A群轮状病毒性肠炎（精选3篇）
A群轮状病毒性肠炎 篇1
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪A群轮状病毒(Porcine rotavirus,RV)被认为是引起仔猪胃肠炎的主要病原[1]。这三种病毒能引起不同生长阶段猪的高度接触性腹泻,其临床症状、病理变化和流行病学特点极为相似,PEDV和TGEV对哺乳仔猪的致死率很高(30%~80%);RV是引起仔猪散发性腹泻的主要原因,致死率低,但若与致病性大肠杆菌混合感染,会带来严重的经济损失[2,3]。
由于PEDV、TGEV及RV有相似的临床表现和剖检变化,其鉴别诊断通常需要借助实验室诊断技术[4],如免疫荧光试验、病毒分离、PCR技术等[5]。传统的诊断技术,如免疫荧光试验、病毒分离等费力费时,不适合用于临床的快速诊断,也不适合用于大规模的流行病学调查;PCR技术具有很强的特异性,很高的敏感度;而多重PCR技术能够在一个扩增反应中同时检测多种病原体,在实验室诊断中具有较突出的优势。
本研究旨在建立一种能够快速检测PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR体系,并用于临床样本的检测,现将结果报道如下。
1 材料
1.1 疫苗、病毒
猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-猪轮状病毒三联弱毒疫苗,购自哈尔滨维科生物技术开发公司;猪瘟病毒(CSFV),购自广东永顺生物制药有限公司;猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)、细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、沙门氏菌、大肠杆菌,由天津市畜牧兽医研究所实验室提供;牛病毒性腹泻病毒(BVDV),由美国明尼苏达大学赠送;TGEV、PEDV、RV阳性质粒p MD-S、p MD-M和p MD-VP7,由天津市畜牧兽医研究所实验室制备;疑似病毒性腹泻粪样,采自天津、河北等地区发病猪场。
1.2 主要试剂
TRIzol试剂、反转录酶、RNA酶抑制剂、r Taq DNA聚合酶、d NTPs、100 bp DNA Marker、DL-2 000Marker,购自Ta KaRa公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.3 引物的设计与合成
根据Gen Bank登录的TGEV S基因、PEDV M基因及RV VP7基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计特异性扩增引物,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,多重RT-PCR引物设计见表1。
2 方法
2.1 病料处理
用p H值为7.4的PBS缓冲液将猪腹泻粪便样品稀释成浓度为100 g/L的悬液,4℃、3 000 r/min离心30 min;取上清液,于-70℃保存,备用。
2.2 RNA提取
采用TRIzol法提取RNA。取200μL待检样品分别加入TRIzol Reagent 600μL,振荡混匀,室温作用5 min;加入200μL氯仿,振荡混匀,室温作用5 min;4℃、12 000 r/min离心10 min;取上清液至新的1.5 m L离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温放置15 min;4℃、12 000 r/min离心10 min;弃上清液,用500μL 75%乙醇洗涤;4℃、12 000 r/min离心10 min;自然干燥,用20μL DEPC水溶解。
2.3 c DNA合成
反转录体系(总体积为20μL):50 pmol/μL RNA模板10μL,5×RT Buffer 4μL,随机引物1μL,d NTP Mix 2μL,Mg Cl22μL,40 U/μL RNA酶抑制剂0.5μL,5 U/μL反转录酶0.5μL。
反应程序:30℃10 min;42℃60 min,99℃5 min,4℃5 min;c DNA合成结束后,进行PCR扩增或-20℃保存,备用。
