猪圆环病毒2型研究

猪圆环病毒2型研究（共10篇）

猪圆环病毒2型研究 篇1

猪圆环病毒2型 (PCV-2) 可引起断奶仔猪和育肥猪生长缓慢、呼吸急迫、消瘦、贫血、黄疸, 以及断奶仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS) , 并且抑制猪的免疫力, 造成免疫力低下而对其他病的防疫和治疗效果降低 。伪狂犬病病毒 (PRV) 属于双股DNA病毒, 为疱疹病毒群成员, 具有疱疹病毒科病毒的共同特性, 即动物一旦被其感染, 病毒可在动物体内呈长期潜伏感染状态, 可在体内存活数年甚至终生, 且难以清除。本研究采用常规PCR和多重PCR方法对采自宁夏灵武地区某种猪场的血清进行了PCV-2、猪细小病毒 (PPV) 、PRV的病原诊断。

1 发病情况及症状

2011年9月份, 宁夏灵武地区某种猪场出生2～3日龄的乳猪突然发病, 站立不稳, 呼吸困难, 体温达41 ℃, 发病仔猪腹部、股部出现粟粒大小的紫色斑点。仔猪、中猪均有发病, 仔猪主要症状为腹泻, 并有个体死亡;中猪表现为咳嗽、食欲不振;母猪无明显临床症状。

2 材料

2.1 血样及主要试剂

采集宁夏灵武地区某种猪场发病母猪及仔猪血液43份, 健康母猪及仔猪血液18份, 种公猪血液3份。TaqTM DNA聚合酶、dNTP、DL-2 000 Marker, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。

2.2 PCR引物

根据GenBank已发表的序列以及参考文献[1,2,3]应用Primer Premier 5.0软件对PCV-2 ORF2基因序列、PRV gD基因部位、PPV VP2基因片段设计3对引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 用双蒸水稀释为100 μmol/L, -20 ℃保存。特异性引物序列见表1。

3 方法

3.1 病毒模板DNA 的提取

分别取临床血样1 mL, 10 000 r/min离心10 min;取100 μL血清放入0.5 mL EP管中煮沸10 min;12 000 r/min离心5 min; 取上清液用于PCR扩增或-20 ℃保存, 备用。

3.2 临床样品的PCR扩增

3.2.1 多重PCR方法的检测

采用已建立的PCV-2、PRV、PPV多重PCR检测方法对所有的临床血清样品进行PCR扩增。PCR反应体系:模板DNA 2 μL, 10×PCR缓冲液5 μL, MgCl2 (25 mmol/L) 3 μL, dNTPs (10 mmol/L) 4 μL, Taq酶 (1 U/μL) 1.5 μL, PVC-2上、下游引物 (20 μmol/μL) 各0.5 μL及PPV上、下游引物 (20 μmol/μL) 各 0.5 μL及PRV上、下游引物 (20 μmol/μL) 各0.3 μL, 加双蒸水至50 μL。

反应程序:96 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min, 59.2 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 共35个循环;72 ℃ 10 min。取扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

3.2.2 单项PCR检测

PCR反应体系:模板DNA 5 μL, 10×PCR缓冲液2.5 μL, MgCl2 (25 mmol/L) 2 μL, dNTPs (10 mmol/L) 1 μL, Taq酶 (5 U/μL) 0.5 μL, 上游引物 (20 μmol/μL) 0.25 μL, 下游引物 (20 μmol/μL) 0.5 μL, 加双蒸水至50 μL。

反应程序:96 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 55.2～62.5 ℃ (PCV-2 55.2 ℃, PRV 62.5 ℃, PPV 57.0 ℃) 30 s, 72 ℃ 45 s, 共35个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

4 结果

4.1 多重PCR反应结果

用3对特异性引物对临床血清提取物进行PCR扩增, 所获得的PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果表明, 各病毒的特异性引物均有效地扩增出了其目的片段, 分别为353 bp (PCV-2) 、471 bp (PPV) 、217 bp (PRV) , 引物间无非特异性片段产生, 结果见图1、图2。对临床血样分别进行单项PCR检测, 结果与复合PCR 检测结果均一致, 两种方法符合率达100%, PCV-2、PRV的单项扩增结果见图3、图4。

M.DL-2 000 Marker;1.PPV阳性对照;2.PRV阳性对照;3, 4.PCV-2阳性对照;5, 6.PPV、PCV-2、PRV阳性对照。

1.阴性对照;2.PCV-2阳性个体;3, 4.PCV-2和PRV混合感染个体;M.DL-2 000 Marker;5.PRV阳性个体。

1, 2, 4, 5.PCV-2阳性个体;3.PCV-2阴性对照;M.DL-2 000 Marker。

1, 3, 5.PRV阳性个体;2, 4.PRV阴性个体;M.DL-2 000 Marker。

4.2 临床样品的检测结果

PCV-2的阳性率达87.5% (56/64) , PRV 的阳性率为12.5% (8/64) , 在样品中未检测出PPV。64份临床样品主要为PCV-2和PRV 混合感染, 阳性率达45.3% (29/64) 。

5 病因诊断及防治措施

通过多重PCR技术在哺乳仔猪、保育猪、母猪及种公猪血样中均检测出PRV、PCV-2阳性个体, 尤其对该猪场常用2头种公猪的检测结果表明, 其中1头长白种猪带有PCV-2和PRV, 但在所有检测样品即哺乳仔猪、母猪及种公猪中均没有检测出PPV阳性个体。病猪、带毒猪是猪伪狂犬毒病的主要传染源, 带毒猪可连续排毒, 健康猪可通过与病猪接触感染, 也可采食污染饲料而感染, 妊娠母猪感染后可经胎盘感染胎儿, 因此推断该场仔猪发病可能与种公猪的带毒有关, 建议该场淘汰带毒种猪, 引种监测与检疫, 种猪、仔猪全群免疫提高免疫接种密度, 同时对感染与带毒种猪群进行净化, 另外应采取进一步实验室检验对猪瘟、蓝耳病、乙脑等进行区别诊断。

摘要：为了研究规模猪场病毒性疾病早期、快速诊断方法, 试验采用多重PCR方法对来自宁夏灵武地区某种猪场的临床血清进行了猪圆环病毒2型 (PCV-2) 、猪细小病毒 (PPV) 、猪伪狂犬病毒 (PRV) 的病原诊断。结果表明:在哺乳仔猪、保育猪、母猪及种公猪中均检测出PRV、PCV-2阳性个体, PCV-2的阳性率达87.5%, PRV的阳性率为12.5%, 但未检测出PPV。临床样品主要为PCV-2和PRV混合感染, 阳性率达45.3%, 其中1头主要采精的长白种猪携带有PCV-2和PRV。因此, 推断该场仔猪发病可能与种公猪的带毒有关, 建议该场仔猪全群免疫, 同时对感染与带毒种猪群进行净化。

关键词：猪圆环病毒2型,猪细小病毒,猪伪狂犬病毒,诊断

参考文献

[1]方立, 徐辉, 陈伟杰, 等.猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立[J].中国兽医科技, 2005, 35 (12) :94-95.

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猪圆环病毒2型研究 篇2

【中文摘要】猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是当前影响养猪业发展的3种重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2单独感染或混合感染均能引起猪发病,造成母猪的繁殖障碍或(和)感染猪的免疫抑制,为其他病原的继发感染提供了便利,甚至会造成猪群中疫病的流行,使养殖效益蒙受损失。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特异等优点,自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势,在动物疫病诊断和病原检测上也得到广泛地应用,对疫病防控起到了重要的作用。由于当前养猪业中猪群中多种病原混合感染病例的增多,单一病原PCR检测方法也表现出自身的不足,需要对一种病料进行多次PCR检测,使得检测时间延长,耗费人力,成本也高。多重PCR不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点,而且还具有一个PCR反应就同时检测多种病原,具有简便、快捷、灵敏等优点,能满足生产上同时对多种疾病进行快速诊断的要求。本研究基于前期对陕西省部分养殖企业猪群中病毒性病原的调查检测,发现常有PPV、PRV和PCV-2的单纯或混合感染,为此我们拟建立PPV、PRV和PCV-2检测的多重PCR方法,以期为生产中这3种病原的快速检测提供可用方法。本研究获得了以下结果:(1)根据GenBank中已经发表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0软件,针对病毒的保守性基因序列,分别设计了检测引物,通过对引物浓度、退火温度、PCR组分等条件的优化建立起鉴别PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性试验表明,PRV、PCV-2在多重PCR反应中的敏感性到达pg级,而PRV在多重PCR反应中的敏感性少了一个数量级,其最低检测量也达到了10pg级。以PCV-

1、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠埃希菌、PPV、PRV、PCV-2为模板分别进行多重PCR检测,结果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及单个病毒的PCR均扩增出各自的特异性条带。(2)用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行病毒检测,从临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果来看,PCV-2在正常猪群中有一定比例的存在,同时在个别猪场也存在PRV和PCV-2双重感染的现象;从临床患病猪病料中进行检测发现,PRV和PCV-2混合感染较严重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染发生;多重PCR检测结果与单项PCR检测结果的符合率达99%以上,说明建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测,为这3种疫病的诊断提供依据。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【关键词】猪细小病毒 伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 多重PCR 【英文关键词】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目录】猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用综述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文献

