Ⅱ型猪圆环病毒病研究

Ⅱ型猪圆环病毒病研究（精选3篇）

Ⅱ型猪圆环病毒病研究 篇1

猪圆环病毒病是近几年新发现的一种猪的传染病, 由猪圆环病毒 (Porcine Circovirus, PCV2) 引起猪的一种多系统功能障碍性疾病。该病原体已被确认为圆环病毒 (PCV2) , 研究表明, Ⅱ型猪圆环病毒 (PCV2) 不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合症 (PMWS) 的病原, 而且能够引起多种猪病, 主要有PMWS、猪皮炎及肾病综合征、猪增生性坏死性肺炎、猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪细小病毒、传染性先天性震颤等均与PCV2感染有重要关联。随着规模化养殖业的不断发展, 由PCV2引起的疫病呈上升趋势, 给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。本文从病原特性、流行病学、临床症状、病理变化、诊断及防制措施研究等几方面进行了综述。

1 病原学特性

Ⅱ型猪圆环病毒 (PCV2) 属于圆环病毒科, 圆环病毒属, 是已知动物病毒中最小的病毒, 无囊膜, 直径17～22 nm, 含有1.76～2.3 kb的单链环状DNA, 相对分子质量58 ku, 沉降系数为52S, 氯化铯中的浮密度为1.37 g/mL。根据PCV2的致病性、抗原性及核苷酸序列, 将其分为PCV1和PCV2两个型, 其中PCV1无致病性, 广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系。PCV2则具有致病性, 在临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS) 。PCV2对酸性环境 (PH3) 、氯仿或者高温 (56 ℃和70 ℃) 有抵抗作用。PCV2在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞上不生长, 可在PK-15细胞中生长, 但不引起细胞病变, 且需将PCV2盲传多代才能使病毒有效增殖。在接种PCV2的PK-15细胞培养物中加入d-氨基葡萄糖, 可促进PCV2复制, 使得感染PCV2的细胞数量提高30%。感染PCV2的细胞内含有许多胞浆内包涵体, 少数感染细胞内含有核内包涵体。

2 流行病学

在我国, 虽然近几年来才对猪圆环病毒引起重视, 但是, 对于猪血清中猪圆环病毒Ⅱ型 (PCV2-2) 抗体所做的回顾性检测以及对猪组织样本所做的回顾性检测结果表明PCV2抗体至少从1969年起就已经存在于猪群中了。

2.1 易感动物

本病主要侵害断奶后仔猪, 哺乳猪很少发病, 如果在采取早期断奶的猪场, 10～14日龄断奶猪亦可发病, 一般本病集中于断奶后2～3周龄的仔猪。

2.2 传染源

该病毒分布广, 猪群中血清阳性率常达20%～80%, 病毒可随粪便、鼻腔分泌物排出体外。

2.3 传播途径

本病可通过消化道感染, 胎盘垂直感染可能性存在。

2.4 流行性

发病率与死亡率不定、呈地方流行性时, 发病率死亡率较低;特别是猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRV) 、细小病毒 (PPV) 、猪肺炎支原体 (MH) 、多杀性巴氏杆菌 (PM) , 败血型链球菌 (DM) 等混合感染时, 促进本病的发生流行, 在我国北京、山东、河南、山西、湖北、湖南、广西, 东北等地均有案例报道。

3 临床症状

与圆环病毒Ⅱ型感染有关的猪病主要有以下5种疾病, 其临床表现如下:

3.1 仔猪断奶后多系统衰竭综合征

断乳后全身多系统衰竭综合征PMWS主要影响6～8周龄的猪, 很少影响吮乳的猪。临床上表现为多系统进行性功能衰弱为特征的症状, 生长发育不良, 渐进性消瘦, 体重减轻, 皮肤与可视粘膜苍白或黄疸, 贫血, 肌肉萎缩、衰弱无力, 呼吸困难、呼吸过速, 一些不常见的症状有下痢、咳嗽和中枢神经系统紊乱。一般而言, 患病猪临床表现为发热、精神不振、被毛粗乱、皮肤苍白、进行性消瘦、发育障碍, 而且表现以咳嗽、喷嚏、呼吸加快及呼吸困难为特征的呼吸器官障碍。体表淋巴结, 特别是腹股沟淋巴结肿大, 部分病例可见皮肤、可视粘膜黄疸, 下痢, 嗜睡。另一个特征就是猪群的死亡率增加。约20%的猪咳嗽、喷嚏、呼吸困难, 死亡率约为8%～35%, 10%～20%猪皮肤和可视粘膜可见黄疸。由于细菌、病毒的二重感染, 常常使PMWS的症状复杂化、严重化。临床上约有20%的病猪呈现贫血与黄疸症状, 具有诊断意义。

3.2 猪皮炎和肾病综合征

病猪发热、不食、消瘦、苍白、跛行、结膜炎、腹泻等。特征性症状是会阴部、四肢、胸腹部及耳朵等处的皮肤上出现圆形或不规则形的红紫色病变斑点或斑块, 有时这些斑块相互融合成条带状, 不易消失。