2.4 单项PCR最佳退火温度的确定
以PEDV、TGEV、RV的c DNA为模板,分别应用表1中的3对引物进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积为20μL):10×PCR Buffer 2μL,2.5 mmol/L d NTPs2μL,Mg Cl21μL,上、下游引物各1μL,5 U/μL r Taq DNA聚合酶0.5μL,c DNA模板5μL,用去离子水补至20μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃30 s,退火温度分别为54℃、56℃、58℃、60℃、64℃,72℃45 s,共30个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存,备用。
2.5 多重PCR引物浓度的优化
在单对引物扩增成功的基础上,将表1中的3对引物同时加到扩增体系中,建立多重PCR扩增反应体系,对多重PCR反应体系的引物浓度进行优化。PCR结束后,取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2.6 多重PCR特异性试验
以CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV、JEV、BVDV、大肠杆菌、沙门氏菌等病原体的核酸为模板,同时以TGEV、PEDV、RV为阳性对照,进行同等条件下的多重PCR扩增,反应结束后取5μL反应液用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.7 多重PCR敏感性试验
将p MD-S、p MD-M和p MD-VP7阳性质粒稀释为1×101~1×105拷贝/μL,每种标准品取1.0μL,加到同一多重PCR反应体系中,验证所建立方法的敏感性。反应结束后取5μL反应液用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.8 多重PCR的临床检测
采集天津、河北等地区的疑似病料样品78份,用已建立的多重PCR方法检测,并分析检测结果。
3 结果与分析
3.1 单项PCR最佳退火温度的确定
采用不同退火温度对PEDV、TGEV、RV进行PCR扩增,退火温度范围为54~64℃,结果5个温度都有目的条带,其中PEDV的最佳退火温度为60℃和64℃,5个退火温度均能扩增TGEV和RV,见图1~3,为防止非特异性扩增,本试验选定64℃作为退火温度。
M.DL-2 000 Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
M.100 bp DNA Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
M.100 bp DNA Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
3.2 多重PCR引物浓度的确定
通过对引物浓度的摸索,结果表明:PEDV的上、下游引物浓度各为0.7μL,TGEV的上、下游引物浓度各为0.75μL,RV的上、下游引物浓度各为0.6μL,该条件下扩增效率最优,见图4。最终PCR反应体系(总体积为20μL):10×PCR Buffer 2μL,2.5 mmol/L d NTPs 2μL,Mg Cl21μL,3对引物(各单条引物终浓度均为10μmol/L)分别为PEDV引物0.7μL、TGEV引物0.75μL、RV引物0.6μL,5 U/μL r Taq DNA聚合酶0.5μL,c DNA模板2μL,用dd H2O补充至20μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸45 s,共30个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存,备用。
M.DL-2 000 Marker;RV、PEDV和TGEV引物量分别为:1.1μL、1μL、1μL;2.0.6μL、0.7μL、0.75μL;3.0.5μL、0.6μL、0.6μL;4.0.3μL、0.4μL、0.3μL。
