猪瘟诊断技术研究

猪瘟诊断技术研究（共8篇）

猪瘟诊断技术研究 篇1

猪瘟 (Classical Swine fever, CSF是由猪瘟病毒 (Classical Swine Feve Virus, CSFV) 引起的猪的一种急性、致死性、高度接触性传染病, 是严重威胁养猪业的烈性传染病, 呈世界范围流行, 严重危害着养猪业的发展, 是世界各国严格检疫防控的重点传染病。国际动物卫生组织 (OIE) 将其列入A类传染病, 我国将其定为一类传染病。我国每年由猪瘟导致的直接经济损失有数十亿元, 造成了巨大的资源浪费。近些年来我国猪瘟在流行病学、临床症状和病理变化等方面出现了较大变化, 发病表现从频发的大流行转变为周期性、波浪式的地区性散发性流行;临床症状和病理变化由典型转变为非典型或温和型, 亚临床感染、持续感染和免疫耐受普遍存在。猪瘟在我国的流行特点及临床表现日益复杂, 依靠常规临床症状和病理变化诊断很难确诊并剔除此类病猪, 给我国猪瘟防控和净化工作带来了挑战。因此, 本文主要对CSFV的病原学方法、血清学方法和分子生物学方法等研究进展进行综述, 为确诊猪瘟提供参考。

1 病毒的分离与鉴定

猪瘟病毒的分离与鉴定是诊断该病最为经典可靠的方法。取疑似病猪的扁桃体、脾脏、肾脏、淋巴结等含毒量高的组织病料加双抗后磨成2%~10%乳剂, 离心取上清、过滤除菌后或采集早期发病猪全血样品 (用肝素或EDTA处理) 于-20℃冻存和37℃水浴融化后, 接毒于带细胞片的PK-l5或猪睾丸细胞培养, 37℃吸附1 h, 弃去接种液, 用MEM洗涤细胞, 然后加生长液培养;细胞不出现病变, 接种48~72 h后取出接毒后的细胞片, 用CSF免疫荧光抗体法或免疫酶染法检查, 可测出细胞培养中盖玻片上细胞浆内的病毒抗原, 亦可将分离的病毒回归到健康猪只体内出现猪瘟的典型症状可确诊。病毒分离鉴定方法特异性高, 是诊断CSFV最为可靠的方法, 但耗时较长, 成本高, 且病毒在传代过程中易发生变异, 不利于对病毒核酸序列的分析

2 血清学诊断方法

2.1 荧光抗体试验 (FAT)

猪瘟荧光抗体检测是一种灵敏而又特异的诊断方法, 是目前国内外实验室诊断猪瘟最常用的方法。许多国家和地区将冰冻组织切片或触片的直接荧光抗体试验作为执行消灭HC规划的法定诊断方法。可用FAT直接检测扁桃体、脾脏、肾脏和回肠远端冰冻切片中的抗原, 且发病早期扁桃体的检出率较高。也可将猪扁桃体和脾制成20 g/L的混合匀浆后接种无瘟病毒污染的猪源细胞 (如PK-15) , 24~72 h后进行飞片FAT试验, 检查细胞中是否存在CSFV。此种病毒分离诊断方法比冰冻组织切片更为敏感。

FAT可用于猪瘟病料和组织培养物的抗原检测, 也可用于培养细胞中猪瘟病毒的抗原检测。此试验的关键因素是利用高效价的特异性免疫血清、提取Ig G、荧光标记, 染色尽可能对FA高倍稀释, 以消除非特异性染色, 设置多种对照, 即已知阴性和阳性标本以及荧光抑制试验等, 以提高试验的准确率。戴爱玲利用荧光抗体技术对20头不同病程的可疑病猪病料样品进行检测, 14头被诊断为猪瘟抗原阳性。结果表明猪瘟荧光抗体染色技术在猪瘟病毒感染早期, 检出率较高, 不仅能检出强毒抗原, 还能检出低毒力病毒感染的带毒母猪。它对猪瘟的早期诊断具有十分重要意义, 猪瘟的常规诊断需要4~5 d, 而该项技术可在半天之内作出判断, 既快速又客观、准确, 在规模化猪场临床上可得到很多广泛应用。

2.2 琼脂扩散试验 (AGP)

琼脂扩散试验是用来检测抗原或抗体的经典实验方法, Molnar建立了琼脂扩散沉淀法, 他提出可选用病猪脾、淋巴结做抗原, 将琼脂糖按1%浓度加入p H8.6硼酸盐缓冲液, 煮沸溶解, 倒入平皿中, 冷却后打孔、加样品, 同时设对照, 置湿盒内37℃孵育, 48 h后观察结果。琼扩试验操作简单、不需特殊仪器、费用低, 但特异性和敏感性差, 现在猪瘟的诊断一般不采用此方法。

2.3 间接血凝试验 (IHA)

IHA能够直观的测出抗体效价, 具有简便、快捷、易操作的特点, 可用于免疫抗体的监测, 利于基层使用, 但不能区分是否野毒感染。

2.3.1 正向间接血凝试验:

正向间接血凝试验是利用CSFV致敏红细胞, 将待检血清梯度稀释后进行抗原抗体反应, 根据红细胞的凝集判断结果。此法能够测出猪瘟抗体效价, 有简便易操作的特点, 可用于免疫抗体的监测。解天珍等用制备的猪瘟间接血凝红细胞抗原诊断液与兰州兽医研究所生产的标准诊断液对猪瘟血清进行检测, 符合率达91%。由于红细胞容易产生血凝现象, 制备诊断液必须排除红细胞处理不当而产生的血凝现象。另外, 病毒细胞培养物应有较高滴度, 必须通过高倍透析浓缩纯化来避免非特异抗原的影响。

2.3.2 反向间接血凝试验:

