A型口蹄疫病毒论文（精选7篇）
A型口蹄疫病毒论文 篇1
近期, 湖北武汉、新疆、上海等地, 陆续发生牛口蹄疫疫情。国家口蹄疫参考实验室确诊三地类似口蹄疫疫情为A型口蹄疫疫情。
口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属, 是目前所知病毒中最细微的一级。其最大颗粒直径为23纳米, 最小颗粒直径为7～8纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型。A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型, 以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型, 我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型 (云南保山型) 。
口蹄疫病毒, 在病畜的内唇、舌面水疱或糜烂处, 在蹄趾间、蹄上皮部水疱或烂斑处以及乳房处水疱排出病毒最多, 其次是流涎、乳汁、粪、尿及呼出的气体也排出病毒。这种病毒在外界的存活力很强, 在污染的饲料、饲具、毛皮、土壤中可保持传染性达数月之久;在污染的冻肉中更能长时间存活, 而造成远距离运输销售传播。而阳光曝晒、一般加热都可杀灭口蹄疫病毒。
1 流行病学
本病传播虽无明显的季节性, 但春秋两季较多, 尤其是春季。风和鸟类也是远距离传播的因素之一。牛尤其是犊牛对口蹄疫病毒最易感, 骆驼、绵羊、山羊次之, 猪也可感染发病。本病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点, 疫区发病率可达50%～100%, 犊牛死亡率较高, 其他则较低。
2 临床症状
该病潜伏期1～7天, 平均2～4天感染牛精神沉郁, 闭口, 流涎, 开口时有吸吮声, 体温可升高到40℃～41℃。发病1～2天后, 病牛齿龈、舌面、唇内面可见到蚕豆到核桃大的水疱, 涎液增多井呈白色泡沫状挂于嘴边。采食及反刍停止。水疱约经一昼夜破裂, 形成溃疡, 这时体温会逐渐降至正常。在口腔发生水疱的同时或稍后, 趾间及蹄冠的柔软皮肤上也发生水疱, 也会很快破溃, 然后逐渐愈合。有时在乳头皮肤上也可见到水疱。本病一般呈良性经过, 经一周左右即可自愈;若蹄部有病变则可延至2～3周或更久;死亡率1%～2%, 这是良性口蹄疫。有些病牛在水疱愈合过程中, 病情突然恶化, 全身衰弱、肌肉发抖, 心跳加快、节律不齐, 食欲废绝、反刍停止, 行走摇摆、站立不稳, 往往因心脏麻痹而突然死亡, 这是恶性口蹄疫, 死亡率高达25%～50%。犊牛发病时往往看不到特征性水疱, 主要表现为出血性胃肠炎和心肌炎, 死亡率很高。
3 预防措施
为减少本病的发生和避免不必要的损失, 建议采取如下预防和治疗措施:规模化牛场在口蹄疫多发和高发季节, 一般多采用预防注射、隔离封场、消毒、减群等技术进行预防, 在发生疫情后常采用有限扑杀、局部封锁、紧急免疫注射、消毒、注射高免血清或康复血清等措施加以控制。
(1) 种牛的调入必须要从无口蹄疫场引种, 引种时要做好种牛及运输工具的检疫和消毒工作, 引进牛隔离饲养30日后经检疫合格方可并群, 同时建立定期、快速的动物疫病记录报告制度。
(2) 在上述严格控制外来疫源入侵的基础上, 制定合理、有效的防疫程序。 (仅供参考, 结合本场口蹄疫病毒检疫情况制定的免疫程序更合理。)
A型口蹄疫病毒论文 篇2
1 材料
大肠杆菌工程菌DH5α、BHK细胞, 石河子大学动物科技学院人畜共患病实验室提供;载体PSC11、痘苗病毒弱毒株, 均由英国剑桥大学吴长新教授馈赠;含有牛源vp1 基因 (pGMT-vp1) 的质粒, 中国农业科学院兰州兽医研究所提供;DMEM培养基和转染试剂, 购自美国Invitrogen公司;犊牛血清, 购自四季青生物公司;限制性内切酶、pMD18-T载体、T4 DNA连接酶、Taq DNA 聚合酶、DNA回收试剂盒、病毒基因组DNA快速提取试剂盒, 均购自北京百泰克生物技术有限公司;琼脂糖、DNA Marker, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司;X-Gal和T4 DNA聚合酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。
2 方法
2.1 引物的设计与基因片段的PCR扩增
2.1.1 引物的设计与合成
根据GenBank上公布的牛源O型口蹄疫病毒vp1基因序列, 利用Primer Premier 5.0软件进行分析, 自行设计1对基因引物P1、P2 (下划线部分为XhoⅠ酶切位点) 用于转移载体的构建和重组病毒的鉴定, 扩增片段为完整序列, 引物序列P1 5′-CTCGAGGGCGAGTCAGCAGACCCCGTG-3′, P2 5′-CTCGAGCGGGTGCCACAATCCTCTGCTTGTGTCT-3′。引物合成后, 用无菌去离子水稀释成工作浓度 (25 mmol/L) , -20 ℃保存, 备用。
2.1.2 vp1基因片段的PCR扩增
