口蹄疫诊断技术研究（精选8篇）
口蹄疫诊断技术研究 篇1
口蹄疫 (Foot and mouth disease, FMD) 是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病, 是目前影响动物健康的重要疫病之一, 世界大部分地区均有发生, 常在牛群及猪群大范围流行。此病的致死率很低, 但是感染率很高。FMD的大规模流行, 会给农牧业生产造成极大的危害, 并波及到市场上毛、皮、肉、奶的供应以及以毛、皮、肉、奶为原料的食品加工业和轻工业, 给畜牧业和进出口贸易造成巨大的经济损失, 直接威胁着国家声誉和人类食品卫生安全, 因而受到国内外的普遍关注。世界动物卫生组织 (OIE) 将该病列为A类家畜传染病之首。口蹄疫病毒 (Foot and mouth disease virus, FMDV) 为单股、正链RNA, 约有8 500 个核苷酸, 病毒衣壳由4种结构蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成, 其中VP1 和VP3 是主要的免疫性抗原。该病毒共有7 个血清型分别为O、 A、 C、 SAT1、SAT2、SAT3 和Asia1 型, 每个型又可以进一步分为亚型。由于不断发生抗原漂移, 因此并不能严格区分亚型。FMD在世界各地几乎都被列为必须申报的疾病, 诊断只能在指定的实验室进行。送检样品包括水泡液、剥落的水泡、抗凝血或血清等。死亡动物可采集淋巴结、扁桃体及心脏。样品应冰冻保存, 或置p H 7.6的甘油缓冲液中保存[1]。FMD的有效控制关键在于早期检测, 然而有很多疾病症状与FMD相似, 仅靠临床症状难以确诊, 因此必须进行实验室诊断[2]。现就目前常用的诊断方法作以综述。
1 传统的病原学诊断方法
病毒分离技术是检测FMDV的黄金标准, 主要有细胞培养和动物接种两种方法[3]。
1.1 细胞培养病毒检测FMDV最初用的细胞是单层原代猪肾细胞, 后来随着细胞培养系统的不断增多, 有许多细胞都可用于FMDV的分离。其中初代小牛甲状腺 (CYT) 细胞分离FMDV时特别敏感, 此外还有小牛肾细胞、仓鼠肾细胞系BHK-21等。一些样品在经过长途运送后, 由于病料受到各种因素的影响, 可能只有少量的感染病毒存活, CYT细胞在检测这种病料时具有特殊的价值。目前许多实验室都将CYT细胞和IB-RS-2培养细胞 (猪肾细胞系) 作为分离FMDV的常规细胞。这两种细胞系可将FMDV和SVDV (猪水泡病病毒) 区分开, 因为FMDV可在这2 种细胞上生长, 且有相似的细胞病变, 而SVDV只能在IB-RS-2细胞上生长。
1.2 动物接种试验动物接种常用乳鼠进行, 通常情况下进行病毒分离需要用8~10只小鼠, 以便于观察接种鼠的死亡情况和获得足够多的抗原, 并在进行补体结合试验时需要获得明显的阳性结果。当致病性毒株非常重要时, 也可用牛等动物来分离FMDV[4]。
2 血清学诊断技术
血清学诊断技术主要包括补体结合试验、中和试验、凝集试验和ELISA等。
2.1 补体结合试验1952 年Brooksby建立了补体结合试验, 它是最早标准化的检测方法, 成功地用于FMDV分型鉴定, 一直被世界参考实验室和FMD研究或定型中心应用至今[5]。在有补体存在的条件下, 溶血素能溶解红细胞, 这三者构成的溶血系统在补体结合试验中起显示作用。该方法可鉴定抗原 (水泡皮、水泡液、鼠组织毒, 而细胞毒需浓缩后方可检测) , 亦可鉴定抗体, 并可进行定量测定。一般用常量补体结合试验为待检血清定型, 微量补体结合试验用于亚型和毒株抗原差异分析。
2.2 病毒中和试验中和试验也称血清中和试验, 该方法是最经典和最具权威性的FMDV检测方法。20世纪70年代末期, Rweyemamu等[6]建立中和试验。中和试验是利用血清中和抗体与病毒的特异中和作用, 使病毒对易感动物和敏感细胞失去感染能力的原理建立的。根据接种病毒——血清混合物的动物发病死亡数或产生细胞病变的细胞管数来判定血清中所含抗体的量和型别。检测病毒——血清混合物的方法有乳鼠中和试验、细胞中和试验、微量细胞中和试验和空斑减少中和试验。中和试验既可定性又可定量, 国际检疫条款规定用此法判定进出境动物是否感染或携带FMDV。
2.3 凝集试验
2.3.1 正向间接血凝试验是当前最为快速、简便和经济的检测血清方法[7]。是将灭活的各型FMDV致敏绵羊红细胞制备的诊断试剂, 当其遇到相应型的血清时即可发生红细胞凝集现象。可检测出猪和牛发病后10~150 d的血清抗体。其灵敏度高于中和试验和琼脂扩散试验, 但缺点是不同批号的产品效价有波动。
2.3.2反向间接血凝试验是将各型血清的Ig G致敏绵羊红细胞, 当其遇到相应型抗原时即可发生红细胞凝集现象, 这一方法和补体结合反应一样不能直接检测淋巴结和骨髓中的FMDV, 须经乳鼠传代增毒后再研磨鼠组织, 制成悬液, 然后离心测定上清液。
2.4酶联免疫吸附试验 (ELISA) ELISA试验检测FMDV具有特异、敏感、快速、简便和可靠性好等特点, 且能自动化操作, 并能迅速地检测大量样品, 在FMD的诊断中日益受到人们的重视, 现已成为国际上检测FMD的常规方法之一。
杨永钦等[8]建立了检测FMDV的斑点ELISA检测方法 (分为一步法和间接法) 结果证实, 用硝酸纤维素膜作固相载体, 很好地解决了在常规ELISA中使用的聚苯乙烯微量反应板对抗原或抗体包被不牢的缺点, 提高了诊断的准确性和可靠性, 而且可以制成方便携带的诊断膜, 应用更为方便, 而且操作简单, 缩短了试验周期, 完全可以在野外进行实地诊断检测, 在基层具有良好的推广前景, 但是由于一步法的操作更为简化, 敏感性稍有下降。杨永钦[9]还研制出用于检测FMDV的生物素-亲和素强化斑点ELISA试验方法, 用光敏素标记的纯化A蛋白代替第二抗体, 通过AP标记的亲和素检测生物素化抗体, 该法能检出微量抗体, 比常规ELISA更为敏感。Sorensen等建立了可检测FMD抗SAT1、SAT2、SAT3 血清型病毒抗体的生物素—亲和素系统阻断ELISA方法, 并与世界参考实验室的液相ELISA方法进行了比较, 结果证实, 该方法具有高特异性和灵敏性, 可作为抗体水平评估的一种精确可行的方法。
美国联合生物制药公司于2000年成功推出以合成肽为基础的FMD ELISA试剂盒, 目前已在世界多个国家和地区使用。该试剂盒是根据传统的ELISA方法设计的, 所不同的是采用的包被抗原是化学合成的非结构蛋白3B和结构蛋白VP1 中的抗原位点来取代传统的病毒抗原或生物合成抗原, 并可区分免疫抗体和感染抗体[10]。