反向间接血凝试验则是用猪瘟免疫血清提取纯化Ig G, 致敏绵羊红细胞, 用其检测CS FV。此法能够检测组织病料如脾脏、淋巴结、扁桃体中的CSFV抗原, 但由于对组织病料处理方法有差异, 而且组织中的血细胞易造成干扰, 非特异性凝集使得结果判定困难, 因而现在已很少应用。

2.4 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

ELISA是检测抗体的主要免疫学方法, 也是检测猪群抗体水平的主要技术手段, 常用于规模化养猪场的检测。根据ELISA的基本原理发展出了间接ELISA、Dot-ELISA、微波快速ELISA、竞争ELISA以及抗原捕获ELISA。目前建立的多种ELISA方法用于猪瘟病毒抗体及抗原检测, 特别是抗体检测技术在血清学调查、流行病学研究、疫苗免疫效果评估及疫病预防控制中发挥重要作用。

间接ELISA是用CSFV已知抗原包板, 待检血清稀释后加入孔中, 反应后加入HRPO标记的葡萄球蛋白A (PPA) , 作用后加入底物显色, 酶标读数后判定结果。王海震等将猪瘟兔化弱毒株 (HCLV) E2基因插入p EI-32a原核表达载体中, 构建了重组质粒p ET-2e, 将其转化宿主菌BL21 (DE3) , 以IPTG进行诱导表达, 比较不同诱导条件下目的蛋白的表达量, 确定其最佳表达条件, 使外源基因获得了较高水平的表达, 可达菌体蛋白总量的36.6%。并以此重组蛋白作为包被抗原建立了检测CSF血清抗体水平的间接ELISA方法。以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约120头份血清样品进行检测, 结果显示该方法具有较高的特异性和灵敏度, 同时克服了以往检测CSF抗体水平所用抗原为完整的病毒粒子, CSFV不易培养, 滴度低, 难于纯化等缺点。

Dot-ELISA与ELISA相同, 只不过将固相载体换为混合纤维素膜, 比ELISA法操作更为简便。邓何生等应用斑点酶联免疫吸附试验 (Dot-ELISA对四川某规模化猪场的43份免疫母猪的血清进行猪瘟病毒抗体水平检测, 阳性血清30头份, 阳性率达69.8%, 试验证实Dot-ELISA是一种操作简便、准确、快速的检测方法, 特别适应规模化猪场猪瘟抗体水平的监测。

吴耀妹等建立了一种微波快速ELISA, 操作程序与常规间接ELISA法相同, 不同的是微波ELISA法将温育反应置于微波炉中进行, 可使反应时间缩短至数分钟。张富强等基于单克隆抗体、抗原表位的特异性和噬菌体拟位的“放大效应”, 以单克隆抗体为包被抗体, 以噬菌体拟位为“竞争指示剂”, 以抗M13噬菌体主要蛋白p VⅢ的特异性抗体 (标记HRP) 为检测抗体, 建立竞争ELISA用于猪瘟病毒抗原检测, 结果表明所建立的竞争性ELISA比国际标准抗原捕捉ELISA更敏感, 所有试剂不包含任何猪瘟病毒成分, 没有感染性, 可作为猪瘟病毒抗原的常规检测方法。Shannon等报道抗原捕获ELISA (AC-ELISA) 能够检测2种不同CSFV株感染的病猪血液和组织中的抗体。中等毒力CSFV (Weybridge virus) 感染4~6 d后即可检测到存在于血液中和淋巴组织中的抗体, 而弱毒株 (New South Wales virus) 感染7~9 d后可检测到抗体。该方法具有不需进行组织培养、省时 (36 h可得到结果) 的特点, 适用于猪瘟的早期诊断。

2.5 免疫胶体金技术 (IGSS)

免疫胶体金技术以其灵敏度高、简便易行、价廉无毒、样品可较长期保存等优点得到了广泛的应用。该方法最大的特点是简单快速, 特异灵敏, 不需要辅助仪器和辅助试剂, 几分钟内就可用肉眼观察到试验结果, 并可长期保存试验结果。胶体金免疫层析技术现在己经成为最快速敏感的免疫学检测技术之一, 具有巨大的发展潜力和应用前景。其原理是利用胶体金的强吸附能力吸附猪瘟病毒抗体而将其标记, 用待检抗原样本与其结合后, 在标记处大量聚集, 可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点, 表明为阳性, 斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。

孔繁德等[10]建立检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法, 检测试纸盒与猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪细小病毒、新城疫和禽流感等阳性血清不发生交叉反应。将该法与Dot-ELISA法和间接血凝试验同时对200份猪血清进行猪瘟抗体检测比较, 符合率达98.4%和98.9%。郑鸣等[11]用胶体金标记抗原, 运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪瘟病毒抗体检测免疫层析试纸条。该方法操作简单、灵敏度高、特异性好, 能区分强弱毒感染, 适合猪瘟的临床诊断。

2.6 血清中和试验

2.6.1 兔体中和试验:

将猪瘟病毒与待检血清中和后接种兔体, 观察体温变化曲线。当待检血清稀释度大于132时, 则表明待检血清能够保护猪群免受CSFV感染;当待检血清稀释度小于1∶32时, 应当及时对猪群进行免疫接种。由于BVDV和CSFV同源性很高, 在血清学上有交叉反应, 因而血清要分别和CSFV、BVDV做中和试验, 如果抗体效价高, 则可能是感染CSFV, 但要明确区分CSFV、BVDV还需用单克隆抗体技术和核酸探针技术加以区别。

2.6.2 荧光抗体病毒中和试验 (FAVN) :

该法是目前最常用的血清中和试验方法。待检血清经56℃30 min灭活后做适当稀释, 与等体积的200TCID 50/0.1m L的病毒液混合2 h, 然后接入飞片上吸附1 h, 最后加入维持液孵育2 d以上。采用直接免疫荧光方法进行荧光观察, 并设立对照组。结果发现对照组有翠绿色光斑, 而试验组光斑消失[12]。其优点特异性强, 操作简便, 不足之处是仅能定性不能定量。

