肠道病毒核酸检测

肠道病毒核酸检测（精选7篇）

肠道病毒核酸检测 篇1

手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)是一种由肠道病毒感染引起的常见传染病,婴幼儿是该病高危人群,患儿以全身发热,手足口出现疱疹、溃疡为典型特征,多数呈自限性,但部分患儿可进展为危重症,并发心肌炎等严重并发,甚至死亡[1]。近年来,我国HFMD有爆发趋势,截止2010年已累计爆发177万人次,部分地区呈周期性流行,严重威胁居民生命健康,其防控形势不容乐观[1]。2014年5月12日至2014年6月16日,盘锦市疾控中心便开展过手足口病肠道病毒核酸检测102例次,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

样本来源:2014年5月12日至2014年6月16日。共检测手足口病疑似病例咽拭子样品102份。

试剂和仪器:①核酸提取试剂德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit,批号:145048635;②病毒采样盒(采集咽拭子):海南兴南峰医药器械有限公司,批号:20140428,有效期:20150427;③肠道病毒通用型核酸测定试剂盒,批号:H20140501,有效期:20150519;③肠道病毒71型核酸测定试剂盒批号:H20140301-1,有效期:20150305;④柯萨奇病毒16型核酸测定试剂盒,批号:H20140301-1,有效期:20150310。仪器设备:美国BIO-RAD IQ5实时荧光定量PCR扩增仪。

1.2 方法

(1)标本采集:发病7日内咽拭子标本,专用棉签,适度用力试抹咽喉壁与扁桃体两侧,避免触及舌与口腔,采样后迅速置入盛有病毒保存液的采样管中,折断棉签,旋紧瓶盖密封,送检,部分以4℃留存送检。

(2)核酸提取:①德国QIAGEN公司生产的RNeasy Mini Kit提取试剂盒在生物安全柜内对咽拭子样品进行核酸提取,取配套无菌Eppendorf管,加入RLT,置入标本悬液,混匀,加入二硫基乙醇,混合加入75%乙醇混匀,取收集管,标记加入以上留取混合液,离心去离心液,按照说明书上操作步骤提取数份病毒提取液;②提取核酸后使用上海之江试剂公司生产的肠道病毒通用型核酸测定试剂盒、柯萨奇病毒16型(CA16)核酸测定试剂盒、肠道病毒71型(EV71)核酸测定试剂盒对样品进行实时荧光定量PCR检测,使用的PCR扩增仪为美国BIO-RAD公司的实时荧光定量PCR扩增仪,Ct值>32为阴性,否则则为阳性。

2 结果

101份样品中肠道病毒通用阳性45份(感染率44.55%、比重26.01%),其中EV71阳性3份(感染率2.97%、比重6.67%),CoxA16型阳性34份(感染率33.66%、比重75.56%),其它型肠道病毒8份。

3 讨论

手足口病(Hand—foot一mouth Disease,HFMD)是一种常见流行性传染病,常见感染病毒包括Cox病毒、埃可病毒以及新型EV病毒,近年来常见CoxA16以及EV71,本次检测结果也证实了这一点。手足口病常呈间断性爆发,90年代后在亚太地区不止一次爆发,我国于2008年呈现流行性爆发,感染数十万例,此后,HFMD呈区域性爆发,成为公共卫生问题。

本疾控中心实验室采用目前通用的核酸PCR检测,样本采用咽拭子,检测符合率较高,可基本满足需要。目前常用的HFMD病毒检测方法包括RT-FCR、FQ-PCR等,FQ-PCR略优于RT-FCR法,且技术实现难度更小、操作更简便[2]。

HFMD病毒类型常见CoxA16、EV71,不同时间、不同地域间,统计比重存在较大差异。如王翔军等统计,临沂某院2010—2011年咽拭子核酸测试34例均为EV71型,2011—2013年检测113例,EV71占69.91%,杜银菊统计聊城2010—2012年EV71占HFMD核酸阳性比重为29.31%,提示HFMD致病病毒流行存在诸多影响因素,季节、地域均可成为致病病毒感染比重。

综上所述:本市HFMD防治状况仍不容乐观,月间报告例数仍较多,呈小规模流行趋势,手足口病监测网络发挥作用,实验室相关核酸检测阳性率较高,多见CA16型病毒感染,HFMD防治工作任重道远。

参考文献

[1]刘民,刘闯.手足口病的流行病学特征及预防[J].中国皮肤病性病学杂志,2010,24(7):591-593.

[2]石秀芳.手足口病RT-PCR和FQ-PCR检测方法比较急毫州市流行特征研究[J].安徽医科大学,2013:33-45.