利用合成的引物和质粒pGMT-vp1进行PCR扩增。PCR扩增体系:10×PCR Buffer 5 μL, dNTP 4 μL, 上、下游引物各1 μL, 质粒模板1 μL, TaqDNA聚合酶3 μL, 加双蒸水至50 μL。瞬间离心, 混匀。反应条件如下: 96 ℃ 4 min;94 ℃ 50 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共30个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。扩增结束后, 取扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为 1×TAE, 以120 V恒压电泳 20 min, 用紫外检测仪观察凝胶电泳结果。
2.1.3 目的片段vp1基因的克隆
将PCR回收产物与克隆载体连接。连接体系如下:pMD18-T载体0.5 μL, SolutionⅠ 5 μL, PCR回收产物4.5 μL。将上述反应体系混匀, 16 ℃反应14～18 h以转化感受态细胞。
2.1.4 目的基因vp1重组质粒的菌液PCR鉴定及测序
方法同2.1.2, 引物也是P1和P2。选取经鉴定为阳性重组质粒的菌落做穿刺管送上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 测序引物为通用引物。
2.2 PSC11-vp1 转移载体的构建
2.2.1 PSC11转移载体的单酶切和vp1基因的补平
将环状的PSC11质粒用SmaⅠ进行单酶切, 体系如下:PSC11质粒3 μL, 10×Buffer 1 μL, BSA 1 μL, SmaⅠ 0.5 μL, 双蒸水2.5 μL。37 ℃水浴2 h。酶切后的产物经过1.5%的琼脂糖电泳后回收片段。补平步骤按T4 DNA聚合酶的说明书操作。
2.2.2 目的基因vp1与PSC11转移载体的连接
将补平后的vp1基因与用SmaⅠ单酶切后回收的PSC11转移质粒连接。10 μL连接体系如下:平滑后的vp1 4 μL, PSC11载体2 μL, 双蒸水2 μL, T4 DNA连接酶1 μL, T4 Buffer 1 μL。将上述反应体系混匀后于4 ℃反应24～36 h, 以连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。
2.2.3 PSC11-vp1菌液的PCR鉴定及测序
随机挑取14个单个菌落, 分别以P1、P2为引物做PCR鉴定, 体系和反应条件同2.1.2。选取鉴定为阳性重组质粒的菌落做穿刺管送上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 测序引物为根据P7.5启动子序列设计的引物。
2.3 转染和rVV的蚀斑筛选
2.3.1 重组病毒的转染与筛选
参照参考文献[3]进行。
2.3.2 重组病毒的PCR鉴定
提取重组病毒的基因组做PCR鉴定, 引物为P1和P2。若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现目的条带, 则说明口蹄疫病毒vp1基因已重组到VV的基因组上。
3 结果
3.1 目的基因扩增及鉴定结果
3.1.1 vp1基因的PCR扩增结果
以P1、P2为引物PCR扩增质粒pGMT-vp1中的vp1基因, 扩增产物大小约为631 bp, 结果见图1。
M.DNA Marker Ⅲ; 1, 2.口蹄疫病毒vp1;3.阴性对照。
3.1.2 vp1基因克隆的筛选与鉴定结果
目的基因片段经过连接转化, 在涂有X-gal和IPTG的LB琼脂板上随机挑取白色菌落做PCR鉴定, 结果见图2。
M.DNA Marker Ⅲ; 1～7.pMD18-T-vp1 的PCR鉴定;8. 阴性对照。
3.1.3 测序结果
取经鉴定为阳性的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 结果有1个碱基发生突变, 氨基酸序列没有改变。
3.2 PSC11-vp1转移质粒鉴定结果
3.2.1 PSC11-vp1 PCR鉴定结果
随机挑取几个单个菌落, 以P1、P2为引物做PCR, 结果见图3。
M.DNA Marker Ⅲ; 1～7.PSC11-vp1 PCR鉴定; 8.阴性对照。
3.2.2 测序结果
将鉴定为阳性的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。结果表明, vp1有1个碱基发生突变, 但经氨基酸序列分析不影响vp1蛋白的翻译。
3.3 rVV筛选检测结果
3.3.1 细胞病变观察结果
转染产物接种于培养24 h的BHK细胞单层, 镜下连续观察7 d, 结果见图4。
A.正常细胞 (第2天) ; B.正常细胞接入痘苗病毒 (第2天) ;C.正常细胞接入重组痘苗毒后出现篮斑 (第5天) ;D. 在高倍镜 下正常细胞接入重组痘苗毒后出现蓝斑。
3.3.2 rVV PCR鉴定结果
提取镜检病变孔的病毒基因组, 以P1、P2为引物做PCR检测, 出现631 bp的片段, 证明重组成功, 即所构建的重组病毒基因组中含有口蹄疫病毒vp1基因, 结果见图5。
M. DNA MarkerⅢ;1.重组痘苗病毒PCR鉴定; 2.重组痘苗病毒PCR鉴定;3.阴性对照。
4 讨论