3.3 母猪繁殖障碍

发病母猪主要表现为体温升高达41～42 ℃, 食欲减退, 出现流产、产死胎、弱仔、木乃伊胎。病后母猪受胎率低或不孕, 断奶前仔猪死亡率上升达11%。

3.4 猪间质性肺炎

临床上主要表现为猪呼吸道病综合症, 多见于保育期和育肥期的猪, 咳嗽、流鼻液、呼吸加快、精神沉郁、食欲不振、生长缓慢。

3.5 传染性先天性震颤

传染性先天性震颤的临床变化很大, 其震颤为从轻度到重度。在出生后第1周, 严重的震颤可因不能吃奶而死亡, 活1周的仔猪可以存活下来, 但多数在3周时间恢复。震颤为双侧, 影响骨骼肌肉, 当卧下或睡觉时震颤消失, 外界刺激可引发或加重震颤, 如声音或温度刺激;有的在整个生长和发育期间都不断发生震颤。主要是母猪在怀孕阶段感染了病毒。PCV2病毒通过胎盘感染胎儿的可能性很小, 或者感染发生在胎儿免疫功能形成以前。曾有人报道, 母猪在不同的怀孕阶段感染类似PCV2病毒时, 可引起震颤发生。

此外, 在临床上还能见到与圆环病毒Ⅱ型相关的中枢神经系统疾病、肠炎和关节炎等。这些情况多见于蓝耳病阳性猪场继发感染所致。实践证明, 圆环病毒病与蓝耳病同时流行的猪场, 其哺乳仔猪和育肥猪的死亡率明显高于单个感染猪场。

4 病理变化

最显著的剖检病变是全身淋巴结, 特别是腹股沟淋巴结、纵隔淋巴结、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结及颈下淋巴结肿大2～5倍, 有时可达10倍。切面硬度增加, 可见均匀的白色。有的淋巴结有出血。在发生细菌感染时, 淋巴结则可见到炎症和化脓性病变。肺脏肿胀、坚硬或似橡皮;部分病例形成固化、致密的病灶。半数病例的肝脏肉眼观察呈不同程度的花斑状, 为轻度到中度的肝萎缩。肝小叶间结缔组织增生明显, 严重病例的肝小叶, 结缔组织非常明显。严重病例肺泡出血, 颜色加深, 整个肺呈紫褐色, 有的肺尖叶和心叶萎缩或实质性病变。脾脏常肿大, 呈肉样变化。花斑肾, 肾脏水肿, 呈灰白色, 被膜下有时有白色坏死灶。胃的食管部黏膜水肿和非出血性溃疡。回肠和结肠段肠壁变薄, 盲肠和结肠黏膜充血和出血。另外, 由继发感染引起的胸膜炎、腹膜炎、心包炎 (心包膜内有大量炎性渗出物) 和关节炎也经常见到。

5 诊 断

对PCV2感染的诊断可以通过原代猪肾细胞或猪肾细胞株培养分离病毒, 利用免疫染色确定病毒的存在。检测到PCV2抗体水平提高也说明最近受到感染。对先天性震颤排除遗传性和化学原因引起的震颤外, 可以通过临床症状进行诊断。

5.1 临床诊断

PMWS的临床症状具有特征性, 有较高的诊断价值。在有PMWS发病史的养猪场挑选出具有发育不良、皮肤苍白及腹股沟淋巴结肿大症状的仔猪, 进行病理检查、PCV2抗原及核酸检验, 结果所有仔猪都患有PMWS。传染性先天性震颤的震颤为从轻度到重度。在出生后第1周, 严重的震颤可因不能吃奶而死亡, 活1周的仔猪可以存活下来, 但多数在3周时间恢复。震颤为双侧, 影响骨骼肌肉, 当卧下或睡觉时震颤消失, 外界刺激可引发或加重震颤, 如声音或温度刺激;有的在整个生长和发育期间都不断发生震颤。

5.2 病理学诊断

当发现全身淋巴结肿大, 肺退化不全或形成固化、致密病灶时, 应疑为本病。病理组织学检查可见全身淋巴组织的淋巴细胞减少, 单核吞噬细胞类细胞浸润及形成多核巨细胞, 如在这些细胞中观察到嗜碱性或两性染色的细胞质内包涵体, 则基本可以确诊。

5.3 病毒分离及电镜观察

将病料制成100 g/L的组织悬液, 加青霉素 (100 IU/mL) 、链霉素 (100 μg/mL) , 4 ℃ 3 000 r/min离心20 min, 取上清液接种于Dulac细胞。接种后6 h用300 mmol/L D-葡萄糖胺37 ℃处理30 min, 再培养72～96 h, 将增殖病毒的细胞冻融3次, 收集细胞病毒液, 用细胞病毒液再接种细胞传代6次。第6代细胞病毒液反复冻融3次, 按5 g/L加Trition114, 37 ℃处理30 min, 10 000g离心30 min, 弃沉淀;将上清液加入盛有300 g/L蔗糖垫的离心管中, 15 000g离心3 h;弃上清, 用0.01 m mol/L pH8.0的TE缓冲液重悬并收集病毒, 乙酸双氧铀负染色后电镜观察。