肠道病毒核酸检测 篇2

为有效防范和积极应对可能出现的新冠肺炎疫情，科学、快速、有序处置出现新冠肺炎疫情暴发流行的情形,进一步提升新冠肺炎疫情核酸检测能力和效率，根据《XX县全员新冠病毒核酸检测实施细则》等文件要求，结合我镇实际，制定本方案。

一、工作目标

全面提升新冠肺炎核酸检测能力和效率，落实“四早”原则，按照“及时发现、快速处置、精准管控、有效救治”要求，为可能出现的疫情做好应对准备，确保能够完成全镇范围内的大规模人群核酸检测任务，保障人民群众身体健康和生命安全。

二、组织领导

（一）党委政府靠前指挥、负总责。

镇、村两级对全员核酸检测工作负总则，统筹各相关部门和单位，多方联动。一旦发生本土疫情，主要领导和挂村领导迅速下沉到村，村两委干部下沉到各采样点，靠前指挥，实行扁平化管理，建立镇、村、采样点三级联动指挥体系，全面统筹核酸检测督导指导。

（二）成立工作组，镇村同步联动。

成立XX镇全员核酸采样检测工作领导小组，由镇党委书记任组长、镇长任常务副组长，各挂村领导、派出所所长任副组长，党政办、卫健办、交管站、派出所、民政办、财政所、宣传办、食安办、科教办等相关部门的负责人任成员，多方联动，实行扁平化管理，建立“一键触发”工作机制。一旦出现本土疫情或者疫情有扩大、蔓延趋势时，第一时间启动工作组，召开工作组会议，统筹协调、周密部署核酸检测工作。

三、工作内容

（一）建立网格化的核酸检测工作小组和网格管理专班

按照属地管理原则，以镇为单位，结合辖区人口及地理情况，科学划分网格化的核酸检测片区，建立相应核酸检测工作小组，负责每个网格内的全员核酸检测，包括网格内人员动员、组织、公告、样本采集送检等工作，建立核酸采样操作流程制度、确定具体采样流程，包括信息核对、采样、送检、报告发放等。

以村为单位，下设若干个采样点，每个采样点按照“1+8”标准配备工作人员，即1名挂村领导，并配备8人专门小组（包括1名联络人、1名采样员、1名录入员、1名消杀员、1名网络员、1名引导员、1名民警（协警）、1名村（居）工作者。

责任领导：各村挂村领导

责任单位：卫生院、XX中学、XX中心小学、各村。

（二）制定工作方案。

各村要结合XX镇全员新冠病毒核酸检测工作方案制定本村实施方案，并以采样点为单位制定操作细则，并上报镇指挥部审核备案。

责任领导：各村挂村领导

责任单位：各村。

（三）合理设置核酸检测采样点。

各村建立人口精准台账，掌握实际管理人口底数和分布，准确掌握特殊人群情况，建立常住人口精准台账（精准到村民小组、楼、户）。结合人口台账分布，以行政村为单位设置采样点，按照每1000-2000人设置一个采样点，1000人以下的采样点设置一个采样台、1000-2000人的采样点设置2个采样台。每个采样点根据场地情况设置七个区域：清洁区和生活物资供应区、脱卸防护用品区、等候区、登记点、采集区、临时隔离区、医废暂存处，有效分散待检人员密度。全镇共设置XX个采样点、XX个采样台，各村应确定采样台具体点位及相应配套设施。提前储备好设置采样点所需帐篷、风扇、电脑、桌椅、身份证读卡器、网络、电源等物资，确保收到指令后能够快速布置采样点。

责任领导：各村挂村领导

责任单位：各村。

（四）采样流程。

因地制宜，根据点位实际情况布置采样点，按照组织群众--现场测温--排队等候--信息录入--核酸采样等流程进行核酸采样工作。点上采样队伍要为行动不便居民提供上门服务，力争做到一个不漏，上门服务安排在采样点集中采样结束后。

（五）采样点物资准备。

按照1个采样台设置3顶帐篷、5张凳子、2张桌子；1个采样区域设置1个医疗废物暂存场所，配备1个大个医疗废物桶（加盖，与采样人数相匹配）、大个黄色垃圾袋；保障各采样点的水、电（含插座）、网络；提供矿泉水、面包、点心、防暑降温、防寒抗冻等物资。

责任领导：各村挂村领导

责任单位：各村。

（六）核酸样本转运

1.转运车辆与人员准备。每车配备2名经过培训的人员负责转运工作的要求，司机、标本转运员实行一级防护，同时车上存放二级防护服2套、隔离服2套、N95口罩2个，一次性手套8双，鞋套2双，一次性医用帽子2个，以备应急时使用。承担转运样本任务的车辆实行专车专用，不得用于其他用途，转运时做好生物安全防护。派出所、交管站等部门根据实际需要做好运输安全保障工作。

责任领导：XX

责任单位：镇交管站、派出所、卫生院。

2.明确转运流程。镇交管站根据采样点分布以及转运时限等要求，合理配备转运车数量、规划转运路线，按3-5个采样点配备1台转运车辆。

责任领导：XX

责任单位：交管站、各村。

3.转运车辆消杀。转运车辆消杀工作由采样点上消杀人员负责，要求进出采样点均落实全面消杀工作（含氯消毒剂浓度为1000mg/L）。

责任领导：XX

责任单位：村建站、镇保洁公司、各村。

（七）医废处置

由经过院感培训合格的各村保洁员负责，要求在指定采样点负责医疗废物清运，将医疗废弃物收集转运至医废临时暂存点，做好每4小时1次的采样点定时消毒和可疑污染物随时消毒。

责任领导：XX

责任单位：村建站、镇保洁公司、各村。

四、保障措施

（一）加强组织领导。

各村、镇直（办）单位要深刻认识到疫情防控工作的重要性和紧迫性，树立底线思维，增强忧患意识，从最坏处着眼，向最好处努力，全力做好应对可能出现的疫情全人群核酸检测筛查各项准备工作。