口蹄疫是世界流行性家畜传染病, 传播速度很快, 往往造成大流行, 因其所造成的经济损失大, 政治影响坏, 又被称之为“政治经济病”。世界粮农组织和世界动物卫生组织把口蹄疫列入A类传染病第1位[4]。口蹄疫病毒最重要的抗原决定簇位于vp1上, vp1是序列依赖型表位的主要结构基础, 可诱导机体产生中和抗体, 是近年来免疫、诊断制剂研究的重点[5]。
本研究利用同源重组技术成功构建了O型口蹄疫病毒vp1基因的重组痘苗病毒, 但在试验中发现同源重组效率不高, 目前普遍认为是同源臂的长度决定的, 若转染入细胞的外源DNA不与基因组整合或缺乏动物细胞复制起点, 则其进入细胞后很快被降解或于细胞分裂过程中被稀释, 与细胞内的其他DNA序列一样, 只要有合适的启动子, 外源DNA就会表达, 这可能是导致效率低的原因之一。
如何筛选重组病毒是本研究的关键之一。在本研究中, 笔者采用了病毒的蚀斑纯化技术 (噬斑筛选最早应用于检测病毒感染后的细胞存活率) 。因为痘苗病毒的蛋白质是在细胞浆中合成的, 所以如果用一种特定的染料进行染色, 该染料首先要使报告基因所表达的蛋白产生反应, 最好是肉眼可见, 其次要对细胞没有任何毒副作用, 所以首选X-Gal进行噬斑筛选。
噬斑筛选中采用琼脂糖的作用主要是固定细胞, 选10%小牛血清的DMEM是为了给细胞提供营养, 染料是为了便于筛选。噬斑筛选的方法主要有3种:第1种就是本文用的这种单层法。该方法适用于细胞病变时间相对短的病毒。第2种就是双层法。该方法适用于细胞病变时间较长的病毒, 如马传染性鼻炎病毒, 病变需要10 d左右, 具体步骤为先铺1层不含染料的、加入含10%小牛血清的DMEM的琼脂糖, 然后待细胞病变后再铺含有染料的第2层。第3种就是挑斑法。主要是配合前两种使用, 即用枪头吸取病变部分的噬斑。本试验将蓝色噬斑放入纯的DMEM中反复冻融3次, 即得到重组病毒;离心, 取上清液, 把它接种正常的细胞扩繁, 然后再重复上述操作, 即可得到大量重组病毒。
参考文献
[1]ARMAND MA, GRANGE M P, PAULIN D, et al.Targeted expres-sion of HTLV-1 envelope proteins in muscle by DNAimmunizationof mice[J].Vaccine, 2000, 18:2212-2222.
[2]BENVENISTI L, ROGEL A, KUZNETZOVA L, et al.Gene gun-mediate DNA vaccination against foot-and-mouth disease virus[J].Vaccine, 2001, 19:3885-3895.
[3]殷震, 刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社, 1997:479-480.
[4]唐耀平.重大动物疫病防治理论与实务[M].北京:中国农业出版社, 2006:169-170.
A型口蹄疫病毒论文 篇3
1 材料与方法
1.1 待检血清
血清来源于黔西南州某县的散养和3个养殖场 (区) , 已用二价活疫苗春秋注射后的成年牛, 样品共56份, 其中养殖场 (区) 27份, 散养29份。
1.2 检测试剂及方法
采用3ABC抗体检测ELISA试剂盒, 武汉前科动物制品有限责任公司生产 (批号:130406, 生产日期:130128) 。方法按检测牛专用的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测ELISA试剂盒使用说明书操作。
2 检测结果
标准阳性血清OD值为2.245, 标准阴性血值OD值为0.092, 按试剂盒说明书计算方式:样品OD值 (S) -阴性对照孔的OD值 (N) ≥0.3判为阳性, <0.3判为阴性。结果:56份血清共检出阳性6份, 可疑1份, 见表1。
3 结果分析
3.1检测结果说明有6份血清来源的牛已感染了口蹄疫病毒或者曾经感染过口蹄疫病毒并产生了抗体;其他阴性血清的牛已进行了疫苗预防, 得到了合格的免疫抗体。
3.2养殖场 (区) 比散养户阳性率高, 因养殖场 (区) 的牛多从各地购入, 从外带毒的几率大于自繁自养的散养户牛。
3.3试验检测全县共13个乡镇, 2013年牛存栏3.2万头, 据查2006年曾大面积感染过牛O型口蹄疫, 并扑杀销毁了500余头牛, 而查出阳性牛的散养户所在的乡镇也在其中, 养殖场 (区) 牛的来源90%是在当地农户家收购。
4 小结
4.1加强该县动物检疫防疫工作, 认真做好产地检疫及种畜的调运管理工作, 对新引进的种畜应有健康证明和监测报告;搞好消毒灭源工作, 加强无害化处理设施建设, 排查口蹄疫病毒的带毒动物, 严防对传染源留有死角。
4.2非结构蛋白抗体又被称为感染抗体, 用于区别疫苗免疫抗体。但在灭活疫苗制备过程中很难彻底去除非结构蛋白, 所以接种灭活疫苗特别是反复接种灭活疫苗的动物往往也会产生非结构蛋白抗体阳性的情况, 这也常被误认为是感染抗体。因此, 感染抗体的检测对检测试剂盒要求很高, 同时改进疫苗制造过程中抗原的纯化工艺, 尽可能减少疫苗中非结构蛋白含量也是提高检测准确性的重要性[2]。
参考文献
[1]侯生库.口蹄疫病毒3ABC抗体检测结果分析[J].中国兽医杂志, 2012, 48 (3) :45.
