猪圆环病毒检测方法

2024-09-12

猪圆环病毒检测方法（精选9篇）

猪圆环病毒检测方法篇1

猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2, PCV-2) 可引起断奶仔猪多系统衰弱综合征 (PMWS) , 还可造成母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪皮炎与肾病综合征 (Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS) 、幼龄仔猪的先天性震颤等疾病。试验根据PCR技术原理建立了猪圆环病毒2型的PCR检测与诊断的方法, 该方法具有高度的敏感性、特异性, 可应用于临床诊断中, 现介绍如下。

1 材料

1.1 病料

采自确诊为PCV-2感染病猪的淋巴结、肺脏和脾脏等组织, 置于-80 ℃冰柜中保存, 备用。

1.2 主要试剂

Tris平衡酚, 购自Solarbio公司;10×Tap Reaction Buffer、Taq DNA聚合酶 (含10×Buffer, 25 mmol/L MgCl2) 、dNTPs、100 bp DNA Marker, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司;蛋白酶K, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。蛋白酶K储存液 (10 mg/mL) 、细胞裂解缓冲液、饱和酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) 、3 mol/L醋酸钠 (pH 值为5.2 ) 、TE缓冲液 (pH 值为8.0) 、RNase A (10 mg/mL) 和EB贮存液 (10 mg/mL) 、50×TAE (Tris-乙酸) 、10×上样缓冲液、1.2%琼脂糖凝胶, 均参照参考文献[1]自制。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据GenBank中PCV-2核苷酸全序列 (DQ910865) , 应用Oligo 4.0软件设计了1对PCV-2特异性引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 序列为P1 5′-AGTGAGCGGGAAAATGCAGA -3′, P2 5′-TCCTCCGTGGATTGTTCTGT-3′。

2.2 组织病料DNA的提取

组织病料DNA的提取参照参考文献[1]进行。

2.3 PCR扩增

将提取的DNA作为PCR模板, 建立25 μL的PCR的反应体系:DNA模板 2 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTP (2.5 mmol) 2 μL, 上游引物 (P1, 25 pmol/μL) 0.5 μL, 下游引物 (P2, 25 pmol/μL) 0.5 μL, Taq DNA聚合酶 0.5 μL, 加双蒸水至25 μL。反应程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 共32个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。取PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检查。

2.4 敏感性检测

将所提取的已定量的病毒DNA (19 μg/mL) 按照1×10-1～1×10-7进行10倍倍比稀释, 分别作为PCR模板。按上述扩增反应体系和反应程序分别对这些模板进行PCR扩增。各取5 μL PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳, 以出现阳性反应条带的模板用量为最高稀释倍数, 推算可检出的最低病毒含量。

2.5 特异性检测

采用设计的PCV-2特异性引物及所建立的PCR方法对PCV-2、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 、猪细小病毒 (PPV) 及PK-15 细胞的阳性样品进行PCR扩增, 观察是否扩增出PCV-2、PRRSV、PPV等病毒及PK-15 细胞的核酸片段。

2.6 临床送检样品的检测

对保定、满城、山东、正定送检的病料 (脾脏、淋巴结、心脏等) 进行PCR检测。

3 结果

3.1 PCR扩增结果

扩增出的片段大小为417 bp, 与预期大小相符, 见图1。

1.100 bp DNA Marker;2～4.阳性病料。

3.2 敏感性检测结果

将提取的DNA按照1×10-1～1×10-7作10倍倍比稀释后进行PCR扩增, 结果可检出目的基因的最低DNA模板的稀释浓度为1×10-4, 见图2。根据该模板的OD260值计算, 在DNA模板稀释浓度为1×10-4时, DNA模板含量为3.8 pg, 可见该方法具有较好的敏感性。

1.100 bp DNA Marker; 2～8.稀释度分别为1×10-1, 1×10-2, 1×10-3, 1×10-4, 1×10-5, 1× 10-6, 1×10-7时扩增结果。

3.3 特异性检测结果

用PCV-2特异性引物对PCV-2、PRRSV、PPV等病毒及PK-15 细胞的阳性样品进行PCR扩增, 经1.2%琼脂糖凝胶电泳后, 只有PCV-2扩增出1条417 bp大小的条带, 而PRRSV、PPV及PK-15 细胞都没有条带出现 (见图3) , 表明该方法所扩增的片段为PCV-2特异性片段, 方法具有良好的特异性。

1.100 bp DNA Marker; 2.阳性标准PCV-2株; 3.阳性标准PRRSV株; 4.阳性标准PPV株; 5.PK-15细胞。

3.4 临床样品的检测结果

对保定、满城、山东、正定等地送检的4份病料应用所建立的PCR方法进行检测, 结果均为阳性, 见图4。

1.100 bp DNA Marker; 2～5.病料分别来自正定、满城、山东、保定;6.PCV-2阳性对照。

4 讨论

(1) PCV-2感染是近些年新发现的一种猪的传染病, 动物感染后可以使机体的免疫系统遭到损害, 导致抵抗力下降, 从而易并发或继发其他病原的感染, 使病情加重, 严重地影响着世界养猪业的发展。从2001年我国报道猪群中存在PCV-2感染以来, 由PCV-2感染所致疾病的发生和流行呈上升趋势[2]。但由于目前国内外尚没有有效的疫苗和药物用于该病的防治, 一旦发病将会给养殖户带来较大的损失。因此, 建立一种快速、特异、敏感的检测方法对该病的预防将发挥极其重要的作用。

(2) 目前, 国内外已对PCV-2的诊断方法进行了大量的研究, 并取得了一定的进展, 主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法。由于PCV-1和PCV-2两个血清型之间的同源性较高, 并存在着共同的抗原表位, 用血清学检测难以区分;并且国内不同厂家生产的PCV-2酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒检测结果差别较大, 因此用ELISA法检测PCV-2抗体很难对临床病例进行确诊。国外生产的ELISA、免疫荧光试验 (IFA) 等诊断试剂盒非特异性较高, 重复性、稳定性还需进一步改进, 而且价格昂贵。要确定病毒病的病原常常需要进行病毒的分离与鉴定, 但由于PCV在细胞上不产生细胞病变, 在细胞培养中病毒的含量也很低, 需要盲传多代后才能获得高效价的病毒, 因此病毒分离费力、耗时, 不适合于临床上对本病的快速诊断[2]。由此可见, 从以往的试验研究的方法、结果和临床实用性上来看, PCR方法具有特异性强、敏感性高和简便易操作的特点, 可以快速准确地检测感染病例组织样品中的核酸DNA, 对临床上PCV-2的快速诊断非常适合。

(3) 本试验根据PCV-2的ORF1基因的保守序列设计了1对引物, 建立了PCV-2的PCR检测方法, 并进行了敏感性、特异性检测, 结果表明敏感性和特异性较好。然后又用该方法对临床样品进行检测, 均能获得预期长度的DNA条带。

(4) 试验中, 提取病毒基因组DNA时, 各操作步骤要谨慎小心, 尽量减少DNA的人为降解;取上清液时不应贪多, 以防非核酸类成分干扰;异丙醇、乙醇、醋酸钠等要预冷, 以减少DNA的降解, 促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

参考文献

[1]宋勤叶.表达圆环病毒2型衣壳蛋白重组质粒的构建及免疫效应[D].北京:中国农业大学, 2005.