5.4 间接免疫过氧化物酶技术

将PK-15细胞在96孔微量培养板上长成单层后, 加入10倍稀释的待检猪血清, 作用一定时间后吸干洗涤, 每孔加入50 uL 1000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG, 30 ℃孵育15 min, 吸干洗涤后加入50 uL底物溶液, 然后终止反应。用显微镜读取结果, 如观察到棕色感染细胞即为阳性。

5.5 实验室诊断

(1) 病毒的分子鉴定:

已经建立了许多诊断 PCV2的 PCR 方法和原位杂交试验方法。研究发现在病毒的反应链上设计引物所建立的原位杂交试验方法比在病毒的正链上设计引物所建立的方法敏感。

(2) 病毒的抗原鉴定:

最常用于病毒抗原鉴定的方法是间接免疫荧光试验 (IIF) 、免疫组织化学试验。通过单克隆抗体的应用, 可以对PCV2进行型特异性鉴定。

(3) 病毒的血清学检测:

己经建立了用于血清学检测的ELISA方法和免疫荧光抗体检测方法。由于 PCV1和 PCV2 之间存在抗原交叉反应, 因此己有的方法不能完全区分PCV1 和PCV2, 需要制备特异性的单克隆抗体, 或者特异性的重组抗原来满足建立特异性血清学方法的需要。根据临床症状、病理变化、流行病学, 可以作出初步诊断, 确诊依赖病毒分离和鉴定, 还可应用免疫荧光或原位核酸杂交进行诊断。

6 防治措施

6.1 预防措施

(1) 实施严格的生物安全措施。

防止PCV2和使其感染恶化的二重因子, 特别是细菌、支原体及其他病毒侵入猪群。对早期发现疑似感染猪进行检查、隔离、淘汰。避免从疫区引进猪只, 严格控制来访者、车辆、货物进入猪场。同时还要避免其它动物接近猪场, 对老鼠和飞鸟也要进行严格控制。PCV2是没有囊膜的DNA病毒, 和环病毒科的其他病毒一样, 对理化因素也有较强的抵抗能力, 猪场应定期使用有效的消毒剂进行消毒。

(2) 购入种猪要严格检疫, 隔离观察。

隔离饲养1个月, 健康者方可进入猪场生产区。

(3) 严格实行“全进全出”制度, 落实生物安全各项措施。

猪舍要清洁卫生保温, 通风良好, 降低氨气及有害气体的浓度;饲养密度要适中, 不同日龄的猪只应分群饲养不要混养;减少各种应激因素, 创造一个良好的饲养环境。

(4) 定期消毒。

杀死病原体, 切断传播途径。建独立的粪尿排放系统, 粪尿要发酵处理。生产中应用3%的火碱溶液、0.3%的过氧乙酸溶液及0.5%的强力消毒灵和抗毒威消毒效果良好。

(5) 药物预防控制发病及继发感染。

①妊娠母猪:产前7 d与产后7 d, 按1 t饲料中加入80%支原净125 g、15%金霉素2.5 kg、阿莫西林150 g, 拌料均匀, 连喂15 d。②哺乳仔猪:1日龄、7日龄和断奶时各肌注1次速解灵 (头孢噻呋500 mg/mL, 每次0.2 mL/头) 。③断奶仔猪:1 t饲料中加80%支原净50 g、15%金霉素150 g (强力霉素150 g) 、阿莫西林150 g, 拌料混匀, 连喂15 d。也可在每千克日粮中添加支原净50 mg、强力霉素50 mg、阿莫西林50 mg, 拌匀后喂饲, 连用7 d, 同时在饲料中注意适当的添加电解质和维生素B12、维生素C等。

(6) 帮助仔猪过好断奶关。

仔猪断奶时易发生心理应激、环境应激和营养应激, 所以仔猪28日龄断奶时, 母猪下床, 仔猪应留在原产床上停留5 d, 并给予优质全价饲料料中拌入药物, 以降低其应激反应。断奶时以原窝仔猪组群, 不要与其他窝仔猪混群、合栏, 以免仔猪相互咬架、打斗, 造成应激。保育猪舍要保温通风, 温度不能与产房舍温度相差过大, 否则易造成仔猪发生死亡。

(7) 发生该病时应采取的措施。

发生该病时要清除病猪, 全群疫苗, 淘汰阳性猪。添加药物, 控制疫情。全面消毒, 改善饲养环境温度, 减少各种应激因素, 加强营养和饲养管理, 防止继发其他疫的发生。

(8) 提高猪群机体抗病力。

疫情严重的猪场可取猪圆环病毒病感染病猪含毒较多的脏器, 如淋巴结、肺、脾等组织, 捣碎研磨灭活后制成组织灭活苗, 给全场猪只进行免疫注射, 注射后12～15 d可使新发病例减少, 并使疫情逐渐平息。

6.2 治疗措施

(1) 治疗方案:

①对于刚断奶仔猪的腹泻, 消化不良、消瘦、皮肤苍白机体衰弱, 免疫功能低下者, 建议用“重症王”或“清开灵”注射, 同时配合红酒酵母多糖、板蓝根或大青叶浓缩提取物等拌料或饮水、并配合“氟苯尼考油乳剂”注射, 连用3 d。②对疑似混合感染猪附红细菌体、弓形体、肺炎支原体 (MH) 、多杀性巴氏杆菌 (PM) 、败血型链球菌 (DM) , 这种情况下用黄芪多糖、甘草浸粉拌料。同时注射方通精典 (高效复方六甲氧) +威利宁。③在以上两种情况混合感染时, 我们建议在以上①+②的基础上再加入VС磷酸酯镁、复合VB等饮水或拌料连用5～7 d, 同时配合补铁, 生血的药物促进本病的康复。间隔1周, 再重复1次即可。并配合氟苯尼考油乳剂注射, 连用3 d。

(2) 目前尚无特效的治疗方法:

应早发现、早确诊、早治疗。根据不同的临床症状应用抗病毒与抗生素及磺胺类药物进行对症治疗, 以控制继发感染, 减少死亡。如应用金刚烷、支原净、卡那霉素、强力霉素、庆大霉素、磺胺嘧啶钠、庆增安、炎康注射液等治疗, 肌注维生素B12、维生素C、肌肝和静注葡萄糖注射液等有一定的治疗效果。

7 小 结

PCV2作为一种新发现的病毒, 与其有关的疾病已经成为世界养猪业的重要传染病, 给养猪业带来巨大的经济损失。尽管世界许多实验室对PPV和PRRSV与PCV2在致病方面的协同机制, 该病毒对其所导致的各种疾病及PMWS的人工复制等方面进行了大量的研究, 使我们获得了大量的相关知识, 但我们对其分子生物学特性、病毒对动物免疫系统的影响、致病机理、有效的预防和控制该病毒引发的各种疾病, 以及一些潜在的问题等方面缺乏全面而系统的了解。因此, 还必须对这些方面进行更详细、更深层的研究。由于该病毒较广泛的存在于猪体内, 与猪的健康密切相关, 尤其是考虑可能用猪的器官进行人的异体移植时, 更应当进一步加强对此病原体的研究。另外, 目前国内关于PCV2的分子生物学和基因工程方面的研究鲜有报道, 这也给国内的兽医科技工作者提出了一个新的课题。但我们相信, 通过对PCV2更深入的研究, 将最终会发现一种有效的疫苗来预防此病, 这对降低全球养猪业的经济损失起着很重要的作用。

Ⅱ型猪圆环病毒病研究 篇2

目前PCV2及其相关猪病已在全世界范围内发生和流行, 给世界养猪业造成了巨大的经济损失。随着国内外学者对PCV2研究的不断深入, 很多学者认为诊断PCV2必须要从临床症状、显微病变和病变组织的抗原检测3个方面进行确认, 这3条不能单独作为诊断猪圆环病毒病的参考标准。由此可见, 猪圆环病毒病的病理组织学的研究显得非常重要和必要。本文的目的是综述PCV2引起的多种器官病理组织学损伤, 并比较各种检测方法。

1 临床症状

PCV2感染后主要表现为PMWS[3]。病毒感染宿主多种器官系统, 感染猪体重降低, 消瘦, 呼吸困难, 腹泻, 黄疸, 咳嗽, 发热, 中枢神经症状, 严重者甚至突然死亡。由于这些临床症状不止出现在断奶仔猪也出现在育成猪, 故PCV2引起的疾病被称为PCV疾病 (PCV disease, PCVD) 或PCV相关疾病 (PCV-associated disease, PCVAD) [4]。

淋巴结肿大是典型的临床症状, 患猪常见呼吸系统疾病。此外, PCVAD也可能引起肠病, 主要见于育成猪, 表现为因胞内劳森氏菌或沙门氏菌继发感染引起的结肠炎。猪皮炎肾病综合征 (Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS) 也与PCV2感染有关, 常发生于无PCV2疫苗接种的猪群, 临床表现为急性皮肤损伤, 受损皮肤凸起, 呈紫色, 发展为多点凸起的红色病灶, 中心呈黑色, 多见于后腿, 患猪发热, 嗜睡, 病程结果通常是死亡。个别病例出现繁殖障碍, 患猪流产率、死胎率、木乃伊胎数量增加及断奶前死亡率增加。

2 病理组织学变化

PCVAD多影响多个器官系统, 也偶见单一系统受损。疾病的确诊常依赖于多器官、多系统的全身性检查。

2.1淋巴系统特征性病变为:扁桃体、脾脏、派氏结和淋巴结等淋巴器官出现肉芽肿性炎症。淋巴组织受损程度因感染程度不同而有差异。通过免疫组织化学法研究发现, 患猪淋巴结变化分为以下3个阶段。.