A型口蹄疫病毒论文 篇4
1 材料
1. 1 血清样品
在13 个单位随机选取存栏100 头以上的养猪场37 个,猪只前腔静脉采血,离心收集血清,共采集571 份猪血清。采样猪场均未免疫过A型口蹄疫疫苗。
1. 2 试剂盒
A型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒,购自洛阳莱普生信息科技有限公司。
1. 3 主要仪器设备
酶标仪( 型号为Multiskan) ,赛默飞世尔( 中国)上海仪器有限公司产品; 恒温培养箱( 型号为SLI -400) ,日本东京理化器械上海工厂产品; eppendorf移液器,德国产品。
2 A型口蹄疫抗体液相阻断ELISA试验
用无离子水配制1 倍PBST缓冲液备用,在U型反应板上加50 μL PBST缓冲液,第1 孔分别加50 μL待检血清、阴性对照、阳性对照,倍比稀释。加50 μL稀释至工作浓度的病毒抗原,抗原对照孔加100 μL。振荡,封板,4 ℃ 过夜。吸取抗原抗体混合液、抗原对照50 μL转至酶标板,37 ℃ 反应30 min,洗板。加50 μL A型口蹄疫病毒抗体工作液,37 ℃ 反应35 min,洗板。加50 μL酶工作液,37 ℃ 反应35 min,洗板。加50 μL底物,37 ℃避光反应15 min,每孔再加50 μL终止液,立即在450 nm波长下读取吸光度值。
3 结果
根据试剂盒判定标准,待检血清效价≥1∶128 为A型口蹄疫阳性。检测的571 份血清中阳性样品42 份,个体阳性率为7. 36% ( 42 /571 ) 。检出阳性样品的单位有9 个,占比为69. 23% ( 9 /13) 。阳性猪场11 个,占比为29. 73% ( 11 /37 ) 。9 个检出阳性样品的单位,个体阳性率最高达15. 0% ( 6 /40) ,最低为4. 0% ( 1 /25) ,详见表1。
4 讨论
1) 接种口蹄疫疫苗或者受野毒感染都会产生口蹄疫病毒抗体,但是口蹄疫病毒7 个血清型之间没有免疫原性,即接种O型口蹄疫疫苗,只能产生O型口蹄疫抗体,不能产生其他血清型抗体。未免疫A型口蹄疫疫苗的猪,血清经检测A型口蹄疫抗体阳性,一种可能是猪群曾经感染过A型口蹄疫病毒,产生了A型抗体; 另一种可能是检测试剂的非特异性反应,或者说是检测试剂的敏感性和特异性不高,导致出现较高的假阳性率,影响检测结果的准确性。本次检测不同单位个体阳性率从4. 00% 到15. 00% 不等,5 个单位阳性率达10. 00% 以上,可以排除检测试剂非特异性反应的影响,猪群可能感染过A型口蹄疫病毒,存在A型口蹄疫疫情风险。
2) 从采样猪场生物安全水平分析,养猪场比较集中,成片建设,小区化建设,每个猪场没有相对独立的防疫屏障,粪污处理和病死猪无害化处理简单,病猪隔离措施落实不到位,猪场混养其他动物等,这些都不符合生物安全要求。同时饲养管理技术不高,部分猪场存在外购仔猪育肥现象,在检疫监管不到位的情况下,很容易引进外来疫病,加大了疫病发生风险。
3) 受易感动物种类多、口蹄疫疫苗免疫、异地调运流通、环境气候等因素影响,加快了口蹄疫病毒进化、变异进程。同一血清型又有不同亚型,各亚型之间交叉免疫程度变化幅度较大,各毒株间交叉保护性免疫也不安全。口蹄疫病毒的进化、变异增加了疫病防控难度。
A型口蹄疫病毒论文 篇5
注射口蹄疫疫苗是现阶段我国预防口蹄疫的重要手段之一,疫苗免疫工作的成功与否直接影响家畜是否能够有效抵御口蹄疫病毒的侵袭。免疫抗体的高低就是评价疫苗免疫效果的重要理论依据。试验旨在研究密山地区口蹄疫A型疫苗免疫后抗体合格率与疫苗免疫注射次数的关系,进而摸索出一套适合密山地区的口蹄疫防疫程序。
1 材料与方法
1. 1 疫苗与试剂盒
口蹄疫疫苗采用国家指定的生产口蹄疫A型疫苗的厂家生产的疫苗( 批号为20120114) ,有效期12 个月。
口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒,中国农业科学院兰州兽医研究所生产( 批号为2013 /03 /01 /03) 。
1. 2 仪器与设备
酶标仪( DNM - 9602) 、洗板机( DNM - 9602) ,北京普朗新技术公司生产; 恒温培养箱( HPX -9162MBE) ,上海博实有限公司生产; 微量振荡器,微量移液器单道5 ~ 50 μL,微量移液器单道50 ~200 μL,微量移液器200 ~ 1 000 μL,微量移液器多道5 ~ 50 μL,微量移液器50 ~ 200 μL,微量移液器200 ~ 1 000 μL,市场采购; 超纯水器( pl - 5241 ) ,美国生产。
1. 3 试验的基本设计
选择密山地区规模化奶牛场的、健康的、饲养条件和机体条件相似的90 头奶牛作为监测对象。90 头奶牛平均分为3 组,采用不同的免疫方式进行免疫,注射疫苗严格按照说明书上的剂量和方法进行。第1 组只进行一次免疫,为对照组; 第2 组在第1 次免疫后的第30 天进行1 次加强免疫,以后不再进行疫苗注射,为一次免疫加强组; 第3 组在第1 次免疫后的第30 天、60 天分别进行2 次加强免疫,为二次免疫加强组。首免时间为2013 年3 月20 日,采用肌肉注射方式。注射剂量: 成年牛每头2 m L,6 月龄以下牛每头1 m L。