3 分子生物学方法

3.1 RT-PCR技术

PCR技术的建立带动了分子生物学的飞速发展, 应用RT-PCR技术成功测定多株CSFV的全基因序列, 为CSF的致病机理、免疫机制、检测防控提供了坚实的基础。迄今为止各国学者利用RT-PCR反应扩增并测定CSFV基因c DNA片段序列, 用生软件分析毒株间的遗传进化关系, 追踪CSFV传播来源, 对CSF的防制和扑灭将起不可替代的作用。

乔军等[13]利用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录, 再以此产物为模板对CSFV可疑病料进行了PCR扩增。结果用CSFV特异性引物扩增能得到与设计片段大小相同的产物 (272 bp) , 并且不会扩增猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的核酸, 其敏感性要高于猪瘟荧光抗体染色法、猪瘟强弱毒酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法, 为临床上猪瘟的诊断提供了一个快速、有效的诊断方法。Wirz等[14]据CSFV基因组的高保守区域序列合成引物, 进行RT-PCR, 与组织培养和免疫荧光染色方法进行了对比, 结果发现RT-PCR可更快地区分CSFV。杨利峰等[15]建立的猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法, 将RT-PCR方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合, 用地高辛标记RT-PCR产物, 再用生物素标记的探针在链亲和素包被的微量板孔中杂交捕获地高辛标记的PCR产物, 进行免疫显色得出结果。该方法的敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测高100倍以上。臧金灿等[16]将河南省25个猪场的191只疑似猪瘟发病猪的病料组织进行RT-PCR, 利用DNA star软件将扩增的SFV TK基因进行比较发现同源性均为97.3%, 证明为猪瘟病毒感染。与传统的实验室诊断方法相比, 此方法快速、简便、准确、可以在较短时间内完成大量样品的诊断, 在临床上可广泛应用。

RT-PCR作为检测CSFV的一种方法, 其特异性强、灵敏度高、重复性好, 操作也很简单, 整个过程在1d内即可完成, 能达到快速检测的目的, 并且适合于各种含毒材料的检测, 也可用于临床。此外, RT-PCR技术还可区别与猪瘟相关的病毒, 如BVDV以及能引起和猪瘟相似临床症状的猪病的病毒, 如亚洲猪瘟病毒、伪狂犬病病毒, 其灵敏度可达100%。

3.2 实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术, 以其快速、灵敏、特异等优点在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到了广泛应用。赵建军等[17]应用Taq Man荧光定量RT-PCR对人工感染106TCID50猪瘟石门强毒的猪只的血液中猪瘟病毒RNA进行定量检测, 此方法可以在感染猪出现猪瘟临床症状前3~4 d内作出快速确诊, 此时猪瘟病毒在宿主体内呈低水平复制的潜伏感染, 通过病毒分离、免疫荧光试验、ELISA等诊断方法很难及时而准确地检测到。

3.3 环介导的反转录等温扩增技术

日本学者Notomi[18]博士于2000年建立了一种新颖的恒温核酸扩增方法, 即环介导的反转录-等温扩增技术 (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) 。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种引物, 利用链置换DNA聚合酶在65℃左右的恒温条件下扩增几十分钟, 即可扩增出靶序列。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。该方法操作简便, 用时短, 敏感性比普通PCR高, 适于基层和现场使用。Xing-Juan等[19]采用RT-LAMP技术区分猪瘟兔化弱毒株 (HCLV) 与CSFV, 该方法灵敏度高达5拷贝每个反应, 对72例疑似HCLV的病料进行诊断中, 与荧光实时定量PCR的符合率为94.4%。

3.4 核酸探针技术

核酸探针技术是以病毒基因组为模板, 在分子标记的基础上制备探针, 反转录生成c DNA后进行Southern-blot, 特异的核酸探针会在不同病毒基因组c D-NA上产生特异性条带, 核酸探针技术可对病毒RNA进行定量检测。核酸探针技术有特异性强, 准确可靠的优点, 可用于不同毒株的分离和鉴定, 但需要合成核酸探针, 诊断费用较高。

3.5 基因芯片检测技术

基因芯片是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术, 在基因表达谱、功能基因组、疾病基因诊断等基础研究及临床应用中已经显示出其重要的理论意义和广泛的应用前景。基因芯片是指将大量的核酸分子以大规模阵列形式排布在很小的载玻片等载体上, 通过与标记的样品进行杂交, 检测杂交信号的强弱进而判断样品中被检分子的数量。包被在固相载体上的核酸分子有序排列成微点阵。可用于DNA序列的测定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析, 以及基因组的功能研究等。杨素等[20]分别用水疤性口炎病毒、口蹄疫病毒、CSFV等病毒的一段高度保守的基因片段构建质粒, 在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸, 经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交, 对杂交结果扫描检测, 可同时对上述几种动物传染病进行快速、准确的诊断, 此方法敏感性高, 特异性强, 适合于大批动物的检疫。

摘要：猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的急性、热性、高度接触性传染病, 可引起各种年龄猪发病。随着猪瘟兔化弱毒疫苗在全国范围内推广应用, 猪瘟在我国得到有效控制, 大规模的爆发流行基本停止, 但是猪瘟并未被扑灭, 近年来我国开始出现非典型猪瘟、温和型猪瘟、隐性猪瘟以及“带毒母猪综合征”现象。该病严重威胁着我国养猪业的发展, 给养猪业造成极大的经济损失。文章主要对CSFV的病原学方法、血清学方法和分子生物学方法等研究进展进行综述, 为猪瘟的确诊提供参考。