De等研制出基于3ABC蛋白的间接捕获ELISA技术, 可区分野毒感染和疫苗毒感染。该方法具有良好的敏感性和特异性。3ABC抗原的抗体最早可于免疫后8 d测出, 并且抗体测出时间可长达至少1 年。此ELISA方法安全、经济。鉴于其优良特点, 可参与FMD根除运动和防控计划。Sorensen等[11]开发出以杆状病毒表达的抗原构建的ELISA方法, 可分别检测非结构蛋白3AB、3ABC、3D, 其中3AB、3ABC、3D ELISA均可检测FMDV的7 种血清型病毒抗体。3D-ELISA与检测结构蛋白的ELISA方法相比, 具有相当的特异性、准确性和敏感性, 他们同时也可证实3AB和3ABC-ELISA, 可在免疫后的畜群中判断是否存在野毒感染。Kweon等以杆状病毒表达的非结构蛋白3A为抗原, 以抗3A的单抗作为捕获抗体, 建立起间接捕获ELISA方法, 此方法与3ABC-I-ELISA相比, 具有较好的敏感性和特异性。
Cullough等建立了一种液相ELISA, 此ELISA比间接ELISA敏感6~8 倍, 在效能上与双夹心或抗原捕获ELISA相当, 可用于检测抗原抗体反应及杂交瘤细胞培养上清的检测。Hamblin等建立了用于检测FMDV抗体的液相阻断夹心ELISA, 该方法比病毒中和试验更敏感, 检出率更高。Oliver等将检测抗原的双抗体夹心ELISA与补体结合试验就检测抗原方面的效果进行了比较, 结果表明, ELISA方法比补体结合试验具有更高的敏感性。
Van建立了可检测A、O、C型FMDV的单抗介导的复合型捕获阻断ELISA方法, 在这个方法中, 同时应用2 个单抗分别针对抗原上不同的抗原决定簇, 有感染力的、未灭活的和灭活的FMDV都可以应用于此ELISA方法中。此ELISA方法和其他ELISA方法一样, 不仅敏感性好, 而且诊断快速, 可重复测定, 其在疫苗效力试验中对免疫应答水平的评估非常实用。Odonneu等应用3D蛋白开发出3D液相阻断夹心ELISA用于检测FMDV抗体。此ELISA可检测自然或实验室感染的A、O、C型FMD抗体, 感染后最早5 d即可测到抗体。此ELISA方法可用于检测病毒活性及对未感染FMDV动物的证实。
Mackay等建立起诊断FMD的固相竞争ELISA方法, 以灭活的纯化FMDV为抗原, 并在系统中应用了多克隆抗血清, 与液相阻断ELISA相比, 敏感性与液相阻断ELISA相当。Chenard等建立了一种简便的固相阻断ELISA检测O型FMDV所刺激而产生的抗体。用此方法对感染和未感染FMDV的牛、猪和羊进行了大量的血清田间试验, 结果证实, 特异性为96%, 对148份感染FMDV的猪、牛和羊的血清进行检测, 证实其敏感性大于99%, 特异性和灵敏性满足ELISA的检测要求[12]。
Lomakina等建立了检测FMDV的PCR-ELISA方法, 在PCR中应用的是针对3D蛋白基因的通用引物。应用该方法成功的检测到32株口蹄疫病毒株。
3 分子生物学诊断技术
3.1 核酸探针法即用放射性同位素标记核酸的c DNA拷贝, 可以特异地同待检样品中的病毒核酸结合, 这种结合可以通过放射自显影显现出来。这一方法是当前最敏感的方法。其缺点是试验程序较为繁琐, 而且同位素标记半衰期短, 并污染环境。相关学者用32P标记克隆在质粒上的FMDV基因组聚合酶序列作为探针, 对试验感染牛的食道/咽部刮取物进行了检测, 认为此法为进出口动物FMD检测提供了快速、准确的检测方法[13]。吴时友等将重组质粒中的FMDV基因片段提出, 用光敏生物素标记成c DNA探针进行检测, 可检测出10 pg以上的病毒核酸。杨永钦[18]应用c DNA探针成功检出了FMDV。苏卫等用PCR技术直接合成生物素化核酸探针, 一方面可克服同位素探针的放射危害及半衰期短等缺点, 另一方面也可克服生物素标记的复杂操作过程。
3.2聚合酶链反应 (PCR) PCR诊断技术用于诊断FMD的报道始见于1991年。在使用时以特殊设计的引物作介导及在反转录酶的作用下再进行PCR扩增, 扩增产物用PAGE、琼脂糖电泳或硝酸银染色检查, 看扩增出的DNA片段大小与设计是否相符。Meyer采用PCR检测牛食道—咽部分泌物中的FMDVRNA;Laor在变化的VP1基因序列中选择引物, 则可用于鉴别FMDV以色列株;国内吴时友等就FMDV的PCR检测研究作了报道;蒋正军等应用RT-PCR一步法和Nested-PCR法快速检测到A型10-6倍稀释、O型10-4倍稀释乳鼠肌肉毒。王伊琴等应用RT-PCR检测口蹄疫灭活疫苗中的病毒RNA。朱彩珠等采用RT-PCR技术检测牛和猪组织中的FMDV, 将FMDV的检测结果与常规法进行比较, 灵敏度提高6~12倍, 最高可检出20 TCID50细胞毒或0.16~0.32 LD50组织毒, 2次扩增还可提高检出灵敏度100倍。娄高明等应用RT-PCR技术能准确快速地 (8 h) 检测肉类、奶类、分泌物及排泄物的带毒、排毒情况。罗长保等[14]应用荧光RT-PCR技术能检测出进口冻肉中的FMDV。PCR检测法与其他方法相比, 其特点是特异性好, 灵敏度高, 简便快速, 对检测样品要求低。在分子流行病学中RT-PCR可与序列分析结合研究不同分离株之间的系统关系, 也有助于追踪该病暴发的传染源。
3.3电聚焦运用电聚焦技术诊断FMD和进行FMDV的流行病学研究。电聚焦是根据等电点的不同来分离像蛋白质这样的两性电解物。FMDV的结构和成分比较简单.在电聚焦技术中, FMDV诱导的肽都能聚成清晰的、通常是单一的区带, 而且成熟多肽数量少, 能产生单一的电焦型, 可在单向电聚焦时与其他病毒带对照比较, 因此电聚焦技术在FMDV流行病学研究中, 具有较大的研究潜力, 能快速地、简单地、大量地分离病毒株, 常被用于FMDV遗传变异等方面的研究。
4 其他诊断方法
用于诊断FMD的方法还有SPA偶联抗体法、基因工程改造细胞发光法、免疫金标记快速检测试纸法、自我染色复制法和色谱带试验等, 其中色谱带试验敏感性等同于实验室的抗原ELISA, 而且可在15 min内判定结果。由于控制FMDV的关键之一在于早期诊断, 因此探索一种能够大量、快速、高效的检测方法将仍是今后研究的热点。在将来, 一种同源分析的新型ELISA也许会应用于诊断FMD的血清学试验中, 这种新型ELISA比传统的需要洗板的ELISA方法更适合于机器操作。另外, 基因芯片和蛋白上清检测系统也将最终应用于FMD的检测技术。
综上所述, 对FMD的诊断仍然依赖于传统的流行病学并结合新的生物技术方法。经典的病毒分离、补体结合试验和病毒中和试验可靠准确, 目前仍在使用, 但FMD病毒分离培养工作量较大, 病料采样的部位、时间、样品处理、病程类型、发病动物的抗病毒抗体水平等因素对病毒分离成功与否有一定的影响, 而最主要的是分离病毒的细胞是否敏感和有效。补体结合试验有些样品中存在抗补体活性, 影响检测结果;体外病毒中和试验需要单层培养细胞, 细胞生长变化不均, 病毒对细胞适应性有别, 细胞易受细菌和霉形体的污染, 并且有些血清样品对细胞有毒性。
随着分子生物学技术迅速发展及其在FMD诊断中的应用, 建立了多种FMD的分子生物学诊断技术。从动物试验到血清学试验以至分子生物学诊断技术, 特异性越来越好, 灵敏度越来越高, 被检样品的局限性愈来愈小, 具有较大应用潜力的方法有补体结合试验、病毒中和试验、ELISA、PCR和病毒基因组核苷酸序列分析。
口蹄疫诊断技术研究 篇2
毕
业
论
文
论文题目：
综述口蹄疫的诊断和防治措施
专
业：
动物医学
作
者：