责任领导：各村挂村领导

责任单位：镇直办相关单位、各村。

（二）工作人员闭环管理。

采样现场工作人员（含采样人员、信息登记员、志愿者、转运员、转运司机等直接面对群众的工作人员）要落实闭环管理和核酸采样工作要求。各村按属地原则和就近原则，指定1-2家酒店或学校作为工作人员隔离场所，要求实行单人单间，期间不回家、不串门、不聚集，每天早、晚各进行1次体温测量。落实每日1次核酸检测要求，完成最后一轮核酸检测后，继续落实14天集中隔离医学观察，并按相关频次落实核酸检测工作。党政办负责隔离酒店的筹备工作，科教办做好学校被征用为隔离准备及对接工作，各村负责工作人员点对点转运工作，卫生院负责工作人员健康管理及核酸检测工作（工作人员闭环管理详见附件8）。

责任领导：各村挂村领导

责任单位：各村。

（三）工作人员保障。

镇党政办负责封控区、管控区内工作人员的生活保障工作，指定1家酒店，工作三餐由酒店提供，并落实工作人员“点对点”转运等闭环管理工作。工作人员核酸采样由应急组负责，落实每日1次核酸检测。

责任领导：XX

责任单位：党政办、财政所

（四）应急响应准备。

各村、镇直（办）单位要根据本方案工作要求，按照各自职责，分级分类做好应急响应准备，开展应急演练，有力保障大规模全人群核酸检测筛查工作。各村、镇直（办）单位要加强新冠肺炎知识的科普宣传工作，做好辖区内群众的宣传动员和引导工作，根据指令组织群众分片区网格化进行核酸采样工作。

五、建立“一键触发”工作机制

（一）“一键触发”机制架构及层级职责

镇指挥部按照扁平化、快速反应的要求，建立以党委书记为乡镇总队长、镇指挥部各工作组（视情况触发）为第一层级，采样点负责人、样本转运组、宣传发动组、后勤保障组为第二层级，各村联络人为第三层级的“一键触发”工作机制。各层级应于11月15日前建立“一键触发”应急响应相应微信工作群，并明确各级各组的职责任务分工。其职责任务分工如下：

第一层级：

1.乡镇总队长：乡镇党委书记担任总队长，对“一键触发”机制启动后村级疫情防控各项工作总负责。

第二层级：

1.采样点负责人：负责人由各村挂村领导担任（可酌情指定不是科级干部的优秀干部担任），负责落实人员到位情况、协调物资调配、样本转运、医废暂存点管理、现场消杀等工作，对“一键触发”机制启动后村级疫情防控各项工作具体负责。

2.宣传发动组：组长由镇宣传委员担任，启动应急响应后必须在2小时内完成采样前公告，运用护林车、环卫车、村村响等方式在全镇进行巡回广播，同时依靠网格管理员、片区民警、村干部、志愿者等力量，建立白天、夜间两个工作组，通过发放宣传单、张贴告知书、发送短信、微信群通知、上门通知等方式，告知属地广大居民（包括租住人口），分时段、有序主动前往指定采样点进行核酸采样，确保全员核酸检测“应检尽检，不漏一人”。

3.样本转运组：组长由镇分管交通领导担任，成员由王志矩、钟祥荣、张家康组成。转运人员接触发指令后1小时内到达卫生院，转运人员防护物资直接在卫生院领取，并做好转运车辆消杀等工作。

4.后勤保障组：组长由镇分管后勤领导担任，负责全镇干部及支援人员的食宿安排，确保单人单间住宿。

第三层级：

1.村采样组组长：组长由卫生院指定，成员由1-2名采样员、1名信息登记员组成。（1）接到指令后迅速召集采样组成员（采样员、信息录入员）携带个人防护用品，并到卫生院领取采样物资（按采样台个数计算，每个采样台至少含转运箱2个、冰排若干、压舌板、采样管、咽拭子<数量根据采样目标人数确定>、防护服3套、N95口罩3个、隔离衣3件、帽子3个、手套3双、鞋套3双、面屏<或护目镜>3个、医用口罩若干、免洗手消毒液3瓶、喷洒器1个、75%酒精和消毒剂各1瓶，以及医疗垃圾桶1个、医疗垃圾袋<大、中、小>若干），确保在2小时内到达采样点实施采样。（2）按相关要求将医疗废物打包装好放至采样点医疗垃圾存放处，由镇环卫车运送至镇卫生院。

2.村后勤保障组组长：组长由村党支部书记担任，成员可由1名联络人、1名网络员和村党员干部、志愿者等（由各村支部书记指定）组成。（1）接到指令后立即安排人员车辆前往村储存点领取帐篷、桌子、椅子、一米线标识等常用物资（各村要将常用物资提前存入本村固定储存点）并迅速到采样点安装、分区。（2）同时安排人员车辆前往XX卫生院领取采样装备（含电脑、打印机、扫码器、打印纸等）1套，确保在1.5小时内转运物资并将采样装备安装完毕供采样组使用。（3）各采样点录入终端电脑优先选择有线网络接入或有线转WiFi接入，保障信息网络畅通。确保1.5小时内依职责准备就绪。

3.村人员组织组组长：组长由村党支部书记担任，指定若干名村两委干部配合，成员可由1名引导员、村工作者（乡村医生），若干“三联”包户党员或其他志愿者（由各村提前指定人员）组成。（1）负责组织力量，承担核酸采样的组织实施和协调工作。按照常住人口将人员台账（包括姓名、手机号码）和采集码提前按户打印，打印的采集码由“三联”包户党员保管。（2）组织所包村民分时段采集核酸，由“三联”包户党员现场将打印的采集码分发至每位村居民手中。