关键词：猪瘟,实验室诊断技术,研究进展

猪瘟诊断技术研究 篇2

关键词：猪瘟；猪链球菌病；混合感染；诊断；防治

中图分类号： S858.28文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0183-02

收稿日期：2014-04-10

基金项目：国家自然科学基金（编号：31001086）。

作者简介：王凤云（1977—），女，硕士，实验师，从事实验技术及管理方面的研究。E-mail：345994020@qq.com。

通信作者：陈玉霞，硕士，高级实验师，从事兽医药理学与临床诊断方面的研究。E-mail：cyx7304@163.com。猪瘟病毒（HCV）属于黄病毒科瘟病毒属。该病毒含有单股RNA，粒子大多为圆形，直径为40～50 nm。具有脂蛋白囊膜，在胞浆中复制，通过芽生的方法成熟而释放。猪瘟病毒可通过口、鼻、泪腺、唾液及分泌物、尿和粪便排泄出来，易感猪采食了被污染的饲料和饮水或吸入含病毒的飞沫和尘埃时，均可感染发病；而感染猪瘟后，若病程稍长，继发猪链球菌病，则表现出复杂的症状，给诊断工作带来极大的难度。为此，应从多方面给猪场的疫病做进一步的诊断[1-3]。2013年5月，在河南省漯河市某规模化养猪场暴发了以母猪繁殖为主要特征的传染病。该养殖场母猪800头，仔猪发病率15%、死亡率23%，母猪产死胎、木乃伊胎和流产。对送检4头濒死仔猪进行了病理剖检实验室诊断，通过临床症状及发病情况来观察，从而诊断为猪瘟病及猪链球菌病混合感染，并通过采取有效的综合防治措施，使疫情及时得到有效的控制，具体情况介绍如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要器材37 ℃恒温箱、微量加样器、冰箱、暗箱、离心机、手术器械、显微镜、血液琼脂平板、普通琼脂平板。

1.1.2病料濒死仔猪血清4份、濒死仔猪4头。

1.1.3试验动物健康家兔2只（由河南农业大学牧医工程学院动物房提供）。

1.1.4试剂革兰氏染色液、猪瘟兔化弱毒疫苗、猪瘟病原测试试剂盒（爱德士公司提供）。

1.2方法

1.2.1临床诊断在养猪场通过向猪场的养殖人员、技术人员询问疾病的发生、发展及流行情况、疫苗使用情况，并结合该猪场流行病发生情况等方法，进行流行病学调查。

1.2.2动物剖检逐一对4头濒死仔猪的心、肝、肺、脾、肠、喉头和膀胱进行仔细检查，并认真记录观察到的结果。

1.2.3细菌学检查取每头猪的心、肝、肺的病料分别接种于普通琼脂、血液琼脂平板培养基上，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，挑去单个菌落涂片、革兰氏染色、镜检，并进一步做必要的生化试验。

1.2.4猪瘟病原的ELISA试验（1）每头猪取病变的扁桃体、脾、淋巴结各2 g，用剪刀剪碎、研磨，移至10 mL的离心管中，加入5 mL的样品稀释液，涡旋振荡；在室温下孵育2 h，并不时涡旋混合，然后在1 500 r/min的离心机上离心30 min；取上清液备用。（2）每孔加入25 μL CSFV特异单克隆抗体，在相应的孔中加入75 μL做阳性和阴性对照，注意更换滴头。（3）在其余孔中分别加入75 μL（1）中备好的样品，轻轻吹打酶标版，使样品混合均匀。（4）將其置于室温（18～22 ℃）孵育过夜。（5）甩掉孔中的液体，用洗涤液洗涤5次，每次间隔3～5 min，在每次洗涤时都要将孔加满。将孔中所有的液体甩掉，用力拍打酶标版，使所有的液体拍出。（6）每孔加入100 μL稀释好的酶标二抗，室温下孵育 1 h。（7）重复操作步骤（5）。（8）每孔加入100 μL底物，在暗处室温孵育15 min。（9）每孔加入100 μL终止液终止反应，加入终止液的顺序与上述底物的顺序一致。（10）在酶标仪上测量样品与对照孔在450 nm的吸光度（D），参照阳性对照计算结果。D校正值=D样品值/D阳性对照-D阴性对照（注意：阳性相对照值D>0.500和阴性对照值D<0.150检测有效）。结果判断标准：D校正值≥0300，结果为阳性；D校正值<0.200，则为阴性；0.200≤D校正值<0.300，则为可疑。

1.2.5兔体交叉免疫试验取濒死猪的脾5 g，灭菌生理盐水50 mL悬液，加入青霉素、链霉素各1 000 IU/mL，4 ℃冰箱过夜；接种3 kg重的健康家兔，每只家兔肌肉注射脾组织悬液上清液3 mL，观察7 d后再与对照组家兔分别静脉注射 1 ∶20 猪瘟兔化弱毒疫苗，接种后24 h开始测温，6 h 1次，连续测3 d。

2试验结果

2.1临床诊断

病猪外观消瘦，被毛粗乱，精神不振，不愿意活动。如果强制使猪站起，个别猪呈弓背姿势。病猪食欲减退，体温升高至 40.5～42 ℃，稽留热；病猪有结膜炎、便秘、腹泻，皮肤有紫色或出血，指压部褪色。大多数3～6 d即可出现死亡现象；仔猪出现磨牙、运动障碍、痉挛和后驱麻痹等神经症状，常喘气。

2.2动物剖检

病死猪颌下和腹股淋巴结发黑，切面为紫黑色（4/4）；心内膜有少量的针尖状出血点（3/4）；肺脏心叶、尖叶和小叶气肿、虾肉样肉变，胸部腹水增多（3/4）；血液凝固不良，呈紫黑色（4/4）；脾脏边缘梗死，呈黑色，中间有黑色梗死斑（4/4）；胃底黏膜有少量针尖状出血点（1/4）；肾脏呈褐色，黏膜有弥漫性针尖状出血点（4/4）；肠系膜淋巴结呈棕黄色，回盲口处有钮扣样坏死灶，膀胱黏膜有少量出血点（1/4）。