[2]董信田, 肖剑, 金俊杰, 等.猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立[J].兽医研究, 2008 (9) :22-24.

猪圆环病毒检测方法篇2

猪圆环病毒病防治概况

猪圆环病毒是断奶猪多系统衰竭综合症的病原.该病对猪的感染较高,在世界范围内广泛发生,已成为严重影响养猪业发展的.传染病之一,引起世界许多国家兽医工作者的高度重视.本文就近几年来国内外对猪圆环病毒的研究状况进行了综述,包括流行特征、致病机理、临床症状、病理变化、病原的检测以及其防治及对策等.

作者：汪金龙作者单位：安徽省宣城市宣州区畜牧兽医管理局,24刊名：中国畜禽种业英文刊名：THE CHINESE LIVESTOCK AND POULTRY BREEDING年，卷(期)：20095(5)分类号：S8关键词：猪圆环病毒症状诊断防治

猪圆环病毒检测方法篇3

目前, 国内外对PCV2的检测方法已经进行了大量的研究, 除了传统的病毒分离、免疫荧光法、ELISA方法、免疫组化法等方法以外, 还建立了检测PCV2的普通PCR、竞争PCR、套式PCR和实时荧光定量PCR等分子生物学诊断方法。在这些方法中, 普通PCR方法具有较高的敏感性和特异性, 而且操作简便, 特别适合于临床的快速诊断。本研究根据PCR技术原理, 建立了PCV2的PCR快速检测方法, 对日常的临床诊断具有较强的指导意义, 现将结果报告如下。

1 材料

1.1 病毒

PCV2毒株为本课题组从临床上发病猪的肺脏和淋巴结中分离得到。对照毒株猪瘟病毒 (HCV) 、猪繁殖与障碍综合征病毒 (PRRSV) 、猪伪狂犬病毒 (PRV) 均为疫苗毒。

1.2 病料

病料采集于2005年6月至2006年3月, 分布于温州市的11家养猪场的发病猪。所有发病猪均是断奶后仔猪, 并具有明显的呼吸道症状。主要表现体温升高, 食欲下降, 消瘦, 被毛粗乱, 皮肤苍白, 呼吸困难或明显咳喘。有的在耳部、腹部可见出血性紫红色斑块, 眼角分泌物增多, 部分病猪共济失调。病猪生长缓慢, 大部分成为僵猪。剖检的病猪大部分表现为全身淋巴结出血、肿胀, 特别是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、肺门淋巴结及颌下淋巴结肿大, 切面呈均匀的苍白色;肺萎陷, 肺尖叶有实质性病变, 胸腺萎缩;脾脏中度肿大, 肉变;肝脏变暗, 萎缩, 肝小叶间结缔组织增生;心包积液, 包膜内有大量炎性渗出物;肾脏水肿, 苍白, 被膜下常伴有白色坏死灶;盲肠和结肠粘膜充血或淤血。采集病猪的腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏、肺脏等组织, 冷冻保存, 作为PCV2检测材料。

1.3 主要试剂

r Taq DNA聚合酶 (上海Promega公司) 、蛋白酶K (MERKE公司) 、10×Buffer、d NTP (25 mmol/L) 、DL-2 000 Marker均购自Ta Ka Ra公司。其余试剂均为分析纯产品。

1.4 主要仪器

PCR扩增仪 (Eppendorf公司) 、冷冻离心机、-70℃超低温冰箱、凝胶成像分析仪。

2 方法

2.1 引物设计

根据Gen Bank中发表的PCV2全基因序列, 设计了一对扩增PCV2 ORF2片段的引物, 引物序列如下:

P1:5’-TCT CAG TAT GAC AGT CTC AAG-3’

P2:5’-GCC ATC GTT CGT CAT GTT TAT-3’

预扩增目的片段大小为750 bp, 引物由上海生物工程公司合成, 用高压灭菌dd H2O溶解配成20 pmol/L, -20℃保存备用。

2.2 病毒DNA的制备

取少量组织病料, 剪碎后加入4倍体积的0.01 mol/L PBS研磨匀浆, 反复冻融3次;10 000 r/min离心5 min, 取上清液 (500~700μL) ;加入等体积的氯仿, 振荡混匀, 10 000 r/min离心10min;取水相, 放入新的EP管中, 再加入等体积的氯仿, 重复操作3次;取上清液于新的EP管中, 加入终浓度为分别为1%和50μg/μL的SDS和蛋白酶K, 55℃作用30 min;加入等体积的酚抽提, 振荡混匀, 10 000 r/min离心10min;取上清液, 加入等体积的酚/氯仿抽提, 振荡混匀, 10 000 r/min离心10min;取上清液, 加入等体积的氯仿抽提, 10 000 r/min离心10 min;取上清液, 加入1/10~1/8体积的p H 5.2, 3M乙酸钠和2~2.5倍体积的无水乙醇, -20℃过夜, 沉淀DNA;然后12 000 r/min离心20 min, 弃掉上清液, 室温干燥;最后加入20μL dd H2O/DEPC溶解, -20℃保存备用。

2.3 PCR扩增

25μL反应体系:引物P1 1.5μL, 引物P2 1.5μL, 2.5 m M d NTPs 2.0μL, 25 m M Mg2+1.5μL, 10×Mg2+free buffer2.5μL, Taq酶0.2μL, dd H2O 10.8μL, DNA 5μL。

反应循环参数:95℃预变性5min, 94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 共30循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳。

2.4 特异性试验

采用设计的PCV2特异性引物对PCV2、HCV、PRRSV、PRVR的阳性样品进行PCR扩增, 观察是否扩增出PCV2、HCV、PRRSV、PRV的核酸片段。

2.5 敏感性试验

提取PCV2 DNA, 用核酸测定仪确定其浓度, 然后按10倍倍比稀释至7~10 ng/m L, 进行PCR扩增, 确定能检测到核酸条带的最低扩增模板浓度。

2.6 重复性试验

对10份临床样本重复检测2次, 确定该方法的稳定性。

3 结果

3.1 PCR反应条件的优化

通过对PCR反应体系中d NTPs、Mg2+、Taq酶、引物浓度的优化, 得出了各成分的最佳反应浓度分别为:d NTPs的浓度为2.5 m M, Mg2+的浓度为25 m M, Taq酶的浓度为0.05 U/μL, 引物的浓度为20 pmol/L。反应的循环参数为95℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 共30循环;最后72℃延伸10 min。用优化的条件对标准PCV2进行PCR扩增, 1%琼脂糖凝胶电泳, 扩增出大小为750 bp的片段, 与预期大小相符。