3.3 多重PCR特异性试验
对PEDV、TGEV和RV进行多重PCR扩增,同时对猪常见的病毒病病原进行PCR扩增,结果显示,多重PCR仅扩增出PEDV、TGEV和RV的目的条带,而未曾扩增出其他病毒,说明本试验建立的多重PCR具有很好的特异性,见图5。
M.100 bp DNA Marker;1.CSFV;2.PRRSV;3.PRV;4.PCV-2;5.PPV;6.JEV;7.BVDV;8.大肠杆菌;9.沙门氏菌;10.PEDV阳性对照;11.TGEV阳性对照;12.RV阳性对照;13.PEDV+TGEV+RV阳性对照;14.空白对照。
3.4 多重PCR敏感性试验
以已测得的含目的片段的阳性质粒作为模板,稀释成1×101~1×105拷贝/μL的5个不同浓度,进行PCR扩增反应,结果见图6。
由图6可知,最低检测浓度为1×102拷贝/μL。
3.5 多重PCR的临床检测
应用建立的多重PCR方法对天津和河北等地区的78份疑似腹泻粪样进行检测,结果在78份样品中检测到PEDV阳性37份,阳性率为47.44%;TGEV阳性10份,阳性率为12.82%;RV阳性4份,阳性率为5.13%;PEDV、TGEV和RV均为阳性2份,阳性率为2.56%。该试验结果表明,阳性样品的PCR检测结果出现3条特异性片段,可用于临床病例的检测与诊断。
M.DL-2 000 Marker;1.空白对照;2.1×105拷贝/μL;3.1×104拷贝/μL;4.1×103拷贝/μL;5.1×102拷贝/μL;6.1×101拷贝/μL。
4 讨论
1)本试验针对TGEV S基因、PEDV M基因及RV VP7基因保守序列设计引物,建立了检测3种病毒的多重PCR方法,扩增得到的特异性片段长度分别为299 bp、437 bp和639 bp,目的片段之间具有明显的长度差异,便于鉴别,而且单对引物的扩增特异性强,扩增效率高。
2)在多重PCR方法建立过程中,引物是最关键的因素。在引物设计时,除了考虑每对引物的特异性及扩增效率之外,还应尽量减少不同引物之间形成二聚体和交叉配错的可能。此外,还需要对各对引物浓度配比及退火温度等条件进行优化,以便确定最佳反应体系和最佳反应温度。
3)本试验所建立的TGEV-PEDV-RV多重PCR方法具有较高的敏感性,能检测出1×102拷贝/μL浓度的阳性质粒模板。该方法和传统PCR方法检测单一病原体相比具有较大优势,能同时检测3种病原,且具有方便、灵敏、快捷等优点,适于动物疫病的流行病学调查和临床病例的快速检测。
4)应用本试验所建立的TGEV-PEDV-RV多重PCR对78份疑似腹泻粪样进行检测,结果表明,多重PCR方法不仅省时、省力,而且具有敏感性高、特异性强等优点,具有较高的实用价值。
参考文献
[1]蔡汝健,张乐宜,宋长绪.2010—2013年华南地区猪流行性腹泻病流行情况调查及防控效果[J].广东农业科学,2013(11):104-106.
[2]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997.
[3]PRABHA S,VERGHESE S.Detection of porcine rotavirus from tissue and faecal specimens[J].Indian J Med Microbiol,2009,27(2):149-152.
[4]邓小红,吕立新,陶庆园,等.猪病毒性腹泻病的实验室诊断[J].畜牧业,2004(1):49-50.
[5]尹宝英,吴旭锦,熊忙利.猪流行性腹泻诊断方法研究进展[J].动物医学进展,2013,34(12):156-159.
A群轮状病毒性肠炎 篇2
1 材料与方法
1.1 研究对象
选取2011年1月至2011年12月入住青岛市某儿童医院神经康复科的患儿为调查对象, 对其大便进行A群轮状病毒抗原检测。
1.2 试剂
北京万泰生物技术公司A群轮状病毒检查试剂盒
1.3 方法
对2011年1月至2011年12月入住青岛市某儿童医院神经康复科的患儿均进行A群轮状病毒抗原检测, 查看其是否发生轮状病毒感染。检测方法按照试剂说明书进行。
1.4 统计学方法