初期阶段:B细胞依赖的淋巴滤泡区轻微萎缩, B淋巴细胞减少, 主要为Ig M+ B细胞减少, 滤泡间质树突状细胞和并指状细胞数量也减少;滤泡旁区T淋巴细胞开始减少, 单核细胞和巨噬细胞无明显变化;在淋巴结滤泡中心可看到少量组织细胞和多核细胞渗透。

中期阶段:B淋巴细胞依赖区的淋巴滤泡衰竭加重, B细胞大量减少, T细胞依赖区 (旁淋巴滤泡和副皮质区) 也开始萎缩, 淋巴细胞继续减少, 滤泡间有少量的树突状细胞和并指状细胞, 组织细胞浸润滤泡区和旁滤泡区, 髓样组织区增大, 巨噬细胞数量增多, 抗原递呈细胞局部减少或组织分布改变, 但仍以淋巴区占优势。

后期阶段:淋巴滤泡区减少或缺失, 淋巴细胞衰竭, 大量淋巴细胞浸润髓样组织, 组织细胞内含大量包涵体, 髓样组织占优势。

PCV2感染引起的淋巴细胞缺失, 曾被怀疑与细胞凋亡有关, 但后续研究否定了这一点。此外, 坏死性淋巴结炎也与PCV2感染有关[6], 主要表现为淋巴滤泡中心坏死, 坏死灶中可检测到PCV2。一些病例中, 病猪所有淋巴组织受损, 而一些病例中可能仅有个别淋巴组织受损。因此临床病例中有必要对淋巴组织进行全面检查。但是, 值得注意的是PCV2亚临床感染也引起淋巴缺失。

2.2呼吸系统PCV2感染引起间质性肺炎和细支气管炎[7], 细支气管纤维增生, 个别病例中可见气道上皮细胞完全脱落, 黏膜层或黏膜下层纤维化增生, 淋巴组织细胞弥漫性浸润。某些患猪支气管上皮细胞中可见PCV2阳性的胞浆内葡萄状包涵体。感染PCV2的胎猪和新生仔猪出现轻微的非化脓性间质性肺炎或支气管肺炎症状, 这可能是细菌继发感染的结果。

PCV2引起的呼吸系统损伤和其他呼吸病原共同感染或继发感染有关[8]。研究显示PCV2单独感染猪, 肺脏损伤几乎不可见。但PCV2和猪肺炎支原体联合感染, 感染后21~35 d可见细支气管增生。

2.3神经系统PCV2感染引起先天性颤抖, 研究证实患猪大脑血管周单核细胞浸润, 成纤维细胞样细胞、脑膜内皮细胞、脉络丛、大脑、小脑中均可检测到PCV2抗原[9]。但由于PCV2引起的神经损伤发生率相对较低, 相关试验数据相对较少, 临床上较低被重视。

2.4消化系统PCV2感染引起消化系统损伤, 通常和系统感染一并出现, 但也可能是PCV2感染的唯一表现。这对于及时识别病毒感染十分重要。

PCV2感染引起最常见的消化系统损伤是肉芽肿性肠炎, 以回肠黏膜层和黏膜下层出现数量增多的巨噬细胞和分散的多核巨细胞为特征, 也偶见于结肠和盲肠[10], 多伴有沙门氏菌继发感染引起的结肠炎。试验感染模型可重现这些症状。

PCVAD常出现胃溃疡[11], 受损胃黏膜中常可检测到PCV2, 但并不清楚是PCV2直接导致了损伤还是由于PCV2感染引起的继发感染而导致的损伤。

肝细胞是PCV2感染和复制的靶细胞[12]。PCV2引起的肝脏损伤, 主要表现为肝门区淋巴细胞浸润、肝细胞坏死、胞浆肿胀、空泡化及巨核化。肝损伤主要发生于无菌动物, 并引起其死亡, 但常规饲养的商品猪很少发生如此严重的肝脏损伤。

2.5泌尿系统PCV2感染引起的另一病理损伤为间质性肾炎。IHC证实这些病例中PCV2抗原的存在, 电镜也可见PCV2病毒颗粒的存在[13]。PCV2引起的肾脏损伤多是和其他病原共同感染或其他病原继发感染的结果。只用PCV2试验感染猪, 仅可见轻度肾盂炎和间质性肾炎, 并伴有病灶内淋巴组织细胞浸润。PCV2和PPV共同感染, 可见肾小管上皮坏死再生及小管周纤维增生。

2.6生殖系统目前没有关于PCV2引起的生殖系统显微病理损伤的相关报道, PCV2相关繁殖障碍猪的生殖器官和胎盘组织切片常表现正常[14]。也有研究显示PCV2和子宫内膜炎间没有相关性。自然感染PCV2公猪精囊中可检测到PCV2抗原和PCV2核酸;但是, 生殖系统没有明显炎症。基于已知数据, 一般认为PCV2引起的生殖系统损伤是偶发的, 不常见的。

2.7皮肤系统PCV2相关的大多数皮肤损伤是由于坏死性血管炎, 心血管系统切片也证明了这一点[15]。此外, PCV2相关皮肤损伤和渗出性皮炎及葡萄球菌共同感染相关[16]。试验感染CDCD猪, 其中42% (8/19) 可见严重的弥散性渗出性皮炎, 细菌培养试验显示葡萄球菌感染的存在。