3.2 特异性试验

用PCV2特异性引物对PCV2、HCV、PRRSV、PRVR的阳性样品进行了PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳后, 只有PCV2扩增出一条750 bp大小的条带, 而HCV、PRRSV、PRV都没有条带出现, 这表明该方法所扩增的片段为PCV2特异性片段, 方法具有良好的特异性。结果如图1所示。

3.3 敏感性试验

将提取的PCV2 DNA从100 ng按10倍倍比稀释至10-7ng/m L, 进行PCR扩增, 结果, 引物对P1/P2可以检测出目的基因的最低DNA模板量为10-5ng, 具有较好的敏感性。结果如图2。

3.4 PCR重复性

对10份临床样本重复检测2次, 结果均与第1次结果相符, 方法稳定性良好。

4 讨论

猪圆环病毒2型感染是近些年新发现的一种猪的传染病, 病毒感染后可以使机体免疫系统遭到损害, 导致抵抗力下降, 从而易并发或继发其他病原的感染, 使病情加重, 严重地影响着世界养猪业的发展。我国从2001年报道猪群中存在PCV2感染以来, 由PCV2感染所致疾病的发生和流行呈上升趋势。但由于目前国内外尚没有有效的疫苗和药物用于该病的防治, 一旦发病, 将会对养殖户带来较大的损失。因此, 建立一种快速、特异、敏感的检测方法, 对本病的预防将发挥极其重要的作用。

目前, 国内外已对PCV2的诊断方法进行了大量的研究, 并取得了一定的进展, 主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法。由于PCV1和PCV2两个血清型之间同源性较高, 并存在着共同的抗原表位, 所以用血清学检测难以区分两者, 并且国内不同厂家生产的PCV2酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒检测结果差别较大, 用ELISA检测PCV2抗体方法很难对临床病例进行确诊;国外市售的ELISA、间接免疫荧光试验 (1FA) 等诊断试剂盒, 非特异性较高, 重复性、稳定性也还需进一步改进, 而且价格昂贵。而对病毒病的病原学的确诊常常需要进行病毒的分离与鉴定, 但由于PCV在细胞上不产生细胞病变, 在细胞培养中病毒的含量也很低, 需要盲传多代后才能获得高滴度的病毒, 因此病毒分离费力、耗时, 不适合于临床上对本病的快速诊断。由于PCV2是DNA病毒, 并且基因组较小, 因此便于从核酸水平对病毒进行检测和研究。PCR方法具有特异性强、敏感性高和简便易操作的特点, 可以快速准确地检测感染病例组织样品中的核酸DNA, 对临床上PCV2的快速诊断非常适合。

本研究根据PCV2 ORF2基因的保守序列, 应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物, 建立了PCV2的PCR快速检测技术, 用该技术对临床样品进行检测, 均能获得预期长度的DNA条带。通过对HCV、PRRSV、PRV的PCR扩增, 证明该方法具有良好的特异性。敏感性试验结果表明该方法敏感性较高, 可以直接用于临床样品的快速检测。重复性试验也说明该方法具有良好的稳定性, 可用于大规模PCV2病料的检测, 能够为温州市PCV2疫情监测提供较好地技术支持。

猪圆环病毒病的诊断与防治篇4

猪圆环病毒病的诊断与防治

本文阐述了猪圆环病毒病的.病原特性、流行特点、发病机制、临床症状及病理剖检变化、诊断方法和防制方法,并结合本省兽医临床诊疗实际提出了对本病的防治对策.

作者：李卓刘清河作者单位：长春市动物疾病诊疗服务中心,吉林长春,130062 刊名：吉林畜牧兽医英文刊名：JILIN ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)： 30(4) 分类号：S852.65+9.2 关键词：猪圆环病毒诊断防治

猪圆环病毒检测方法篇5

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

基因组DNA快速抽提试剂盒、100 bp DNA Ladder、6×DNA Loading Dye、Taq DNA聚合酶、d NTP Mix、25 mmol/L Mg Cl2及10×PCR Buffer,均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。PCR扩增仪(型号为PTC-200),美国Bio-Rad公司产品;自动凝胶图像分析仪(型号为JS-380A),上海培清科技有限公司产品;冷冻高速离心机(型号为Mikro200R),德国Hettich公司产品;电泳仪(型号为DYY-7C)、琼脂糖水平电泳槽(型号为DYCP-31DN),北京六一仪器厂产品;恒温箱、微量移液器等,实验室自备。

1.2 引物的设计及合成

参照Gen Bank上发表的PCV-2全基因序列(登陆号为JX682407)设计一对扩增PCV-2片段的特异性引物,扩增片段位于826~979 bp,长度为153 bp。上游引物序列:5'-CGTTGGAATGGTACTC CTC-3';下游引物序列:5'-TATGGAAATTCAGGGC ATG-3'。

引物由生物工程(上海)股份有限公司合成,-20℃冰箱保存,备用。

1.3 DNA模板的提取

采集有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)典型症状的发病猪脾脏、淋巴结和肺脏等病变组织,研碎,按1∶4的比例加入无菌含双抗的PBS液,混匀,反复冻融3次,4℃条件下8 000 r/min离心7 min,取上清液于冰箱中-20℃保存待用。用基因组DNA快速抽提试剂盒,按使用说明书上的操作方法提取组织病料DNA。3 000 r/min离心5 min,取上清液转移到新的EP管中;6 000 r/min离心5 min,取上清液200μL转移到新的EP管中;加入400μL Buffer Digestion,震荡混匀,65℃水浴60 min;加入200μL Buffer PA,颠倒混匀,-20℃放置5 min;室温下10 000 r/min离心5 min,取上清液500μL转移到新的EP管中;加500μL异丙醇,颠倒5~8次混匀,室温下放置2 min,室温下10 000 r/min离心5 min,弃上清液;加1 000μL 75%的乙醇溶液,颠倒漂洗2 min,10 000 r/min离心2 min,弃上清液;乙醇溶液重复漂洗1次;开盖室温下放置10 min左右;加入150μL TE Buffer溶解,-20℃保存。

1.4 PCR扩增及条件的优化

以提取的PCV-2的DNA为模板,用试验设计的一对特异性引物进行扩增。反应体系(50μL):10×Buffer和Mg Cl2各5μL,2.5 mmol/L d NTP 4μL,Taq DNA聚合酶1μL,上、下游引物各1μL,模板2μL,加dd H2O至终体积50μL。混匀后放入PCR扩增仪中。反应程序:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,48~59℃梯度退火30 s,72℃延伸30 s,共41个循环;最后72℃延伸6 min。反应结束后将PCR产物在1.5%琼脂糖中进行电泳,用凝胶成像系统进行观察。