应用SPSS13.0软件进行统计学分析, 采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2011年1月至2011年12月入住青岛市某儿童医院神经康复科的患儿322人, 其中住院期间发生腹泻患儿25人, 轮状病毒检测阳性20例, 以秋冬春季为主, 其中冬季12例 (60%) , 秋季6例 (30%) , 春季2例 (10%) , 夏季0例, 发生轮状病毒感染者均为6个月-2岁患儿, 其中年龄<7个月2例 (10%) , 7个月～1岁9例 (45%) , 1～2岁8例 (40%) , >2岁1例 (5%)
3 讨论
轮状病毒是导致秋冬季节儿童腹泻的重要病原体[2]。小儿脑性瘫痪 (PC) 简称脑瘫, 是一种严重危害儿童健康的疾患, 主要表现为种属性运动障碍和姿势异常, 同时伴有智力、语音、视觉、听觉障碍。脑瘫患儿在住院康复过程中发生轮状病毒感染, 不仅延迟了患儿的康复, 而且也增加了家长的经济负担。
有关脑瘫儿童住院期间发生轮状病毒感染的情况未见报道, 本研究发现, 我院神经康复科脑瘫患儿发生轮状病毒的感染率为6.21%, 发生季节以秋冬季为主, 发病年龄主要为<2岁患儿, 与赵丹洋等[3]报道基本一致。我院发生轮状病毒感染均为散发, 且发病患儿或家长有明显的离开病区或接触轮状病毒感染者经历。因我院对医务人员的手卫生等制度要求严格, 为发现可疑医务人员导致的感染[3]。
调查显示, 儿童神经康复科患儿因住院时间较长, 对院内环境相对较为熟悉, 因此患儿或家长经常到本病区以外的地方走动的或活动, 加之脑瘫患儿本身免疫力相对较低, 是造成患儿发生轮状病毒感染的主要原因。
综上所述, 为降低脑瘫患儿轮状病毒感染的发生。在轮状病毒易感季节, 需限制患儿或家属到本病区以外的地方活动;患儿或家属外出归来或进入病区建议执行严格的手卫生消毒制度;适当情况下可以考虑对处于高发年龄阶段的神经康复科患儿应用增强免疫力的药物。
参考文献
[1]赵丹阳, 邹宝兰.儿童医院感染轮状病毒经济损失的病例对照研[J].中华医院感染学杂志, 2009, 19 (18) :2426-2428
[2]梁英怡, 肖华, 喻玫, 等.神经康复患儿医院感染及其危险因素研究[J].中国康复医学杂志, 2009, 24 (7) :647-649
A群轮状病毒性肠炎 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择年龄6个月~3岁的腹泻患儿188例,诊断均符合《诸福棠实用儿科学》[1]腹泻诊断和分型标准。临床表现为大便检测呈黄绿色或蛋花汤样水便,每日5~12次或更多,大多患儿有轻、中度脱水,少数为重度脱水。大便检验主要为脂肪滴及少量白细胞,大便培养阴性,血常规检验白细胞正常或下降、淋巴细胞增高,体温轻者37.6℃以上,重者可达39.7℃,大便A群轮状病毒抗体均为阳性。均诊断为A群轮状病毒性腹泻。其中,男92例,女96例,平均年龄13.5个月,病程1~5 d。随机分为两组:治疗组94例,男44例,女50例;对照组94例,男48例,女46例。两组患儿在年龄、性别、病程、症状、实验室检验以及脱水程度等方面经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。
1.2 治疗方法
对照组:均不用抗生素及止泻收敛药,给予口服补液盐,纠正脱水及酸中毒,并调整饮食等对症治疗。
治疗组:在常规治疗基础上加用经皮给药治疗仪(S2-Ⅲ型,河南三浪公司生产),中药贴片组成:药用党参、白术、山药、陈皮、茯苓、山楂等,中药贴片直径为4.5 cm,厚度为0.2 cm,由河南三浪医疗新技术有限公司提供。治疗时将2个电极分别置于2个药片上并固定于2组穴位上,选用神阙穴、天枢穴、关元穴或足三里穴,根据年龄大小调节好治疗参数,开机治疗时间30 min,温度39~40℃,强度5~8级,1次/d,3 d为1个疗程。
1.3 疗效评定标准
参照方鹤松《腹泻治疗疗效判断标准的补充建议》[2]中有关标准。显效:治疗72 h,粪便性状及腹泻次数恢复正常,全身症状消失。有效:治疗72 h,粪便性状明显好转,腹泻次数减少50%以上,全身症状改善明显。无效:治疗72 h,粪便性状及腹泻次数改变未达有效标准,全身症状无好转甚至恶化。