2.8心血管系统PCV2感染的猪受损严重的器官可见严重的弥漫性淋巴组织细胞性和浆细胞性动脉周炎和动脉内膜炎[17]。动脉管壁内皮细胞和炎性细胞中可检测到PCV2抗原。研究证实PCV2感染的内皮细胞被活化, 细胞表面促凝血活性增加。而且, PCV2感染的内皮细胞用外源性凝血酶预处理, 病毒载量增加。PCVAD猪淋巴坏死可能与高内皮细胞小静脉肥大增生相关, 坏死性损伤也随着淋巴结内血管损伤, 血栓形成及滤泡坏死而发生。PCV2感染猪的肺脏组织中可见内皮细胞变性、血管周和血管内水肿、纤维素样坏死、血管炎、血管周炎和血栓[18]。PDNS病例出现的皮肤和肾脏损伤主要是因为真皮和皮下毛细血管坏死和中性血管炎、肾小球性肾炎, 并伴随血栓形成和周围组织梗死形成[15]。此外, PDNS血管损伤也出现在其他组织, 特别是肠系膜和脾脏。

PCV2感染引起胎猪及幼年猪心脏病变。4~7周龄猪自然感染PCV2可见心脏肥大 (特别是右侧心脏) 及心包渗出液。PCV2相关心肌炎是充血性格心脏衰竭的主要原因。病理切片可见心肌细胞肿胀或坏死, 心肌纤维化, 胞浆内含有丰富的PCV2抗原[17]。在胎儿中, PCV2相关的显微病变主要集中于心血管系统, 特别是心脏, 这已成为PCV2引起流产的诊断标准之一。通常心肌细胞坏死脱落, 甚至缺失, 被纤维结缔组织取代。此外, 出现心肌炎, 并伴有淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞不同程度浸润, 多核巨细胞也偶尔可见。心肌细胞内可见嗜碱性胞核内包涵体。通常, 这些损伤部位可检测到PCV2抗原。

基于文献中报道的PCV2相关心血管系统病理损伤, 包括PCV2在内皮细胞中的复制能力, 血管改变对于PCVAD病理学变化十分重要。因此, 应对心血管系统进行更深入研究。

2.9骨骼系统已经证实PCV2感染猪的骨髓中可检测到PCV2[19], 但髓系和红系细胞均正常存在并正常发育。目前没有直接证据证实PCV2感染可引起骨和软骨直接损伤。

2.10肌肉系统PCR已经证实PCV2 DNA存在于感染猪的皮肤肌肉中, 且活体检验也证实具有传染性[19], 但并没有肌肉特异性的损伤被报道。很可能PCV2在肌肉系统中被检测到是由于PCV2引起的血管损伤, 而不是肌纤维损伤, 而且目前缺乏肌肉系统检测PCV2抗原的免疫组化数据。

2.11内分泌系统试验感染PCV2或PCV2/PPV联合感染, 试验动物胰腺、甲状腺和肾上腺可见PCV2相关肉芽肿性病理变化[20]。

3 PCV2亚型的影响

3.1 PCV2分类基于PCV2衣壳蛋白6氨基酸序列的差异, PCV2被进一步分为PCV2a和PCV2b[19]。这两种亚型间另一差异是病毒基因组长度不同, PCV2a为1 767个核苷酸, 而PCV2b为1 766个核苷酸。此外, 丹麦报道了PCV2c的存在[21]。中国报道了PCV2d和PCV2e的存在[22], 但由于采用的分类系统不同而存在争议。

3.2 PCV2a与PCV2b引起的损伤比较目前没有确切的证据证实PCV2a与PCV2b感染引起的病理损伤不同。临床病例中多是二者共同感染。近年来PCV2b的流行及PCV2a向PCV2b的转变, 使相关人员考虑是否PCV2b致病性更强。但是, 用单一PCV2亚型病毒进行试验感染或者PCV2/PRRSV共同感染的试验结果并不支持这一假说[23,24]。总之, PCV2a和PCV2b引起的组织学损伤并没有显著差异。

4 PCV2实验室诊断方法

PCVAD的系统诊断除了临床症状、病理学变化外, 其进一步确诊还需要借助实验室诊断技术。

4.1电镜法利用电镜技术可以直观、准确地鉴别病毒, 根据病毒本身所具有的形态、结构和大小等不同特征, 可即刻做出诊断。但该方法对仪器要求较高, 较难推广使用。

4.2组织学检测方法PCVAD系统诊断的组织学检测方法通常采用IHC或ISH。IHC可用特异性抗体检测组织中特异性抗原, ISH使用DNA或RNA特异性探针检测组织中特异性核酸序列。研究证实ISH结果更真实可信, 且更容易识别, 但在检测PCV2a或PCV2b的感染率方面没有差异。此外, 由于大多数实验室采用中性10%福尔马林固定组织, 多项研究显示固定时间越长, IHC信号越弱, ISH检测的病毒载量越低, 因此用于检测PCV2或其他病毒和核酸的组织样品不应被长期固定在福尔马林中[25]。

4.3血清学检测方法目前最常采用的是酶联免疫吸附试 验 (Enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA) , 此方法可以检测抗体, 也可以检测抗原, 具有灵敏、简单、快捷的特点。免疫过氧化物酶单层细胞试验 (Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA) 利用含有PCV的PK-15细胞可以检测血清中的抗体, 但由于需要细胞培养及其相关仪器, 对于技术要求较高。此外, 还有近年来兴起的免疫胶体金技术 (immune colloidal gold technique, ICGT) , 其原理是以微孔滤膜为载体, 以红色胶体金为标记物, 通过渗滤而逐步反应, 整个过程3~5 min即可完成。