第一章 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒

12-26

1.1 猪细小病毒

1.1.2 猪细小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型检测方法研究进展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 猪细小病毒病流行情况14-1

51.2 伪狂犬病病毒19-22的检测方法研究15-19概述191.2.2 伪狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 伪狂犬病病毒检测方法

1.3.1 概述

1.2.3 伪狂犬病流行情况2020-2222-231.3 猪圆环病毒22-261.3.2 猪圆环病毒的特性231.3.3 猪圆环病毒检测方法23-26检测上的应用26-31PCR 技术26

第二章 聚合酶链反应(PCR)技术在动物病原

2.1 PCR 技术概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技术的发展26-27

PCR 技术27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常规PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二温式PCR27-28转录PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反转录一复合套式聚合酶链反应

2.2.7 竞争PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 标记PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31试验研究31-45重PCR(Multiplex PCR)猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2 型 PCR 检测方法的建立31-38313232-333.1 材料与方法31-3

33.1.1 主要试剂

3.1.3 引物设计3.1.5 PCR 反应33

3.1.7 PCR 产物3.1.2 毒株、菌株和细胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反应条件的优化的测序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反应的敏感性和特异性分析

3.2.1 最佳PCR 退火温度的确定3.2 结果33-363.2.2 PCR 反应最佳引物体浓度的确定3.2.3 PCR 产物的鉴定3

43.2.4 PCR 反应的敏感性3.2.5 PCR 反应的特异性试验和重复性试验3.3 讨论36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料与方法检测方法的建立与临床样品检测分析38-39384.1.1 主要试剂38

4.1.2 毒株、菌株、细胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 结果4.1.3 临床样品及病料的采集反应条件的优化384.1.5 样品检测38-39

39-424.2.1 两重PCR 反应条件的优化39-40

4.2.3 样品检测41-42

参考文献46-56

4.2.2 4.3 讨致谢多重PCR 的建立40-41论42-4556-57结论

猪圆环病毒病原学研究进展 篇3

关键词：猪圆环病毒；PCV2；病原特性；基因结构

中图分类号：S852.65+9.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.017

Abstract： Porcine circovirus virus （PCV） has 2 serotype， named porcine circovirus virus type 1 （PCV1） and porcine circovirus type 2 （PCV2）. PCV1， the first discovered one， has no pathogenity to pigs， while PCV2， the newly defined virus，is recognized as one of the main pathogens for PCVDs. The disease has prevalented in many countries and cause huge economic loss and also pose great challenges to the pig production industry. It is highly valued by scholars in Home and Abroad. This paper reviewed the development of the pathogeny of PCV2.

Key words： porcine circovirus； PCV2； pathogen characteristics； genetic structure

1 发现及分类地位

迄今，人们对猪圆环病毒的起源和进化过程了解得并不多。可追溯的最早的有关于PCV感染猪群的资料是在1962年的德国[1]。Hans Nauwynck 博士通过血清学方法研究证实，猪圆环病毒于20世纪70年代以前就已出现。1974年，Tischer I 等首次报道在PK-15细胞中发现猪圆环病毒（PCV1），由于该病毒不引起细胞发生病变，当时被认为仅仅是一种细胞污染物。通过深入研究，Tischer I 等[2]进一步证实这种细胞污染物实际上是一种单链的环状DNA病毒， 并将其命名为猪圆环病毒。加拿大在1991年报道了一种新猪病——断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning pigs multi-systemic wasting syndrome， PMWS）。该国的养猪业由于PMWS在猪群中的广泛流行而遭受了很大的损失。Harding 和Clark 等从PMWS 的病料中分离鉴定出的病毒与已发现的PCV有70%的同源性，从而认识到该病毒有不同的致病特性，故将无致病性的PCV命名为PCV1，有致病性的命名为PCV2。随后，PCV2由地方性流行性疾病发展为动物流行性疾病，并在全球的猪群中不断感染扩散，引发了一系列猪圆环病毒疾病（Porcine circovirus diseases，PCVDs）[3]，该病毒不仅可感染家猪群，也在野猪群中广泛传播。虽然很少出现临床症状，但其仍被认为是全球养猪业最重要的病原之一。在PCV2疫苗问世前，亦有诸多专家学者认为与猪圆环相关的疾病（PCV2-systemic disease ，PCV2-SD）的出现和传播其实与PCV2并无太多关联，而是与其他某个尚不确定的因素[4] “agent X”[5]有关。然而，也有人认为疾病爆发的主要原因并不是外来的传染源。随着PCV2疫苗的问世，PCV2被证明是引发PCV2-SD的主要原因，关于PCV2疾病爆发的“因果论”的争辩也因此结束，但对于病毒由地方流行性发展为动物流行性的原因还有待进一步的研究。

在第八次国际病毒学会议上，将脊椎动物的圆环病毒分为圆环病毒（Cir-covirus）和环病毒（Gyrovirus）两个属。

2 形态结构与理化特性

PCV是已知最小的感染哺乳动物的病毒[6]，其直径约12～23 nm[7]，呈二十面体对称，无囊膜，病毒的基因组是一条共价结合的闭环单链DNA，衣壳蛋白由单肽链组成，分子量为36 kDa。根据其基因序列、致病性和抗原性的差异，将PCV划分成PCV1和PCV2两个型。PCV对外界环境的抵抗能力较强，在72 ℃高温条件下能存活15 min，在酸性环境（如pH3）和氯仿中也能存活很长的时间。该病毒对苯酚、氧化剂、氢氧化钠和季胺类化合物等比较敏感，以上消毒剂可用于PCV的消毒[8]。PCV没有血凝活性，不能凝集猪、牛、羊、鸡等动物和人的红细胞[9]。PCV1和PCV2在理化特性方面的差异不是很明显。

3 组织培养特性

PCV能够在增殖能力旺盛、正在进行有丝分裂的PK-15细胞上复制，该病毒的复制主要依赖于处于细胞周期S期的细胞蛋白及酶[10]。Tischer等[11]将PCV2接种到没有污染PCV的PK-15单层细胞上，发现PCV2能够增殖并形成浆内包涵体或核内包涵体；接种PCV的PK-15细胞用D-氨基葡萄糖处理，对病毒DNA进入细胞核有着促进作用，增加30%的细胞感染量。Stevenson等[12]通过研究发现，适当延长PCV2在PK-15细胞上的培养时间（24 h），也可以获得良好的病毒增殖效果。除PK-15细胞外，PCV还可以在其他细胞中复制，如牛外周血单核细胞、外周血液细胞、猪骨髓细胞等。但PCV2对RK和Vero细胞的适应性比较差，且在PT、ST、PET等传代细胞系和BHK-21细胞、恒河猴肾细胞、原代胎猪肾细胞等细胞上不能增殖。Taís F.等[13]发现，如果用收毒技术（Shell vial technique）培养接种于ST细胞的PCV2，可以收到比传统培养技术更好的效果。

4 基因组特征及分型

PCV的基因组非常小而且核苷酸序列非常保守，PCV1的基因组只含有1 759 nt，PCV2基因组则分为3种：1 766 nt、1 767 nt和1 768 nt。研究表明，PCV1和PCV2可能有相同的进化起源，其中PCV1突变率是每年1.15×10-5个变异位点[14]，PCV2则是每年1.2×10-3个变异位点[15]。不同PCV2毒株之间基因序列的同源性大于96%，而PCV1相对保守，不同毒株之间核苷酸序列的同源性大于99%[16]。PCV1和PCV2核苷酸的相似性是68%，基因序列推导出的aa同源性小于76%。现预测PCV基因组含有11个潜在的开放阅读框（Open reading frames， ORFs），大部分阅读框大小相差很大，且存在部分重叠的现象。有一定同源性的开放阅读框有ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF7和ORF8，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10的5-3方向均为顺时针方向，其余的ORF则为逆时针方向。

迄今，已经报道的PCV2包括4个基因亚型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。其中PCV2a和PCV2b 是主要的基因型，PCV2c亚型毒株目前只有丹麦分离并报道，而PCV2d不仅发现于中国，可能还出现在欧洲野猪群和南美洲。我国报道的PCV2分离毒株的基因型主要是PCV2a和PCV2b，其中PCV2b已成为近年来国内流行范围最广的基因型[17]。虽然PCV2b的流行与各国近年PCVDS的频繁爆发在时间和空间上可能相符，但PCV2基因型的转变仍属于PCVDS进化的未解之谜。

5 复 制

PCV依赖双链DNA （dsDNA）中间体从而完成自身复制，dsDNA 也就是人们说的复制型（Replicative form，RF）。RF是双义的，其负链主要编码ORF2和ORF3，正链主要编码ORF1。PCV的主要开放阅读框是ORF1和ORF2，其5'端和3'端分别由基因间区（Intergenic region， IR） Ori和编码终止处IR隔开。 ORF1非常保守，有研究表明，PCV1和PCV2的rep和Ori可以完全替换；比较而言，ORF2变异程度相对较大[18]。PCV主要在单核巨噬细胞中复制，是能够在哺乳动物细胞中自主复制的最小病毒，其复制主要是滚环模式。Mankertz等发现，该病毒滚环复制时正链合成的起点位于PCV1基因组ORF1与ORF2的中间区域的728～838 nt处，长111 bp。这段片段包括圆环病毒属特有的茎环结构 TAGTATTACC 或AAGTATTACC （stem-loopstructure），其顶端的保守九核苷酸基序（nonanucleotide motiof）是滚环复制的剪切位点。位于茎环结构下游还有该区域的特异性结构，即4个六聚体重复（5'-CGGCAG-3'） （ H1， H2， H3， H4 ），是病毒复制酶蛋白的结合位点。因为病毒正链的起始点和终止点都在这个保守基元中定位，所以病毒复制的关键是九核苷酸序列，该保守序列的第7和8个碱基之间被核酸酶切开，进行滚环复制。