3 个试验组在注射后分别进行抗体监测,并根据监测结果分析免疫方法的免疫效果。
1. 4 抗体检测方法
试验应用液相阻断酶联免疫吸附试验进行检测。
1) 用包被缓冲液稀释A型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度,在ELISA板上每孔加50 μL,振荡,封板或置室温内,室温过夜;
2) 抗原抗体反应( 2 ~ 8 ℃ 过夜) ;
3) 用洗涤液连续洗ELISA板5 次,在洗板纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相应孔,每孔50 μL,封板,37 ℃ 温育1 h;
4) 同上洗板5 次,甩干,用豚鼠抗血清稀释液稀释A型口蹄疫病毒至工作浓度,每孔加50 μL,封板,37 ℃ 温育1 h;
5) 同3) 洗板5 次,甩干,用1 × PBST液稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度,每孔加50 μL,封板,37 ℃温育1 h;
6) 同3) 洗板5 次,甩干,每孔加50 μL底物,底物务必加双氧水,37 ℃ 温育15 min,每孔再加入50 μL终止液终止反应,立即在酶标仪492 nm下读取吸光度值。
1. 5 结果判定
以病毒抗原对照孔的平均OD492值的50% 为临界值,被检血清稀释孔的OD492值> 临界值的孔为阴性,抗体不合格; 被检血清稀释孔的OD492值≤临界值的孔为阳性,抗体合格。血清阳性孔所对应的稀释度就为该被检血清的抗体效价,根据农业部的规定,口蹄疫A型免疫抗体的合格效价≥26( 64 倍) 为免疫合格,根据样品数和合格数计算合格率,群体免疫抗体合格率≥70% 判定为疫苗免疫合格。
2 结果与分析
通过以上液相阻断酶联免疫吸附试验对以上3 个试验组做了多次抗体检测,计算抗体合格率,见表1 和图1。
从表1 和图1 可以看出,A型口蹄疫疫苗免疫后抗体合格率变化情况: 对照组在免疫后60 天的合格率最高,为70% ,以后逐渐降低,免疫后100 天已经降到46. 7% ,180 天时已经降为0。 试验1 组经过1 次加强免疫,免疫合格率由60 天的66. 7% 增长到90天的90. 0% ,以后逐渐降低,150 天降到66. 7% ,180 天降到46. 7% 。而试验2 组经二次加强免疫后,抗体合格率一直保持在较高水平,180 天时为80. 0% 。
3 讨论
口蹄疫疫苗免疫是我国口蹄疫防控的重要手段,试验通过三种免疫方式进行免疫,测定抗体效价,计算抗体合格率,从而确定了在密山地区A型口蹄疫的最合适免疫方式。
试验结果表明,对照组( 试验1 组) 没有达到国家规定的免疫效果,一次免疫加强组( 试验2 组) 虽然达到了国家规定的效果,但有效免疫持续的时间比较短,能维持在大约120 d( 4 个月) ,二次免疫加强组( 试组3 组) 免疫合格率在首次免疫后180 d时免疫抗体合格率仍然达到80% ,效果较好。
A型口蹄疫病毒论文 篇6
关键词：猪圆环病毒2型,自然感染,猪口蹄疫,免疫,效果
猪2型圆环病毒 (Porcine circovirus type2, PCV-2) 是现代养猪业十分重要的免疫抑制性病原之一。目前该病毒感染流行十分普遍, 由PCV-2感染所引起的断奶仔猪多系统衰竭征 (PMWS) 和猪呼吸系统综合征 (PRDC) , 对现代养猪业危害较大, 而且由于猪在感染PCV-2后产生免疫抑制作用, 可能导致对其他猪群疫病免疫造成负面影响, 导致猪群疫病防控效果大打折扣, 对养猪业健康发展构成了现实威胁。为探究田间状态下的PCV-2自然感染猪群接种猪口蹄疫灭活疫苗的免疫效果, 并对指导和评价猪口蹄疫科学免疫提供参考依据, 笔者开展了本次试验调查。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验猪
选择具有PCV-2病史的某种猪场2013年6月2~5日出生的10窝105头仔猪群和5头成年母猪, 作为备用调查群体。
1.1.2免疫用疫苗
猪口蹄疫 (O/GX/09-7株+O/XJ/10-11株) 灭活疫苗, 中牧实业有限公司生产, 批号:1304003。
1.1.3主要检测试剂
PCV-2抗体ELISA检测试剂盒, 购自北京世纪元亨生物技术公司, 批号:PCV-20130508E;PCV-2核酸荧光PCR检测试剂盒, 购自达安基因生物技术公司, 批号:2013001、2013002。口蹄疫O型液相阻断ELISA试剂盒, 购自中国农业科学院兰州兽医研究所, 批号:2013050901。
1.2试验方法
1.2.1试验猪处理