但是, 用血清学检测方法确定疾病状态仍有待考量, 因为大多数猪群存在PCV2亚临床感染[26], 大多数猪血清学检测呈阳性。

4.4聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 是一种快速、简便、特异的诊断方法, 可直接检测病毒核酸。目前已报道的PCR方法有很多, 常用的有常规PCR、套式PCR、多重PCR、实时定量PCR等。PCR被广泛用于检测病毒, 确定猪各种组织及猪产品如精液中的病原体含量[27]。而且, 多种可以区分不同PCV2亚型的方法已经被建立, 并可以在大多数兽医诊断实验室实施。然而当解释检测结果时需要考虑很多可能的变量, 如提取方法, PCR方法如产物位置或引物序列, 定量标准, 样品类型和动物疾病状态。此外, 样品间交叉污染, 为了降低花费而采用的多样品检测, 均会影响结果。

4.5免疫荧光技术免疫荧光技术 (Immunofluorescence Assay, IFA) 可用于PCV的抗体检测及抗原组织定位的研究。通常将组织病料在PK-15细胞中培养, 再用抗PCV血清检测, 以对样品中PCV进行检测和分型。一般认为IFA是实验室检测PCV-2的一种快速、灵敏、成本低的方法, 但操作上较复杂, 不宜作为临床快速诊断。

4.6基因芯片检测技术基因芯片技术是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术DNA芯片技术检测疾病具有高通量、并行性和结果判读客观、准确和信息化的特点。据报道已建立了CSF-PRRS-PCV2诊断DNA芯片, 能同时检测PRRS、CSF和PCV2感染。

5 总结

Ⅱ型猪圆环病毒病研究 篇3

关键词：Ⅱ型猪圆环病毒,Cap蛋白,单克隆抗体

猪圆环病毒 (Porcine circovirus, PCV) 属于圆环病毒科圆环病毒属的成员, 无囊膜, 呈二十面体对称[1]。根据抗原性、致病性不同, PCV可以分为Ⅰ型圆环病毒 (PCV1) 和Ⅱ型圆环病毒 (PCV2) 两个血清型[2]。一般认为PCV1对猪没有致病性, PCV2对猪有致病性, 是猪断奶后多系统衰竭综合症 (post-weaning multisystemicc wasting syndrome, PMWS) 等疾病的病原。

PCV病毒核酸为单股DNA, 共价闭合, 呈环状。PCV2主要有2个大的开放读码框ORF1和ORF2, 其中ORF1编码病毒的复制蛋白, ORF2编码病毒主要的结构蛋白, 构成病毒的核衣壳, 是病毒的主要保护性抗原, PCV1和PCV2间无交叉反应[3]。哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室猪病分子诊断组通过基因工程重组菌NLS-Cap M15表达的Cap蛋白免疫小鼠, 制备抗Cap蛋白单抗, 为进一步研究Cap基因的功能和PCV2的检测方法奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

基因工程重组菌NLS-Cap M15、293T细胞、PCV2分离株PCV2-871、PK15细胞系、SP2/0骨髓瘤细胞、PCV阳性血清和阴性血清, 均为哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室猪病分子诊断组保存;雌性Balb/c小鼠, 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供;弗氏佐剂、HAT、HT混合盐, 购自Sigma公司;DMEM粉末, 购自Gibco公司;犊牛血清, 购自PAA公司;羊抗鼠二抗, 购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 PCV2-ORF2蛋白的表达以及纯化

表达重组蛋白的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达后, 用QIAGEN公司的Ni-NTA组氨酸的树脂进行纯化。

1.2.2 动物免疫

将纯化的Cap蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合并乳化后, 选取5只6周龄的雌性Balb/c小鼠进行, 第1次免疫, 按照100 μg/只的剂量, 于小鼠的腹部、颈部、背部皮下多点注射;间隔2周后进行第2次免疫, 将纯化Cap蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合后腹腔注射, 剂量同上;再间隔2周后进行第3次免疫, 方法、剂量同第2次免疫。第3次免疫10 d后断尾取血, 检测抗体。融合前3 d进行加强免疫, 腹腔注射不加佐剂的纯化后的蛋白100 μg/只。

1.2.3 细胞融合

无菌取加强免疫后的小鼠脾细胞, 与SP2/0骨髓瘤细胞按10∶1比例混合, 800 r/min离心10 min;弃上清液, 用PEG融合后缓慢加入无血清的基础细胞培养液, 1 000 r/min离心8 min; 弃上清液, 用HAT培养液重悬沉淀, 加入铺好饲养层细胞的96孔细胞培养板。

1.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选、克隆

以纯化的Cap蛋白包被ELISA板, 将同时诱导仅含有空载体的M15 大肠杆菌的产物作为阴性对照, 用方阵法确定最佳抗原包被量。选取阳性杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克隆。

1.2.5 单克隆抗体的特性鉴定

单克隆抗体的亚型鉴定:采用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents试剂盒 (Sigma) 进行抗体的亚型鉴定。操作步骤参见试剂盒说明书。