4.村安全维稳组组长：组长由1名支委（村委）担任，成员可由1名民警、1名村居工作者组成，负责做好治安维稳工作，同时疏导周边交通；针对可能出现的舆情，做好应急准备，提醒现场工作人员留意现场居民情绪，如遇紧急事件务必做好安抚工作。

（二）触发流程

肠道病毒核酸检测 篇3

关键词：儿童手足口病,诊断应用价值,肠道病毒核酸检测

手足口病是儿科常见病和多发病,近年来发病率明显上升,感染肠道病毒是导致其发病的主要原因,肠道病毒多达20种以上,其中较为常见的是CA16、EV71两种。5岁以下儿童是手足口病的高发人群,口腔黏膜出现散在疱疹,手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹是患儿的主要临床表现,多数患儿1周之内可自行痊愈,但病情严重者会发生心肌炎、肺水肿等并发症,甚至死亡。因此,及时准确的诊断对临床治疗和预后具有重要意义[1]。本文选取抚顺市中心医院儿科门诊收治的297例疑似手足口病患儿作为研究对象,现作如下报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料:

选取2015年1～10月抚顺市中心医院儿科门诊收治的疑似手足口病患儿297例作为研究对象,其中男160例,女137例,平均年龄(5.2±1.3)岁。本次研究纳入的患儿临床诊断结果符合《手足口病诊疗指南》中手足口病的临床诊断标准[2]。

1.2 方法:

所有患儿入院24h内给予血细胞分析以及生化系列、C反应蛋白(CCRP)检查,48h之内进行心电图、胸部X线检查。病原学具体检测方法:无菌采集297份咽拭子样本,将其置于MEM采样液中,密封,2h之内低温(4℃)运送至实验室。采用AB 7500 Fast荧光定量扩增仪以及由广州中山达安基因试剂公司提供的核酸检测试剂对肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒CA16、肠道病毒EV71进行检测,一切操作按照试剂盒上的要求进行。

1.3 统计学方法:

借助SPSS21.0版本的统计学软件对研究数据进行处理分析,所有计数资料使用百分比(%)进行描述,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与其他肠道病毒检查率相比,肠道病毒通用型阳性检出率最高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

3 讨论

肠道病毒是导致小儿手足口病的主要原因,若不及时采取治疗措施,就会危及患儿生命安全[3]。EV71是诸多肠道病毒中较为常见的一种,其发生感染后具有2～7d的潜伏期,隐性感染率较高,此外EV71感染性极强,可在短时间内呈现大范围流行性感染,病情难以得到有效控制,增加了临床诊断和治疗的难度。所以,针对早期感染EV71的患儿要及时进行筛查和诊断,这对提高临床治疗效果和改善患儿预后具有至关重要的作用。分离、培养细菌的传统的诊断手足口病方法,不仅操作繁琐,且假阴性率较高,严重影响临床诊断和治疗。本研究结果显示,297例疑似样本中,肠道病毒通用型阳性236例(84.6%)、肠道病毒CA16阳性7例(2.4%)、肠道病毒71阳性1例(0.3%),肠道病毒阴性53例(17.8%),其中肠道病毒通用型检出率最高。上述数据提示临床必须对手足口病患儿早期诊断给予高度重视,以提高病原学依据。值得注意的是,进行肠道病毒核酸检测标本采集过程中,尽量收集粪标本,条件允许的情况下可同时联合咽拭子标本检测,以提高检测结果的准确性和可靠性。除此之外,在手足口病流行季节,对公共场所、幼儿园等要加强通风管理,加大流行性疾病的宣传力度,及时有效隔离手足口病患儿,避免或者杜绝此种疾病的大肆传播[4]。

综上所述,儿童手足口病应用肠道病毒核酸检测,具有显著的诊断价值,可为手足口病病原学提供准确可靠的确诊依据,值得临床积极推广应用。

参考文献

[1]戴光跃.肠道病毒核酸检测在儿童手足口病诊断应用价值[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊),2015,15(27):172-173.

[2]吴亦栋,周俊,陈东,等.肠道病毒核酸与抗体联合检测在手足口病病原早期诊断中的应用[J].中华检验医学杂志,2015,20(6):397-401.

[3]李国辉.儿童手足口病检验及治疗进展[J].海南医学,2012,23(23):129-131.

肠道病毒核酸检测 篇4

新冠病毒核酸检测流程及注意事项

检测流程:

注意事项:

核酸检测应知应会

【什么是核酸检测？】

【什么是抗体检测？】

【谁可以申请核酸检测，个人可以申请吗，费用是多少？】

【哪里可以进行核酸检测？】

【检测如何进行，检测过程中我有感染风险吗？】

【检测呈阳性意味着确诊吗？】

【检测前我需要准备什么】

新冠病毒核酸检测流程及注意事项

为满足社会各方和群众对新冠病毒核酸检测的需求，进一步落实“外防输入、内防反弹”的总要求，推进核酸检测“应检尽检、愿检尽检”的原则，XX县人民医院面向社会提供新冠病毒核酸检测服务，现将检测流程及注意事项告知如下:

检测流程:

1.请使用电子健康卡就诊;

2.感染楼一楼发热门诊开具检测单;

3.感染楼一楼东大厅检验窗口打印采集条码;

4.感染楼一楼西大厅采集咽拭子;