选择该场同期分娩的10窝105头仔猪和5头成年母猪作为备用调查试验猪, 仔猪28日龄前, 死亡7头, 其余98头随机分成常规剂量免疫组 (58头) 和倍量免疫组 (40头) 。为了便于区分, 随机将实行常规剂量免疫的仔猪打上蓝色耳标, 将实行倍量免疫的仔猪打上绿色耳标, 5头成年母猪记录耳标号, 调查试验猪群与场内同期未参加试验的其他仔猪同舍饲养, 28日龄断奶。备选试验猪分组情况见表1。
1.2.2参试猪免疫及采样检测程序
试验组仔猪达35日龄时, 进行猪O型口蹄疫灭活疫苗初次免疫, 1~6窝58头仔猪按疫苗说明书, 每头仔猪颈部肌肉1 m L (1头份) , 7~10窝40头仔猪每头颈部肌肉2 m L (2头份) , 共免疫98头;达65日龄时, 按初次免疫方法再进行1次加强免疫;5头成年母猪每隔4个月免疫1次 (4 m L/头) 并于产前45 d和15 d进行2次PCV-2灭活疫苗免疫。所有参试仔猪分别于28日龄、56日龄和94日龄采血分离血清 (1 m L/头) , 5头母猪进行同期采血分离血清, 送省动物疫病预防控制中心实验室分别进行PCV-2核酸检测、PCV-2抗体检测 (间接ELISA) 和猪O型口蹄疫抗体 (液相阻断ELISA) 检测。
1.2.3临床观测指标
试验期间按该场常规要求实施生物安全及饲养管理措施, 每日观察猪群精神状态、采食状况是否正常, 生长发育状况是否良好, 一旦发现临床发病猪, 及时隔离、采样检测。28日龄断奶成活率及个体平均体重, 1~3月龄期间发病及死亡数, 3月龄时成活率及个体平均体重。
1.2.4实验室检测程序
1.2.4.1依据PCV-2荧光PCR试剂盒给出的检测方法, 分别对采集的猪血清样品进行荧光PCR检测和结果判定。试验成立条件:阳性对照Ct值≤28, 阴性对照Ct值应等于none。样品的荧光PCR扩增的Ct值≤35, 判定为核酸阳性, 否则, 均判为阴性。
1.2.4.2依据PCV-2 ELISA抗体检测试剂盒给出的检测方法, 分别对采集的猪血清样品进行ELISA抗体检测和结果判定。试验成立条件:阴性对照平均OD值≤0.15, 阳性对照平均OD值≥0.60。计算该次试验的临界OD值=阳性对照平均OD值×0.25, 样品OD值≥临界OD值时, 样品抗体判为阳性, 否则, 判为阴性。
1.2.4.3依据猪O型口蹄疫液相阻断ELISA检测试剂盒给出的检测方法, 分别对采集的猪血清样品进行检测和结果判定。试验成立条件:病毒抗原对照平均OD492nm值在1.0~2.0范围内, 阳性对照血清抗体效价在1:1024±1滴度, 阴性对照血清抗体效价<1:4, 试验有效;临界值=病毒抗原对照平均OD492nm值×50%;根据临界值判定被检样品的抗体效价, 抗体效价≥1:64, 99%以上保护;效价≤1:4, 不保护;效价在1:4~1:45之间, 50%保护。
2 结果与分析
2.1临床观测结果
2.1.1断奶前情况
10窝初生仔数共105头, 28日龄前死亡7头, 采集病料样品进行PCV-2核酸检测, 结果检出核酸阳性1头, 其他均为阴性。
2.1.2断奶重
试验猪断奶时98头称重总重量为727 kg, 平均个体重为7.42 kg, 死亡率为6.67%。
2.1.3断奶后至3月龄临床指标
试验猪达3月龄时, 称重总重量为4 021 kg, 平均个体重为41.03 kg, 临床观察有10头猪疑似感染PCV-2, 采集血清样品进行PCV-2核酸检测, 结果均为核酸阳性。主要临床监测项目及结果见表2。
2.2实验室检测结果
2.2.1试验猪28日龄断奶且进行猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫前检测结果
2个免疫剂量组PCV-2病毒核酸阳性检出率分别为1.7%和2.5%, 抗体阳性率分别为13.8%和12.5%, 猪口蹄疫O型抗体效价≥1:64的比率均为100%;母猪的PCV-2病毒核酸阳性检出率为0, 抗体阳性率为100%;猪口蹄疫O型抗体效价≥1:64的比率均为100%。检测结果统计详见表3。
2.2.2试验猪56日龄且进行猪口蹄疫O型灭活疫苗初次免疫后21 d检测结果
2个免疫剂量组PCV-2病毒核酸阳性检出率分别为12.1%和10%, 抗体阳性率分别为96.6%和95%;猪口蹄疫O型抗体效价≥1:64的比率分别为69%和97.5%。检测结果统计详见表3。
2.2.3试验猪94日龄且进行猪口蹄疫O型灭活疫苗二次免疫后29 d检测结果
2个免疫剂量组PCV-2病毒核酸阳性检出率均为100%, 抗体阳性率均为100%;猪口蹄疫O型抗体效价≥1:64的比率分别为13.8%和25%。检测结果统计详见表3。
2.3结果分析
2.3.1从成年母猪的检测结果来看, 成年猪血液中均未检出PCV-2病毒核酸, 说明猪在未受到PCV-2自然感染攻击条件下, 检测猪口蹄疫免疫效果保持较高水平, 也说明口蹄疫疫苗在免疫原性上是可信的。
