊液和胚体, 经普通琼脂培养基杂检, 连续传代5次。
1.6分离毒株鸡胚半数致死量 (ELD50) 测定2个分离毒株第5代尿囊液分别作6个稀释度, 即10-3~10-8, 每个稀释度取0.2 m L接种5枚鸡胚, 置37℃孵化, 每天观察记录结果, 6 d后按Reed-Muench法计算ELD50。
1.7鸡胚中和试验取2个分离毒株第5代尿囊液稀释至200 ELD50, 分别与I型DHV阳性血清等量混合, 37℃水浴1 h, 取0.2 m L接种SPF鸡胚, 同时设标准毒株、分离毒株、生理盐水作对照, 每天照胚3次, 观察6 d, 记录死亡胚数。
1.8氯仿敏感性试验取2个分离毒株第5代尿囊液2 m L, 加入96μL氯仿, 4℃振荡10 min, 5 000r/min离心5 min, 吸取上层液, 连续10倍稀释, 取10-3-10-75个稀释度, 每个稀释度0.2 m L接种鸡胚5枚, 37℃孵化, 每天照胚3次, 记录死亡胚数, 观察6 d, 测ELD50。对照病毒液加入96 u L生理盐水, 作同样的处理和滴定。氯仿处理病毒液的滴定比对照病毒液下降2个对数以上者, 判为对氯仿敏感。
1.9动物回归试验选择无鸭病毒性肝炎母源抗体的1日龄雏番鸭40羽, 分为4组。分别取2个分离毒株第5代尿囊液, 按照0.2 m L/羽攻毒剂量, 采10-5.34/0.2 m L、10-4.68/0.2 m L, 对照组病毒的ELD50分别为10-6.3/0.2 m L、10-5.49/0.2 m L, 表明2株分离毒株对氯仿不敏感、无囊膜。
2.6动物回归试验2株分离毒株分别接种感染1日龄雏番鸭, 对雏番鸭的致死率分别为80%和70% (见表1) , 死亡时间多数集中在72 h以内, 症状表现为短时间内停止运动, 蹲伏并半闭眼、打盹、倒卧, 两腿痉挛性后伸, 头向后背, 一般在出现症状后约1 h死亡, 死亡雏番鸭呈“角弓反张” (见图1) , 剖检死亡雏番鸭, 肝脏肿大、出血, 表面有出血斑、出血点 (见图2) , 上喙淤血, 胆囊胆汁充盈, 呈青褐色;有的可见肾脏出血点、脾脏坏死。
取腿部肌肉注射方式对第1组、第2组各10羽番鸭进行攻毒。第3组为标准强毒株对照, 第4组为生理盐水对照, 方法均同上。4组试验番鸭均隔离饲养, 每天记录番鸭发病和死亡情况, 并对死亡雏番鸭进行剖解。
2结果与分析
2.1病毒分离病毒液接种鸡胚传代6次, 从第2代开始, 接种的鸡胚多数在60~120 h出现死亡。病毒液在鸡胚上传代4次后, 鸡胚死亡多集中在48~72 h, 死亡鸡胚发育不良, 全身出血, 肝脏有出血点或出血斑, 收集该鸡胚病毒尿囊液, 置-70℃保存备用。
2.2细菌分离死亡雏番鸭肝脏经普通琼脂、巧克力琼脂和麦糠凯琼脂平板培养, 均无细菌生长。
2.3鸡胚中和试验2株分离毒株与I型DHV阳性血清等量混合后接种鸡胚, 均未见鸡胚死亡, 病毒标准毒株对照组鸡胚全部死亡, 表明2个分离毒株均能被I型鸭病毒性肝炎阳性血清中和。
2.4分离毒株ELD50测定通过对分离毒株2次重复试验, 按Reed-Muench法计算出分离株MJ5和HS5在鸡胚中的半数致死量分别为10-6.32/0.2 m L、10-5.49/0.2 m L。
2.5氯仿敏感试验2株分离毒株经氯仿处理后接种鸡胚, 9枚鸡胚均死亡, 与对照组结果没有差异。经氯仿处理后MJ5株、HS5株病毒的ELD50分别为3讨论与小结
1) 1950年, Levine首次报道运用鸡胚中和试验开展DHV-I的诊断[6]。1969年, Hwang研究表明运用鸡胚中和试验开展DHV-I诊断, 试验准确、重复性好。目前鸡胚中和试验仍然是公认的权威方法, 因此, 运用鸡胚中和试验, 对洛江区域内分离的疑似鸭肝炎病毒株进行鉴定, 但鸡胚中和试验存在操作程序多、费时的缺点, 不适于快速诊断, 对于快速、特异、操作方便并适用临床大量样品的检测, 可参照Yang M等成功建立的RT-PCR检测方法进行[7]。
2) 试验从疑似鸭病毒性肝炎的病死鸭病料中分离到2株病毒, 该病毒能致死鸡胚, 病毒能被Ⅰ型鸭肝炎病毒标准强毒高免血清特异性中和;病毒人工感染3日龄雏番鸭, 在很大程度上复制出了DVH的流行特点, 如发病急、病程短、病死率高, 其临床症状及剖检病变与自然感染病例相同, 结果表明洛江辖区内分离的2株病毒为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒。
3) 试验表明, 洛江辖区内番鸭养殖业存在鸭病毒性肝炎流行, 若疫情被延误, 对雏鸭的致死率可达90%, 辖区、镇兽医部门和番鸭养殖场业主应高度重视, 督促指导辖区内番鸭养殖业主落实防疫、消毒、自繁自养和全进全出等疫病防控措施, 尤其是要把好免疫关, 制定合理的免疫程序, 应用疫苗进行预防接种, 减少该病的发生, 对于无母源抗体的雏番鸭, 在l~3日龄采用饮水方式用鸭病毒性肝炎弱毒疫苗免疫1次, 可有效防控雏鸭发病;对于种鸭, 在开产前间隔15 d接种2次鸭病毒性肝炎疫苗, 之后隔3~4个月加强免疫1次, 可以保证雏鸭具有较高的母源抗体, 获得较好的保护。
摘要：从洛江区临床发病鸭分离到2株病毒, 2株分离病毒能够致死鸡胚, 能被Ⅰ型鸭病毒性肝炎标准强毒高免血清特异性中和。分离毒株在鸡胚上传代培养, 并测定ELD50分别为10-6.32/0.2 m L、10-5.49/0.2 m L;经动物回归试验, 对1日龄雏番鸭的致死率分别为80%和70%, 雏番鸭出现明显的角弓反张姿态, 剖检可见肝脏出血斑、出血点, 为鸭病毒性肝炎的典型症状, 表明分离到的病毒为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒 (DHV-I) 。
关键词：鸭病毒性肝炎,分离,鉴定
参考文献
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[2]郭玉璞, 潘文石.北京鸭病毒性肝炎血清型的初步鉴定[J].中国兽医杂志, 1984, 10 (11) :2-3.
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[6]Levine.P P.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America[J].Cornell Veterinarian, 1950, 40 (4) :71-86.