5.核酸检测一般于当天或第二天出结果。

注:因近日核酸检测人数较多，我院检验科力争在24小时内出具检测结果，如未在上述时间内查询到结果，还请您耐心等待，或拨打电话咨询。检验科咨询电话:XXXXXXXXXXX,XXXXXXXXXXX

注意事项:

1.在做核酸检测前2小时尽量避免进食，以免引起呕吐;

2.在采集口咽拭子时检测者头后仰，张口发出「啊」音，有助于暴露咽喉，但过程中会出现刺激性干咳、恶心、呕吐等症状，检测者可配合采集人员尽量放松、深呼吸;

3.请做好个人防护，注意手卫生，全程戴口罩，只有在核酸检测采样时才能取下口罩，采样完毕请立即戴好口罩;

4.为了您的安全，请自觉排队，尽量减少交谈，保持1米以上的距离;

5.前来检测人员需如实向医生提供自己的既往病史、流行病学史等，这将是后续诊疗的重要依据。

咨询电话:XXXXXXXXXXXX

检测地址:XX县人民医院感染楼一楼

核酸检测应知应会

【什么是核酸检测？】

即采集人体分泌物后，在实验室条件下，通过分析病毒的RNA基因序列，利用PCR扩增的方法进行检测，进行临床病原学的诊断。目前，核酸检测是及早确定病人是否感染病毒，早发现、早治疗最有效的检测方法。

【什么是抗体检测？】

血清抗体检测就是抽血检测人体对病毒的免疫反应，如果近期有感染新冠病毒，人体会及时产生抗体与病毒抗衡。抗体检测操作简单方便，适用于大量疑似病例、既往感染者和无症状感染者检测初步筛查。

【谁可以申请核酸检测，个人可以申请吗，费用是多少？】

可以。除国家规定的新冠肺炎确诊病例、出院病例、疑似病例、密切接触者等人群必须进行核酸检测外，建议有国内外疫区旅居史的居民或曾直接、间接与确诊、疑似病例短暂接触过的市民进行检测。有工作、就医需要的人员也可以自愿自费进行核酸检测。一般费用在150-200元左右。因疫情形势和地区不同，有的地区免费检测！

【哪里可以进行核酸检测？】

目前国内大部分省级、地级城市的三级医疗机构均可提供新冠病毒核酸检测及新冠病毒核酸抗体检测，具体可咨询当地医疗机构。

【检测如何进行，检测过程中我有感染风险吗？】

采样过程，医生会用一根像棉签一样的拭子去擦拭咽部及扁桃体、或是鼻腔周围的分泌物，只要“轻轻一抹”，快捷、无痛苦。医疗机构会针对检测区域消毒，医护人员会也进行手部消毒，避免交叉感染。一般来说，采样过程安全清洁，无需担心感染风险。

【检测呈阳性意味着确诊吗？】

目前核酸检测试剂的灵敏度和特异性还有限，可能出现假阳性或假阴性，一次检测阳性并不就是确诊。根据国家卫健委发布的诊疗方案，需要结合肺部CT诊断和临床症状才能确诊新冠肺炎。

【检测前我需要准备什么】

肠道病毒核酸检测 篇5

关键词：肠道病毒EV71,ELISA,实时荧光定量RT-PCR,RT-PCR

手足口病 (HFMD) 是由多种肠道病毒引起的一种急性传染病, 以婴幼儿发病为主, 重症手足口病多发生于年龄<3岁的儿童。主要通过密切接触或消化道传播, 以手、足、口腔等部位皮肤黏膜的皮疹、疱疹和溃疡为表现, 个别患者可引起心肌炎、肺水肿和无菌性脑膜脑炎等并发症[1]。该病以手、足和口腔黏膜疱疹或破溃后形成溃疡为主要临床症状[2], 是一种自限性疾病, 绝大多数病例1 w内痊愈, 但少数患儿病情复杂多变, 进展迅速, 可引起中枢神经系统并发症及神经源性肺水肿和肺出血, 具有较高的病死率和致残率[3]。引发手足口病的肠道病毒有20多种, 其中柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型最常见[4]。针对目前手足口病诊断技术的现状, 本实验室采用手足口病病毒核酸RT-PCR检测体系、手足口病病毒核酸实时荧光RT-PCR[5]检测体系及手足口病病毒抗原捕获ELISA检测体系, 均用于肠道病毒71型手足口病病毒检测, 旨在对其灵敏度、特异性、重复性、符合率等方面的差异进行比较。

1 材料与方法

1.1 样品来源

采集2012年1~10月四平市传染病院临床诊断159份手足口病患者血清标本。

1.2 试剂及仪器

QIAamp Viral RNA Mini Kit (52904) 购自Qiagen公司;肠道病毒71型病毒RNA检测试剂盒 (荧光PCR法) 购于北京金豪制药股份有限公司;QIAGEN One Step RT-PCR kit (210212) 自Qiagen公司;Rnasin (40 U/ul) 及核酸分子量质量标准DL2000DNA marker购于宝生物工程 (大连) 有限公司;PCR引物及探针购于上海生工生物技术有限责任公司;核酸染料购于厦门百维信生物科技有限公司;电泳液购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;肠道病毒71型Ig M抗体 (EV71-Ig M) 检测试剂盒 (酶联免疫法) 购于北京万泰生物药业股份有限公司。PTC-100PCR仪 (伯乐) ;FTC-3000荧光定量PCR仪 (上海枫岭) ;AUED-SYSTEM自动凝胶成像仪 (美国UVP) ;酶标仪及洗板机均为安图2010。

