新型肠道病毒71型

新型肠道病毒71型（精选3篇）

新型肠道病毒71型 篇1

摘要：目的 探讨不同方法在肠道病毒71型 (EV71) 检测中的效果对比分析, 方便对EV71做出及时而有效的诊断, 为该病快速鉴别诊断奠定基础。方法 采用ELISA、荧光定量RT-PCR、RT-PCR 3种方法对EV71病毒特异性和灵敏度进行综合分析。结果 通过对比分析, ELISA方法检出阳性18份, 阳性率为11.32%;实时荧光定量PCR方法检出阳性53份, 阳性率为33.33%;RT-PCR方法检出阳性51份, 阳性率为32.08%。结论 3种方法中实时荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度及特异性, 更具优势, 更能满足临床需要。

关键词：肠道病毒EV71,ELISA,实时荧光定量RT-PCR,RT-PCR

手足口病 (HFMD) 是由多种肠道病毒引起的一种急性传染病, 以婴幼儿发病为主, 重症手足口病多发生于年龄<3岁的儿童。主要通过密切接触或消化道传播, 以手、足、口腔等部位皮肤黏膜的皮疹、疱疹和溃疡为表现, 个别患者可引起心肌炎、肺水肿和无菌性脑膜脑炎等并发症[1]。该病以手、足和口腔黏膜疱疹或破溃后形成溃疡为主要临床症状[2], 是一种自限性疾病, 绝大多数病例1 w内痊愈, 但少数患儿病情复杂多变, 进展迅速, 可引起中枢神经系统并发症及神经源性肺水肿和肺出血, 具有较高的病死率和致残率[3]。引发手足口病的肠道病毒有20多种, 其中柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型最常见[4]。针对目前手足口病诊断技术的现状, 本实验室采用手足口病病毒核酸RT-PCR检测体系、手足口病病毒核酸实时荧光RT-PCR[5]检测体系及手足口病病毒抗原捕获ELISA检测体系, 均用于肠道病毒71型手足口病病毒检测, 旨在对其灵敏度、特异性、重复性、符合率等方面的差异进行比较。

1 材料与方法

1.1 样品来源

采集2012年1~10月四平市传染病院临床诊断159份手足口病患者血清标本。

1.2 试剂及仪器

QIAamp Viral RNA Mini Kit (52904) 购自Qiagen公司;肠道病毒71型病毒RNA检测试剂盒 (荧光PCR法) 购于北京金豪制药股份有限公司;QIAGEN One Step RT-PCR kit (210212) 自Qiagen公司;Rnasin (40 U/ul) 及核酸分子量质量标准DL2000DNA marker购于宝生物工程 (大连) 有限公司;PCR引物及探针购于上海生工生物技术有限责任公司;核酸染料购于厦门百维信生物科技有限公司;电泳液购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;肠道病毒71型Ig M抗体 (EV71-Ig M) 检测试剂盒 (酶联免疫法) 购于北京万泰生物药业股份有限公司。PTC-100PCR仪 (伯乐) ;FTC-3000荧光定量PCR仪 (上海枫岭) ;AUED-SYSTEM自动凝胶成像仪 (美国UVP) ;酶标仪及洗板机均为安图2010。

1.3 检测方法

1.3.1 ELISA法

检测急性血清EV71Ig M抗体, 按照标准过程进行血清处理并严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.2 样本准备

利用本实验已知的EV71病毒核酸阳性菌株作为阳性参考品, 同时设立DEPC处理水作为阴性参考品。将血清标本12 000 rpm离心5 min, 取上层血清提取核酸。

1.3.3 病毒RNA的提取

采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit, 按照试剂盒说明书操作。取上清液140μl。提取RNA, 最终收集RNA提取液40μl, 置-70℃保存或直接检测。阳性质控品待完全解冻后8 000 r/min离心10 s待用。