颜祥龙
学号：
16082236
班
级：
16-822
指导教师：
加春生
评阅人：
2018
年
6月28日
黑龙江农业工程职业学
综述口蹄疫的诊断和防治措施
摘要
口蹄疫是人畜共患病，本病广泛流行于世界各地。口蹄疫病毒发病急，传播速度快，常在短时间内造成较大规模流行，给养殖业带来非常严重的后果，危害人类身体健康。该病一经发生，往往会导致大范围流行，不易控制和消灭，并可造成巨大的经济损失和社会影响，世界卫生组织（IE）将该病列为A类动物疫病名单之首，我国政府也将口蹄疫排在14个一类动物传染病的第一位。
关键词：口蹄疫；流行；防治；诊断
1流行特点
口蹄疫病毒感染偶蹄兽类，侵染的对象主要包括牛、羊、猪、驼、鹿、大象等家养和野生偶蹄动物。牛最易感，猪次之，羊再次之，牛是“报警器“，绵羊是“储存器”，对于猪，则是
“放大器”，因为猪的排毒量最大。一年四季均可发生。口蹄疫的潜伏期短，发病急，动物感染病毒的最快十几个小时就可以发病排毒。
2发病特点
2.1血清学多
口蹄疫有七个血清型，目前在我国流行的有四种，分别是
0、亚洲I、A、c型，尤其以0型和亚洲I型最为常见，各血清型号之间没有交叉保护性，同型号内不同各亚型之间交叉免疫变化幅度较大，亚型内各毒株之间也有明显的抗原差异，免疫防治等于面对七种不同的传染病，而新毒株又不断出现，每出现一次新的毒株，疫情就会出现一次高潮[1]
2.2传染性强
口蹄疫是由口蹄疫病毒感染所致，而口蹄疫的传播途径又有多种，有：直接接触传播，间接传播，气源传播，水源传播。牛只要吸人10个感染单位就可以发病，猪更少，而且猪的排毒量又特别大，如一头100kg左右的病猪每天仅从呼吸道排出的病毒如全被牛吸人，可以使1000万头牛发病，所以口蹄疫病毒在偶蹄类动物传染性极强。
3鉴别诊断及防治措施
近几年来，有一些乡村兽医人员和养殖场畜主经常以类似口蹄疫的几种病，当作是人畜共患的口蹄疫，他们都把类似病误诊了。那就是：羊的口疮、蹄癀、动物的水疱病和口炎、牛的趾间皮炎、蹄皮炎、蹄叶炎、腐蹄病等。
3.1临床特点和发病症状
口蹄疫病对于不同动物发病的临床症状基本相似，患病动物一般体温升高到40
℃一41
℃，食欲不振或者是完全禁食，精神沉郁，齿龈、口腔黏膜舌部、鼻端形成水泡和溃疡，再有就是蹄冠、蹄叉等出现水泡，水泡破裂后出现溃疡，甚至有些出血，成糜烂，如果无细菌感染一般7天左右就自然痊愈，如果严重的或者被感染了的动物蹄部，蹄壳在一周过后就一部分会脱落，蹄冗脱落以后动物根本不敢站立。患病动物有些乳房已有不同大小的水泡出现，如果哺乳期的小猪吃了患病母猪的奶后，小猪基本上全部都会被感染，还会引起小猪的心肌炎，从而导致此窝小猪全军覆没。不过，成年猪严重心肌炎的已有死亡。
3.2水疱病和口炎与疑似口蹄疫病的鉴别诊断
动物的水疱病和口炎的临床症状：这种病和口蹄疫极为相似，一般人是最难鉴别的，二者病作为对比，水疱病和口炎的症状是体温40
℃、42
℃，而凵蹄疫是40
℃、41
℃，略微比口蹄疫高，0
2d后口腔和蹄部出现水泡，不久破裂形成结痂块，这种结痂多在舌、唇部、鼻端及蹄部，即使蹄壳脱落，大约2周后就转归良好，病灶不留痕迹。还有就是口蹄疫孕畜会流产，哺乳期的小猪仔几乎死亡率是100％，而水疱病小猪仔只是会出现神经症状[3]。
3.2.1猪口蹄疫的临床特征
由FMDV引起的猪口蹄疫，是一种高度接触性、热性的传染病，严重危害着养猪行业。猪口蹄疫具有较强的传染性，而且有广泛的传播途径。猪口蹄疫的引发，会降低动物生产性能，从而影响着触畜牧业的健康发展。[2]该病的潜伏期最短1～2h，最长潜伏期为14h。患猪临床表现为：精神不振、初期体温会上升、食欲减退、猪蹄部位会出现水疱现象，使得难以站立行走。有部分猪的口腔黏膜上会出现烂斑，患病之后的2h内水疱会破裂，流出微黄色或透明的液体，边缘红色糜烂。[4]如果伤口没有产生感染，则会在7h后痊愈结痂，如果发生感染，会导致死亡。如果是怀孕的母猪，会发生死胎或者流产现象。近年来猪口蹄疫的临床表现不明显，且死亡率较高，诊断也十分困难，无法及时准确的采取有效的防控措施，给养殖户造成经济损失很大。其临床表现为：症状不典型、不明显，危害程度较大，仔猪发病呈现心肌炎表现，死亡率较高。
3.3预防措施
（1）加强饲养管理，注意饲料营养，合理配搭日粮，提高机体对外界的抵抗力，减少应激。加强舍内通风，保持圈舍干燥，清洁，阳光充足，通风良好，力争给动物创造一个稳定安全洁净的环境，对口蹄疫的疫情控制起到积极的作用。
（2）加强免疫接种，贯彻预防为主的方针，采取综合性防疫措施。实践证明，采取“综合防治措施"控制和扑灭口蹄疫的做法是成功的。具体操作：在断奶仔猪阉割时进行首免，在双月龄再进行加强免疫，后备牛：每年注苗两次，每六个月注射一次，生产母牛：分娩前3个月肌肉注射口蹄疫疫苗，犊牛：出生后4巧个月首免，肌注单价苗或双价苗2m1/头；首免后6个月二免（方法剂量同首免）；以后每间隔6个月接种一次，肌肉注射单价苗3m1
/头或双价苗4ml/头。这样经过强制免疫的动物由易感变为不易感[5]
（3）加强血清抗体监测，血清抗体监测是监测免疫效果进行评估的一项丁作，坚持定期的免疫监测，随时调整免疫计划，保持有效的抗体水平，这样就完全能达到有效预防
（4）强化消毒，严格防疫消毒制度，杜绝强毒污染和人侵。为了防治口蹄疫，必须做好消毒工作，消毒可有效杀灭口蹄疫病毒，消灭传染源。
（5）发生疫情要及时上报，任何个人或单位发现口蹄疫疑似症状和怀疑发生口蹄疫疫情时，都要向当地兽医主管部门报告不得自行采取措施处理，以免处置不当引起疫情的进一步扩大，造成更大的经济损失，给口蹄疫疫情的防控带来更大的困难。
（6）在平时养殖过程中，养殖户应当注重饲养管理，饲养者之间应当尽量减少接触，杜绝发病的源头，要确认购进的猪是否健康，然后在进行并群饲养。制度科学防疫制度，加强免疫措施，定期对猪群的生存环境进行打扫，预防猪口蹄疫疾病
（7）疫苗接种是最有效最便捷的防控措施，猪口蹄疫在我国是强制免疫的疫病。要求动物免疫率达到100％，免疫抗体合格率必须大于70％。由于猪口蹄疫病毒的血清型较多，且无交叉免疫，所以，防控难度较大。当发现猪口蹄疫疫情时，除隔离防治外，还应该进行紧急免疫接种。这样才能有效防控猪口蹄疫。同时养猪场户要制定合理、科学的免疫程序，选择高效优质的疫苗，并严格按照免疫程序执行。
4小结
当发现猪口蹄疫时，应当主动积极报告给当地动物疫病预防控制中心，由该部门对猪群进行确诊。如果猪群确实发生猪口蹄疫，则应当送至动物疫病预防控制中心检测。发现此类疫病，要立即隔离，隔离确诊为猪口蹄疫，应当患病的猪群进行捕杀，然后再进行无害化处理。消灭疫病的感染源头，控制猪口蹄疫病蔓延，而这也是防控疫情的有效办法。总之，控制猪口蹄疫是一项非常复杂而难度很高的工作，必须加强饲养管理，对猪群进行预防免疫工作，严格按照免疫程序进行疫苗接种，消灭猪口蹄疫的感染源，切断猪口蹄疫的传播途径，避免猪口蹄疫的发生。
致
谢
大学的生活即将结束，在此，我要感谢所有曾经教导过我的老师和关心过我的同学们，他们在我的人生中留下了浓厚的一笔，给予了我很大的帮助。本文能够成功的完成，我要特别感谢我的指导教师加春生老师的关怀和教