2.3.2从仔猪28日龄临床观察和采样检测结果来看, (1) 临床上表现为各种原因导致的死亡率为5.71%, 在6头发病仔猪中检出1头PCV-2阳性病例, 但猪群生长发育总体上相对稳定。 (2) 28日龄检测发现, 断奶前PCV-2病毒核酸阳性检出率分别为1.7%和2.5%, 同时PCV-2初免前7d抗体 (母源抗体) 阳性率分别为13.8%和12.5%, 说明此时大多数仔猪将丧失母源抗体的保护, 仔猪群进入PCV-2感染的风险期。 (3) 检测猪口蹄疫O型抗体效价≥1:64的比率二组均达到100%, 说明被调查的仔猪群在生后4周时母源抗体水平仍维持在较高水平, 也间接反映出该场母猪群的口蹄疫免疫水平很高。
2.3.3综合成年母猪的检测结果和仔猪首免后21 d检测结果来看, 二组仔猪PCV-2病毒核酸阳性检出率分别为12.1%和10%, 自然感染带毒检出率较低, 在此时期检测猪口蹄疫O型抗体效价≥1:64的比率二组分别为69%和97.5%, 经统计学卡方检验分析, 差异极显著 (P<0.01) , 结合5头成年猪检测结果, 说明在PCV-2自然感染带毒率较低时进行猪口蹄疫灭活疫苗免疫, 其免疫效果基本未受到影响。
注:*号表示母猪O型口蹄疫抗体检测抗体效价均≥1:128。
2.3.4综合仔猪二免后29 d检测结果来看, 正常情况下进行口蹄疫疫苗加强免疫后, 免疫抗体合格率会较初免后明显提高, 然而本次试验中仔猪94日龄检测PCV-2带毒率二组均为100%, 同时临床上出现疑似病例, 此时检测94日龄猪口蹄疫O型抗体效价≥1:64所占比率二组分别为13.8%和25%, 效价在1:4~1:45之间所占比率二组分别为86.2%和75%, 经统计学卡方检验, 差异均不显著 (P<0.05) , 说明二组猪口蹄疫免疫未达到预期效果, 最大可能是受到PCV-2高自然感染率的影响。
3 讨论
PCV-2是现代养猪业倍受关注的免疫抑制性疫病。关于PCV-2感染后引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道病综合征等免疫抑制性综合征的文献报道颇多[1]。任静柏等[2]报道证实引起此类综合征的主要元凶是PCV-2与猪的其他疫病的混合或协同感染;王克才等[3]报道了猪圆环病毒2型存在病毒抗原与抗体在血液中可同时检出现象;史利军等[4]、司兴奎等[5]报道感染PCV-2后对猪的体液免疫和细胞免疫均产生不同程度的抑制作用;高世杰等[6]、吴在玉等[7]、吕六新等[8]、孙宝权等[9]分别报道了口蹄疫母源抗体保护水平的临界点为生后5~7周;王克才等[10]、于长泳等[11]分别报道了断奶仔猪PCV-2自然感染条件下, 进行高致病性猪蓝耳病和猪瘟免疫的效果, 其中, 进行高致病性猪蓝耳病活疫苗免疫后26 d时, 抗体合格率未达到国家规定的70%标准, 免疫后64 d时, 抗体合格率明显高于70%, 进行猪瘟活疫苗首次免疫后32 d和二次免疫后39 d的免疫抗体合格率分别为43.4%和38.4%, 均未达到国家规定的免疫合格率标准。本试验观察在PCV-2自然感染条件下对仔猪进行猪口蹄疫免疫, 二次免疫即使增加免疫剂量, 也不会明显提高口蹄疫免疫抗体水平, 这与上述文献报道的关于PCV-2具有的免疫抑制作用报道的观点相近或一致。
4 小结
综合上述分析与讨论结果, 断奶仔猪在PCV-2自然感染风险条件下进行猪口蹄疫免疫, 其免疫效果会受到不同程度抑制或干扰。
参考文献
[1][美]斯特劳 (Barbara E.Straw) 等主编;赵德明等主译.猪病学 (第9版) [M].北京:中国农业大学出版社, 2008:313-318, 423-446.
[2]任静柏, 郜博.引种导致猪圆环病毒和蓝耳病混合感染的诊断与防制[J].农业科学, 2009 (10) :137-138.
[3]王克才, 段亚良, 王军, 等.猪圆环病毒2型灭活苗免疫效果试验[J].现代畜牧兽医, 2014 (9) :31-36.
[4]史利军, 任林柱, 李刚.猪圆环病毒2型免疫抑制机理研究进展[J].动物医学进展, 2009, 30 (3) :74-77.
[5]司兴奎, 第济培, 陈建红, 等.猪圆环病毒2型对口蹄疫O型合成肽疫苗免疫应答的影响[J].中国兽医学报, 2010, 30 (6) :713-717.
[6]高世杰, 窦永喜, 程爱华, 等.母源抗体对猪口蹄疫疫苗免疫应答的影响[J].中国兽医学报, 2011, 31 (1) :45-48.
[7]吴在玉, 张杰.猪O型口蹄疫母源抗体消长规律及疫苗免疫的干扰作用[J].安徽农业科学, 2013 (14) :6292-6293.
[8]吕六新, 何孔旺, 倪艳秀, 等.规模猪场不同日龄仔猪O型口蹄疫母源抗体消长规律及免疫试验[J].江苏农业科学, 2011, 39 (5) :304-306.
[9]孙宝权, 王昌斌, 王小新, 等.猪口蹄疫0型灭活疫苗免疫效果评价[J].养猪, 2013 (1) :102-104.
[10]王克才, 李祝田, 郑洪玲, 等.猪圆环病毒2型自然感染条件下的高致病性猪蓝耳病免疫效果调查[J].现代畜牧兽医, 2015 (7) :35-39.