6 编码蛋白

6.1 ORF1编码的蛋白

ORF1全长945 nt，由312 aa（PCV1）或314 aa（PCV2）组成，分子量大小为35.8 kDa，编码后可形成分子量约为36 kDa的Rep蛋白，Rep基因转录后剪辑的产物为分子量为19.2kDa的Rep'蛋白。Rep必须和Rep'相互作用才可以促进PCV的复制过程，单独启动病毒的复制是不可能的。Rep蛋白含有结合dNTPs的P环（P-loop ）结构（序列为G—GKS ）、3个糖基化位点以及与典型滚环复制（RCR）相关的3个保守基序，这些结构对维持Rep蛋白的功能非常重要，发生突变或缺失，均会影响病毒的复制。在PCV2体外感染PK-15细胞的试验中，该病毒感染后可产生10种RNA[19]，其中5种与Rep蛋白相关，分别为Rep（1 000 nt）， Rep' （750 nt）， Rep3a（280 nt）， Rep3b（280 nt）和Rep3c（470 nt），这些RNA具有相同的5'和3'端核苷酸序列。研究表明，Rep mRNA可能是病毒基因组的初始转录物，其余mRNA的功能目前尚不明了。

6.2 ORF2编码的蛋白

ORF2主要编码构成病毒衣壳的结构蛋白，即衣壳蛋白（Capsid protein， Cap），该蛋白是由60个Cap亚单位组成的二十面体[20]，包括702个核苷酸，含有233或234个aa，分子量大小约为27.8 kDa。Cap蛋白与病毒和宿主细胞结合有关，且对Rep和Rep'蛋白的复制转运起一定作用[21]。ORF2基因的启动子位于Rep基因内部的1 428～1 168 nt处，转录起始位点在1 238 nt，转录子是一个119 nt的非翻译引导序列。通过多肽扫描分析，发现PCV2 Cap蛋白上存在一个PCV共同的抗原决定簇及3个特有的抗原位点，即65-87aa， 113-139aa和193-20aa，这一特点为建立区分其它圆环病毒的PCV2的特异性血清学方法奠定了基础。Fenaux等研究发现，CP110位（P-A）和191位（R-S）氨基酸发生改变可以增强病毒的体外复制，但会减弱病毒在体内的毒力。2003年他们发现用感染性克隆构建的来自PCV1 ORF1及PCV2 ORF2重组病毒在猪体内无致病性。

7 结 语

PCV2所引发的一系列PCVDs给全球养猪业造成了严重危害。对于该病及其病原，国内外学者进行了大量的研究，对其相关疫苗的研制也取得了突破性进展[22]，接种疫苗是目前国内外防治该病最有效也是最有收益和回报的方法。但现今仍有许多问题亟待解决：如最近一种发生于接种猪群的新的疾病——急性肺水肿（Acute pulmonary edema ，APE），似乎与PCV2疫苗的接种有关[23]；国外有报道仔猪在接种55 d后分离出了PCV1，且在接种的21 d后出现肺部损伤，似乎证明PCV1也是具有致病性的[24]。因此，我们应该对PCV2的致病机理等问题进行更深入的研究，以期为推进此项研究的发展做出贡献。

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猪圆环病毒2型研究 篇4

对PCV2血清学回顾性调查显示，多国的猪血清中均发现PCV2抗体。PCV2在猪群中的感染率日趋升高。某些国家商品化猪场的血清阳性率高达100%。云南省血清学调查显示我省各州市均有PCV2抗体检出，为了进一步弄清我省PCV-2的分布和感染情况，2009～2011年我们对云南省内不同来源猪组织样品进行PCV-2病原学检测，研究分析PCV-2在猪群中的感染及流行规律，为猪圆环病毒病的防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织样品

云南省16个州市采集猪脾、肺组织样品8864份，剪碎、研磨，按1:1.5比例加PBS液稀释，-20℃保存备用。设立阴阳性对照, 阳性对照样品采用猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)，阴性对照样品采用PCVD血清学抗体检测和胶体金PCV抗原检测均为阴性的猪脾、肺组织。

1.1.2 主要试剂

病毒RNA/DNA提取试剂盒(Ta Ka Ra Mini BEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)、PCR扩增试剂盒(Ta Ka Ra PCR Amplification kit)、DNA分子量标准(DL2000 DAN Marker)购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据已发表的PCV-2毒株CAP基因测序数据，参照GenBank中登录的序列，设计PCV-2检测引物，上游引物PC-F:ATTACCAGCAAACAGACCCCGT，下游引物PC-R CGCACTTCTTTCGTTTTCAG，预期片段大小为951bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.2 核酸提取

采用病毒RNA/DNA提取试剂盒，参照操作手册，分别提取组织样品、灭活疫苗(阳性对照)、健康猪猪脾、肺(阴性对照)的总RNA/DNA，加RNA酶抑制剂后-80℃保存备用。

1.3 PCV-2 PCR检测方法的建立

采用Ta Ka Ra PCR扩增试剂盒，以PC-F/PC-R为引物，按照试剂盒提供的操作手册配制反应体系，用于检测组织样品中猪圆环病毒2型，同时进行反应条件筛选和优化，反应条件：94℃、5min, 95℃、15s～1min, 53℃～60℃、30s～60s, 72℃、45s～1min, 30个循环，72℃、10min，产物4℃或～20℃保存。取5μL进行电泳分析，预期PCR产物大小约为951bp。

1.4 PCV-2病原学监测

用已建立的PCV-2型PCR检测方法对8864份猪脾、肺组织进行检测。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

M.DL20000分子量标准;1-3.猪脾、肺样品;4.阴性对照;5阳性对照

对送检的猪脾、肺组织进行PCR扩增, 设立阴阳性对照。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在约951 bp的位置出现特异条带(如图1)，与预期结果一致，筛选部分扩增片段进行测序鉴定扩增片段即是目标片段。对反应条件进行筛选和优化，最终确定最优反应条件为：94℃、5min, 95℃、15s, 53℃、30s, 72℃、1min, 30个循环，72℃、10min。

2.1.1 病原监测结果与分析

(1) PCV-2流行情况监测(见表1)

注:进行阳性率比较, 标有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) , 标有不同字母表示差异显著 (P<0.05) 。

表1显示，同年度不同饲养方式阳性率比较，2009～2011年分年的散养户与规模场圆环病毒阳性率进行X2检验差异极显著 (P<0.01) 。结果表明，全省散养户和规模场阳性率在1%～5%之间，散养户圆环病毒感染率高于规模场，疫情流行态势不明显。

(2) PCV-2流行状况时间分布(见表2)

注:进行阳性率比较, 标有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) , 标有不同字母表示差异显著 (P<0.05) 。

表2显示，2009～2011年间云南省各州市PCV-2监测，各季度之间X2检验差异不显著 (P>0.05) 。结果显示，各监测季均有阳性样品检出，且阳性率变化无规律性，提示该病发生无明显季节性，一年四季均可能发生。

(3) PCV-2流行状况空间分布

表3显示，2009～2011年间PCV-2平均阳性率分别为3.97%(120/3019)、1.95%(57/2923)和2.7%(79/2922)。结果表明，我省各地州均有PCV-2病原检出，不同程度地存在着感染，普洱年平均阳性检出率高达6%。云南省滇西和滇南片区的阳性率明显高于其他片区，滇中和滇东片区阳性检出率较低。

3 讨论

3.1 三间分布特点

用已建立的检测PCV-2型PCR方法对云南省猪群的PCV-2病原进行监测，2009～2011年全省16个州市平均阳性率2.87%，与国内其它地区PCV-2检出率相比，发现云南省内猪群的感染处于较低水平。全省16个州市均检出阳性样品，表明PCV-2感染在我省猪群中已普遍存在。据调查阳性率相对较高的普洱、临沧、版纳、迪庆等州市近年来从外省引入种猪时，未经严格的PCV-2检疫，使PCV-2经种猪的精液缓慢传播。对我省不同地区PCV-2的发病率进行统计分析，卡方检验显示我省猪群PCV-2感染存在明显的地域差异，地区间检测结果与饲养管理水平密切相关。3年间全省猪群PCV-2平均感染率显示，散养户的PCV-2带毒率高于规模场，这可能与散养户的饲养条件差、生物安全水平低及散养户进猪途径较广，将不同来源仔猪混合饲养的引种模式有关;监测结果还显示我省PCV-2感染无明显流行趋势，无明显季节性。