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口蹄疫的危
害与防控措施
口蹄疫诊断技术的研究进展 篇3
1 病原学诊断
病原学诊断包括动物试验、鸡胚接种和细胞培养。1951年Skinner用田间样品接种2~7日龄乳鼠成功分离增殖病毒[2]。1955年sellers培养初代猪肾细胞获得成功后, 很快用于病毒分离增殖, 与补体结合试验 (CFT) 结合用于FMD的诊断[3], 随后培育成功的犊牛甲状腺初代细胞 (CTY、幼仓鼠肾细胞系BHK21) 和猪肾细胞 (I-BRS2) 都可用于诊断。病毒分离增殖和CFT在FMD诊断中沿用了近30年, 尽管这种技术准确可靠, 但不敏感, 而且有些样品中存在抗补体活性, 影响检测效果。FMD的病原分离, 通常应用试验动物 (乳鼠、豚鼠、鸡胚) 和组织培养细胞自患畜病料中分离病毒和进行毒型鉴定。组织培养细胞分离病毒, 常将悬液接种敏感细胞, 如牛舌上皮、牛肾、猪肾、豚鼠肾、仓鼠肾和兔肾原代细胞或BHK-21、IBRS、PK15等细胞系, 观察细胞病变效应 (CPE) , 最敏感的细胞是犊牛甲状腺原代细胞。
2 抗体检测
2.1 琼脂扩散试验
该方法既可以检测病毒抗原, 也可以检测抗体。在琼脂中FMDV抗原和标准阳性血清或未知的被检血清之间形成免疫沉淀线, 并能在48 h之内提供结果。长期以来, 该试验主要用于血清样品中FMDV的检测。
2.2 补体结合试验 (CFT)
1952年Brooksby建立了补体结合试验 (CFT) [4]。近年来, CFT常用于FMD病料的检测和分型。补体结合试验是应用可溶性抗原与相应的抗体结合后, 其抗原抗体复合物可以结合补体, 如再加入致敏红细胞 (溶血素) , 即可根据是否出现溶血反应判定反应系统中是否存在相应的抗原和抗体。补体不能和单独的抗原或抗体结合, 若待检材料中的FMD抗原 (或抗体) 不对应或没有相应的抗原 (或抗体) , 不能形成抗原抗体复合物, 补体只能和绵羊红细胞与溶血素构成的溶血系统结合, 引起红细胞溶解, CFT结果为阴性;若待检材料中的FMD抗原 (或抗体) 与某型抗体 (或抗原) 特异性结合, 则反应混合液中的补体就不参与溶血反应, 红细胞不再被溶解, CFT结果阳性。CFT既可鉴定抗原, 又可鉴定抗体, 并可定量, 但CFT方法相对不够敏感, 且有易解释样品的亲补体活性和抗补体活性。
2.3 病毒中和试验 (VNT)
病毒中和试验是利用血清中和抗体与病毒特异性的结合作用, 使病毒失去吸附细胞的能力或抑制其侵入和脱衣壳, 丧失对易感动物和敏感细胞的感染力。VNT既可鉴定抗原, 又可对抗体定量测定, 具有特异性, 是经典的FMD检测方法, 常作其他方法的参照。该方法用于FMD感染急性期和恢复期的血清 (发病后2~3周) 检测, 可根据病毒-血清混合物的动物发病死亡数或产生CPE的细胞孔数来判定血清中所含抗体量和血清亚型。VNT虽然具有型特异性但它需要细胞培养, 需要2~3 d才能够获得结果。被检血清低效价导致的假阳性有时出现, 动物精神沉郁或偶然发病、发烧也会干扰VNT结果。VNT又需要单层培养细胞, 因此细胞生长状态、病毒的细胞嗜性、细胞污染以及血清样品因素均对VNT的推广和应用带来诸多限制性因素。
2.4 酶联免疫吸附试验 (ELISA)
1979年Crowthe建立了间接夹心ELISA[5], ELISA试验是当前应用最广的一种免疫测定方法, 包括间接法、双抗体夹心法和竞争法以及近年来发展的一些改良法。1989年被欧洲FMD防制委员会推荐广泛使用, 成为国际认可的一种标准化诊断技术。近年来, ELISA已先后用于FMD病原和血清样品的诊断并逐步代替补体结合试验以及中和试验。这项技术快速、敏感、准确, 用灭活的1405制备抗血清或作抗原, 可在一般的实验室操作, 还可制成方便的诊断试剂盒。检测田间样品时ELISA的敏感性高于补体结合试验;对于含量较高的样品, 如新鲜的水疱皮和细胞培养物, 可在2~4 h内获得结果, 应用预先在实验室内包被的免疫反应板以及冻干剂, 将更便于现场检测。
2004年Paiba GA等应用固相竞争ELISA (SPCE) 对绵羊、山羊和猪分别进行了O型FMD血清学抗体检测, 对2001年英国爆发FMD其间的267头绵羊和143头猪分别进行VNT和SPCE检测, 发现SPCE较VNT能够检测出更多的阳性结果[6], 充分证实了SPCE方法的灵敏性、可施行性和可重复性。同时, 田间血清学试验和实验室血清学试验也同样表明与VNT相比, SPCE方法的敏感性很少因病毒毒株的不同而受影响。
3 分子生物学诊断技术
近年来, 由于分子生物学技术的迅速发展及其在FMD诊断中的应用, 建立了各种FMD的分子生物学诊断技术, 主要包括以下几种方法:核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酸胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。
3.1 聚合酶链反应 (PCR)
20世纪90年代初, PCR技术日趋成熟, 也渗入到FMD的诊断中。这一技术特异性强, 灵敏度高, 可检测多种组织样品, 检测病毒RNA的PCR方法已经成为FMDV检测方法中的一种。PCR方法具有极高的灵敏度 (其理论值为一个病毒粒子的核酸) , 仅需要极少量的反应模板, 而且可以设计多循环PCR反应。由于仅将RNA的目的片段扩增出来, 所以也具有很好的特异性。PCR检测提供了适合于对应序列的基因物质, 提供了较为详细的流行病学信息, 为疫源的追踪提供了可靠的理论依据。Clavijo A通过RT-PCR的方法扩增FMDV特异性核酸快速诊断病毒感染动物[7]。Callahan J D建立了real time PCR的方法快速判断病毒感染[8]。近年来, 随着PCR技术的不断成熟, 该技术在检测FMDV方面也有了较大的进展。这种方法不但可以检测活病毒核酸, 也能直接检测灭活的核酸片段。吴时友等就FMDV的PCR检测研究作了报道[9]。朱彩珠等也将此项技术应用于FMD的诊断, 可检测出20倍TCID50 (细胞毒) 或0.16~0.32LD50 (组织毒) 的病毒量[10]。该法特异性好, 检测灵敏度高, 可以检测病毒, 也能直接检测核酸片段, 样品可以是水疱液, 也可以直接用扁桃体、淋巴结、肌肉和蹄、皮肤等组织, 这是免疫学方法无法替代的。此方法需要较高的试验设备和熟练的分子生物学试验操作技能, 到目前为止, 尚未在检疫中推广应用, 仅限于专业实验室应用。
3.2 Tap Man PCR技术
本检测技术是利用Tap Man技术的原理 (利用共振能量转移达到荧光猝灭而距离增加后荧光恢复的技术) 建立的一种先进的荧光实时定量PCR技术, 由于其高度的敏感性、特异性, 已得到越来越多的重视和应用。目前, 此项技术在人类病毒的检测上应用广泛, 在动物病毒的检测方面也发展迅速, 如禽流感、FMD、新城疫、鸡传染性支气管炎、猪瘟、牛病毒性腹泻、马脑炎等疾病病毒的检测也都有报道[11]。