猪瘟诊断方法研究进展探析 篇3

1 血清学诊断方法

猪瘟ELISA试验是世界动物卫生组织推荐的血清抗体检测方法。Clavijo等利用CSFV E2基因表达产物制成单克隆抗体, 建立了竞争ELISA方法, 利用此方法对临床健康猪和试验感染猪血清2 000份进行检测。结果表明其特异性和敏感性分别达到100%和86%, 并能在人工感染后21d检测到抗体。周宗元等[1]应用猪瘟兔化弱毒抗原与HRP-SPA建立了HRP-SPA-ELISA方法检测CSFV抗体。周广森等[2]应用HRP-SPA-ELISA对某猪场40份母猪血清和240份仔猪血清进行检测, 发现母猪中有10%隐性猪瘟感染者, 仔猪中有3.7%的隐性猪瘟感染者, 证明了隐性猪瘟的母猪是垂直传播和水平传播的传染源。Shannon等[3]报道抗原捕获ELISA能够检测2种不同株CSFV感染的病猪血液和组织中的抗体。余兴龙等[4]以在大肠杆菌中高效表达的CSFV E2基因主要抗原编码区 (m E2) 基因产物为抗原, 以HRP标记的兔抗猪Ig G为二抗, 建立了检测CSFV抗体的间接ELISA方法, 试验证实用重组m E2蛋白作为诊断猪瘟的抗原, 具有特异性高、易纯化和成本低等优点。Saunder、邱惠深、房德兴等分别建立了快速酶标微量技术、淋巴细胞杂交瘤技术和单克隆抗体ELISA抑制法等免疫酶测定技术, 这些测定技术均以猪瘟单克隆抗体为基础[5,6,7]。

兰州所李树春等[8]进行了猪瘟间接血凝试验的研究。将猪瘟兔化弱毒株细胞培养物纯化后, 用醛化绵羊红细胞致敏, 制成间接血凝诊断液, 用以检测血清中的猪瘟抗体效价。该方法具有操作简单、无需特殊仪器、快速和适于大量样品的检测等优点, 非常适合基层单位的推广应用。

胶体金免疫层析技术是近几年国内外兴起的一种快速诊断技术, 目前分为2类。一类是与仪器配套的自动化免疫分析, 另一类是以硝酸纤维素膜为载体的快速免疫分析。金颜辉等[9]应用该技术进行了检测猪瘟抗体的研究, 共测试了30份标准阳性血清和18份标准阴性血清, 符合率100%, 用该方法进行现场检测具有直观、准确、便捷等优点。

2 病原学诊断方法

荧光抗体试验是Robertso[10]于1965年首次报道的。主要应用于猪瘟病料和组织 (Flurorescent Antibody, FA) 培养物的检测。主要是用扁桃体、脾、肾、回肠末端等器官制作冰冻组织切片, 或将病料乳剂接种于敏感细胞, 培养后也可用FA检测猪瘟抗原。高免血清的制备是试验的关键, 一般是将猪只免疫6次后提取血液, 提纯免疫球蛋白, 进行荧光素标记。目前已有多家商品化的产品可供选择。FA方法简便、快捷、可靠, 所以许多国家将其作为执行猪瘟扑灭计划的法定诊断试验。

反转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 是以病毒RNA为模板进行反转录后, 再以PCR进行核酸扩增来检测CSFV的方法。罗廷荣等[11]应用RT-PCR对来自广西不同地区的135份疑似猪瘟病料进行检测, 阳性率为6.2%。另从柳州地区采集的健康猪扁桃体和淋巴结276份, 检测阳性率为13.4%。其中扁桃体检出阳性率高于淋巴结检出阳性率, 证实了RT-PCR技术的临床诊断方法可行性。刘海鹏等[12]建立了口蹄疫病毒与CSFV的二联RT-PCR诊断方法, 对2种病毒的敏感性可达到10-4倍稀释, 约10pg的总RNA。证明了该方法对这2种病毒诊断的高度敏感、特异等特点。Liu等报道了用RT-PCR方法检测感染组织中的CSFV, 其敏感性达到10-4TCID50。令人感兴趣的是当用巢式RT-PCR进行检测时, 敏感性可提高1 000倍, 这对疫病的及时诊断将有更大帮助。Choi等利用巢式RT-PCR对人工接种CSFV的5头公猪精液进行了检测, 结果在接种后7d便检测出了阳性精液。

随着RT-PCR技术的日益成熟, 实时PCR和荧光定量PCR以其灵敏、快速的优点赢得了关注。Risatti等 (2003) 应用荧光实时RT-PCR对CSFV快速检测进行了研究, 试验结果表明该方法的敏感性可以达到甚至超过病毒培养[13]。而在扁桃体和肾中的病毒RNA可以在出现临床症状的前2~4d前检测出, 试验只需不多于2h的时间。陈玉栋等 (2003) 建立了快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术[14]。该方法是在兔化弱毒株的5’-UTR区设计了一对引物和一条荧光探针, 利用荧光PCR原理, 结合Ligh Cycler检测系统而建立的。结果表明, 该方法灵敏度可达100个拷贝数, 线形范围为6个数量级。利用该方法对9份疫苗样品进行了检测, 与兔体定型热反应方法相比较有很好的相关性, 更重要的是整个检测只需4h, 极大地节省了时间, 为CSF的及时诊断创造了有利条件。