1.5 PCR产物的测序鉴定

将PCR产物按DNA凝胶回收试剂盒的要求进行回收,将回收产物送南京金斯瑞生物公司进行测序,将测序结果与Gen Bank中的PCV-2序列进行比对。

1.6 特异性测定

以提取的PCV-2的DNA、猪瘟脾淋苗、猪伪狂犬病阳性病料、猪大肠杆菌的DNA为模板,用上述所设计的PCV-2的特异性引物按照1.4的方法进行扩增、电泳、结果观察。

1.7 敏感性测定

将提取的PCV-2的DNA作不同浓度的稀释,分别用1.4中的条件进行PCR扩增,扩增结束后以10μL的PCR产物进行电泳,检测PCR方法的敏感性。

1.8 PCR检测方法的应用

采用1.4的方法,对泰州市海陵区、高港区及兴化市等6个地区发病猪的脾脏、淋巴结和肺脏等病变组织67份进行PCV-2的检测。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及条件的优化

为了获得较好的扩增效果,对扩增的条件及程序进行了调整,最终确定了最佳的扩增参数为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,共41个循环;最后72℃延伸6 min。

PCR扩增结束后,取5 m L的PCR产物在1.5%琼脂糖中进行电泳,凝胶成像系统观察,在约153 bp处见一特异性条带,与预期的大小一致,结果见图1。

M.100 bp DNA Ladder;1~4.PCV-2扩增产物。

2.2 PCR产物的测序

将阳性的PCR产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序,结果与Gen Bank中的PCV-2序列进行比对,比对结果显示扩增的条带为PCV-2序列。

2.3 特异性和敏感性测定结果

以提取的PCV-2的DNA、猪瘟脾淋苗、猪伪狂犬病阳性病料、猪大肠杆菌的DNA为模板,PCR扩增后电泳检测,结果显示所设计的引物仅能扩增出PCV-2的DNA片段,约153 bp,而其他病料扩增结果均没有显示条带。

DNA模板在经过10-1~10-7稀释后,采用优化的条件扩增仍能在10-5时扩出片段,表明其敏感性较高,见图2。

M.100 bp DNA Ladder;1~7.DNA模版10-1~10-7倍稀释液。

2.4 PCR检测方法的临床应用

采用最佳的扩增条件,对所采的67份有PMWS症状发病猪的病料(淋巴结、脾脏等)进行了PCV-2的检测。结果显示67份病料中有42份为阳性,阳性率达62.9%。

3 讨论与分析

PCV-2可引起PMWS、猪皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、仔猪传染性先天性震颤等多种疾病,但以PMWS最为常见[2]。

2000年郎洪武等[3]采用ELISA法对7个省(市)的559份猪血清样品进行检测,发现大多数存在有PCV-2抗体,且抗体的阳性率随着猪的年龄的增长随之升高。随后又有王忠田等[4]、王先炜等[5]关于PCV-2检测阳性的报道,可见PCV-2在我国多地普遍存在。PCV-2的存在严重制约了养猪业的发展,但目前尚无针对该病的有效疫苗和药物,所以建立快速、便捷、特异性好的检测方法对该病的防治具有重要意义。

PCV-2的实验室诊断方法较多,主要为血清学诊断和病原学诊断。血清学诊断常用的有直接免疫荧光试验,该方法简便快捷、敏感性强,但荧光染料不易清洗干净,易产生假阳性[6]。ELISA法应用较多,敏感性高、特异性强、重复性好,适用于临床检测。病原学诊断主要有病毒分离、普通PCR、定量PCR等,与这些方法相比,普通PCR具有快速、便捷、特异性好等优点,可用于PCV-2的早期诊断及流行病学调查。本试验根据Gen Bank上发表的PCV-2全基因序列(登陆号为JX682407)设计一对扩增PCV-2片段的特异性引物,扩增片段长度为153 bp,对其反应条件及程序进行优化,建立的PCV-2的PCR检测方法,其特异性和敏感性较好,对泰州市海陵区、高港区及兴化市等地区采集的67分疑似病料进行检测,其阳性率达62.9%,结果与试验室设计的另一对引物扩增的结果一致。试验结果说明:该检测方法的建立有利于规模化猪场对PCV-2的检测及监控,可为该病的早期诊断提供技术平台。

参考文献

[1]李志娟,王永生,陈陆,等.荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的研究与应用[J].杨州大学学报(农业与生命科学版),2011,32(1):49-54.

[2]温立斌,何孔旺,杨汉春.一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析[J].中国农业科学,2010,43(2):411-416.

[3]郎洪武,张广川,吴发权,等,断奶猪多系统衰竭综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技,2000,30(3):3-5.

[4]王忠田,杨汉春,郭鑫.规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查[J].中国兽医杂志,2002,38(10):3-6.

[5]王先炜,姜平,李玉峰,等.华东地区PMWS患病猪群PCV-2的检测及其基因特征[J].中国兽医学报,2004,24(3),240-242.

猪圆环病毒检测方法篇6

ORF2编码PCV-2的主要结构蛋白为Cap蛋白[3], 该蛋白具有较强的免疫原性, 核苷酸序列同源性与PCV-1相比仅为66%, 与PCV-1的血清没有交叉反应性, 因此适合用于血清学的检测。

鉴于目前尚无PCV-2有效疫苗在临床上应用, 有效检测PCV-2的诊断技术就显得尤为重要。试验建立了PCV-2 Cap蛋白琼脂扩散试验检测方法, 现报道如下。

1 材料

Ⅱ型猪圆环病毒Cap蛋白, 吉林农业科技学院动物医学学院动物疫病研究室制备、保存;猪圆环病毒抗体胶体金试纸条, 厦门长宏医学科技有限公司生产;凝胶成像扫描系统, Alpha innotech Gene公司生产。

2 方法

2.1 琼脂扩散试验的操作步骤

参照参考文献[4,5]进行操作。

2.2 琼脂扩散试验最佳工作条件的确定

2.2.1 琼脂配制的最佳比例试验

采用不同比例的琼脂粉、不同的缓冲液、不同的pH值, 确定最佳配方。

2.2.2 重组蛋白最佳工作浓度的确定

将纯化后的重组蛋白进行倍比稀释, 然后上样, 采用中间孔加抗原、周围孔加阳性血清的方法, 根据沉淀线出现的明显程度确定该蛋白的最佳工作浓度。

2.2.3 琼脂扩散试验的最佳观察时间范围的确定

根据沉淀线出现的时间确定最佳观察时间的范围。

2.2.4 琼脂扩散试验的判定标准

根据沉淀线的明暗程度[6]确定工作时间为30～39 h时是最佳观察时间, 该蛋白的最佳稀释度为4, 8倍时效果好, 即工作浓度为0.91～1.83 mg/mL。

阳性:阳性血清与抗原孔之间有明显的沉淀线时, 被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线, 并与阳性血清的沉淀线末端吻合, 则被检血清判为阳性。