1.4 统计学方法
应用SPSS13.0软件行统计学处理。计数资料采用χ2检验,P<0.05为有显著性差异。
1.5 护理
1.5.1 治疗护理
治疗前给家长做好解释工作,说服父母配合治疗,建立良好的护患关系。治疗时正确调试治疗仪:参数要灵活掌握,根据患儿体温、环境温度调节温度指数,天气寒冷时,可先将贴片预热后再使用以免给患儿造成不良刺激。治疗强度及时间按年龄大小调节,强度为5~8级,时间不超过30min。对高热的小婴儿,要避免灼伤患儿皮肤。因小婴儿皮肤娇嫩,高热时导致皮肤表面温度高,治疗仪作用于高温度的皮肤表面,可导致局部皮肤烫伤[3]。治疗结束后,药贴尽量留置于穴位处4~8 h,让药充分吸收。治疗后观察大便次数、性质、量,以便为判断病情、评定疗效提供依据。
1.5.2 饮食护理
腹泻患儿多有营养障碍,因此继续进食是必要的治疗与护理措施。但应进食米汤、稀饭、面条或去乳糖奶粉,并加些熟的植物油,蔬菜、肉末等。但要由少到多,由淡到浓,由稀至稠,逐步增加饮食。达到减轻胃肠道负担,恢复消化功能的目的。哺乳的患儿母亲禁食油腻辛辣食物,多饮水,进清淡饮食,患儿减少喂奶次数,辅以不含乳类食物及水分。1.5.3肛周护理每次便后须用温水清洗臀部并吸干,尽量保持会阴部及肛周皮肤干燥。尽量少用纸尿片,保持透气,可减少红臀,如出现红臀可涂以5%鞣酸软膏并按摩片刻,促进血液循环。如皮肤破溃、糜烂,可外用红霉素软膏或百多邦。需特别注意的是,由于多次腹泻导致肛门有灼热感,2岁以上小孩会有意识地用手去抓,这时需注意防止小孩搔抓,以防手口传染。
1.5.4 其他护理
以预防病毒感染为主,进行健康教育。食具、衣物、尿布应专用,注意饮食卫生,食物要新鲜,食具、奶具应定时煮沸消毒。培养儿童饭前便后洗手,勤剪指甲的良好卫生习惯,以防传染。护理患儿前后要洗手,对腹泻患儿的粪便、被污染的衣被进行消毒处理,防止交叉感染。
2 结果
治疗组与对照组的显效及总有效率分别为78.72%、90.43%与38.30%、74.47%,比较有非常显著性差异(P<0.01),说明治疗组疗效优于对照组。见表1。
与对照组相比,χ2=31.64,▲P<0.01;与对照组相比,χ2=8.27,*P<0.01
3 讨论
轮状病毒感染的发病机制是轮状病毒侵犯小肠绒毛顶端的柱状上皮时,小肠的柱状上皮细胞发生一系列病理生理变化,使肠道吸收功能障碍,水分大量积聚于肠腔,引起水样腹泻,从而引起婴幼儿水电解质酸碱平衡紊乱[4]。
中医学认为,小儿腹泻均为脾阳受损,脾失健运,脾虚湿困,升降失宣而致。小儿“稚阳未充”、“稚阴未长”和“脾常不足”,其气未充,久罹腹泻,必致脾肾阳虚。故中医治疗宜着重于健脾扶正,温中燥湿。方中党参、白术、山药、茯苓健脾益气,渗湿止泻;陈皮、山楂理气除满,消食化积。经皮给药治疗仪是利用现代科技与中医学相结合的新型医疗仪器,融合了现代离子透析、电化学、生物学与药剂学疗法和穴位疗法于一身,通过其产生电场增加了离子化药物分子的驱动力,使中药有效成分在穴位吸收扩散,扩张局部毛细血管、促进血液循环,增加皮肤通透性,有利于药物渗透吸收,免去了口服和注射带来的不便和痛苦,作用持久,避免了肝脏的首过效应及胃肠道酶的干扰与降解[5]。
从本组病例治疗组和对照组治疗来看,治疗组与对照组的治愈率分别为90.43%、74.47%,比较具有非常显著性差异(P<0.01),说明治疗组疗效优于对照组,说明经皮给药结合对症护理和预防病毒感染对于治疗小儿A群轮状病毒腹泻的辅助效果明显。由于至今尚无治疗轮状病毒所致腹泻的特效药物,因此治疗过程中的护理和预防就显得尤其重要。所以经皮给药结合对症护理和预防病毒感染,能明显改善小儿A群轮状病毒腹泻的病情,临床疗效显著,值得临床推广。
参考文献
[1]胡亚美,江载芳.诸福棠实用儿科学(上册)[M].7版.北京:人民卫生出版社,2002:1289-1290.
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[3]金海燕.治疗范围内经皮给药致局部皮肤烫伤1例[J].现代中西医结合杂志,2004,13(8):98.
[4]张镇松,刘秀卿.318例腹泻婴幼儿粪便A群轮状病毒的检测与分析[J].河北医学,2009,15(6):698-699.