1.3.4 RT-PR反应

EV71病毒核酸检测引物来自中国疾病预防控制中心。EV71-S (上游) :5’-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC-3’;EV71-A (下游) :5’-ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC-3’。扩增片段长度为226 bp。反应体系:5×PCRBuffer 5.0μl, d NTPs (2.5 m Meach) 1.0μl, 上游引物 (0.1μg/μl) 下游引物 (0.1μg/μl) 各0.5μl, RNasin, 40 U/μl 0.1μl, RNase Free d H2O 12.0μl, 模板RNA 5.0μl。反应条件:60℃1 min, 42℃10min, 45℃30 min, 95℃15 min;94℃1 min, 45℃30s, 72℃1 min, 共34个循环;72℃10 min, 转入4℃。扩增结束后进行电泳及用AUED-SYSTEM自动凝胶成像仪进行结果判读。

1.3.5 实时荧光定量PCR

在PTC-3000 PCR扩增仪上进行PCR扩增, 按说明书进行反应混合液的配制和循环参数的设置, 同时设置阳性梯度模板和阴性对照。结果判定严格按照PTC-3000仪器操作说明书和PCR检测试剂盒说明书进行。

2 结果

ELISA法与荧光定量PCR法比较 (见表1) , χ2=22.20, P<0.01, 差异有统计学意义。对159份血清标本进行检测后, ELISA法检出EV71 Ig M抗体阳性18份, 阳性率为11.32%, 荧光定量PCR法检出EV71 Ig M抗体阳性53份, 阳性率为33.33%。荧光定量PCR法优于ELISA法。

ELISA法与RT-PCR法比较 (见表1) , χ2=20.15, P<0.01, 差异有统计学意义, 对159份血清标本进行检测后, ELISA法检出EV71Ig M抗体阳性18份, 阳性率为11.32%, RT-PCR法检出EV71Ig M抗体阳性53份, 阳性率为32.08%。RT-PCR法优于ELISA法。

RT-PCR法与实时荧光定量PCR法比较 (见表1) , χ2=0.064, P>0.05, 差异无统计学意义。

总体来看, ELISA法检出EV71Ig M抗体阳性18份, RT-PCR和实时荧光定量PCR检测方法中也呈阳性, 结果一致。RT-PCR法检出EV71Ig M抗体阳性51份, 实时荧光定量PCR检测方法中也呈阳性, 结果一致。

3 讨论

本研究通过对采集到的手足口病患者的159份血清标本, 进行了ELISA方法、RT-PCR及实时荧光定量PCR检测血清标本, 3种检测方法的比较研究:实时荧光定量PCR法检测出核酸阳性53份比RT-PCR法检测的阳性数多出2份, 符合率高, 表明实时荧光定量PCR比RT-PCR相比[6], 特异性与准确性更好, 具有独特的优势。由于从病毒感染到抗体出现需要一定时间, 因此, ELISA法用于肠道病毒EV71早期诊断灵敏度不高, ELISA检测159份血清中EV71Ig M抗体阳性数为18份, 通过比较显示ELISA法成本低, 方便快捷;局限性是灵敏度低。实时荧光定量PCR和RT-PCR技术克服了缺点且无需双份血清就能检测是否存在感染, 把基因扩增, 分子杂交和荧光标记技术融为一体[7], 反应和产物分析全过程都在完全封闭条件下进行, 实现了实时监测和自动分析, 从根本上解决了传统PCR检测过程中产物易受污染和不能定量的问题[8,9], 无需电泳和凝胶成像仪等步骤, 从标本开始处理到完成检测仅需3~4 h即可完成检测, 节省了检测的时间。

综上所述, 实时荧光定量PCR检测方法简便快速、更敏感、特异性更强, 更能减少实验室的交叉污染, 采样后数小时内检测到病毒的RNA, 达到快速诊断的目的, 因此该方法对肠道病毒的流行病学调查及治疗起重要作用[10]。荧光探针PCR方法能及时地为临床提供快速筛查, 鉴别判断感染病原的依据, 提高了肠道病毒诊断的可行性, 是一种理想的肠道病毒检测方法, 值得推广。

参考文献

[1]卫海燕, 黄学勇, 许玉玲, 等.EV71病毒核酸快速检测方法的比较[J].病毒学报, 2012, 28 (6) :670-674.