3.3 基因芯片技术
基因芯片是指采用原位合成或合成后点样等方法, 将大量寡核苷酸或c D-NA以大规模阵列的形式有序的固化于基片 (硅片、玻璃、尼龙膜等) 的表面, 然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交, 反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示, 通过激光共聚焦扫描仪或电荷耦联摄像机 (CCD) 等仪器对杂交信号的强度进行高效的检测分析, 从而判断样品中靶分子的数量。
3.4 电聚焦
电聚焦是根据等电点的不同来分离像蛋白质这样的两性电解物。在电聚焦技术中, FMDV诱导的肽都能聚成清晰的, 通常是单一的区带, 而且成熟多肽数量少, 能产生单一的电聚焦型, 可在单向电聚焦时与其他病毒带对照比较。因此, 电聚焦技术在FMDV流行病学研究中具有较大的运用潜力, 常被用于FMDV病毒株的遗传变异分析以及特异型别研究中。在研究FMDV突变的物理图、病毒诱导的前体蛋白与最终产物的相互关系、病毒的遗传重组、测定蛋白的分子量、病毒的演化、毒株的鉴定、病毒的分类、肽的指纹图、蛋白的二级修饰等方面, 等电点聚焦电泳技术均得到了应用。
3.5 口蹄疫病毒抗原的快速色谱带检测
世界口蹄疫参考实验室曾进行常规FMD诊断、ELISA、细胞病毒培养、反转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 等方法培训, 上述技术要求熟练人员操作, 并且试验设备昂贵。明晰色谱带检测法, 能够快速、简便地应用于现场, 该法可检测鼻拭子上皮和食道探子所采样本以及细胞培养继代上清液的FMD病毒抗原。本法比用ELISA对鼻拭子上皮的7种血清型FMD病毒的检出更为敏感, 并与ELISA检测细胞培养上清液的病毒有同样的敏感性。研究表明, 此法对可疑FMD暴发地区能提供临床证实, 有利于疾病的迅速控制, 且应用简便, 不需将样本运送实验室。
目前, 国内也已有口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、蓝耳病、伪狂犬、禽流感、新城疫、鸡传染性法氏囊病等疾病的快速诊断试纸面世[12]。
3.6 生物传感器
生物传感器是多学科交叉和各种高新技术结合的产物, 其核心部分由分子识别元件和信号转换元件组成。分子识别元件由酶、抗原、抗体、细胞、细胞器、组织、微生物等生物活性物质组成, 它们能够识别各种被测物质, 并与之发生物理、化学或生物化学变化。信号转换元件主要由电极、热敏电阻器离子敏或化学敏场效应晶体管、压电晶体、光导纤维、光敏二极管等构成, 将感知的变化转换成可测量的电信号或光信号, 再由仪器记录下来, 成为人们可以掌握的信息。目前, 生物传感器有压电生物传感器和细胞传感器两类。
3.7 核酸指纹图法 (T1酶谱法)
这一方法是将同位素标记在病毒核酸上, 然后用专切3’端G碱基的核酸T1酶消化, 经电泳继而放射自显影, 即可得到该病毒特有的带型, 因而称之为指纹图。此法重复性好, 虽然它只能分析基因5%左右的核酸, 但能测定毒株间的相关性, 可用于病毒变异研究和追踪疫源。
3.8 多肽分析法
不同的FMD病毒株其结构多肽的氨基酸组成是有变化的, 特别是FMDV的结构蛋白的VP1、VP2和VP3, 而这种变化可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 或电聚焦图谱显示出来[13]。
4 展望
口蹄疫诊断及疫苗等研究综述 篇4
口蹄疫病毒 (FMDV) 属于微核糖核酸病毒科中的口蹄疫病毒属。FMDV是已知较小的动物RNA病毒, 病毒粒子直径23~25nm, 呈圆形或六角形, 由60个结构单位构成20面体。所含核酸为RNA, 全长8.5kb。在负染标本中, 可见衣壳由32个壳粒组成, 口蹄疫病毒的壳粒大于其它小RNA病毒的壳粒。取感染细胞培养物作超薄切片, 进行电子显微镜检查, 常可见到胞浆内的口蹄疫病毒呈晶格状排列。X线衍射分析证明, 口蹄疫病毒除VP1蛋白第141~160位氨基酸突出于表面外, 整个病毒粒子呈光滑平整的球形, 不具有其它小RNA病毒表面的凹陷结构。
2 FMDV的遗传变异
FMDV的毒力和抗原性均易发生变异, 经过不断的抗原“漂移”过程, 导致一系列亚型的产生。FMDV基因组中编码衣壳蛋白的核苷酸发生变异从而导致病毒抗原性的变异。分析口蹄疫病毒结构蛋白的差异, 可以发现VP1的变异性最高, 特别是其编码病毒抗原的核苷酸序列是一个可变区, 是由抗原表位的氨基酸缺失、添加或替换造
氧发生器。
4臭氧消毒技术独特的优越性
4.1消毒无死角, 杀菌效率高, 除异味消毒进行时臭氧发生装置产生一定量的臭氧, 在相对密闭的环境下, 扩散均匀, 通透性好, 克服了紫外线杀菌存在的消毒死角的问题, 达到全方位、快速、高效的消毒杀菌目的。另外, 由于它的杀菌谱广, 既可以杀灭细菌繁殖体, 芽孢, 病毒, 真菌和原虫孢体等多种微生物, 还可以破坏肉毒杆菌和毒素及立克次氏体等, 同时还具有很强的除霉、腥、臭等异味的功能。
4.2无残留、无污染臭氧利用空气中的氧气产生的, 消毒氧化过程中, 多余的氧原子在30min后又结合成为分子氧, 不存在任何残留物质, 解决了消毒剂消毒时残留的二次污染问题, 同时省去了消毒结束后的再次清洁。
总之, 臭氧技术已经越来越广泛的应用于很多领域, 也已经尽显出它独特的优越性, 但也存在着一些实成的。VP4几乎不发生变异[1]。四种衣壳蛋白的变异顺序VP1〉VP3〉VP2〉VP4。欧洲O、A、C三个型中任何两个型的氨基酸同源性约为60%。曾有人对3个O1亚型的核苷酸序列进行比较, 发现编码VP1的核苷酸高度同源, 达98%;在O1亚型VP1多肽的213个氨基酸中, 三个毒株之间只有3个氨基酸残基不同。但在几个C3亚型毒株之间, 核苷酸序列中有25个碱基序列不同, 结果造成8~9个氨基酸残基的变化。随后又证实, 各型病毒之间不仅组成抗原环的氨基酸种类不同, 而且组成这种抗原环的氨基酸数目也有差异:以SAT3最多, 为VP1 124~165号氨基酸;其次是O、A、C型, 分别比SAT3少5、7、9个氨基酸。
3 口蹄疫诊断技术研究
FMD是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病, 世界大部分地区时有发生, 常在牛群及猪群大范围流行。此病的致死率很低, 但是感染率很高。口蹄疫的大规模流行, 会给农牧业生产造成极大的危害, 并波及到市场上毛、皮、肉、奶的供应以及以毛、皮、肉、奶为原料的食品加工业和轻工业, 给畜牧业和进出口贸
际问题, 因此, 也给研究者们带来了难得的机遇和挑战, 相信在不久的将来会逐步成熟和推广。
参考文献
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[6]沈芄, 邱立军, 杨振玲等.KXD-1型空气消毒器消毒效果的试验观察[J].中国消毒学, 1996, 13 (1) .