猪瘟胶体金快速诊断法的研究进展 篇4

1 利用胶体金技术检测猪瘟抗原

陈龙斌等 (2007) 用15 nm的胶体金颗粒标记兔抗猪瘟病毒的多克隆抗体, 研制的试纸条可以检测猪瘟病料中的猪瘟病毒。该法与直接猪瘟荧光抗体试验和RT-PCR试验的阳性检出率分别为36.4%、45.5%和72.7%, 虽然阳性检出率较后两者低, 但该法操作简单、耗时短, 可用于猪瘟的流行病学调查。张长弓等 (2007) 应用胶体金标记猪瘟病毒单克隆抗体 (Ab2) 制成检测CSF抗原的“猪瘟抗原胶体金快速检测试纸”。该试纸条可以检测猪瘟病毒和猪瘟弱毒活疫苗, 而对猪源性的其他病毒、细菌抗原均呈阴性, 且具有微量、特异、快速和简便等优点, 可以作为检测猪瘟抗原的一种新试剂。姜成等 (2009) 、付连军等 (2011) 通过采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金, 选择15 nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒纯化后的多抗, 组装免疫层析试纸条, 用试纸条和荧光抗体试验同时对8份猪瘟可疑病料进行检测, 结合阳性符合率为83%。

夏照和 (2008) 采用环磷酰胺免疫抑制法, 用纯化的杆状病毒表达的猪瘟疫苗株 (HCLV株) E2蛋白作为耐受原, 石门株E2蛋白作为免疫原免疫小鼠, 获得抗E2蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体可以用于鉴别猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株, 为研究猪瘟强毒和弱毒之间的分子差异奠定了基础。杨明等 (2010) 用胶体金标记猪瘟特异性单克隆抗体, 将纯化的CSF抗体和羊抗鼠Ig G分别包被在硝酸纤维膜上作为检测线和质控线, 然后用所研制出的试纸条检测了70份待检样品, 结果与病毒分离鉴定的符合率高达92.8%。用试纸条对猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等进行检测, 无交叉反应, 敏感性较高。王向鹏等利用猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体为捕捉抗体, 建立了快速、简便的检测猪瘟病毒野毒的胶体金免疫层析方法。该试纸条不与猪瘟兔化弱毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型等反应, 其检出病毒培养物的最低检测限为103.5TCID50, 具有良好的特异性、敏感性和重复性。初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的, 目前已申请了专利, 为猪瘟强、弱毒的鉴别诊断提供了高特异的快速诊断方法, 应用前景广阔。

2 利用胶体金技术检测猪瘟抗体

孔繁德等 (2003) 以猪瘟抗原包被硝酸纤维素膜, 用胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白 (SPA) 直接显色 (阳性者出现红色斑点) , 建立了检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒。该试纸盒操作简单, 整个试验过程仅需5 min, 与猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪细小病毒病等阳性血清不发生交叉反应。应用该试纸盒与Dot-ELISA法、间接血凝试验同时对200份猪血清进行猪瘟抗体检测比较, 结果符合率达98.4%和98.9%, 非常适用于猪瘟的早期诊断和普查, 以及疫苗接种后抗体水平的检测。王荣等 (2009) 在此基础上, 将提纯的猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗原同时包被在硝酸纤维膜上, 利用胶体金标记SPA显色, 建立了能同时检测CSF和PRRS的双重斑点免疫金渗滤法, 该方法可以同时检测CSF和PRRS两种抗体, 且特异性高、重复性好, 对这两种疾病的预防和临床检测具有十分重要的意义。

刘畅、郑鸣、王慧杰、李华玮等以猪瘟兔化弱毒E2基因表达后的纯化蛋白为弱毒抗原, 以PK-15细胞培养纯化后的猪瘟病毒强毒为强毒抗原进行胶体金标记, 运用双抗原夹心法建立了猪瘟抗体检测的免疫层析试纸条。该试纸条与猪瘟兔化弱毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪传染性胸膜肺炎、猪衣原体、猪萎缩性鼻炎等无明显的交叉反应, 显示了较好的特异性。此外, 该试纸条可很好地避免因试验操作误差造成的假阳性、假阴性, 还具有操作简单、灵敏度高、不需特殊设备、价格低廉、能区分强弱毒感染等优点, 非常适合基层实验室对猪瘟的临床诊断和现场检测。同时, 该试纸条的建立在典型猪瘟标记疫苗的研制与应用中具有重要的血清学鉴别功能, 对于监测猪瘟病毒流行情况、疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要的作用。

李学伍等 (2012) 利用基因工程方法将猪瘟病毒C株Erns和E2基因主要抗原域连接后在原核表达系统中表达, 获得嵌合蛋白Cn C2, 将纯化后的嵌合蛋白进行胶体金标记, 并在硝酸纤维膜上包被抗Cn C2单克隆抗体, 建立了猪瘟抗体检测的免疫层析试纸条。该试纸条可在5 min内出检测结果, 无需特殊仪器和技术, 敏感性和特异性分别高达97%和100%, 非常适合猪瘟抗体滴度的临床检测和调查。

3 讨论

胶体金免疫技术具有快速、灵敏、操作简便等优点, 可最大限度地避免试验过程中各种因素的干扰, 并减轻实验室人员的工作强度, 为猪瘟的快速诊断提供了新模式, 特别适用于基层防疫员和规模户, 是未来猪瘟临床诊断的主要发展方向。但随着该技术的临床应用, 胶体金试纸的一些问题也逐渐暴露出来。

综合以上文献可以看出, 胶体金试纸条的猪瘟阳性检出率从36.4%到92.8%不等, 与操作相对复杂、耗时相对较多的ELISA、荧光抗体试验相比, 还是有漏检和误检。因此, 试纸的敏感性、特异性还需进一步提高和加强。笔者建议从以下几方面进行改进:一是完善胶体金的制备工艺, 最好能够实现标准化和程序化, 从而提高胶体金的质量, 提高检测的准确性和可重复性, 减少假阳性、假阴性;二是确定金溶胶与被标蛋白质的最佳用量比例, 每次标记时都要测定二者具体的稳定点, 以获得最佳标记率;三是改变蛋白吸附时的p H值, 以此调节膜的蛋白吸附量, 从而提高检测的灵敏度;四是要尽量提高金标蛋白的纯度, 最好是使用纯化后的单克隆抗体等来提高试纸条的敏感性。

此外, 笔者从王荣等 (2009) 的试验中可以预见, 胶体金试纸条还可以有更多的发展。即可以在同一膜上同时包被多种抗原或抗体, 当进行一次检测时即可得到多个项目的测定结果, 实现猪瘟与其他猪病的鉴别诊断。

参考文献

[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].北京:中国农业出版社, 2001.