[2]王睿.402例手足口病病原学监测结果分析[J].安徽预防医学杂志, 2013, 19 (3) :151-152.

[3]曹银光, 胡艳军, 孙爱霞, 等.EV71感染重症临床诊断和预警指示的研究[J].中国实验诊断学, 2013, 17 (6) :1170-1171.

[4]徐昌敏, 王水明.24例重症手足口病的临床特征与治疗分析[J].湖北科技学院学报 (医学版) , 2013, 27 (3) :242-243.

[5]陶力新.实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用[J].职业与健康, 2010, 26 (9) :994-996.

[6]王雅静, 肖红, 王冰姝, 等.手足口病肠道病毒核酸检测方法的比较研究[J].中国热带医学, 2009, 9 (2) :199-201.

[7]陈应坚, 李水明, 徐亚军.应用荧光定量技术检测肠道病毒71型.现代预防医学, 2010, 37 (2) :339-355.

[8]王敏, 周小蓟, 陈露.实时荧光PCR技术在手足口病检测中的应用[J].中国卫生检验杂志, 2013, (3) :679-681.

[9]杨小柯, 冼慧霞, 张倩, 等.2010年深圳市手足口病的病原学检测分析[J].中国卫生检验杂志, 2012, (8) :1866-1868.

[10]毛国梁.一步法荧光定量PCR快速检测肠道病毒EV71[J].医学信息 (旬刊) , 2011, 24 (5) :1896-1897.

新型肠道病毒71型 篇2

1 材料与方法

1.1 标本、病毒株及基因序列来源 本实验中HFMD病例的粪便标本采集、标本前期处理、RT-PCR快速鉴定以及患者的流行病学调查均由白城市疾病预防控制中心(CDC) 完成,RT-PCR鉴定阳性的粪便标本悬液送至吉林省CDC进行病毒分离,对白城EV71病毒株的RNA提取、VP1编码区全基因扩增由吉林省CDC完成。吉林省EV71代表株序列由吉林省CDC提供,全球EV71各基因型代表株参考序列由中国CDC脊灰室提供。

1.2 试剂 病毒RNA提取使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒(Catalog 74104),逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增使用QIAGEN RT-PCR试剂盒(Cat No 210212)。核糖核酸酶抑制剂(RNase Inhibitor)为Promega公司生产,上下游引物均配成50 μmol浓度。

1.3 RNA提取、EV71的VP1编码区全基因扩增、序列测定分析与生物信息学分析 见文献[3]。

2 结果

2.1 病毒分离与基因亚型鉴定

6株EV71分离于白城市的洮南、大安两个县流行的HFMD标本。经鉴定,这6株EV71均为C4a基因亚型。

2.2 白城市分离株与中国C4a基因亚型各代表株及吉林省C4a代表株间同源性分析

基于EV71的VP1编码区核苷酸和氨基酸同源性分析显示(表1),6株白城分离株间的核苷酸同源性为98.6%～100.0%,氨基酸同源性为100.0%。6株白城分离株与安徽阜阳2008年流行株(EU703813-Fyang-08/2)核苷酸同源性为98.9%～99.4%,氨基酸同源性为100%;与吉林省2010年3株分离株(JL-HFM-10-6、JL-HFM-10-4、JL-HFM-10-9)的核苷酸同源性为97.1%～100%,氨基酸同源性为98.6%～100%;与吉林2009年的4株分离株(JL-HFM-09-2、JL-HFM-09-4、JL-HFM-09-5、JL-HFM-09-15)的核苷酸同源性为95.6%～99.4%,氨基酸同源性为98.9%～100.0%。

注:右上为核苷酸,左下为氨基酸。1.AY906614-2005ZJ;2.EU024958-BJ4211-07;3.EU703813-Fuyang-08/2;4.JL-HFM-09-4;6.JL-HFM-09-5;7.JL-HFM-09-15;8.JL/BC-HFM-10-1;9.JL/BC-HFM-10-2;10.JL/BC-HFM-10-3;11.JL/BC-HFM-10-4;12.JL/BC-HFM-10-5;13.JL/BC-HFM-10-6;14.JL-HFM-10-6;15.JL-HFM-10-4;16.JL-HFM-10-9