易造成巨大的经济损失, 直接威胁着国家声誉和人类食品卫生安全, 因而受到国内外的普遍关注。口蹄疫病毒共有7个血清型:O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1型, 每个型又可以进一步分为亚型。由于不断发生抗原漂移, 因此并不能严格区分亚型。口蹄疫诊断只能在指定的实验室进行。送检样品包括水泡液、剥落的水泡、抗凝血或血清等。死亡动物可采集淋巴结、扁桃体及心脏。样品应冰冻保存, 或置p H7.6的甘油缓冲液中。目前口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术、血清学检测技术和分子生物学技术等。
3.1 病毒分离技术
病毒分离技术是检测口蹄疫的黄金标准, 主要有细胞培养和动物接种2种方法。
3.1.1 细胞培养
检测口蹄疫最初用的细胞是单层初代猪肾细胞, 后来随着细胞培养系统的不断增多, 有许多培养细胞都可用于FMDV的分离。其中初代小牛甲状腺 (CYT) 细胞分离FMDV时特别敏感[2], 此外还有小牛肾细胞[3]、仓鼠肾细胞系BHK21等。目前许多实验室都将CYT细胞和IBRS 2培养细胞 (猪肾细胞系) 作为分离FMDV的常规细胞, 这2种细胞系可将FMDV和SVDV (猪水泡病病毒) 区分开, 因为FMDV可在这2种细胞上生长, 且有相似的细胞病变, 而SVDV只能在IBRS 2细胞上生长。
3.1.2 动物接种
动物接种常用乳鼠进行, 通常情况下进行病毒分离需要用8~10只小鼠, 以便于观察接种鼠的死亡情况和获得足够多的抗原, 并在进行补体结合试验 (CFT) 时获得明显的阳性结果。当致病性毒株非常重要时, 也可用牛等动物来分离病毒。
3.2 血清学检测技术
血清学诊断技术主要有病毒中和试验 (VNT) 、CFT、间接血凝试验、乳胶凝集试验、免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、免疫荧光电子显微镜技术等。
3.2.1 补体结合试验
CFT是较早的应用于诊断FMD的血清学诊断技术之一, 最初的CFT是在试管中进行的, 后来被微量法所替代, 微量法操作简便, 节省试剂, 但是CFT的敏感性不高, 且易受样品中的亲补体性和抗补体物质的干扰。
3.2.2 病毒中和试验
病毒中和试验是OIE推荐的检测FMDV抗体的标准方法。在进行抗原鉴定时病毒中和试验比补体结合试验要好, 但体外VNT试验也有一些缺点, 如需用的细胞生长不一致、病毒敏感性的变化、外源性微生物因子 (如细菌和真菌) 的可能性干扰以及被试血清对细胞的不同影响等等, 这一方法必须使用活病毒, 非普通实验室所能操作, 而且中和试验全然不能区分免疫抗体和感染抗体。
3.2.3 酶联免疫吸附试验
ELISA试验检测口蹄疫具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点, 且能自动化操作, 并能迅速的检测大量样品, 在FMD的诊断中日益受到人们的重视, 现已成为国际上检测FMD的常规方法之一。
3.3 分子生物学技术
近年来, 随着分子生物学的飞速发展, 以及对FMDV研究的不断深入, 已经建立起检测FMDV的各种分子生物学方法, 其中包括聚合酶链式反应 (PCR) 、核酸探针、核酸序列分析、电聚焦寡核苷酸指纹图谱法、基因芯片技术等等。
3.3.1 聚合酶链式反应 (PCR)
PCR诊断技术在使用时以特殊设计的引物作介导及在反转录酶的作用下再进行PCR扩增, 扩增产物用PAGE或琼脂糖电泳或硝酸银染色检查, 看扩增出的DNA片段大小与设计是否相符。PCR检测法与其它方法相比其特点是特异性好, 灵敏度高, 简便快速, 对检测样品要求低。在分子流行病学中RT-PCR可与序列分析结合研究不同分离株之间的系统关系, 也有助于追踪该病暴发的传染源。
3.3.2 核酸探针
即用放射性同位素标记核酸的c DNA拷贝, 可以特异地同待检样品中的病毒核酸结合, 这种结合可以通过放射自显影显现出来, 这一方法是当前最敏感的方法。其缺点是试验程序较为繁琐, 而且同位素标记半衰期短, 并污染环境。相关学者用32P标记克隆在质粒上的FMDV基因组聚合酶序列作为探针, 对实验感染牛的食道/咽部刮取物进行了检测, 认为此法为进出口动物FMD检测提供了快速、准确的检测方法[4]。
4 口蹄疫疫苗的研制
使用灭活疫苗, 需经常重复免疫接种, 才能维持保护, 弱毒疫苗存在的散毒和毒力返祖现象、灭活疫苗中的活毒残留问题及因毒株的抗原漂移和基因组的变异选择而导致疫苗接种失败等现象都可能造成FMD的大流行。同时疫苗的研制总是落后于病毒变异, 造成现行的疫苗对当时的流行毒株预防效果不理想, 这也是FMD防治困难重重的另一重要原因。随着对FMDV深入研究和知识的积累, 已能从分子水平阐明病毒的基因结构和免疫特点, 重组DNA及相关技术的兴起, 推进了口蹄疫疫苗的研究, 开拓了口蹄疫基因工程苗研究的领域, 使新一代口蹄疫疫苗的诞生成为可能。
4.1 传统疫苗
4.1.1 活疫苗
FMDV容易发生变异, 且不易致弱, 有致病性, 不安全, 所以活疫苗不适宜用来防控FMD, 目前世界上大多数国家已经禁止使用此苗。
4.1.2 灭活疫苗
目前FMD主要是使用灭活疫苗进行预防, 且使用效果较其它类型疫苗效果好。由于活疫苗可能会因遗传变异导致原疫苗的效力丢失或突变成强毒株而引发疾病, 死疫苗灭活不彻底导致疾病流行等原因, 研制安全、稳定和抗原性强的新型疫苗便成为众多学者研究的热点。
4.2 新型疫苗的研制
4.2.1 基因工程亚单位疫苗
目前, 已经发现FMDV结构蛋白基因和非结构蛋白基因2A、3C串联起来表达, 可以产生76S的类病毒粒子, 提纯该病毒粒子用来免疫动物, 其免疫效果类似于全病毒, 可产生高水平的中和抗体, 能抵抗强毒的攻击, 并彻底解决FMDV常规疫苗散毒的危险, 显示其良好的前景。现只有A型FMDV基因工程疫苗试验证明具有相当的效力。目前我国已完成抗O型口蹄疫病毒基因工程疫苗的基因克隆和表达, 用其制备的疫苗同时完成田间试验和区域性试验等一系列动物免疫试验, 取得显著效果。
4.2.2 基因缺失疫苗
世界上第一个基因工程缺失苗是由美国的Baylor医学院和Texas大学联合研制成功的一株猪伪狂犬病基因缺失疫苗。受这一研究以及随后不同实验室成功结果的启发, 许多研究者也开始致力于口蹄疫基因缺失苗的研究。
4.2.3 活载体疫苗
2000年, Berinstein A等[5]发现, 结构蛋白前体基因构建的重组痘苗病毒免疫牛和小鼠后, 用ELISA检测动物血清发现, 中和抗体滴度高, 抗病毒保护效果好, 动物应答较强且持久, 一次免疫诱导产生的抗体在体内可持续两个月, 加强接种后, 动物可获得更长的免疫力;另外, 腺病毒和疱疹病毒也可以作为重组载体, Gregory A等[6]用表达FMDV结构蛋白的腺病毒-5型免疫猪, 4周后用相同剂量加强免疫一次, 可产生高滴度的FMDV中和抗体, 5/6免疫猪获得了保护, 用该重组病毒接种牛诱导产生高滴度的抗FMDV抗体。以复制能力缺陷第5型腺病毒介导的免疫由于转入本身缺乏复制机制, 不会与宿主染色体基因整合, 所以不会像弱毒疫苗出现毒力恢复的可能性。目前, 腺病毒的基因结构与功能研究得比较清楚, 而且腺病毒活疫苗已在美国使用30年, 证明是安全的, 所以重组病毒具有发展活疫苗的前景。