弱阳性:被检血清与抗原孔之间没有沉淀线, 但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯, 则被检血清判为弱阳性。

阴性:被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线, 且阳性血清沉淀线指向被检血清孔, 则被检血清判为阴性。

2.3 特异性试验

采用中间孔加抗原、周围孔加血清的方法, 对PCV-2、细小病毒 (PPV) 、猪呼吸与繁殖综合征病毒 (PRRSV) 、猪瘟病毒 (HCV) 、伪狂犬病毒 (PRV) 的阳性血清进行特异性试验。

2.4 稳定性试验

2.4.1 批内重复试验

将同一批次纯化的蛋白在不同时间做重复性琼脂扩散试验, 采用中间孔加抗原、周围孔加不同稀释倍数的阳性血清方法, 进行重复性试验。

2.4.2 批间重复试验

将不同批次纯化的蛋白进行重复性试验, 用同一浓度的蛋白进行上样, 中间孔为抗原, 周围孔为不同稀释度的阳性血清。

2.5 符合率试验

将所建立的琼脂扩散检测方法对40份血清样品进行检测试验, 并与猪圆环病毒抗体胶体金试纸条作对照, 比较检测结果, 计算两者符合率。

3 结果

3.1 优化的琼脂扩散试验的工作条件

琼脂板配制的最佳比例见表1。

以出现明显沉淀线的最高稀释度作为判定的琼扩散试验效价。从表1中可以看出, 最适合的pH值是7.4, 最适合的溶液是PBS 缓冲液。琼脂糖和琼脂粉比较时发现两者在检测效价上差别不大, 相对而言琼脂粉的效果好, 沉淀线比较清晰。

本试验中用PBS配制1.0%琼脂粉, 按照上述试验方法制备琼脂板、上样, 中间孔为抗原, 周围1～4孔分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8稀释的阳性血清, 第5孔为阳性对照, 第6孔为阴性对照。37 ℃放置24 h观察到有微弱的沉淀线出现, 说明该蛋白可以和阳性血清进行抗原、抗体结合反应。

3.2 特异性试验结果

按照上述操作方法进行琼脂扩散试验的准备, 中间孔加表达的蛋白抗原, 周围孔加阳性血清的方法, 对PCV-2、PPV、PRRSV、HCV、PRV 5种病毒的阳性血清进行特异性试验。结果表明, 该重组蛋白针对抗PCV-2阳性血清具有特异性, 和抗PRRSV、PPV、HCV、PRV的阳性血清无交叉反应, 结果见表2。

注:-表示阴性, +表示阳性。

3.3 稳定性试验结果

3.3.1 批内重复试验结果

将同一批纯化的蛋白分为5批, 分别在4 h、8 h、16 h、24 h、36 h进行重复性试验, 每批的1号孔为抗PCV-2阳性血清, 2～5号孔为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8稀释的阳性血清, 6号孔为阴性对照。结果发现该蛋白具有良好的重复性, 1号孔的阳性对照出现明显的沉淀线, 2～5号孔都出现肉眼可见的沉淀线, 以4, 8倍稀释的沉淀线更明显些;6号孔未出现沉淀线。

3.3.2 批间重复试验结果

同时进行了3批 (批号为20070524、20070910、20080228) 纯化蛋白的重复性试验, 都能重复出现沉淀线, 间隔时间最长批次的蛋白-20 ℃保存时间可以达到10个月。结果见图1 (A、B、C) , 加样顺序同批内。

1～5.不同稀释度的阳性血清;6.阴性血清。

3.4 符合率试验结果

将所建立的琼脂扩散试验检测方法用于40份临床样本的检测, 同时与胶体金试纸条方法作对照, 结果2种方法检出的共同阳性样品21个, 共同阴性样品16个;而胶体金试纸条方法检出阴性的样品为1个;琼脂扩散试验检出阴性, 而胶体金检出为阳性的样品为2个。因此, 两者的总符合率为 (21+16) /40=92.5%, 阳性符合率为21/ (21+2) =91.3%, 阴性符合率为16/ (16+1) =94.1%。

4 结论

研究应用表达的Cap蛋白建立了琼脂扩散试验的诊断方法, 进行了特异性试验、稳定性试验、符合率试验, 结果表明应用该蛋白建立的琼脂扩散试验诊断方法对PCV-2抗猪阳性血清具有良好的特异性、稳定性, 与猪圆环病毒抗体胶体金试纸条进行符合性试验, 结果两者的总符合率为92.5%, 阳性符合率为91.3%, 阴性符合率为94.1%。

参考文献

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[5]房春林, 杨光友, 古小彬, 等.琼脂扩散试验检测附红细胞体抗体[J].中国畜牧兽医, 2006, 33 (9) :43-47.

猪圆环病毒检测方法篇7

目前PCV-2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、原位核酸分子杂交技术等,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想,因此生产实践中需要一种快速、特异、敏感的PCV-2检测技术来准确检测圆环病毒病,并为该病的防治提供事实和理论依据。本试验旨在对比新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室建立的常规PCR和荧光定量PCR检测方法的优缺点,为实验室或者临床中PCV-2的准确、快速检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

荧光定量PCR仪,购自Bio-Rad公司;普通PCR仪,购自Eppendorf公司;琼脂糖,购自Invitrogen公司;PCR试剂盒、DL-2 000 Marker等,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 标准阳性模板

包含PCV-2-ORF2全基因的重组质粒p MD-PCV-2-ORF2,新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室构建保存。

1.3 标准阳性模板的制备

培养含p MD-PCV-2-ORF2的工程菌,提取质粒,用核酸蛋白分析仪测定其浓度,并计算标准品的拷贝数。将重组质粒稀释至1.0×1010拷贝数/μL后再倍比稀释成含质粒数量分别为109,108,107,106,105,104,103,102,101,100拷贝数的标准阳性模板,-80℃保存,备用。

1.4 引物设计与合成

1.4.1 荧光定量PCR引物和探针的设计

根据Gen Bank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物和Taq-Man探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成,探针的5'端用FAM标记,3'端用TAMRA标记,扩增目的片段长度为106 bp。具体序列如下。

引物F(上游):5'-CCCTATGTAAACTACTCCT C-3';引物R(下游):5'-GGAAGTAATCAATAGTG-GAAT C-3'。

探针序列:5'-(FAM)ACCATAACCCAGCCCT-TCTCC(TAMRA)-3'。

1.4.2 普通PCR引物和探针的设计

根据GenBank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物,扩增目的片段长度为494 bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列如下。