3.2 阳性率差异原因分析

我省PCV-2近3年PCR病原阳性检出率平均为2.87%, 低于ELISA阳性率29%，与PCV-2感染猪产生的病毒血症持续时间短，而PCV-2感染猪产生的中和抗体持续时间长有关。中和抗体与血清中病毒的载量呈负相关，中和抗体增长的同时病毒数量明显下降。病毒感染的不同时期，血清中病毒抗体载量不同，同样可造成PCV-2抗体的ELISA检测结果出现偏差。我省PCR阳性率低亦可能与处理样品的方式有关，有报道称腹股沟淋巴的检出率高于脾脏。据此，我省PCV-2感染率可能会高于检测结果。本研究的监测范围较广，覆盖云南省主要规模场、散养户和屠宰场;检测样本量较大，监测结果基本真实反映了PCV-2在云南省猪群中的感染状态，并为PCV-2在我国猪群中的流行分布情况提供了参考。

3.3 防制对策

PCV-2是引起临床发生PMWS的主要病原体, 主要侵害机体免疫系统, 导致猪的免疫抑制, 从而导致其它病原的混合感染和继发感染。鉴于我省PCV-2的感染率不高, 防控的重点一是全省要严格执行监测制度, 定期开展监测, 及时淘汰阳性猪只, 侧重滇西和滇南片区兼顾其他片区;二是要严格检疫制度, 提倡自繁自养、全进全出的饲养方式。确实需要引入种猪的, 必须坚持严格检疫和隔离消毒工作;三是要做好猪场的卫生防疫工作, 降低或避免应激因素。在提高饲养管理和断奶仔猪的营养水平的基础上, 有效预防和控制其他感染性疾病, 做好猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征等疫苗的免疫接种, 提高猪群整体的免疫水平。

%

注:进行阳性率比较, 标有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) , 标有不同字母表示差异显著 (P<0.05) , 相邻字母表示差异不显著 (P>0.05) , 相间字母表示差异极显著 (P<0.01) 。

摘要：本研究利用PCR方法, 对云南省16个州市的临床健康猪群进行PCV-2病原学监测。2009～2011年PCV-2阳性率分别为3.97.% (120/3019) 、1.95% (57/2923) 和2.7% (79/2922) 。规模场的PCV-2阳性率分别为1.65% (6/362) 、1.24% (4/321) 、1.31% (5/379) ;散养户的PCV-2阳性率分别为4.29% (114/2657) 、2.03% (53/2602) 、2.9% (74/2543) ;监测结果显示, 我省猪群PCV-2感染范围较广, 滇西和滇南片区的阳性率明显高于其他片区, 滇中和滇东片区阳性检出率较低;散养户圆环病毒感染率高于规模场;该病在我省无明显的季节性。

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猪圆环病毒感染的防治技术研究 篇5

科技项目申报（合同）书

项目名称：猪圆环病毒感染的防治技术研究

计划类别：

申报单位（盖章）：***市畜牧兽医站

联系人：****

联系电话：****

通讯地址：**省***路***号

管理部门：***市农业局

****市

科学技术局

二○○五年五月十日

填表说明

一、本科技项目申报（合同）书一表两用。在项目申报阶段作为科技项目申报书；经审批列入科技计划后，作为科技项目合同书。

二、封面“批准文号”、“合同编号”、“资助类别”、“资助形式”、“管理部门”由市科技局填写。

三、“项目简介”要求内容简明扼要，字数不超过300字，着重说明本项目的主要研究内容、技术特点、项目的投资情况以及项目完成时预期的经济效益。

四、“技术来源”：

1、自有技术；

2、产学研合作开发技术；

3、国内其它单位或个人技术；

4、国外引进消化与创新技术；

5、其它技术。请在相应数字后“□”内打“√”。

五、“技术领域”：电子、信息、生物、医药、新材料、机电一体化、资源与环境、新能源、高效节能、汽车、纺织、精细化工、食品、农业、林业、畜牧、水产等。请在表中注明项目所处技术领域。

六、“所处阶段”：

1、研发阶段；

2、中试阶段；

3、批量（规模化）生产；请在相应数字后“□”内打“√”。

七、“经济类型”：

1、国有企业；

2、集体企业；

3、联营企业；

4、私营企业；

5、有限责任公司；

6、股份有限公司；

7、股份合作企业；

8、外商投资企业；

9、港澳台商投资企业；

10、其它企业。“港、澳、台商投资企业”指与港、澳、台商合资经营企业，合作经营企业，港、澳、台商独资经营企业及港、澳、台商投资股份有限公司；“外商投资企业”指中外合资经营企业、中外合作经营企业、外资企业和外商投资股份有限公司。请在相应数字后“□”内打“√”。

八、“三项经费预算（分项表）”请据实填写，其中“审批经费”内容由市科技局填写。

九、“技术水平”：国际领先、国际先进、国内领先、国内先进、省内领先、省内先进。“技术表达形式”：论文、新材料、新工艺、新产品（品种）、成熟产品（品种）。

十、“项目实施基础条件”要求填写项目实施在技术人才、资金投入、技术装备、企业管理及水电条件等方面的情况。

十一、“技术指标”要求注明项目研究开发产品（品种）执行的标准，项目完成后达到的具体技术性能指标。

十二、“经济指标”指项目完成后，达到的年产量、产值、利润、税收、创汇等。

十三、“社会与环境效益”指项目完成后，资源利用、人员就业、环境污染与防治等方面的情况。

十四、“管理部门意见”、“项目管理”部分由市科技局填写。

一、基本情况

1、项目简介（限300字以内）

一、主要研究内容

1.猪圆环病毒（PCV-2）感染的致病机理研究；

2.猪圆环病毒的实验室培养方法的研究；

3.猪圆环病毒感染发病的防治技术研究。

二、技术特点

本研究的技术关键在于猪圆环病毒感染致病机理的研究。针对猪圆环病毒感染发病引起的特征性高度免疫抑制，探讨猪圆环病毒与免疫系统之间的相互作用。

三、投资情况

预计总投资20万元，其中申请经费15万元，自筹经费5万元。

四、预期经济效益

1.仔猪成活率提高5以上；

2.研制出猪圆环病毒单克隆抗体、疫苗和药物，通过技术成果转让产生直接经济效益30--50万元，推广应用产生间接经济效益500万元。

2、项目技术领域及所处阶段

技术来源1√2□3□4□5□

技术领域畜牧

所处阶段1√2□3□

3、项目承担单位

主要承担单位单位名称**市畜牧兽医站

单位地址**市**210号

法人代表**联系电话****

传真*****邮政编码****

经济类型1√2□3□4□5□6□7□8□9□10□

上级行政主管部门**市农业局

合作或

协作单

位及其

分工

4、项目主成员情况

姓名性

别年

龄职务

职称学历所学

专业现从事专业所在单位

负责人****38站长、高级畜牧兽医师大学本科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

主

要

参

加

人

员**********副站长、高级畜牧兽医师大学专科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

*****男**站长、高级畜牧兽医师大学本科兽医畜牧兽医**市家畜家禽检疫站

*****男**中级畜牧兽医师大学本科畜牧畜牧兽医

**市畜牧兽医站

*****男**助理畜牧兽医师硕士兽医畜牧兽医**市畜牧兽医站

*****男**助理畜牧兽医师大学本科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

*****男**助理畜牧兽医师大学专科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

5、三项经费预算（单位：万元）

费用名称申报

经费审批经费备注

设备、仪器购置费

2材料、样品加工费

2土建安装费

3资料、调研费

2实验、检测费8

鉴定费

1技术合作费1

其它费用1

合计20

二、立项依据

1、项目的目的、意义及国内外发展趋势、市场预测

猪2型圆环病毒(PCV-2)感染及其相关疾病现已在全球范围内被认识并被看成是造成猪场主要经济损失的原因，已引起世界各国的广泛重视。猪圆环病毒与其他病原体混合感染的高度相关性；在短时间内世界范围广泛的传播;对猪广泛的高度易感性；对免疫器官的严重攻击，导致高度免疫抑制性；目前尚缺商品化的疫苗、有效治疗药物和有效的控制能力，使养猪业蒙受惨重的经济损失，成为当前国内外对养猪业危害极大的病毒性传染病。探讨防制该病的有效措施，是当前国内外养猪业密切注视的热点。

2、项目研究开发内容、技术关键、技术方案或技术路线，预期技术水平

及表达形式

一、主要研究内容

1.猪圆环病毒（PCV-2）感染的致病机理研究；

2.猪圆环病毒（PCV-2）的实验室培养方法的研究；

3.猪圆环病毒（PCV-2）感染发病的控制技术研究。

二、技术关键

本研究的技术关键在于猪圆环病毒（PCV-2）感染致病机理的研究。针对猪圆环病毒感染发病引起的特征性高度免疫抑制，探讨猪圆环病毒与免疫系统之间的相互作用，这是项目研究的重点和难点。

三、技术路线

3、项目实施基础条件

具有一定水平的动物疫病诊断实验室和饲料质量检测室，为项目实施提供有力的设备支持。拥有全自动生化培养箱、酶标仪、高效液相色谱仪、冷冻离心机、冷冻切片机、荧光显微镜、双道原子荧光光度计等仪器设备。另外，我站**白猪育种中心下属的四个原种场，进贤县、新建县、**县、安义县畜牧良种场可提供优良的试验猪场和推广基地。