2.3 VP1区基因亲缘关系分析

基于EV71的VP1编码区基因亲缘关系树显示(图1),白城市2010年6株EV71流行株均为C4a基因亚型,并形成两个传播链。其中4株(JL/BC-HFM-10-2、JL/BC-HFM-10-4、JL/BC-HFM-10-5、JL/BC-HFM-10-6),与吉林省2010年流行株代表株JL-HFM-10-5病毒亲缘关系最近,在基因树上处于一个小分支,形成传播链1;2株(JL/BC-HFM-10-1、JL/BC-HFM-10-3)与吉林省2009年流行株代表株(JL-HFM-09-2 、JL-HFM-09-5)及阜阳2008年流行株代表株(EU703813-Fuyang-08/2-C4a)处于另外一个小分支,形成传播链2。

3 讨论

HFMD是婴幼儿常见的肠道传染病,大多表现为发热、口腔溃疡及特征性的出疹,少数由EV71引起的HFMD病例出现神经系统症状,甚至出现严重并发症导致死亡。根据Brown关于EV71分子流行病学的研究成果,将EV71分为3个基因型:A、B、C基因型[4]。其中A基因型只有1个成员,即EV71的原型株BrCr株;B基因型可进一步分为5个基因亚型(B1～B5),而C基因型也可分为5个基因亚型(C1～C5)。

本研究中白城市的6株EV71经核苷酸同源性和系统进化树分析,证实均为C4a基因亚型,与中国近年报道的EV71流行株基因亚型一致[3,5,6,7,8]。在基因亲缘关系树图中可以看出,白城市2010年6株EV71流行株形成2个传播链,传播链1中白城的4株病毒与吉林省2010年流行株代表株JL-HFM-10-5病毒亲缘关系最近,并且在传播链1中,除了JL/BC-HFM-10-6(与另外5株核苷酸同源性高达99.7%)外,其余5株之间核苷酸同源性高达100%,这种高度亲缘的关系提示传播链1是由一个EV71病毒株或相似株在白城部分县区循环传播导致HFMD的流行;传播链2的2株白城流行株与2008年的阜阳流行株和2009年的2株吉林省流行株亲缘关系较近,核苷酸同源性高达99.3%～99.4%,提示EV71病毒有跨省跨地区持续传播的特点。

本研究获得了白城市致HFMD流行的重要病原体EV71基因数据资料,为今后的分子流行病学研究打下了良好的基础。由于本研究中的6株EV71流行株仅来源于白城市的洮南和大安两个县,还有3个县区处于基因型监测空白,因此需要加强分子流行病学监测,补充和完善白城市EV71基因数据库,为追踪EV71在分子水平的传播提供科学数据,为HFMD防控策略的制定提供参考依据。

参考文献

(1)McMinn PC.An overview of the evolution of enterovirus 71 and itsclinical and public health significance(J).FEMS Microbiol Rev,2002,26(1):91-107.

(2)金奇.医学分子病毒学(M).北京:科学出版社,2001:606-613.

(3)侯祥,周剑惠,常新,等.吉林省2009年致手足口病流行的肠道病毒71型分离株基因特征分析(J).中国疫苗和免疫2011,17(3):222-226.

(4)Brown BA,Oberste MS,Yamaoka K,et al.Outbreak of hand-foot-and-mouth disease by enterovirus 71 strains isolatedfrom1970 to 1998(J).J Virol,1999,73(12):9969-9975.

(5)檀晓娟,许文波.肠道病毒71型的分子流行病学现况(J).中国疫苗和免疫,2008,14(4):361-367.

(6)张勇,刘建锋,王东艳,等.2008年人肠道病毒71型的多个传播链在甘肃省流行(J).中国疫苗和免疫,2009,15(1):35-40.

(7)高贾蕾,李洁,李锡太,等.2009年北京市手足口病重症病例流行病学分析(J).疾病监测,2010,25(9):687-690.