4.2.4 核酸疫苗
90年代, 随着基因免疫概念的问世及完善, 为FMDV免疫带来契机。Shieh等[7] (2001) 根据包含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-胸腺嘧啶 (Cp G) 基序的寡核苷酸 (ODN) 能够刺激细胞免疫反应, 而且可充当有效的佐剂, 因此构建了一个带有FMDV O/Taiwan/97株衣壳蛋白VP1的质粒DNA, 并以Cp G ODNs作为免疫刺激剂, 结果证实用Cp G ODNs加强免疫后能够使小鼠产生更高滴度的中和抗体。除此之外, 研究者还将FMD基因疫苗与IL-2, GM-CSF等细胞因子或携带其编码基因的质粒DNA共同免疫动物, 结果证实这种方法大大提高了基因疫苗的免疫效力。核酸疫苗是用携带免疫原基因的核酸制成。美国梅岛动物病毒研究所正在研究口蹄疫病毒核酸疫苗, 据称有一定的效果, 但核酸疫苗安全性方面尚有许多需要探讨的问题, 如染色体整合、免疫耐受、自身免疫和抗DNA抗体形成等诸多可能性。目前在动物试验中尚未出现这些现象, 但是其安全性还需通过长期大量的观察和试验加以证实。
参考文献
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山羊口蹄疫诊断与防治 篇5
1 病原
病原体为口蹄疫病毒, 属小病毒科, 口蹄疫病毒属。核酸类型为单股核糖核酸, 病毒粒子呈球形, 不具有囊膜。目前已知有7个主型, 即a型、o型、c型、sat型 (南非) i型、sat (南非) Ⅱ型, sat (南非) Ⅲ型及asia (亚洲) i型。同一血清型又有若干不同的亚型。各血清型之间几乎没有交叉免疫性, 同一血清型内各亚型之间仅有部分交叉免疫性。口蹄疫病毒具有相当易变的特征。病毒主要存在于患病动物的水疱皮以及淋巴液中。
2 流行病学
2.1 易感性
口蹄疫可感染多达33种动物, 其中以偶蹄兽最为易感, 在家畜中, 以黄牛、奶牛最为易感, 其次为水牛、牦牛、猪、骆驼、羊, 野生偶蹄兽如黄羊、野牛、鹿、野猪也可发病, 人也可感染本病, 同种动物中, 幼龄动物易感性强, 发病时, 死亡率较高。
2.2 传染源
病畜和带毒动物 (潜伏期、恢复期) 是最危险的传染源, 发病初期的病畜排毒量最大, 排出的病毒毒力最强。此外, 痊愈的家畜还可带毒, 带毒时间从几个月至数年不等。
2.3 传播途径
口蹄疫病毒可通过直接接触传播, 也可通过污染的饲料、饮水、空气经消化道、呼吸道及损伤和未损伤的皮肤、粘膜进行传播。牲畜的流动、畜产品的运输以及被病畜的分泌物、排泄物和畜产品 (如皮毛、肉品等) 污染的车辆、水源、空气、牧地、饲养管理用具、饲料、饲草等以及来往人员和非易感动物 (狗、马、野生动物、候鸟) 等都是重要的传播媒介, 均是促进本病传播的重要因素。
2.4 传染性
口蹄疫传染性极强, 病原很容易从一种动物传给另一种动物, 有时表现为多种动物 (牛、羊、猪) 共同发病, 但也有时仅发生于牛、羊、而猪很少发生, 或者仅发生于猪, 而牛羊不发生或很少发生。
2.5 发病季节
口蹄疫一年四季均可发生, 但在饲养牛羊为主的牧区, 则常从秋末开始, 冬季加剧, 春季减轻, 夏季基本平息, 而在以养猪为主的农区则季节性表现不明显。
2.6 流行特点
口蹄疫流行形式常表现为流行性或大流行, 其流行方式为扩散式或跳跃式, 另外口蹄疫的流行具有一定的周期性, 常为每隔5~10年流行一次。
3 临床症状
病毒侵入羊体后, 可使口腔粘膜和蹄趾间发生水疱和疱疹, 水疱主要发生于硬腭和舌面。开始时不易发觉, 以后病羊出现跛脚、采食减少、精神不振等症状, 这时蹄部肿痛发热, 体温上升, 2~3d后四肢再度出现水疱。初期疱内为清液, 后来痂冠。部变撕发为去生浑痂水浊皮疱, , 时可破, 见裂常鲜后因红结继的成发溃棕性疡色坏。的疽蹄2.︵山
4而剖检病变D引起蹄壁脱落。
新疆博1.新疆羊肤粘除膜体及表蹄、部口产腔生、皮水肤疱、外乳, 房上部呼皮吸OI:10.3州精河博州精席口胃和大小肠粘膜可见出血性炎道及前胃粘膜也可能产生溃烂, 症真。969/茫河J.IS丁县畜凤琴蹄心肌上有心肌病变:心内外膜出血灰白色或淡蓝色, 斑点或纵切后, SN.乡16畜牧牧兽, 1疫
5条预纹状。
防71-兽医602医站站, 音布诊区5.引1进动物及动物产品无病地区严禁从有、饲料病国或、生地7.200精, 河精塔2断物其制产品品等, 也。应来进自行无检病疫地。区检的出动阳物性及9.07.035河88333与工具动物、动时, 全群动物销毁处理物废料等污染器物应, 就地运载330300;防
5 消情.2毒, 应。无采口取蹄果疫断地措区施, , 对一患旦病发动生疫物0︶治和同群动物全部扑杀销毁, 对被污染的环境严格、彻底消毒。
5.3 口蹄疫流行区用当地流行毒株同型的口蹄疫弱毒疫苗或灭活疫苗接种动物。
由于牛、羊的弱毒疫苗对猪可能致病, 安全性差, 故目前已改用口蹄疫灭活疫苗。
5.4 当动物群发生口蹄疫时, 应立即上报疫情, 确定诊断,
划定疫点、疫区和受威胁区, 实施隔离封锁措施, 对疫区和受威胁区的未发病动物进行紧急免疫接种。
6 治疗措施
羊只发生口蹄疫后, 一般经10~14d可自愈。为促进病畜早日康复, 缩短病程, 特别是防止感染和死亡, 在严格隔离条件下, 及时对病羊进行治疗。
6.1 口腔患病
用0.1%~0.2%高锰酸钾、0.2%福尔马林、2%~3%明矾或2%~3%醋酸 (或食醋) 洗涤口腔, 然后给溃烂面上涂抹碘甘油或l%~3%硫酸铜, 也可撒布冰硼散。
6.2 蹄部患病
用3%臭药水、3%煤酚皂溶液、1%福尔马林或3%~5%硫酸铜浸泡蹄子。也可以用消毒软膏 (如1:1的木焦油凡士林) 或10%碘酒涂抹, 然后用绷带包裹起来。最好不要多洗蹄子, 因潮湿能够妨碍痊愈。
6.3 乳房患病
应小心挤奶, 用2%~3%硼酸水洗涤乳头, 然后涂消毒药膏。
6.4 恶性口蹄疫
牛口蹄疫的诊断和防治 篇6
口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科中的口蹄疫病毒属,容易发生变异,主要存在于患畜水疱皮及淋巴液中。病牛是该病的主要传染源,康复期和潜伏期的病牛亦可带毒、排毒。该病主要经呼吸和消化道感染,无明显的季节性。
该病潜伏期平均2~4 天,病牛体温升高至40~41℃,精神沉郁、食欲下降,闭口流涎,开口时有吸吮声;发病1~2天后,在唇内面、齿龈、舌面和颊部黏膜出现蚕豆大至核桃大的水疱。此时,病牛口角流涎增多,呈白色泡沫状,常挂满嘴边,采食、反刍完全停止。在口腔发生水疱的同时或稍后,病牛趾间及蹄冠的柔软皮肤上也发生水疱,并很快破溃出现糜烂,然后逐渐愈合。若病牛衰弱、管理不当或治疗不及时,糜烂部可能化脓、坏死,甚至出现蹄匣脱落,乳头皮肤有时也可能出现水疱,而且很快破裂形成烂斑。