二、项目主要技术、经济指标和社会与环境效益

技

术

指

标

探讨猪圆环病毒（PCV-2）感染致病机理。

经

济

指

标

1.仔猪成活率提高5以上；

2.研制出猪圆环病毒（PCV-2）单克隆抗体、疫苗和药物，通过技术成果转让产生直接经济效益30-50万元，推广应用产生间接经济效益500万元。

社

会

与

环

境

效

益

猪2型圆环病毒(PCV-2)感染及其相关疾病现已在全球范围内被认识并被看成是造成猪场主要经济损失的原因，已引起世界各国的广泛重视。目前尚缺商品化的疫苗、有效治疗药物和有效的控制能力，使养猪业蒙受惨重的经济损失，成为当前国内外对养猪业危害极大的病毒性传染病。探讨防制该病的有效措施，是当前国内外养猪业密切注视的热点。

三、项目工作进度安排

起止年月主要工作资金使用安排（万元）

自筹资金三项经费

2005.1—2005.6

完成开题报告和相关资料的查新

2005.7—2006.6

猪圆环病毒（PCV-2）的实验室培养

2006.7—2007.6

猪圆环病毒感染的致病机理的研究

2007.7—2008.6总结猪圆环病毒感染相关疾病的综合防治技术

2008.7—2008.12完成结题报告和撰写论文

五、管理部门意见

项目管理人意见：

项目管理人(签章):

二○○年月日

处室负责人意见：

负责人（签章）：

是否提交评估：是口否口二○○年月日

市科技局审定意见：

市科技局资助经费总额：

二○○年月日

六、项目管理

项目进展阶段项目进程及完成情况三项经费

（万元）项目管理人

（签章）

第一阶段

（年月开始）

第二阶段

（年月开始）

第三阶段

（年月开始）

第四阶段

（年月开始）

七、共同条款

1、本合同签字生效后，**市科技局（以下简称甲方）按合同规定进度向项目承担单位（以下简称乙方）核拨经费，按合同规定到位配套资金。乙方应实行专款专用，并接受甲方的监督、检查，乙方在经费下达后，必须按计划进度将项目执行情况以书面形式向甲方报告。

2、乙方应在项目完成后的二个月内向甲方申请项目鉴定或验收，并按规定提交鉴定或验收的有关材料。

3、在本合同生效后5年内，甲方有权因非商业目的（如：在政府性会议、报告、文件、统计资料等）使用乙方企业、项目信息。

4、甲方鼓励乙方尽快将本项目进行商业化应用。如在项目验收后2年内，乙方未能将本项目投入实质性商业化应用，甲方有权指定第三方进行商业化应用。乙方应就技术使用费及其支付方式与第三方达成协议，双方不能达成协议的，由甲方确定合理的使用费。

5、任何一方因不可抗拒力不能履行合同时，应及时通知另一方，并在合同期内出具不能履行合同的证明。任何一方提出变更合同的要求，需与另

一方协商，签定变更协议后方可执行。

6、甲乙双方应严格遵守本合同的各项条款、在项目实施过程中，如发现乙方违反本合同及有关规定，甲方有权撤消或终止合同。撤消或中止合同后，乙方应进行项目清算，并将甲方下拨的剩余经费如数退还。同时，甲方在今后三年内不再受理乙方的项目申请。

7、甲乙双方与___________________________（以下简称丙方）共同协商，确认丙方为本项目的委托管理部门，乙方应接受甲方赋予丙方对本项目实施及拨付资金使用的监督和检查。

8、双方如发生争议，应协商解决，协商不成，任何一方均可向**市仲裁委员会提请仲裁。仲裁是终局的，对双方均有约束力。

9、根据项目具体情况，经双方协商订立的附加条款将作为本合同的组成部分。

10、本合同未尽事宜，双方按科技计划、科技三项经费管理等有关规定执行。

11、其它条款：

①、②

12、本合同一式份。

八、签定合同各方

甲方：

地址：

负责人（签章）：

电话：

邮编：

（盖章）

二○○年月日

乙方：

地址：

法人代表（签章）：

电话：

邮编：

开户银行：

帐号：

（盖章）

二○○年月日

丙方：

地址：

负责人（签章）：

电话：

邮编：

（盖章）

二○○年月日

猪圆环病毒2型研究 篇6

免疫因素包括病毒与宿主免疫系统的相互影响。 病毒对免疫系统的影响表现在PCV2的感染能够引起淋巴组织损伤,产生免疫抑制; 因此,PCV2阳性猪场更容易出现其他病原的混合感染,造成多系统损伤。宿主免疫系统对病毒的影响首先表现在不同的其他病原疫苗免疫后感染PCV2能够引起不同程度的病毒血症和淋巴组织损伤,PCVAD出现的概率也存在差异,说明宿主免疫系统状态影响PCV2感染的发展。其次,PCV2疫苗的接种能够有效控制PCV2的感染和PCVAD的发生,缓解组织损伤,减少病毒血症和共感染［2］,说明宿主免疫保护性应答水平也影响PCV2感染的走向。

PCV2虽然个体小,却有很大的破坏力,主要破坏免疫系统,引起淋巴细胞减少和免疫抑制,导致其他病原的感染,合力损害机体主要组织器官,最终发展为多系统衰竭,甚至死亡。当然,大部分感染并不表现出明显的临床症状,只影响猪群质量。如今PCV2影响免疫系统的机制和PCVAD的发生机制仍不是很清楚,感染是否发展为PCVAD也受多方面影响,但可确定宿主的免疫状态,包括疫苗引起的免疫保护性应答是其中的关键因素。因此,本文对PCV2感染引起的免疫应答和免疫系统损伤进行了综合探讨,并介绍了PCV2的疫苗发展情况,对疫苗接种引起的免疫应答效果进行总结。

1 PCV2对靶器官和靶细胞的影响

PCV2可感染任何时期的猪,包括胚胎期。当胚胎细胞开始孵化、透明带屏障消失后,细胞非常容易被PCV2感染,病毒大量复制后可导致胚胎细胞在子宫内死亡并被吸收。对已怀40 ~ 70 d的胎儿,PCV2主要的靶细胞为心肌细胞、肝细胞和单核细胞系,其中心肌细胞是病毒复制的最佳场所,细胞内病毒含量最高,持续时间最长,可导致胎儿心脏受损引发死亡, 变成木乃伊胎。胎儿出生后PCV2不再趋向心肌细胞,主要在巨噬细胞和淋巴母细胞内,巨噬细胞内的病毒一般为自身吞噬,而淋巴母细胞则对PCV2非常易感。6 ~ 16周龄断奶仔猪是出现多系统衰竭综合征( PMWS) 的主要群体,淋巴结肿大是早期最突出的症状,包括腹股沟和肠系膜淋巴结等; 而微观损伤主要为各器官淋巴细胞相关区域被组织细胞和多核巨细胞浸润,涉及的器官有肺脏、肝脏、肾脏等,表现在PMWS猪为CD+21B淋巴细胞和CD+3T淋巴细胞明显减少,所有T淋巴细胞亚群包括CD+3CD+4CD8+记忆性Th细胞、CD+3CD+4CD－8Th细胞、CD+3CD4－CD+8Tc细胞、CD+3CD－4CD－8γδT细胞含量均下降, 其中减少最显著的是CD+3CD+4CD+8记忆性/效应Th细胞; 另外,CD－3CD－4CD+8的NK细胞含量也下降,但中性粒细胞和单核细胞很少受影响［3］。

2 PCV2感染对固有免疫系统的影响

固有免疫在病毒感染早期起着重要作用,尤其是PCV2这种以淋巴组织和细胞为靶点的病毒。迄今为止,不同研究者对PCV2与猪免疫系统之间的相互作用还存在争议,矛盾点在于病毒如何影响固有免疫系统,包括在免疫防御和调节中起决定性作用的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞( DC细胞) 。

2. 1 PCV2感染对树突状细胞的影响

体外试验证实,PCV2偏好于感染DC细胞和巨噬细胞,但基本不在DC细胞中复制。有趣的是, PCV2的感染不影响DC细胞的生存,DC细胞内长期积累的病毒抗原和DNA也不会影响病毒在体内的复制,因此带毒的DC细胞在病毒的持续感染和传染中扮演重要角色; 另外,PCV2对单核细胞和DC细胞的感染能够通过交互作用引起其他免疫相关细胞和细胞因子的异常,破坏体内生理平衡［4］。研究还发现, 用感染PCV2的DC细胞与淋巴细胞共孵育,可引起CD+4CD+25Foxp3+Treg细胞数量增加,而且PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV) 共感染的DC细胞引起的增幅更显著［5］,这可能是产生细胞抑制的原因之一。

2. 2 PCV2感染对单核细胞和巨噬细胞的影响

在体外,单核细胞衍生的巨噬细胞和肺巨噬细胞容易内化PCV2,这种感染方式与DC细胞相似,同样病毒很少在肺巨噬细胞内复制,但PCV2可以增强单核细胞和巨噬细胞的增殖能力,促进巨噬细胞融合形成多核巨细胞。因此,巨噬细胞和DC细胞都不是一个“病毒制造厂”,而是一个“病毒特洛伊木马”。研究显示: PCV2可通过削弱O－2和H2O2的产生来降低巨噬细胞的噬菌和杀菌作用; 并可刺激肺巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子- α( TNF - α) 和白细胞介素- 8 ( IL - 8) ,上调肺泡巨噬细胞趋化分子Ⅱ( AMCF - Ⅱ) 、粒细胞集落刺激因子( G - CSF) 和单核细胞趋化蛋白- 1( MCP - 1) 的mRNA表达［6］。这些增加的细胞因子,尤其是TNF - α 和IL - 8,可能是引起发热、呼吸窘迫和肺炎的主要分子。