[2]Tanaka R, Yuhi T, Nagatani N, et al.A novel enhancement assay for immunochromatographic test strips using gold nanoparticles[J].Anal Bioanal.Chem., 2006, 385 (8) :1 414-1 420.

[3]陈龙斌, 王爱华, 苏小庚, 等.猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学, 2007, 37 (6) :496-499.

[4]姜成, 李沐森, 付连军, 等.猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用[J].当代畜牧, 2009, (5) :17-19.

[5]付连军, 姜成, 李沐森, 等.猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用[J].畜牧兽医杂志, 2011, 30 (3) :17-19.

[6]夏照和.特异性识别猪瘟病毒野毒株的单克隆抗体制备[D].长春:哈尔滨兽医研究所, 2008.

[7]杨明, 陈伯祥, 孙晓林, 等.猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制[J].甘肃农业大学学报, 2010, 45 (2) :34-37.

[8]王向鹏, 孙元, 杨增岐, 等.检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立[J].中国兽医预防学报, 2010, 32 (6) :441-445.

[9]王荣.猪瘟和蓝耳病快速检测方法的建立和应用[D].福建农林大学, 2009.

[10]王慧杰, 宁豫昌.猪瘟胶体金免疫层析快速诊断法的建立及应用[J].中国农学通报, 2007, 23 (6) :61-64.

[11]李华玮, 郑鸣.胶体金免疫层析法检测猪瘟 (强弱毒区分) 抗体研究[J].广东农业科学, 2012, (7) :130-132.

猪瘟免疫失败原因及技术研究 篇5

疫苗介绍

【性状】本品为海绵状疏松固体, 呈乳白、淡黄或淡红色, 易与瓶壁脱离, 加入生理盐水后, 迅速成为均匀的混悬液。

【用途】供预防猪瘟。

【免疫期】注射后4日即产生可靠的免疫力, 离乳后仔猪的免疫期可达1年半。哺乳仔猪产生的免疫力不坚强, 必须在离乳后再加强免疫1次。

【用法与用量】按瓶签所标示的头份量, 于无菌条件下, 加入灭菌生理盐水, 使每头份稀释成1毫升混悬液。于股内、后臀或耳根背后, 行皮下或肌内注射。无论猪只大小, 用量均为1毫升。头份量有剩余时, 可注2毫升。在无猪瘟流行的地区, 如猪只在60日龄时断奶, 则于断奶后免疫1次即可;如猪群周围有疫情, 则以2次免疫法为宜, 1次在21-30日龄时, 1次在断奶后 (65日龄左右) 。怀孕母猪也可注射。乳兔组织冻干苗, 按瓶签规定的用量行皮下或肌内注射。

【反应】一般无不良反应。个别猪可出现体温升高、减食或停食, 经1-3日即可恢复, 对健康无不良影响。

【保存期】于-15℃冷冻条件下保存, 有效期为1年;0-8℃冷暗干燥处保存, 有效期为6个月;8-25℃阴暗干燥处保存, 有效期为10日;保存温度超过25℃以上的, 不能使用。

【注意事项】 (1) 本品在运输时, 如气温在8℃以下, 可用普通包装;若超过8℃, 必须用冷藏包装。 (2) 收到冷藏包装的疫苗后, 应立即保存于8℃以下的环境中, 如果保存在8-25℃的环境中, 则须在10日内用完。 (3) 稀释后的疫苗, 如气温在15℃以下, 6小时内用完;如气温在15-27℃则应在3小时内用完, 过时不可再用。 (4) 病、弱猪, 食欲、体温不正常的猪都不可注射。 (5) 给怀孕母猪注射时, 操作要谨慎, 以免引起流产。

2 猪瘟免疫失败的技术研究

2.1 保证疫苗质量

疫苗质量是控制猪瘟的关键环节, 从我国疫苗研制质量来看猪瘟疫苗的质量安全得到的保障, 疫苗研制能够实现安全有效的使用效果, 并且疫苗使用范围在不断的扩大, 但是也要注重对于疫苗的管理等各环节的质量控制。首先要严格按照疫苗运输、保存等要求进行疫苗的管理工作。其次对于疫苗的使用要做到及时使用, 并且在2小时内使用完疫苗。

2.2 疫苗的剂量

我国目前猪瘟疫苗的剂量标准还存在争议, 我国每头份150个免体反应单位与国外国家的单位药剂量标准还存在一定的差距, 剂量的不足容易造成猪瘟的发生, 因此有的专家提出来要增加我国疫苗剂量, 比如加大首免疫苗用量为4头份/头, 通过这样的剂量增加可以提高猪身体的免疫能力, 降低其被感染的机率。

2.3 规范免疫操作

在保证疫苗质量的情况下, 要提高对于猪体进行疫苗注射仪器的消毒处理, 避免因为注射仪器的病毒感染而导致的猪瘟发生, 具体操作步骤:首先在进行疫苗注射前对注射器进行彻底消毒;其次注射的深度要保证进入猪的身体内, 防止注射过浅而影响疫苗的吸收;最后要选择合适注射针头, 要根据猪的大小等选用适合的注射针头。