1.3 检测方法

1.3.1 ELISA法

检测急性血清EV71Ig M抗体, 按照标准过程进行血清处理并严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.2 样本准备

利用本实验已知的EV71病毒核酸阳性菌株作为阳性参考品, 同时设立DEPC处理水作为阴性参考品。将血清标本12 000 rpm离心5 min, 取上层血清提取核酸。

1.3.3 病毒RNA的提取

采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit, 按照试剂盒说明书操作。取上清液140μl。提取RNA, 最终收集RNA提取液40μl, 置-70℃保存或直接检测。阳性质控品待完全解冻后8 000 r/min离心10 s待用。

1.3.4 RT-PR反应

EV71病毒核酸检测引物来自中国疾病预防控制中心。EV71-S (上游) :5’-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC-3’;EV71-A (下游) :5’-ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC-3’。扩增片段长度为226 bp。反应体系:5×PCRBuffer 5.0μl, d NTPs (2.5 m Meach) 1.0μl, 上游引物 (0.1μg/μl) 下游引物 (0.1μg/μl) 各0.5μl, RNasin, 40 U/μl 0.1μl, RNase Free d H2O 12.0μl, 模板RNA 5.0μl。反应条件:60℃1 min, 42℃10min, 45℃30 min, 95℃15 min;94℃1 min, 45℃30s, 72℃1 min, 共34个循环;72℃10 min, 转入4℃。扩增结束后进行电泳及用AUED-SYSTEM自动凝胶成像仪进行结果判读。

1.3.5 实时荧光定量PCR

在PTC-3000 PCR扩增仪上进行PCR扩增, 按说明书进行反应混合液的配制和循环参数的设置, 同时设置阳性梯度模板和阴性对照。结果判定严格按照PTC-3000仪器操作说明书和PCR检测试剂盒说明书进行。

2 结果

ELISA法与荧光定量PCR法比较 (见表1) , χ2=22.20, P<0.01, 差异有统计学意义。对159份血清标本进行检测后, ELISA法检出EV71 Ig M抗体阳性18份, 阳性率为11.32%, 荧光定量PCR法检出EV71 Ig M抗体阳性53份, 阳性率为33.33%。荧光定量PCR法优于ELISA法。

ELISA法与RT-PCR法比较 (见表1) , χ2=20.15, P<0.01, 差异有统计学意义, 对159份血清标本进行检测后, ELISA法检出EV71Ig M抗体阳性18份, 阳性率为11.32%, RT-PCR法检出EV71Ig M抗体阳性53份, 阳性率为32.08%。RT-PCR法优于ELISA法。

RT-PCR法与实时荧光定量PCR法比较 (见表1) , χ2=0.064, P>0.05, 差异无统计学意义。

总体来看, ELISA法检出EV71Ig M抗体阳性18份, RT-PCR和实时荧光定量PCR检测方法中也呈阳性, 结果一致。RT-PCR法检出EV71Ig M抗体阳性51份, 实时荧光定量PCR检测方法中也呈阳性, 结果一致。

3 讨论

本研究通过对采集到的手足口病患者的159份血清标本, 进行了ELISA方法、RT-PCR及实时荧光定量PCR检测血清标本, 3种检测方法的比较研究:实时荧光定量PCR法检测出核酸阳性53份比RT-PCR法检测的阳性数多出2份, 符合率高, 表明实时荧光定量PCR比RT-PCR相比[6], 特异性与准确性更好, 具有独特的优势。由于从病毒感染到抗体出现需要一定时间, 因此, ELISA法用于肠道病毒EV71早期诊断灵敏度不高, ELISA检测159份血清中EV71Ig M抗体阳性数为18份, 通过比较显示ELISA法成本低, 方便快捷;局限性是灵敏度低。实时荧光定量PCR和RT-PCR技术克服了缺点且无需双份血清就能检测是否存在感染, 把基因扩增, 分子杂交和荧光标记技术融为一体[7], 反应和产物分析全过程都在完全封闭条件下进行, 实现了实时监测和自动分析, 从根本上解决了传统PCR检测过程中产物易受污染和不能定量的问题[8,9], 无需电泳和凝胶成像仪等步骤, 从标本开始处理到完成检测仅需3~4 h即可完成检测, 节省了检测的时间。

综上所述, 实时荧光定量PCR检测方法简便快速、更敏感、特异性更强, 更能减少实验室的交叉污染, 采样后数小时内检测到病毒的RNA, 达到快速诊断的目的, 因此该方法对肠道病毒的流行病学调查及治疗起重要作用[10]。荧光探针PCR方法能及时地为临床提供快速筛查, 鉴别判断感染病原的依据, 提高了肠道病毒诊断的可行性, 是一种理想的肠道病毒检测方法, 值得推广。

参考文献

[1]卫海燕, 黄学勇, 许玉玲, 等.EV71病毒核酸快速检测方法的比较[J].病毒学报, 2012, 28 (6) :670-674.

[2]王睿.402例手足口病病原学监测结果分析[J].安徽预防医学杂志, 2013, 19 (3) :151-152.

[3]曹银光, 胡艳军, 孙爱霞, 等.EV71感染重症临床诊断和预警指示的研究[J].中国实验诊断学, 2013, 17 (6) :1170-1171.