A型口蹄疫病毒论文 篇7
1 材料与仪器
1.1 材料
1.1.1 病毒样品及阳性血清:
Asia-I型FMDV流行毒株JS2005 (江苏2005) , 由本实验室传代、保存;FMDV阳性血清, 由本室收集、制备并保存。
1.1.2 质粒、宿主菌株:
pMD18-T质粒购自大连宝生物 (Takara) 公司;大肠杆菌菌株JM109为本室保存。
1.1.3 工具酶及其它试剂:
逆转录酶AMV、Taq酶、T4 DNA连接酶, 限制性内切酶Xho I、Sma I、EcoR I, Agarose Gel DNA PurificationKit、RNA酶抑制剂 (RNAsin) 、DNA快速纯化回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒等均购自大连宝生物公司;总RNA提取试剂盒RNeasy mini Spin-Columns Kit购自德国QIAGEN公司;饱和水酚、Tris酚、DEPC、RNA酶抑制剂 (RNAsin) 、琼脂糖, 由上海生工进口分装;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG等均购自Promega公司;X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) 、IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 等购自华美公司;Agarose Gel DNA Extraction Kit、DAB (二氨基联苯胺) 、氯化钴、核酸Marker、低等分子量蛋白Marker购自经科公司;无水乙醇、异丙醇、氯仿、琼脂、蛋白胨、酵母粉、SDS、NaOH、EDTA等有关化学试剂均为国产分析纯产品。
1.1.4 寡聚核苷酸引物:
参考已发表文献中的引物, 并结合国内外已发表或登陆的Asia-I型FMDV全序列, 用计算机软件DNAstar进行序列比对 (alignment) , 根据FMDV基因组的特性及序列的保守性, 用Primer设计引物, 其中pu1、pl1, 为扩增P12A基因的两对引物, cu1、cl1, 为扩增3C基因的两对引物, 由大连宝生物公司合成, 引物序列如下:
pu1:5’-GACATGTCCTCCTGCATCTG-3’
pl1:5’-TAGTGCTGGTAAAGACTTTG-3’
cu1:5’-CCAGATGCAGGAGGACATGTCAGTGAAAGCTAAGAA-3’
cl1:5’-GCGGATCCTTACTCGTGTGGTTCGGG-3’
1.2 仪器与设备
DNAThermal Cycler 2400 (PE公司产, USA) ;2K15高速低温离心机 (Sigma公司产) ;紫外凝胶成像仪 (GeneGenius公司产) ;核酸/蛋白紫外检测系统 (日本岛津产) ;低温冷冻离心机 (HermLer公司产, 德国) ;半干电转移仪 (USA) ;DYY-31A型稳压稳流电泳仪及微型水平、垂直电泳槽 (北京六一厂产) ;DYNEX-OPSYS酶标检测仪 (USA) ;磁力混匀器 (USA) ;酸度计 (USA) ;电转移仪Pharmacia Biotech产。恒温水浴锅 (DK-8D型, 上海精宏实验设备有限公司) ;恒温培养箱 (上海市跃进医疗器机械一厂) ;DYY-31A型稳压稳流电泳仪及微型水平、垂直电泳槽 (北京六一厂) ;PCR扩增仪 (MJ Research, PTC-150, USA) ;紫外凝胶成像分析系统 (UVP公司, 英国) ;DYY-III稳压稳流电泳仪 (北京六一仪器厂) ;SORVALL MC 12V桌式离心机;SK-1涡旋快速混匀器。
2 方法
按照《分子克隆实验指南》所述方法操作。
3 结果
3.1 P12A, 3C基因PCR产物的电泳结果
通过RT-PCR扩增的P12A-cDNA产物的大小约为2.2 kb (实测结果2247 bp) , 3C cDNA产物大小约650 bp (实测结果639 bp) , 与预期大小相同。取PCR产物4μL, 在7.5 g/L琼脂糖凝胶上电泳, 结果见图1、图2。
3.2 pMD-P12A、pMD-3C鉴定结果
PMD-P12A、PMD-3C鉴定结果见图3-图7。
3.3 序列分析结果
序列分析结果见图8-图10。
1:质粒pMD-P12A3C的PCR产物M:DNA分子量标准
4 结论与讨论
本次试验克隆了口蹄疫病毒JS2005毒株P12A、3C基因, 将基因P12A和基因3C联接后克隆于pMD18-T载体, 获得了带有P12A3C基因片段的克隆载体, 为下一步构建P12A3C自杀式真核表达载体奠定基础。
序列分析发现, 病毒株JS2005的3C蛋白酶序列与Asia I IND 491 97毒株同源性最高 (91.2%左右) , Vp1进化树图也显示了这一结果, 而与P12A序列比较结果存在差异, 这固然与其变异性大有关, 也与基因的拆分有一定的关系。
VP1蛋白大部分暴露在病毒的表面, 是决定病毒抗原性的主要成分, 存在抗原性的高变区。分析该高变区, 不仅对FMDV遗传变异的研究具有指导意义, 而且对FMD流行病学的研究以及新型疫苗的研制也很重要。世界上许多国家在FMD分子流行病学调查中, 都是利用VP1基因核苷酸序列测定和分析, 比较毒株间的核苷酸同源性, 为FMD流行的疫源分析提供理论依据。本次试验序列分析结果表明, 流行毒株JS2005与AsiaI IND491 97有着最接近的遗传关系, 而与YNBS58株遗传关系较远。
摘要：试验克隆了AsiaI流行株JS2005的P12A3C基因, 并将其插入自杀式表达载体pshame2a中, 构建成自杀式真核表达载体, 为自杀式DNA疫苗的研究奠定基础。