引物P1(上游):5'-CACGGATATTGTAGTCCT-GGT-3';引物P2(下游):5'-CGCACCTTCG-GATATACTGTC-3'。

1.5 反应条件

1.5.1 荧光定量PCR反应条件

经过反复试验确定出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中Premix Ex Taq 12.5μL,上、下游引物(终浓度为10μmol/L)各0.5μL,探针(终浓度为10μmol/L)0.25μL,模板DNA 2μL,去离子水9.25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,57.4℃退火延伸30 s,40个循环。

1.5.2 普通PCR反应条件

经过反复试验选出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中上游引物P1 1μL,下游引物P2 1μL,10×PCR Buffer(Mg Cl2Plus)2.5μL,d NTP Mixture(2.5 mmol/L)4μL,La Taq(2.5 U/μL)0.25μL,模板DNA 5μL,去离子水11.25μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,54℃退火40 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,置紫外灯下观察。

1.6 临床样品检测

临床送检的158份病料用常规PCR和荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 重组质粒浓度的测定

提取的p MD-PCV-2-ORF2质粒,经核酸蛋白分析仪测定其质量浓度为449.9 ng/μL,并计算其拷贝数为9.84×1010拷贝数/μL,OD260/OD280值为1.80,符合纯度要求。

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立

根据重组质粒浓度测定结果,选择106,105,104,103,102,101拷贝数/μL 6个梯度浓度的质粒为模板,制作标准曲线(见图1)。标准曲线斜率为-3.354,轴截距为35.337,线性方程为Y=-3.354X+35.337,相关系数r为0.999,表明线性关系很好。

2.3 荧光定量PCR敏感性试验

以10倍系列稀释的p MD-PCV-2-ORF2标准质粒(1.0×106~1.0×101拷贝数/μL)为模板进行扩增,1.0×101拷贝数/μL仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为1.0×101拷贝数/μL。荧光曲线见图2。

2.4 普通PCR特异性与敏感性试验

选用101~1010拷贝数/μL 10个梯度浓度的质粒为模板进行扩增,凝胶电泳结果显示:当模板浓度≤1.0×104拷贝数/μL时,无法扩增出特异性目的条带。凝胶电泳检测结果见图3。

2.5 临床样品检测

对临床送检的158份病料用常规PCR法和荧光定量PCR法进行检测,结果见表1。荧光定量PCR法比常规PCR法的检出率高出8.86个百分点,表明荧光定量PCR法更加敏感。

-.PCR阴性对照;M.DL-2 000 Marker;1~10.101~1010拷贝数/μL。

3 讨论

断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年首次在加拿大的SPF猪群中被发现,随后在世界范围内广泛流行,自2001年起,我国的一些猪场也发现了PMWS[3]。PMWS主要侵害6~12周龄仔猪,引起淋巴系统疾病、渐进性消瘦、呼吸道症状及黄疸,造成病猪免疫机能下降、生产性能降低。现已证明PCV-2是导致PMWS的主要病原,特别是在有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病毒(PRV)存在的情况下,该病的阳性率更高[4],是当前严重危害我国养猪业的重要疫病之一。

圆环病毒病的确诊需要进行病毒分离,PCV-2在细胞上不产生细胞病变,且需将PCV-2盲传多代后才能使病毒有效增值,有时连续传代会导致病毒抗原性的改变,因此病毒的分离费力耗时,不适合快速诊断。国内外已有多种诊断试剂盒,如ELISA、IFA等,但其非特异性较高,且价格昂贵。常规PCR方法可以快速、敏感、特异地定性检测PCV-2,具有简单、易操作、设备价格较低、人员素质要求不高的优点,但也存在非特异性扩增造成的假阳性结果需要PCR后处理的缺点。荧光定量PCR可以对样品中的病毒含量进行准确的定量检测,具有结果直观、灵敏度高、特异性强的优点[5],同时也存在设备及试剂价格较高、对人员的素质要求较高、在基层推广性低的缺点。

参考文献

[1]ALLAN G M,mc NEILLY F,KENNEDY S,et al.Isolation of porcine circovirus 2 like viruses frompigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10(1):3-10.

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[4]张治涛,李玉峰,姜平,等.猪圆环病毒2型感染的检测与流行病学调查[J].中国兽医学报,2008,28(3):227-231.

猪圆环病毒检测方法篇8

1 材料

猪圆环病毒Ⅱ型淋巴组织毒,由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司分离鉴定;PK-15细胞,由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司传代与保存,经PCR检测无PCV-1污染;VectorVIP SUBSTRATE KIT FOR PEROXIDASE,购自Vector Laboratories公司;DMEM和胎牛血清,购自Gibco公司;猪圆环病毒Ⅱ型ELISA抗体检测试剂盒,购自JBT生物技术股份有限公司;辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗,购自Sigma公司;BSA,购自Amresco公司。

2 方法

2.1 PCV-2抗原诊断板的制备

取出于-70℃条件下保存的猪圆环病毒Ⅱ型淋巴组织毒,用无血清的DMEM培养液稀释至2×104TCID50/m L,将稀释好的病毒加到96孔细胞培养板中,每孔100μL;用胰蛋白酶消化PK-15细胞,然后用0.04%台盼蓝染色进行细胞计数;用含8%胎牛血清的DMEM将细胞密度调整至1×105个/m L,每孔加入PK-15细胞100μL,第12排只接种PK-15细胞;将96孔细胞培养板置36~38℃、5%CO2培养箱中培养3 d;取出细胞培养板,将病毒液倒入含2%Na OH的废弃桶中,每孔加入200μL PBST(0.1 mol/L PBS中加入0.05%吐温-20)清洗3次,然后每孔加入100μL固定液,室温条件下固定10 min;弃去固定液,将细胞培养板于超净工作台中放置5 min,自然干燥。

2.2 猪血清PCV-2抗体的IPMA检测

血清样本于56℃水浴灭活30 min;向固定好的抗原诊断板加入PBST,200μL/孔,洗板4次,拍干;各孔加入75μL抗体稀释液,第1孔加入25μL血清样本,连续4倍稀释血清,4℃感作过夜;去除一抗后每孔加入200μL PBST,清洗4次;以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗,每孔加入50μL二抗,于25℃感作1 h;去除二抗后每孔加入200μL PBST,清洗4次。每孔加入AEC显色液100μL,显色15 min;弃去显色液,每孔加入200μL超纯水,清洗4次,拍干,每孔再加入100μL超纯水,在显微镜下观察并拍照。结果判定:显微镜下可清晰观察到细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染,细胞边界清楚,结构清晰,判为阳性[7];阳性对照的细胞孔内应有红棕色着染;阴性对照、空白对照的细胞孔内无红棕色着染。满足以上条件试验成立;否则试验不成立,应重检。待检血清的抗体效价应为出现红棕色着染细胞的最大血清稀释倍数。