[4]徐昌敏, 王水明.24例重症手足口病的临床特征与治疗分析[J].湖北科技学院学报 (医学版) , 2013, 27 (3) :242-243.

[5]陶力新.实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用[J].职业与健康, 2010, 26 (9) :994-996.

[6]王雅静, 肖红, 王冰姝, 等.手足口病肠道病毒核酸检测方法的比较研究[J].中国热带医学, 2009, 9 (2) :199-201.

[7]陈应坚, 李水明, 徐亚军.应用荧光定量技术检测肠道病毒71型.现代预防医学, 2010, 37 (2) :339-355.

[8]王敏, 周小蓟, 陈露.实时荧光PCR技术在手足口病检测中的应用[J].中国卫生检验杂志, 2013, (3) :679-681.

[9]杨小柯, 冼慧霞, 张倩, 等.2010年深圳市手足口病的病原学检测分析[J].中国卫生检验杂志, 2012, (8) :1866-1868.

肠道病毒核酸检测 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

2010年1月1日-2010年8月1日本市各大医院传染科住院的433名手足口病患者的咽拭子标本。仪器:高速微型离心机 (杭州汇尔仪器设备有限公司) 、小型漩涡振荡器 (北京华尔博科技有限公司) 、全自动荧光定量PCR检测仪 (广州市炳阳生物科技有限公司-美国) , ClassⅡTypeA2生物安全柜 (北京东联哈尔仪器制造有限公司) 。试剂:北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 ( 硅胶膜吸附法) 。

1.2 方法

标本保存:取患者的咽拭子标本和大便标本立即放-20℃保存。RNA提取:采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 (硅胶膜吸附法) 。反应体系:RT-PCR反应液 19 μl、聚合酶1 μl、 逆转录酶0.35 μl、 标本RNA 5 μl。设置循环条件:逆转录及变性50℃ 30 min;95℃ 3 min;预扩增95℃ 15 s, 50℃ 30 s;72℃ 1 min。扩增及荧光收集95℃ 10 s, 55℃ 40 s。

1.3 结果判断

阴性质控品:扩增曲线无对数增长期或无Ct值显示;阳性质控品:扩增曲线有明显对数增长期, 且Ct<30;表示实验有效。如果检测样品的扩增曲线无对数增长期或Ct>37, 判断样品为阴性;如果检测样品Ct≤37, 且曲线有明显的对数增长期, 判断样品为阳性。

2 结果与讨论

用荧光PCR法对433份咽拭子标本进行肠道病毒核酸检测, 结果有253例呈肠道病毒核酸阳性, 阳性率为58.4% (253/433) 。在253肠道病毒核酸阳性病例中经分型检测, EV71型为146例, Cox.A16型为107例, 未见有混合感染。手足口病是以手掌、脚掌、口腔黏膜上发生疱疹和溃疡为特征的一种病毒感染性疾病, 但有些患者没有典型病症, 病情发展很快。因此及时检出和发现患者是否感染EV71和Cox.A16, 可为临床提供实验诊断依据。而常规诊断方法存在一些弊端, 如病毒分离培养对技术要求较高, 费用较昂贵, 耗时需要4~15 d, 而且各实验室分离的阳性率各不相同, 无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要;中和抗体检测常需比较患者急性期血清与恢复期血清的中和抗体滴度, 有时仅靠检测单份血清的中和抗体滴度很难做出诊断;RT-PCR技术虽然克服了以上缺点[2], 已成为快速诊断的重要手段, 但PCR后需要进行凝胶电泳分析, 操作也较繁琐。今年年初本市手足口病又有抬头趋势, 为了及时控制疫情笔者采用实时荧光定量PCR法对433例可疑患者做了EV71和CA16检测, 为及时控制疫情发挥了作用。本文使用的实时荧光定量PCR法操作简单快速, 整个操作只需两步, 不到3 h, 即可获得高质量的数据;具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点, 该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

关键词：荧光PCR,手足口病,肠道病毒

参考文献

[1]金奇.医学分子病毒学〔M〕.北京:科学出版社, 2000:606-613.

肠道病毒核酸检测 篇7

关键词：荧光,酶联免疫吸附检测,乙肝病毒,无偿献血

酶联免疫吸附法 (ELISA) 属于一种血清学诊断方法, 具有快速、灵敏与廉价的特点, 是目前检测乙型病毒性肝炎 (乙肝) 最为常用的方法[1], 在血站血液筛查中具有重要地位。乙肝病毒 (HBV) -DNA含量测定则更为直接、可靠, 近年来在血液筛查工作中逐渐推广应用[2]。本文通过分析ELISA检测与HBV-DNA检测两种方法筛查献血者HBV感染率的差异, 希望为血液筛查工作提供一定理论依据, 现报道如下:

1 资料与方法

1.1 血液标本

选取2 01 3年1月至2 01 4年12月金华市中心血站采集的无偿献血血液标本36 473份。所有献血者均经HBs-Ag快速试纸法与丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 化学法初筛检测合格。每位无偿献血者标本均留取两管样本, 分别进行ELISA检测与HBV-DNA检测。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

血样处理采用Xantus150样本处理系统;ELISA检测采用FAME24/20型全自动酶免分析仪 (瑞士哈米顿公司) 及HBV血清学标志物检测试剂盒 (上海卡努生物科技有限公司) ;HBV-DNA检测采用实时荧光定量PCR系统 (罗氏公司) 和配套检测试剂。