新型肠道病毒71型 篇3

关键词：肠道病毒89型,VP1蛋白,原核表达

肠道病毒自1969年首次被发现以来,在全世界引起了规模不等的爆发流行。自此,人们开始不断意识到肠道病毒所带来的严重公共卫生问题。在我国肠道病毒已成为对中国人危害最大的疾病之一。近年来随着新型肠道病毒不断出现,肠道病毒的致病性已引起人们高度重视。科研人员针对各种肠道病毒的致病性、同源性鉴定等研究越来越多[1,2,3,4,5]。

本研究对1例不明病因的急性肝炎同时出现肠道症状患者粪便标本中分离到的1株新型肠道病毒(EV89)进行了研究并进行相关序列分析,希望通过构建VP1结构蛋白,为下一步建立EV89抗体检测方法进行EV89病毒的流行病学调查及致病性研究奠定基础,希望通过序列分析揭示其遗传进化关系。

1 材料与方法

1.1 材料

EV89病毒株分离自解放军三〇二医院住院患者粪便标本,病毒经空斑纯化后分装冻存于-80℃。RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、BL21(DE3)感受态细胞购自全式金公司。PCR相关试剂购自Ta Ka Ra公司。

1.2 重组质粒的构建

根据Genbank中所报道的EV89病毒保守区VP1片段进行引物设计。上下游引物分别引入Bam HⅠ和PstⅠ酶切位点(上游1F:5'-ggatcc CGGTGATCCCATG-GAAGAG;下游:1R:5'-ctgcag TCAAAGGTTCTTGAT-GTCAGCTCG)。以提取的EV89病毒为模板,利用一步法RT-PCR,扩增出全长的VP1基因。电泳检测正确后回收目的片段,送Invitrogen公司测序。Bam HⅠ和PstⅠ酶切测序鉴定正确的VP1基因片段后,胶回收纯化目的片段,与原核表达载体p ET28a连接后转化大肠杆菌DH5α,扩增培养单克隆菌落并提取质粒,酶切和PCR分析鉴定正确的重组质粒,命名为p H-VP1。

1.3 重组蛋白的原核表达及纯化

将重组质粒p H-VP1转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取阳性克隆子用含100 mg/m L氨苄青霉素的LB培养液培养过夜后,1∶100转接于新鲜液体LB中继续培养至OD/A600值达0.6,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG在37℃诱导蛋白表达。分别收取不同时间段的菌液,10 000 r/min离心10 min收集沉淀,10倍浓缩溶于PBS(0.02 mol/L)中。反复冻融3次后超声破碎,用梯度离心法分别收取表达菌的菌液和沉淀。SDS-PAGE分别确定表达蛋白的最佳表达条件、表达特性(可溶性蛋白/包涵体)及表达量。取3 m L表达产物用HIS标记蛋白微量纯化试剂盒纯化表达蛋白,具体操作步骤见试剂盒说明书(北京天恩泽基因科技有限公司)。

1.4 表达蛋白的活性鉴定

将表达重组蛋白及空载体分别用抗HIS标签抗体和阳性患者血清转膜后做Western Blot实验分析表达蛋白的特异性,具体操作为:将转膜后的硝酸纤维膜用30%的灭火牛血清封闭2 h,加1∶20稀释的EV89患者血清,用酶标抗人Ig G抗体作为二抗,TMB显色,初步鉴定重组蛋白的生物学活性。取不同浓度咪唑洗脱的蛋白进行SDS-PAGE电泳,检测蛋白纯度及纯化量。

1.5 遗传进化分析

采用MEGA软件对EV89 VP1区序列进行遗传进化分析。

2 结果

2.1 VP1全基因序列的扩增

如图1所示,扩增出的EV89病毒VP1片段大小约900 bp。回收纯化后测序结果分析表明,与EV89VP1基因同源性最高,没有核苷酸的位点突变,表明VP1基因扩增成功(图1)。

2.2 重组原核表达载体的构建

VP1基因片段与原核表达载体p ET28a连接转化后挑取单克隆菌落扩增培养并抽提质粒,Bam HⅠ和PstⅠ酶切后,电泳结果显示有约3 kb和900 bp两条DNA带,其中3 kb条带为T载体,900 bp条带为插入的VP1基因,均与预计大小相符,表明构建VP1基因重组原核表达质粒成功,见图1。