2.3 IPMA反应条件的确定

2.3.1 固定液最佳使用浓度的确定

分别用-20℃预冷的80%、100%丙酮固定培养好的PCV-2抗原诊断板,对猪血清PCV-2抗体进行IP-MA检测,筛选最佳固定液浓度。

2.3.2 抗体稀释液最佳使用浓度的确定

向固定好的PCV-2抗原诊断板分别加入1%、5%BSA浓度的抗体稀释液,稀释相同工作浓度的PCV-2阳性血清,并以不加抗体稀释液的细胞孔作为对照,确定两个浓度抗体稀释液的封闭效果。

2.3.3 PCV-2阳性血清最佳工作浓度的确定

向固定好的PCV-2抗原诊断板加入1∶256,1∶1 024,1∶4 096,1∶16 384倍稀释的PCV-2阳性血清,再加入最佳工作浓度的二抗,AEC染色,以染色结果呈红棕色为最佳PCV-2阳性血清抗体浓度。

2.3.4 辣根过氧化物酶标记兔抗猪二抗最佳工作浓度的确定

采用1∶1 000,1∶2 000,1∶3 000,1∶4 000,1∶5 000,1∶6 000,1∶8 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗工作浓度进行试验,以染色结果呈红棕色为最佳二抗工作浓度。

2.4 特异性、敏感性与交叉反应试验

用人工感染猪血清和已知阴性血清进行IPMA检测,确定反应的敏感性与特异性。用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和PCV-1参考血清进行交叉反应与符合试验。

2.5 IPMA与ELISA符合试验

用IPMA与猪圆环病毒Ⅱ型ELISA抗体检测试剂盒进行对比试验。

2.6 临床血清样品的检测

血清样品采自新疆昌吉、石河子、玛纳斯、米泉等地区,共采集血清380份,所有样品均用于抗体检测。

3 结果与分析

3.1 IPMA反应条件的确定

3.1.1 固定液最佳使用浓度的确定

用预冷的80%、100%丙酮将培养好的PCV-2抗原诊断板于室温条件下固定10 min,肉眼观察发现:100%丙酮对细胞培养板有腐蚀性,细胞培养板的清晰度差,影响PCV-2抗体效价的判定;而用预冷的80%丙酮固定PCV-2抗原诊断板效果最佳,无脱落细胞,能较好地保持细胞形态且对抗原损伤小,显微镜下可清晰观察到阳性细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染,细胞边界清楚。

3.1.2 抗体稀释液最佳使用浓度的确定

经测定显示,两个浓度的抗体稀释液的背景均较干净,无非特异性着色。1%、5%BSA浓度的抗体稀释液均可在今后的PCV-2抗体检测的待检血清和二抗的稀释中应用。

3.1.3 PCV-2阳性血清最佳工作浓度的确定

经测定发现,1∶1 024倍稀释时染色效果最好,试验最终选用1∶1 024的一抗稀释浓度作为阳性血清工作浓度用于PCV-2抗体检测。经AEC染色可见,阳性血清与病毒感染细胞染色,细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染,细胞边界清楚,结构清晰,判定为阳性,见282页彩图1A;阴性血清与细胞及抗原感染细胞孔对照均无着色反应,判定为阴性,见282页彩图1B。随着血清稀释倍数增加,着染细胞数量也呈梯度下降,这与理论上是相符合的。

3.1.4 辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗工作浓度的确定

经测定发现,1∶5 000倍稀释时染色效果最好,阳性细胞的胞核内或胞浆有典型的红棕色着染。试验最终选用1∶5 000的过氧化物酶标记二抗工作浓度用于PCV-2抗体的检测。

3.2 特异性、敏感性与交叉反应试验

用人工感染猪血清和已知阴性血清进行IPMA检测,结果只与PCV-2抗血清呈特异性阳性反应,与PCV-2阴性血清呈阴性反应。与PCV-2和PPV、PRV、CSFV、PRRSV、PCV-1阳性参考血清进行交叉反应,结果只与PCV-2抗血清呈特异性阳性反应,与其他几种猪病毒参考血清均呈阴性反应,证明无血清学交叉反应。

3.3 IPMA与ELISA符合试验

用IPMA与ELISA对135份猪血清进行平行试验,结果表明,IPMA法检测样品中有73份呈阳性和62份呈阴性,而ELISA法检测有87份呈阳性和48份呈阴性。采用IPMA法检测ELISA法检测的阳性样品,其中阴性者有14份;检测ELISA法检测的阴性样品,其中阳性者有2份。两种方法检测出均为阳性者73份,均为阴性者46份,总符合率为88.15%。

3.4 临床血清样品的检测

用IPMA法对采自不同地区的临床健康仔猪血清进行抗体检测,结果见表1。

由表1可知,阳性检出率为50.00%~100%。说明大多数猪只有机会感染上PCV-2,感染率高。

4 讨论

试验依据所研究的抗原和组织细胞种类的不同,采用不同固定液,从而确保固定后,标本可保持目的抗原自然形态、位置和活性不受损失,可见染色标本的固定是个重要步骤。目前,应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇[8]。在IPMA试验中,本研究采用预冷的100%、80%丙酮于室温条件下固定10 min,80%丙酮固定效果比较好,在规定时间内未见细胞板的腐蚀,保持良好的细胞形态且对抗原无损伤。

PCV-2抗体检测对于进行PCV-2流行病学调查、疫苗效果评价及试验用阴性猪的筛选等具有重要意义。目前,检测PCV-2抗体的常用方法有ELISA、IPMA和IFA方法。虽然ELISA方法因具有敏感、快速、简便等特点得到广泛应用[9],但国内的PCV-2抗体检测试剂盒种类繁多,质量参差不齐[10],而进口的PCV-2抗体检测试剂盒费用高昂,使得ELISA方法的应用很受限制。在操作方法上IPMA和IFA基本一致,但是两者的显色系统不一样,IPMA是采用AEC显色系统,在固定病毒制备的抗原诊断板上,有PCV-2抗体细胞孔的细胞核或胞浆呈红棕色着染,而无PCV-2抗体的PK-15细胞不能被染色,结果判定在普通的倒置显微镜下观察即可,IFA则需要在荧光显微镜下观察。因此,IPMA检测一般基层单位均有条件实施,但需要具备一定实际操作经验者进行检测方可保证结果判定的准确性。

用建立的IPMA方法对新疆各地猪场血清样品进行检测,结果发现,目前新疆各地猪群中广泛存在PCV-2抗体,380份血清的阳性率达86.32%,与临床上PCV-2感染导致的猪群发病的实际情况相符合,表明猪场PCV-2感染率很高,证实了此方法临床应用的可行性。

参考文献

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[8]崔尚金,全艳平,李曦,等.猪圆环病毒间接免疫荧光方法的建立[J].中国预防兽医学报,2007,29(1):63-66.

[9]刘长明,张超范,危艳武,等.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国预防兽医学报,2007,29(8):621-624,633.