1.2.2 检测方法

静脉采血后留取标本两份, ELI SA检测与HBV-DNA检测均应在标本采集后48小时以内完成, 不能完成的标本需提取血浆并在-20℃环境下保存, 7天以内检测。所有血液样本均进行HBV血清学标志物检测与HBV-DNA检测, 其中, lg (HBV-DNA) >2.70为阳性, H B V血清学标志物主要包括乙肝表面抗原 (HBs Ag) 、乙肝表面抗体 (HBs Ab) 、乙肝e抗原 (HBe Ag) 、乙肝e抗体 (HBe Ab) 及乙肝核心抗体 (HBc Ab) 。

1.3 观察指标

比较两种方法诊断符合率, 并分析HBs Ag阳性的3种不同HBV感染状态的HBV-DNA含量, 包括HBV急性感染或感染慢性期 (HBs Ag+/HBc Ab+) 、“小三阳” (HBs Ag+/HBe Ab+/HBc Ab+) 、“大三阳” (HBs Ag+/H B e A g+/H B c A b+) 。

1.4 统计分析

采用统计学软件SPSS 16.0对数据进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 采用t检验, 计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法诊断符合率比较 (表1)

ELISA检测HBV的阳性率为0.2% (73/36 473) , HBV-DNA检测HBV阳性率为0.2% (82/36 473) , 组间比较差异无统计学意义 (χ2=0.5 2, P>0.0 5) 。两种方法诊断符合率为9 9.9% (3 6 4 2 6/3 6 4 7 3) 。

2.2三种不同H B V感染状态的H B V-DN A含量 (表2)

3种HBs Ag阳性的状态中, HBs Ag+/HBe Ag+/HBc Ab+的HBV-DNA检测阳性率与HBV-DNA含量均显著高于HBs Ag+/HBe Ab+/HBc Ab+和HBs Ag+/HBc Ab+, 差异均有统计学意义。HBs Ag+/HBe Ab+/HBc Ab+与HBs Ag+/HBc Ab+的HBV-DNA检测阳性率与HBV-DNA含量差异无统计学意义。

注:A组:HBs Ag+/HBc Ab+, B组:HBs Ag+/HBe Ab+/HBc Ab+, C组:HBs Ag+/HBe Ag+/HBc Ab+;1为A组与B组比较, 2为A组与C组比较, 3为B组与C组比较;*Fisher确切概率法

3讨论

我国是HBV感染高发的国家, 血液传播是乙肝感染的重要途径之一, 所以HBV筛查是血液系统最主要的工作内容之一。目前, ELISA属于一种血清学方法, 已成为HBV感染诊断最为广泛的方法, 在临床诊断与血液筛查中具有重要作用[3]。HBV-DNA检测是一种近年发展起来的分子生物学诊断方法, 可在早期发现HBV感染并对病毒进行定量, 其结果较为灵敏可靠。

研究报道[4], ELISA检测与HBV-DNA检测HBVAg检测结果存在一定差别。本文28份标本HBs Ag检测阴性呈现HBV-DNA阳性, 主要原因可能是HBV感染早期, 献血者血液中病毒数量较少, HBs Ag不能被ELISA检测到, 而DNA则已存在于血清中, 故HBV-DNA检测阳性[5]。19份标本HBs Ag检测阳性呈现HBV-DNA阴性, 主要原因是有的乙肝患者经过药物治疗血液中仅存在HBs Ag, 并不具备病毒DNA, 病毒复制率与传染性低[6]。

本文结果还显示, 相对于HBsAg+/HBcAb+与HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+状态, HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+的HBV-DNA阳性率与含量均显著较高。由于HBV传染性与HBV-DNA含量有关, HBsAg+/HBcAb+通常提示HBV急性感染或者感染慢性期, HBV感染但无传染性, HBsAg+/HBeAb+/HBcA b+通常提示H BV具有一定传染性但传染性较弱, HBs Ag+/HBeAg+/HBcAb+标本传染性极高[7]。这说明HBV-DNA定量检测在一定程度上反映了HBV的传染性。

综上所述, ELISA检测与HBV-DNA检测HBV感染结果存在不一致现象, 在诊断HBV感染时具有一定互补性, 在血液筛查同时进行可减少漏检, HBV-DNA含量在一定程度上反映了HBV的传染性, 为杜绝HBV的血液传播, 开展HBV-DNA定量检测还是有必要的。

参考文献

[1]祝继华, 严立, 陈瀑, 等.ELISA法在检测乙肝标志物中的应用和评价[J].重庆医科大学学报, 2009, 34 (10) :1397.

[2]姜伟超.650例慢性乙肝患者HBV-M、HBV-DNA同步检测分析[J].胃肠病学和肝病学杂志, 2013, 22 (2) :141.

[3]邓雪莲, 安万新, 梁晓华, 等.大连市血液中心血清学检测与核酸检测并行的效果观察[J].中国输血杂志, 2012, 25 (1) :38.

[4]刘社琴.乙肝血清标志物与HBV-DNA定量检测结果分析[J].中国医药导报, 2011, 8 (10) :171.

[5]陈宇新, 林志强.荧光定量PCR检测HBV-DNA与ELISA方法测定乙型肝炎五项指标相关性分析[J].吉林医学, 2012, 33 (30) :6533.

[6]徐丛荣.乙型肝炎病毒表面抗原阳性HBV-DNA阴性1例[J].检验医学与临床, 2009, 6 (2) :142.