2. 3 PCV2感染对外周血单核细胞( PBMC) 的影响

研究显示,在PBMC中瞬时表达PCV2的ORF3蛋白能够诱导PBMC的凋亡。研究还发现,在PCV2感染前期,PBMC中的促炎症细胞因子( IL - 8、 TNF - α、IL - 1β) mRNA的表达明显上升,但PMWS动物的PBMC中促炎症细胞因子的含量反而下降( 与巨噬细胞相反) ; 并且分泌IL - 2、IL - 4和 γ - 干扰素( IFN - γ) 的能力下降,尤其是在外源抗原( PRV抗原) 、细胞有丝分裂原( PHA) 或超级抗原( SEB) 的刺激下减少得更明显。此外,PCV2能促进PBMC、 CD+172a细胞和小鼠骨髓来源树突状细胞( BMDC) 等分泌IL - 10,提高脾脏、淋巴结、扁桃体和胸腺的IL - 10含量。由于IL - 10主要介导免疫抑制,所以有学者推测这可能与PCVAD的发生和PCV2的持续感染密切相关［7］。

2. 4 PCV2核酸对固有免疫的影响

PCV2诱导免疫调节的分子机制仍不清楚,不过研究显示,PCV2的病毒DNA影响单核细胞和树突状细胞的细胞因子分泌,因此有学者推测相关DNA片段可能与体内TLRs或者细胞质内解旋酶相互作用以影响细胞因子分泌［8］。F. C. Hasslung使用5个含Cp G模体的PCV2基因相关寡聚核苷酸序列( Cp G - ODNs/PCV) 刺激PBMC,结果有4个可促进细胞分泌IFN - α,另一个则抑制IFN - α 的分泌。 T. Kekarainen等人用16种Cp G - ODNs / PCV刺激猪PBMC和BMDC,结果表明: Cp G - ODNs / PCV并不能诱导PBMC分泌IL - 10( 全病毒可诱导) ; 但绝大多数可抑制记忆抗原刺激后的PBMC分泌IFN - γ 和IL - 2,并抑制伪狂犬病病毒( PRV) 刺激后的BMDC分泌IFN - α［2］。有趣的是,这种抑制效应主要位于PCV2 Rep基因上,进一步研究显示,Cp G - ODNs / PCV的免疫调节功能不仅受核酸序列影响,还可能与DNA的二级结构密切相关［9］。

另外,这些抑制效应不局限于Cp G - ODNs/PCV中,用PCV2全基因组DNA刺激上述细胞具有更加多样的抑制效应。除上述抑制作用外,还能抑制TLR7 /8激动剂R837和其他病原相关分子模式分子[包括伪狂犬病毒( PRV) 、猪传染性胃肠炎病毒( TGEV) 、猪瘟病毒( CSFV) ]引起的免疫应答反应［8］。即全基因组DNA具有更强的免疫抑制作用, 可引起固有免疫系统紊乱,导致多重感染。

3 PCV2感染对体液免疫系统的影响

在猪场中,母源抗PCV2抗体从3周龄左右开始下降,直至11周龄基本消失; 母源抗体在哺乳期和断奶前期对仔猪抵抗PCV2感染有着很重要的作用,这也是4周龄前仔猪极少出现PMWS的原因,但母体抗体和母源抗体均无法阻止病毒感染仔猪［10］。猪场仔猪自身抗PCV2抗体一般在7 ~ 12周龄出现阳转, 至少能够持续到28周; 但在实验室中阳转一般发生在病毒接种后10 ~ 28 d内,不过出现PMWS的猪抗体阳转会延后,并且抗体效价低于无临床症状猪［3］。

抗PCV2的Ig M抗体阳性是PCV2病毒血症的指标; Ig M抗体一般于病毒接种后7 ~ 14 d内出现,21天时达到最高值,随后下降,直至第49天消失。Ig G抗体的出现晚于Ig M抗体,是抗PCV2抗体的主要组成部分,一般在病毒接种后14 ~ 21 d内出现,并能持续增长至第69天。根据病毒中和试验,中和抗体一般为Ig G抗体,其阳转发生于接种后第15天之前,表现为随着中和抗体效价的上升血液中病毒含量会相应减少,与之对应,中和抗体效价低的动物感染PCV2后病毒含量也高,而出现PMWS的猪中只含有较低甚至没有中和抗体,说明中和抗体与病毒的清除密切相关［11］。

4 PCV2感染对细胞免疫系统的影响

最新研究显示,动物接种PCV1 ~ 2嵌合疫苗后抗体水平很低,但却能完全抵御后面PCV2的感染, 说明细胞免疫应答在对抗PCV2感染具有重要作用。 研究指出,PCV2的Cap和Rep都能够诱导产生PCV2特异性诱导分泌IFN - γ 细胞( PCV2 - IFN γ - SC) ,此细胞的发育情况是细胞免疫应答抵抗PCV2感染的关键点［11］。共同接种PCV2和猪细小病毒( PPV) 的动物最早于接种后第7天出现PCV2 - IFN γ - SC,但单独接种PCV2的动物直到接种后第21天才能检测到。伴随着PCV2特异性抗体( 尤其是中和抗体) 和PCV2 - IFN γ - SC的出现,无症状动物血液中的病毒效价随之下降; 而缺少任何一个都会影响病毒的清除,导致PMWS的出现［12］。

大部分研究指出,淋巴细胞的损耗并伴随组织细胞浸润是PMWS动物最显著的特征。主要表现为: 在淋巴结中滤泡树突状细胞、指突状细胞、滤泡间质淋巴细胞、B淋巴细胞和CD45RA+细胞减少; 滤泡区域中SLA - Ⅱ阳性细胞和CD+3T淋巴细胞减少; 大部分淋巴组织中CD+4、CD+8、CD+4CD+8T淋巴细胞减少,而单核巨噬细胞的数量增加。试验证实,这些改变与感染的PCV2病毒数量密切相关,相似的改变也出现在PMWS动物的外周血中。另外研究还显示,PWMS动物中MHCⅡ + CTL细胞和CD+25CD4+Fox P3+Treg细胞明显增加,前者参与自身免疫造成淋巴细胞的损伤,后者引起免疫抑制［13］。总体显示, PMWS动物细胞免疫系统受损严重,效应细胞的减少和免疫抑制导致免疫应答能力下降。

5 PCV2疫苗

自发现PCV2是引起PWMS的主要病原,有关PCV2疫苗研究从未停止过。自2004年起,一些商业化PCV2疫苗被广泛用于各地区猪场,均为PCV2a型,包括法国梅里亚动物保健有限公司的油佐剂灭活疫苗CIRCOVAC,德国勃林格殷格翰动物保健公司和美国先灵葆雅动物保健有限公司的PCV2 - ORF2亚单位疫苗茵格发Circo FLEX和Circumvent,美国富道动物保健公司的灭活PCV1 ~ 2嵌合病毒疫苗Su- vaxyn PCV2。韩国学者最近使用上述疫苗接种3周龄仔猪,并在接种17周后攻毒,显示4种疫苗均能有效对抗PCV2的感染,缓解PCV2与PRRSV共感染引起的病毒血症和组织损伤。不过灭活的PCV1 ~ 2嵌合病毒和PCV2病毒疫苗能够诱导更多的中和抗体和PCV2 - IFN γ - SC,并且具有较轻的病毒血症［14］。 另外试验证实,使用大剂量的疫苗能够完全清除实验室猪群中人为感染的PCV2,但在天然感染猪场中使用亚单位疫苗进行多次免疫,结果在免疫前、免疫期和免疫期后仔猪带毒率分别为8% 、0. 9% 、3. 5% 。 说明接种疫苗可以降低猪场的感染率,但不能完全清除猪场环境下的PCV2,一旦疫苗效力消失猪场感染率就开始上升［15］。

进一步研究表明,PCV2疫苗的一个重要组成部分是PCV2的衣壳蛋白( Cap) 或者相关基因。含Cap或相关基因的亚单位疫苗和基因载体疫苗都能有效诱导抗PCV2抗体的产生和淋巴细胞的增殖。小鼠和猪的试验结果显示,病毒ORF2基因的质粒载体疫苗与Cap亚单位疫苗均能有效诱导淋巴细胞增殖和特异性识别Cap的CD+4T淋巴细胞产生,但前者在诱导CD+8T淋巴细胞免疫应答和病毒中和抗体方面优于后者,并能够更有效对抗PCV2感染［16］。说明疫苗诱导的CD+8T淋巴细胞和中和抗体在对抗PCV2中处于一个非常重要的地位。