1:PCR阴性对照;2:PCR阳性对照;M:DNA mark;3:T-EV89 VP1酶切结果

2.3 重组蛋白的诱导表达

为确定蛋白最佳表达条件,将空载体质粒、重组质粒转入大肠杆菌(BL21 DE3)中37℃诱导表达。结果如图2所示,重组质粒诱导表达1、3、5、7 h后菌液离心沉淀进行SDS-PAGE电泳,在约33 k D处均可见一条明显的蛋白表达带,而p ET28a空载体对照(诱导前后)及重组质粒诱导表达前均未见相应的蛋白带。该蛋白分子量与预期一致,且诱导5、7 h蛋白表达量最高。

1:pet28a+空载体未诱导;2:pet28a+空载体诱导7 h;3:pet28a+-EV89 VP1未诱导;4:pet28a+-EV89 VP1诱导1 h;5:pet28a+-EV89VP1诱导3 h;6:pet28a+-EV89 VP1诱导5 h;7:pet28a+-EV89 VP1诱导7 h

2.4 EV89 VP1抗原活性的初步鉴定

分别用抗HIS抗体和EV89患者阳性血清对重组蛋白的成功表达及其特异性进行鉴定(图3、4),结果与蛋白电泳位置一致,空载体未出现相应的蛋白带,显示重组蛋白表达成功且该蛋白带为EV89-VP1特异性蛋白。

2.5 EV89 VP1蛋白的纯化及活性鉴定

为进一步了解表达蛋白的生物活性及表达产物的特性,本研究将EV89 VP1蛋白反复冻融3次后超声破碎,将超声后的液体分别用500、10 000 r/min离心后收集上清和沉淀做SDS-PAGE电泳,结果如图5所示,表达蛋白均以包涵体的形式存在。用IMAC纯化柱对表达蛋白进行了纯化,用9种不同浓度的咪唑溶液40、60、80、100、150、200、300、400、500 mmol/L各1 m L依次洗脱结合在柱子上的重组蛋白VP1,并做SDS-PAGE电泳以确定最佳的洗脱液浓度,结果如图6所示,400、500 mmol/L纯化效果最好。

1:pet28a+空载体未诱导;2:pet28a+空载体诱导7 h;3:pet28a+-EV89 VP1诱导1 h;4:pet28a+-EV89 VP1诱导3 h;5:pet28a+-EV89 VP1诱导4 h;6:pet28a+-EV89 VP1诱导5 h;7:pet28a+-EV89VP1诱导7 h

1:pet28a+空载体未诱导;2:pet28a+空载体诱导7 h;3:pet28a+-EV89 VP1未诱导;4:pet28a+-EV89 VP1诱导1 h;5:pet28a+-EV89VP1诱导3 h;6:pet28a+-EV89 VP1诱导5 h;7:pet28a+-EV89 VP1诱导7 h

M:Mark;1:pet28a+-EV89 VP1诱导上清;2:EV89 VP1诱导蛋白10 000 r/min离心后沉淀;3:EV89 VP1诱导蛋白500 r/min离心后沉淀

M:Mark;1~9:40、60、80、100、150、200、300、400、500 mmol/L咪唑洗脱蛋白

2.6 EV89 VP1区遗传进化分析

将EV89 VP1区序列和Genbank中相关序列比对,发现和Genbank中仅有的3株EV89型(GB AY697459.1,GB AY 697472.1,GB JN204093.1)VP1区序列同源性最高,分别为86.4%、85.9%、85.6%。从进化树来看,本研究分离的EV89 VP1区于Genbank中的3株EV89型VP1区亲源关系均较远。见图7、8。

3 讨论

近年来,肠道病毒的流行在亚太地区不断上升,我国自1981年首次报道了肠道病毒的病例以来,肠道病毒已上升为我国病毒性脑炎的第1位病原[6,7,8,9]。肠道病毒的研究也越来越为人们所重视。