猪圆环病毒检测方法篇9

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞

PCV, 河北农业大学兽医微生物实验室分离;PRV闽A株HK2-RK2、PPV 强毒株7909、猪瘟病毒 (CSFV) 石门系强毒株F114、新城疫病毒 (NDV) F48E9、法氏囊病毒 (IBDV) BC6/85及PK-15细胞, 均购自中国兽药监察所。

1.1.2 主要生物制剂 Taq DNA Polymerase、DL

2 000 Marker、蛋白酶K, 购于中国天根生物科技有限公司;XbaⅠ, 购自于宝生物工程 (大连) 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

参考GenBank上发表的PCV2、PRV和PPV核苷酸序列, 利用Primer Premier5.0软件辅助分析合成引物 (PCV、PRV、PPV引物分别参照Ouardani M等[1]、Harding M J等[2]、Molitor T W等[3]的研究结果设计) , 见表1。

1.2.2 病毒培养

分别取PCV、PRV和PPV的细胞毒按照1/10的比例接种于长成单层的PK-15细胞, PCV在接种72 h后收毒, PRV和PPV待细胞出现70%～80%细胞病变 (CPE) 时收毒。CSFV用PK-15细胞培养并收毒。NDV和IBDV均由鸡胚成纤维细胞增殖而得。

1.2.3 DNA模板的制备

参考《分子克隆实验指南》采用常规方法提取核酸。

1.2.4 单相PCR扩增

PCV的单相PCR:取提取的核酸进行PCR 扩增。PCR反应体系 (25 μL) :40 pmol/L引物P1、P2各0.5 μL, 0.125 mmol/L dNTPs 2.5 μL, Taq DNA聚合酶0.5 μL, 10×PCR Buffer (Mg2+Plus) 2.5 μL, DNA模板2 μL, 用去离子水补至25 μL 。反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃45 s, 55 ℃1 min, 72 ℃1 min, 30个循环;72 ℃ 10 min。

PPV的单相PCR 反应体系同PCV。反应条件: 94 ℃ 3 min;94 ℃、55 ℃、72 ℃各1 min, 35个循环;72 ℃ 10 min。

PRV的单相PCR 反应体系同PCV。反应条件: 94 ℃ 5 min;94 ℃、64 ℃、72 ℃各1 min, 35个循环;72 ℃ 10 min。

1.2.5 多重PCR扩增

PCR反应条件的确定:引物用量分别采用5, 10, 20, 40 pmol/L。退火温度分别选择55, 57, 60, 62, 70 ℃。单相扩增中模板用量分别选取1 , 2 μL;双模板扩增PCV/PRV、PCV/PPV、PRV/PPV 的模板用量分别选择0.5, 1 μL;多重PCR中PCV/PRV /PPV模板用量分别采用0.5 μL/0.5 μL/0.5 μL, 0.5 μL/1 μL/1 μL, 1 μL/1 μL/1 μL, 2 μL/2 μL/2 μL。

特异性试验:将1.1.1中所述病毒以不同形式混合, 利用多重PCR 对混合的病毒及无病毒感染细胞进行检测。

重复性试验:以建立的多重PCR方法对3株病毒重复检测3次, 以验证结果的可靠性。

PCR 产物的电泳鉴定:分别取单相及多重PCR 产物各4 μL 与2 μL 凝胶加样缓冲液混合, 以混有EB 的琼脂糖凝胶在0.5倍TAE 电极缓冲液中100 V/50 mA 电泳50 min, 在紫外凝胶成像系统中观察结果。

2 结果

2.1 单相PCR扩增结果

以作者设计并合成的3对引物分别对病毒模板DNA进行PCR扩增, 扩增出的片段分别为PCV 489 bp、PRV 219 bp、PPV 158 bp (见图1) 。

1.DL2 000 Marker;2.PCV;3.PPV;4.PRV。

2.2 多重PCR反应条件的确定

试验确定了反应条件:引物用量为PCV 20 pmol、PPV 20 pmol、PRV 10 pmol时均可出现清晰条带;退火温度在57 ℃时扩增效果较好 (见图2) ;模板用量在PCV/PRV /PPV为1 μL/1 μL /1 μL时条带较清晰 (见图3) 。在此条件下, 多重PCR 以如下反应程序为佳:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s, 57 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 32个循环;72 ℃ 10 min。

1.DL2 000 Marker;2.57 ℃ ;3.60 ℃;4.62 ℃;5.70 ℃;6.55 ℃。

1.DL 2 000 Marker;2.0.5 μL /0.5 μL /0.5 μL;3.0.5 μL /1 μL /1 μL; 4.1 μL /1 μL /1 μL;5.2 μL /2 μL /2 μL。

2.3 多重PCR特异性试验结果

采用试验所建立的多重PCR体系将PCV分离株、PRV 闽A株HK2- RK2、PPV强毒株7909、CSFV石门系强毒株F114、NDV F48E9、IBDV BC6/85的模板进行人为混合后扩增, 结果在含有PCV、PPV和PRV的核酸样品中成功扩增出493 bp ( PCV) 、219 bp ( PPV) 及158 bp (PRV) 的目的片段, 不含有此3种核酸的样品中未见条带出现 (见图4) 。

1.DL 2 000 Marker;2.PCV/CSFV;3.PCV/PPV/CSFV;4.PPV/NDV;5.PRV/IBDV;6.PPV/CSFV/PRV;7.PCV/PRV/IBDV;8.PCV/PRV/PPV;9.PK-15。

2.4 重复性试验

重复检测PCV、PPV和PRV的核酸样品, 结果均一致。

3 讨论

(1) 试验在进行PCV、PRV及PPV单项PCR扩增的基础上, 通过对病毒引物、模板用量及反应温度的筛选, 建立了快速、特异的PCV、PRV及PPV多重PCR鉴别诊断方法。

(2) 试验所设计的引物与靶序列的同源性高, 引物长度在18～21 bp之间, GC含量在40%～65%之间, 引物浓度也很接近 (10 pmol/L和20 pmol/L) , 这些条件的界定保证了较高的扩增效率。

(3) 试验中PCV的目的片段比PRV和PPV条带清晰, 作者认为是优先扩增现象造成的。特异性试验结果表明, 试验建立的方法仍能准确、特异地检测出病毒核酸的存在。

(4) 在进行多重PCR时选择合适的退火温度十分重要。在选择温度时应选用三者都能扩增的温度范围, 同时也应兼顾扩增片段的大小。试验最终确定57 ℃作为多重PCR的退火温度。

参考文献

[1]OUARDANI M, WILSON L, JETTE R, et al.Multiplex PCR for de-tection and typing ofPorcine circoviruses[J].Journal of Clinical Mi-crobiology, 1999, 37 (12) :3917-3924.

[2] HARDING M J, ISABELLE P H, JERZY R.Specificity and nucleotyping studies of a gpS0-based polymerase chain reaction assay for detection of Pseudorabies virus[J].Can J Vet Res , 1997, 6l:157-160.

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