迄今,全球市场仍没有商品化的PCV2减毒活疫苗,相关研究也较少。M. Fenaux等将PCV2分离株在PK - 15细胞中连续传至120代,结果发现,第120代病毒( PCV2 VP120) Cap基因中有2个碱基突变。 用PCV2 VP120和PCV2 VP1感染SPF猪,结果感染PCV2 VP120的病毒血症发生率低于PCV2 VP1,同时病毒血症的持续时间短,血清中病毒基因拷贝数较低,临床症状及组织学病变也较轻,这可能是减毒活疫苗研究的突破点。另外,M. Hemann等［17］用弱毒的PCV1 ~ 2嵌合病毒接种健康猪,并与灭活的PCV1 ~ 2嵌合病毒对比,结果发现: 接种活PCV1 ~ 2的21 ~ 28 d后可在猪体内检测到PCV1 ~ 2的DNA, 保护性抗体出现得更早且效价更高; 但在攻毒后第147天检测淋巴组织中PCV2 DNA,接种活PCV1 ~ 2的3头猪有1头为阳性,而灭活疫苗组3头猪均为阴性,说明弱毒PCV1 ~ 2有一定的免疫保护效力,但仍有缺陷,无法达到猪场应用条件。

6总结

猪圆环病毒2型疫苗的合理使用 篇7

猪圆环病毒通常感染3周后发病，常与多种病原混合感染，猪圆环病毒和蓝耳病混合发生时，死亡率高达70%～80%。目前，疫苗免疫是预防猪圆环病毒的有效方法，病毒2型灭活疫苗使用效果好。

猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫有着严格的程序。仔猪：3～4周龄首免，间隔3周加强免疫1次，1 mL;后备母猪：配种前做基础免疫2次，间隔3周，产前1个月加强免疫1次，2 mL;经产母猪：跟胎免疫，产前1个月接种1次，2 mL;公猪和其它成年猪：实施普免，每半年免疫1次，2 mL。另外，猪圆环病毒单独发生率只有1%，与蓝耳病混合感染发生率高达51%以上，因而，猪圆环病毒疫苗与经典蓝耳病活疫苗合免效果好。

猪圆环病毒2型研究 篇8

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料

取病变典型的病猪肺脏腹股沟淋巴结、部分肺脏以及部分肾脏, 于-20℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

DL-2000 DNA Marker (购自大连宝生物生物工程有限公司) 、蛋白酶K、饱和酚、琼脂糖等 (购自金博生物技术有限公司) , 其它试剂均为进口或国产分析纯品。

1.1.3 主要仪器

DYY-2型琼脂糖凝胶电泳槽 (北京六一仪器厂) 、凝胶成像系统 (Alpha Innotech公司) 、2A200型电泳仪 (Amersham公司) 、生物安全柜 (苏净集团安泰公司) 、超纯水 (自宝生物工程有限公司) 、DTC-200型PCR仪 (MJ Reaserch公司) 、BCD-251型冰箱 (Hisense公司) 、移液枪 (Eppendorf公司) 。

1.2 试验方法

1.2.1 根据NCBI上发表的PCV2全基因序列, 参照Fenaux等设计1对引物:

PF、PR用于扩增PCV2全基因序列, 引物由生工生物 (上海) 股份有限公司合成。PF:TGTCCGCGG GCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA, PR:GCCCGCGG AAATTTCTGACAAACGTTACA。

1.2.2 对病料用蛋白酶K裂解法提取总DNA

取称取病死猪的腹股沟淋巴结各0.5g于研钵中, 用剪刀剪碎, 加入2.0ml PBS缓冲液, 研磨。取研磨液500μl于1.5ml离心管中, 按终质量浓度为20mg/L蛋白酶K、1%SDS 56℃消化2h, 然后用等体积的酚:氯仿 (1:1) 抽提组织中的总DNA, 最后用2倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA, 并将DNA溶解在100μl灭菌超纯水中, 其后取2μl作为PCR反应模板。

1.2.3 利用设计的PCR引物, 以上述DNA为模板进行PCR扩增

PCR扩增条件为:预变性95℃9min, 94℃变性1min, 48℃退火1min, 72℃延伸3min, 30个循环后, 72℃延伸10min。取5μl PCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测。

2 试验结果

2.1 临床症状及剖检病变

通过观察送检疑似感染猪圆环病毒2型的病猪, 临床上主要表现为消瘦, 腹部皮肤表面有硬币大小的斑块, 呼吸急促困难。剖检发现该病最明显的病变是淋巴结肿大、肝硬变、多灶性黏液肿性支气管炎, 肠、胃、回盲瓣黏膜有出血, 肺脏外观灰色至褐色呈斑驳状, 质地似橡皮, 脾肿大、坏死色暗, 肾苍白、肿大、有坏死灶, 心包炎, 胸腔积水并有纤维素性渗出。

2.2 PCR鉴定结果

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 阳性对照及送检样品在703bp处均出现目的条带 (附图) , 与预期结果相符。确诊该病猪感染猪圆环病毒2型。

1.阳性对照;2.腹股沟淋巴结;3.肺脏;4.肾脏

3 结论

本研究通过对送检病猪临床症状和剖检病理症状的观察以及PCR检测实验室诊断方法确诊了一例感染猪圆环病毒2型 (PCV2) 病例, 以该养殖户为中心对周围养殖小区进行调查, 发现周围养殖小区普遍存在疑似感染PCV2现象, 证实了该病毒在山东省诸城市流行的可能, 因此应加强对该病的预防。

猪圆环病毒2型研究 篇9

由于PCV2感染所致的疾病较为复杂, 目前对组织病理学变化特点了解不够全面。本研究对云南猪场临床确诊的PCV2感染猪的组织病理学进行了观察, 以期为PCV2感染的诊断及治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2013年2月, 云南省某猪场10余头5~6月龄猪先后发生了以食欲废绝、气喘, 病猪体温升高达41℃, 拉稀, 粪便呈污水状, 病猪普遍消瘦, 耳红, 皮皮肤以紫色、白色或轻度黄疽为临床特征的疾病。对1头病死猪和2头濒死猪进行了解剖, 采集2份实质器官, 1份现场用10%福尔马林固定, 另1份冷冻保存用于病原检测。

1.2 组织病理学观察

将上述固定好的组织经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋, 然后作厚4μm的连续切片。切片入二甲苯脱蜡, 梯度酒精脱水, 苏木素染色10min, 盐酸酒精分色, 自来水蓝化, 伊红酒精染色, 酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光镜观察、照像, 判定结果。

2 结果

组织病理学观察结果发现, PCV2感染猪肾脏出现严重的坏死性血管炎、纤维坏死性血管肾炎, 肾小管腔内有蛋白管形;心肌肌纤维断裂;肝脏存在肝窦、中央静脉淤血和淋巴细胞浸润;支气管和细支气管区出现很多病灶, 肺泡腔、支气管存在间质性肺炎、炎性渗出物, 肺泡间隔淋巴细胞和浆细胞数量减少, 而单核细胞和巨噬细胞渗入, 肺泡间隔明显增厚;脾脏有严重的坏死性血管炎;坏死性淋巴结炎, 淋巴结实质区发生广泛性坏死, 或者主要集中在淋巴结滤泡区, PCV2在淋巴结坏死区大量存在。多数患猪淋巴结淋巴细胞缺失, 还有大量组织细胞及多核巨噬细胞浸润。

3 讨论

近年来, 云南省猪群中因PCV2感染引起的相关疾病日趋严重, 发病率和死亡率不断增加, 给养猪业带来巨大的经济损失。PCV2感染后可出现各种临床类型, 如断奶仔猪多系统衰竭综合征, 表现为消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、腹泻, 有时还表现出黄疸, 增生和坏死性肺炎可见呼吸困难、支气管间质性肺炎、细支气管纤维素性渗出、中度或严重坏死等, 皮炎与肾病综合征可表现为妊娠后期母猪流产、死胎及木乃伊胎为主的繁殖障碍病等。剖检变化表现出多种组织器官的广泛性病理损伤, 如肺脏重量和硬度增加, 深红色小叶性肺炎病灶, 外观大理石样, 严重时可见黑红或棕色的肺泡出血斑;肝淤血、肿大, 胆汁淤滞, 肝小叶间结缔组织明显增生, 致肝硬化, 体积缩小;肠道黏膜充血、出血、固有层内大量炎性细胞浸润;肾脏肿大、色淡、表面散在有出血点;脾脏增大、切面呈肉状、无充血。

PCV感染常见组织病理学变化, 有急性坏死性或慢性纤维素性心肌炎、淋巴结炎、肾脏的间质性肾炎、间质性肉芽肿肾炎或者二种类型并存等。猪皮炎肾病综合征中肾脏损伤最为严重, 肾小球严重的纤维素性坏死、肾盂非化脓性间质性肾炎和坏死性血管炎。近年来已有报道, 猪皮炎肾病综合征患猪肾小管细胞具有很高的PCV2载量, 并伴有肾小管坏死和间质性出血。肺脏组织弥漫性巨噬细胞和淋巴细胞间质性渗出, 肺泡血管壁纤维素性坏死其周围肺泡出现水肿。资料表明, PCV2感染还可导致小脑淋巴组织细胞血管炎、脑出血或者淋巴组织细胞脑膜炎。本次研究结果表明, 云南PCV2感染猪主要受侵害的系统为淋巴结、肾脏、肺脏和心脏。心肌肌纤维断裂等病理表现再次表明, 心血管系统和内皮细胞可能在PCV2感染的发病机制中发挥了重要的作用。

PCV2能引起猪的免疫抑制, 从而带来混合感染、继发感染等一系列问题, 给养猪业带来严重的危害。迄今为止, PCV2感染尚无有效疫苗和特效的治疗药物, 所以及早地对其进行准确诊断, 并采取相应的生物安全措施, 对预防和控制此病至关重要。期望通过研究其致病机理而寻找到能够有效地防控此病的方法和措施。

参考文献

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[2]蒋志远.猪圆环病毒病及其预防[J].中国畜牧兽医文摘, 2014, (1) :98.