单克隆抗体腹水的制备: 采用12周龄的雌性Balb/c鼠, 按照0.5 mL/只的剂量腹腔注射灭菌的石蜡油, 7 d后将杂交瘤细胞以5×105个/只给小鼠腹腔注射, 待小鼠腹部膨大后抽取腹水, 离心后取上清液, 用间接ELISA法测定其效价。

Western-blot检测:将纯化的Cap蛋白和空载体细菌表达的蛋白经SDS-PAGE后, 经转膜仪将蛋白转至硝酸纤维素膜 (NC膜) 上;NC膜用5%的脱脂乳4 ℃封闭过夜, 以制备的腹水为一抗37 ℃孵育1 h;以HRP-羊抗鼠IgG为二抗37 ℃孵育1 h;DAB显色液显色10 min, 进行Western-blot检测。

间接免疫荧光试验:将猪圆环病毒与PK-15细胞混合培养, 48 h后用300 mmol/L的D-氨基葡萄糖处理15 min, 继续培养直至长成单层细胞。将胰酶消化后的细胞铺在载玻片上, 然后用致冷的丙酮固定15 min;将PCV阳性血清、阴性血清和制备的腹水单克隆抗体稀释后滴在固定的细胞上, 37 ℃孵育1 h;PBST洗涤3次, 加入FITC标记的羊抗鼠IgG, 37 ℃ 作用45 min;PBST洗涤3次, 置荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 表达蛋白的纯化结果

将原核表达的Cap蛋白进行纯化, SDA-PAGE检测蛋白纯化, 结果见图1。纯化蛋白的浓度为1.2 mg/mL。

M.蛋白质质量标准;1.表达蛋白阴性对照;2.表达蛋白粗产品;3.纯化的Cap蛋白。

2.2 杂交瘤细胞的筛选结果

采用间接ELISA方法检测细胞培养上清液, 共获得3株单抗, 分别命名为2F3、2C3、1E10。

2.3 抗体亚型的鉴定结果

应用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定获得的3株单克隆抗体, 2F3、2C3均为IgG1亚型, 1E10为IgG2a亚型, 轻链都是κ型。

2.4 单克隆抗体腹水效价的测定结果

用间接ELISA方法检测小鼠腹水效价, 2F3、2C3、1E10的腹水效价均可达1.0×105。

2.5 Western-blot检测

筛选的3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可以与Cap蛋白反应, Western-blot检测结果见图2。

M.蛋白质质量标准; 1. 2C3; 2. 2F3; 3.1E10; 4.SP2/0。

2.6 单克隆抗体的间接免疫荧光试验结果

PCV感染的PK-15细胞有绿色荧光的为阳性, 无绿色荧光的为阴性。这3株单克隆抗体均可以与PCV2感染的PK-15细胞反应, 结果见图3。

a.阳性对照;b.阴性对照;c.2F3;d.2C3;e.1E10。

3 讨论

PCV2不但引起猪断奶后多系统衰竭综合征, 而且还可以引起猪皮炎和肾病综合征、呼吸道疾病综合征等疾病[4], 而且常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒等病原体混合感染[5]。在我国, 郎洪武等[6]采集了7个省市22个猪群的559份血清, 用ELISA方法进行检测, 结果PCV2抗体阳性率为42.9%。PCV2的感染已给我国的养猪业造成了很大的经济损失, 目前仍然缺少适合现地检测的快速诊断方法。

PCV ORF2基因编码产物N端有41个氨基酸组成的核定位信号肽, 这段信号肽还有很多稀有密码子, 使原核表达的量很低。哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室猪病分子诊断组构建表达的ORF2蛋白去掉了核定位信号肽, 有利于蛋白大量的表达以及确保纯化蛋白的量[7]。

PCV2-ORF2蛋白是病毒的主要结构蛋白, 是病毒刺激机体产生抗体的主要抗原位点。研究以具有免疫原性的PCV2-ORF2蛋白为免疫原制备了3株单克隆抗体。Western-blot检测结果表明, 3株单克隆抗体均能特异地识别26 ku的融合蛋白, 说明所制备的单克隆抗体的特异性较好。间接免疫荧光试验结果表明, 3株单克隆抗体均可以与PCV2反应, 为进一步研究PCV2的快速、简便的诊断方法奠定了基础。

参考文献

[1]殷震, 刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社, 1997:1180-1181.

[2]BRIAN M, McNEILLY F, TODD D.Characterization of novel Cir-covirus DNA associated with wasting syndromes in pigs[J].J Gen Virol, 1998, 79:2171-2179.

[3]WANG X W, JIANG W M, JIANG P, et al.Construction and im-munogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid pro-tein of Porcine circovirus2 (PCV2) in mice[J].Vaccine, 2006, 24:3374-3380.

[4]JOAQUIMS, CARLES R, MARIANO D.Pathological findings as-sociated with naturally acquired Porcine circovirus type2associated disease[J].Veterinary Microbiology, 2004, (98) :137-149.

[5]ELLIS J, CLARK E, HAINES D, et al.Porcine circovirus-2and cocurrent infections in the field[J].Veterinary Microbiology, 2004, (98) :159-163.

[6]郎洪武, 张广川, 吴发权, 等.断奶猪多系统衰竭综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技, 2000, 30 (3) :3-5.