该病一般为良性经过,若只是口腔发病,约经1周即可治愈;如果蹄部出现病变,则病期可延至2~3 周或更久,死亡率一般不超过1%~3%。但有时病牛在水疱病变逐渐愈合,趋向恢复健康时,病情突然恶化,出现全身虚弱、肌肉震颤,心跳加快、节律不齐等症状,最后因心脏停搏而突然倒地死亡。这种病型称为恶性口蹄疫,病死率在20%~50%,主要是由于病毒侵害心肌所致。
犊牛患病时主要表现为出血性肠炎和心肌炎,特征性水疱症状不明显,死亡率很高。通过剖检发现患病牛心包膜有弥漫性点状出血,心肌切面有灰白色或淡黄色斑点,质地松软呈熟肉样。
猪口蹄疫疾病的诊断及防控 篇7
1. 猪口蹄疫的诊断
(1) 临床诊断
猪患有口蹄疫没有明显的季节性, 但以秋末、冬春多发, 一经发生往往呈流行性传播, 病猪以蹄部出现水泡为主要特征, 潜伏期1～2 d, 体温升至40℃～41℃, 精神不振, 食欲减退或废绝。鼻镜、唇边、母猪乳头、口腔黏膜有明显小水泡或糜烂, 蹄冠、蹄叉、蹄踵等部位出现局部发红, 微热, 不久后形成米粒大或蚕豆大的水泡, 水泡破后表面形成溃疡, 如无细菌感染, 1周左右痊愈。如有继发感染, 严重者蹄壳脱落, 患肢不能着地, 卧地不起。成年猪死亡率不高, 仔猪多因引发急性胃肠炎, 心肌炎而死亡。
(2) 病理解剖
可见咽喉、气管、胃黏膜有烂斑和溃疡。最具诊断意义的是心肌病变, 心包膜有弥散性及点状出血, 心肌切面有灰白色或淡黄色斑块或条纹, 形似老虎身上的斑纹, 称为“虎斑心”, 心脏松软, 似煮过的肉。
(3) 实验室诊断
确诊该病可采用病毒分离、血清中和试验、补体结合试验、乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验等方法。例如与水疱病难辨时须用实验室诊断, 可取病猪蹄部水疱片或水疱液置于50%的甘油生理盐水中, 然后送有关部门作补体结合实验, 或送检病猪恢复期的血清作乳鼠中和试验, 病毒中和试验, 琼脂扩散试验等。近几年常用生物素标记探针技术来检测口蹄疫病毒, 该方法简便、快速、特异性强。
2. 猪口蹄疫的防控
(1) 饲养管理
定期对圈舍进行清扫、消毒, 保持环境卫生, 减少染病机会。
(2) 免疫接种
种母猪一年免疫2～3次, 每次配种前免疫1次, 气候转冷时加强1次;初产母猪在配种时免疫2次, 首免30 d后再免1次;该场免疫母猪所产仔猪70日龄首免, 30 d后再免1次。
(3) 防潮保湿
气候转冷和发病期间务必做好舍内的防潮保温工作, 注意通风。
(4) 对症治疗
对发病猪多采用对症疗法, 以促进创口的痊愈。
(5) 建立健全预警机制
简述猪口蹄疫的类症鉴别诊断 篇8
1 从发病特征上进行鉴别
猪口蹄疫:由口蹄疫病毒引起偶蹄动物发病, 呈急性、热性、高度接触性传染。以口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。
猪水泡病:由猪水泡病毒引起猪的一种接触传染性的病毒病。临床特征是在蹄、鼻、口腔粘膜和母猪的乳头周围出现水泡。症状难与口蹄疫区别。
猪水泡疹:由水泡性疹病毒引起的一种急性发热传染病, 特征为病猪体无毛部分的皮肤和口腔粘膜以及蹄部发生水泡性炎症;不久破裂形成糜烂, 又迅速恢复, 传染快, 死亡率低的疫病。
猪水泡性口炎:由水疱性口炎病毒引起, 呈急性热性高度接触性传染, 人畜共患。以口腔粘膜、舌、唇、乳头和蹄冠部上皮发生水疱为特征。
猪痘:由痘病毒引起猪的一种急性、热性、接触性传染病 (常被称为天花) , 以皮肤上发生典型的丘疹和痘疹特征。
2 从流行病学上进行鉴别
猪口蹄疫:通过直接接触病畜或被病毒污染的畜产品、饲料、草场、饮水和水源、交通工具、饲养工具及空气进行感染, 可跳跃式传播。发生没有严格的季节性, 传染性强, 发病率高, 幼畜死亡率高。
猪水泡病:仅猪类动物易感, 通过与粪尿、鼻液、口腔分泌物等直接接触或经被污染的饲料、饮水、运输工具等间接接触感染, 发病率高 (达70～80%) , 死亡率低。
猪水泡疹:从消化道传染, 因食含病毒的肉类下脚料而致病, 污染的泔水也能散播此病。仅发生于猪, 偶见于马和狗。
猪水泡性口炎:多发于夏季及秋初, 病毒通过双翅目昆虫的叮咬或损伤的皮肤、粘膜及被污染的饲料和水体经消化道感染。
猪痘:一年四季均可发病, 以4～6周龄仔猪多见, 通过伤口或媒体传染。
3 从临床表现上进行鉴别
猪口蹄疫:病猪体温升高 (41℃以上) , 蹄冠部皮肤潮红、肿胀、出现水泡、跛行、疼痛、蹄壳脱落、跪行、卧地不起;鼻颈部出现黄豆大或乒乓球大小不等水泡, 很快破裂, 形成溃疡;哺乳仔猪出现急性胃、急性心肌炎或四肢麻痹, 衰弱死亡, 死亡率可达80%以上。
猪水泡病:体温变化、蹄部和口腔病变等与口蹄疫病表现相似, 但少数病猪出现中枢神经紊乱症状。
猪水泡疹:持续高热 (24～72h体温达40.6℃～41.8℃) , 鼻盘、唇、口腔、蹄部出现水疱, 疼痛, 以膝着地, 或卧地不起, 结痂脱落。哺乳母猪的乳头、足部等处皮肤也出现水疱, 色灰白, 布满浆液性液体, 稍压水疱即破裂, 露出创面。
猪水泡性口炎:病初体温升高 (40～41℃) , 随后在病猪鼻部、唇部、舌、口腔粘膜出现水疱, 破溃, 蹄叉溃疡病灶扩大, 可使蹄壳脱落, 露出鲜红色出血面跛行;发病率低, 病死率低。
猪痘:病猪体温升高到41℃以上, 无毛少毛部位出现痘疹, 皮肤和粘膜上发生特殊的深红色硬结节丘疹突出于皮肤表面, 破裂后形成痂壳, 病程长, 死亡率低。
4 从病理解剖上进行鉴别
猪口蹄疫:溃烂蹄部, 口腔粘膜、鼻镜、乳房等部有溃疡, 呈黑棕色;肠粘膜严重出血;心包膜有弥散性和点状出血, 心肌切面有灰白色或淡黄色斑点或条纹 (虎斑心) , 心肌松软, 黄褐色似煮肉样。
猪水泡病:除没有虎斑心病变外, 其余基本与口蹄疫病相同。
猪水泡疹:主要病变是水疱, 开始是皮肤小面积变白, 进而形成苍白隆起, 并随着水疱形成而扩大。上皮与基地层分离, 形成一个有破裂上皮碎片的红色病灶。病变通常被粪便污染, 从而导致条件菌继发感染。蹄部病变常伴有蜂窝织炎, 持续水肿, 导致跛行。
猪水泡性口炎:体表水疱性病变是该病的主要变化, 内脏病理变化不明显这。病理组织学变化可见淋巴管增生, 大脑神经胶质细胞和心肌单核细胞浸润。
猪痘:可见鼻、唇、乳头、腹、四肢内侧等皮肤处发生丘疹, 并继发胃肠炎、肺炎, 引起败血症导致死亡。
5 从实验室诊断进行鉴别
猪口蹄疫:剪取水疱皮, 装入青霉素, 采用酶联免疫吸附试验, 检测结果灵敏可靠。
猪水泡病:血清学试验以中和试验较为准确, 病猪在发生水泡后4～5天即在血清中出现中和抗体。
猪水泡疹:用水疱液接种健康猪牛马豚鼠和小鼠, 用于区别口蹄疫。应用中和试验接种组织培养细胞分离病毒进行鉴定。
猪水泡性口炎:把病猪的水疱液取出, 加5倍量的生理盐水, 给牛肌肉注射不发病, 舌面注射发病, 出现水疱, 诊断为水疱性口炎。