[3]Darwich L, Mateu E.Immunology of porcine circovirus type 2 (PCV2) [J].Virus Res, 2012, 164:61-67.

[4]刘今竺, 刘飞, 王云飞.猪圆环病毒病研究进展[J].当代畜禽养殖业, 2013, (1) :19-21.

猪圆环病毒2型研究 篇10

本文对2009～2010年上半年辽宁省335个兽医门诊送检的具有典型PMWS症状病猪的病料样品进行PCV2荧光PCR检测, 从中选取6份阳性病料进行病毒DNA的分离、鉴定、测序, 分析6株PCV2辽宁省分离毒株的基因序列, 比较分离毒株互相之间的同源性, 再与Genbank中2004～2010年之间国内外不同地域发表的13个参考毒株的ORF1、ORF2基因序列之间进行比对, 进而分析国内外流行毒株之间的内在联系, 各毒株分子流行病学特点, 比较各毒株间的同源性和差异性, 为辽宁省防控PCV2相关疾病提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

PK-15细胞由中国动物卫生与流行病学研究中心惠赠。病料为辽宁省各地区335个兽医门诊采集具有典型PMWS临床症状和剖检病变的病死猪的淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和扁桃体等组织器官。

1.1.2 主要试剂

DNA凝胶快速回收试剂盒购自广州东盛科技有限公司;Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、1 dNTPs、10×Buffer E、T4DNA连接酶和限制性内切酶EcoRI均购自上海华美生物工程有限公司;Proteinase K、pGEM-T Easy载体均购自Promega公司;大肠杆菌DH5α由中国动物卫生与流行病学研究中心惠赠;DNAMarker DL 2 000+DL 15 000、X-gal和IPTG均购自大连Takara公司。

1.1.3 主要仪器

台式高速冷冻离心机 (Z323K型) , 德国赫默公司;PCR仪 (T1型) , 德国Biomepra公司;凝脂成像分析仪 (UV-WHIPE型) , 美国Upv公司;电泳仪 (3000X1型) , 美国BIO-RAD公司;紫外分析仪 (UV-3000型) , 上海天能科技电子有限公司;恒温金属浴 (CHB-100型) , 杭州大和热磁电子有限公司

1.2 方法

1.2.1 PCV2的分离与鉴定

(1) 分离。将PCV2荧光PCR检测结果为阳性的病料中随机选取6份用研磨器研磨后, 反复冻融4次, 提取上清液, 用0.22μm的细菌滤器过滤除菌。培养过程中同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。将上述病毒滤液与PK-15细胞悬液按体积比1:9的比例充分混合, 37℃培养48 h。弃去生长液, 用200 mmol/L D-氨基葡萄糖37℃处理25 min。倒去D-氨基葡萄糖, 用Hank′s液洗涤细胞3次。再加入细胞生长液继续培养72 h, 将细胞反复冻融3次, 收集病毒液。 (2) 将接种PCV2病毒的PK-15细胞, 反复冻融3次以裂解细胞, 取待测样本各100μl, 分别加到0.5 ml离心管中;加入100μl试剂盒的DNA提取液1, 振荡混匀, 13 000 r/min离心10 min;吸弃上清;再加入25μl试剂盒的DNA提取液2, 振荡混匀, 2 000 r/min离心10 s;100℃干浴10 min;13 000 r/min离心10 min, 保留上清于-20℃备用。

1.2.2 PCV2基因测序与分析

1.2.2. 1 PCV2全基因引物设计及合成

参考GenBank中已发表的PCV2序列, 应用primer 5.0软件, 设计出一对PCV2全基因扩增引物 (P1/P2) 。

引物由大连宝生物工程公司合成。

1.2.2. 2 PCV2基因的PCR扩增

各自以病料组织和细胞抽提物获得的DNA为模板, 进行PCR扩增。

PCR反应体系 (20μl) 包括:10×PCR缓冲液2μl、模板DNA 1μl、P1 (20 pmol/μl) 0.4μl、P2 (20 pmol/μl) 0.4μl、ExTaq酶0.2μl、dNTP (2.5 mmol/ml) 1.5μl、灭菌ddH2O 14.5μl。将各成分瞬时离心混合。

反应条件:94℃5 min;93℃55 s;59℃1 min;72℃1.5 min, 进行30个循环;最后72℃10 min, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.2. 3 PCV2基因片段的回收

利用DNA凝胶快速回收试剂盒, 按照试剂盒说明书对PCR扩增产物进行基因片段的回收。

1.2.2. 4 连接反应

取新的经灭菌处理的0.5 ml eppendorf管, 编号。将pGEM-T easy 0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中, 加等量 (可稍多) 的PCR产物。加蒸馏水至体积为8μl, 于45℃保温5 min, 以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。加入10×T4 DNA ligase buffer1μl、T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底, 于16℃保温8～24 h。

1.2.2. 5 重组质粒转化

用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α, 冰浴3 h后供转化试验用。

1.2.2. 6 质粒DNA的少量制备

按照质粒提取试剂盒说明书操作, 并于-20℃保存。

1.2.2. 7 酶切鉴定

在10μl重组质粒中加入2μl 10×buffer E、0.5μl EcoRⅠ, 添加超纯水至20μl, 37℃温育1 h, 用1.5%的琼脂糖电泳。根据出现目的片段大小, 确定目的基因是否已插入到pGEM-T easy载体。

1.2.2. 8 PCV2基因的序列测定与分析

通过以上病毒分离培养的方法获得6个克隆菌株, 送交中国动物卫生流行病学研究中心完成PCV2基因序列测定。利用DNAstar软件, 结合相关的文献资料, 分析PCV2基因的序列及所编码的氨基酸, 与已发表的基因序列比较分析同源性。

2 结果与分析

2.1 PCV2全长基因鉴定结果

2.1.1 病毒分离培养PCR鉴定结果

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 紫外光下观察可见, 6个PCR扩增产物都出现了与预期结果相符的位于1 767 bp附近的特异条带, 见图1。

1-6.6个PCV2分离株全长基因PCR扩增产物)

2.1.2 重组质粒酶切鉴定结果

共获得6个含不同PCV2毒株全基因组扩增片段的阳性重组质粒, 分别命名为PCV-LN33-08、PCV-LN73-10、PCV-LN02-10、PCV-LN07-10、PCV-LN101-10、PCV-LN19-09, 见图2。

(1-6.六个重组质粒T-pcv的双酶切产物)

2.2 序列分析结果

2.2.1 全基因组序列分析结果

本试验获得的6个PCV2辽宁分离株基因组全长均为1 767 bp, 与有关报道的一致。将这6个分离株与Genbank中2004～2010年以来分离的8株国内代表株以及5个国外代表株进行比较。应用DNAStar分析软件对这些序列进行全基因组序列同源性分析发现, 本试验6毒株与所选的其他参考毒株全基因核苷酸序列同源性介于94.6%～100%之间, 见图3。

2.2.2 ORF1序列分析结果

本试验6个PCV2分离株ORF1均为945 bp, 编码314氨基酸的蛋白质。通过对PCV2分离毒株ORF1核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较发现, 本试验6个分离毒株内部ORF1核苷酸同源性为96.8%～100%, 推导的氨基酸序列同源性为98.4%～100%, 见图4。

本研究用PCV2毒株 (包括试验株与参考毒株) 的ORF1核苷酸序列同源性为96.8%～100%, 推导的氨基酸序列同源性为97.5%～100%, 见图5。

2.2.3 ORF2序列分析结果

大部分PCV2病毒的ORF2有702个核苷酸组成, 推导氨基酸数目为233 aa。本试验的6个毒株内部ORF2核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.3%～100%和85.5%～100%, 见图6。

通过对PCV分离毒株ORF2核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较发现, 与ORF1相比, 不同PCV2毒株ORF2之间差异明显, 核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.6%～100%和80.4%～100%, 见图7。

2.2.4 PCV毒株的遗传学关系分析

从系统发生进化树可以看出 (见图8) , 所有PCV毒株大致可分为2个大分支, 试验株PCV-LN19-09单独位于其中的一个大分支内, 其他5株试验株共同位于另一大分支。每个大分支又明显分支为2个小亚群, 并在此基础上进一步分成细小的分支。

其中, 试验株PCV-LN19-09与2005年辽宁分离株LN05-EF524526以及2006年广西、河北、河南等地分离株同在一个小亚群内, 提示亲缘关系较近。试验株PCV-LN02-10、PCV-LN07-10与2005年上海分离株和2006年甘肃分离株同在一个小亚群, 亲缘关系较近。

试验株PCV-LN33-08、PCV-LN73-10、PCV-LN101-10与国外的2004年英国分离株、2010年西班牙分离株、2006年斯洛文尼亚分离株以及国内的2008年山东分离株、2004年浙江、江西分离株同在一个小亚群, 有较近的亲缘关系。2000年美国分离株和2000年加拿大分离株共同位于一个单独的小亚群, 且与试验株亲缘关系均较远。

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