2.4 控制免疫抑制性疾病, 合理使用兽药

正确使用兽药。 (1) 坚持预防为主、治疗为辅。畜禽疾病要进行早期预防, 尤其是畜禽传染病, 应按照免疫程序, 做到有计划、有目的适时预防疾病。不要发病时才注重治疗, 增加成本又起不到效果。 (2) 严格按照适应症、用法与用量、休药期、免疫规程等兽药安全使用规定使用兽药。 (3) 农业部兽用处方药管理办法颁布实施后, 严格按照规定凭执业兽医师开具的处方购买、使用处方药。 (4) 不将不是“兽药添字”产品批准文号的兽药预混剂违规添加在饲料中使用。 (5) 不直接将原料药添加到饲料及动物饮用水中, 或者饲喂动物。 (6) 严格按照规定建立完整真实的用药记录。 (7) 不将人用药品用于动物, 不销售尚在用药期、休药期内的动物及其产品用于食品消费。 (8) 严格执行农业部规定的兽药休药期, 避免兽药残留超标。

2.5 建立免疫抗体监测系统

猪瘟的发生具有严重的危害性因此需要建立免疫抗体检测系统, 及时观察猪的免疫情况, 对于没有免疫抗体的要进行疫苗注射, 如果在注射以后仍然存在问题的要进行隔离处理, 根据免疫抗体检测系统及时发现潜在存在感染的或者已经感染的而没有症状表现的猪, 避免猪瘟的进一步传播。

2.6 做好消毒工作

猪瘟发生与猪的生活环境具有重大的关联, 因此要对于猪场环境进行严格的消毒处理等措施保证猪场的卫生。应该选用具有高效的消毒剂进行环境消毒, 对于疫苗注射器要进行干净清洁之后选用高压消毒锅进行消毒, 而不能简单处理, 对于注射部位的消毒也要严格按照疫苗说明书进行消毒处理。

2.7 加强饲养管理

猪瘟的发生与猪的饮食存在一定的关联, 因此要在猪的饲料中加强相应的物质, 提高猪的抵抗力, 降低猪对于外界环境的变化的不适, 同时还要加强对于猪场的科学管理, 通过有效的管理措施提高猪场的环境卫生, 降低猪的疾病发生。合理配置猪场的存猪数量, 做好猪场的冬夏温度控制, 最大程度降低温度对于猪的影响。

摘要：猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病。长期以来, 我国对猪瘟采取了包括强制免疫、加强检疫和疫病监测、处理病死猪等综合防制措施, 有效地控制了猪瘟的传播和流行。即便如此, 猪瘟仍是当前猪病之首, 是养猪场首先要控制或净化的疫病, 为此笔者就猪瘟免疫失败原因进行分析, 并提出相应的对策。

关键词：猪瘟,免疫失败,原因

参考文献

[1]邵园青, 金星方, 陈建民, 等.南方夏季猪高热性疾病调查与回顾[J].养猪, 2007 (1) :21-22.

[2]钟官武, 江桂林, 曹建新.猪瘟 (HC) 发生的特点、原因及防治对策[J].湖北畜牧兽医, 2008 (8) :20-22.

猪瘟的诊断与防治 篇6

猪瘟俗称"烂肠病"是一种由猪瘟病毒引起的具有急性、热性、高度的传染性疫病, 死亡率极高, 是威胁养猪产业的一种传染病, 以发病急, 高稽留热性病和细小血管壁变化引起的广泛出血, 梗塞和坏死等变化, 为其特征, 我国的《中华人民共和国动物防疫法》及《家畜家禽防疫条例实施细则》列为一类传染病。

2 猪瘟病的流行特点

2.1 猪瘟病的病原学特性

猪瘟病毒归属为黄病毒科瘟病毒属, 具有囊膜的单股环琏RNA病毒, 病毒粒子, 具有二十面体非螺旋型核衣壳。

本病毒, 对外界环境抵抗力强, 耐低温和400℃以上的高温, ρH3.0~ρH 11.0, 乙醚、氯仿, 2%的氢氧化钠, 1%的福尔马林可激活。

2.2 流行病特点

在自然条件下, 只感染猪, 不感染其它动物, 一年四季均可发生, 呈流行型或地方流行型传播, 猪瘟的传播主要是通过接触, 经消化道、呼吸道感染, 感染母猪经胎盘垂直传染, 病猪经治愈后, 病猪利用潜伏期带毒猪的排泄物, 病死猪的脏器和尸体, 饮水都可传染疾病。

3 猪瘟病的临床症状和剖解病变

3.1 临床症状

病猪表现、呆滞、弓背、寒颤、怕冷、低头垂尾、喜卧及行走摇晃, 食欲减退或废绝, 喜引水、体温明显升高, 稽留热, 浓性质膜分泌物, 先便秘后拉稀, 有血液腹泻、大便恶臭, 齿龈后唇断有溃疡或血斑, 后期全身皮肤出血发绀, 非常明显。

母猪死亡率高, 死亡率70%~80%, 哺乳仔猪神经症状, 运动障碍转圈昏迷, 有的后肢麻痹, 可诊断为急性期猪瘟。

有的猪体温不高, 出血, 全身瘦弱, 病程可达1个月左右, 食欲时好时坏, 便秘, 腹泻交替发生, 耳边、尾根、四肢皮肤坏死, 脱落成为猪病, 临床可诊断为慢性猪瘟。

感染猪一段时间不表现症状, 数月后出现厌食, 不活泼, 结膜炎, 半年后后肢麻痹, 怀孕母猪可以群发性流产、死胎、干尸化, 造成母猪临床上表现不典型, 发病率、病死率、仔猪死亡率都高, 大猪能耐过, 诊断为非典型猪瘟。

3.2 解剖症状

3.2.1 急性期, 无明显病变, 黏膜有少量的出血点。

3.2.2 泛发性出血性病变, 呈败血症状, 全身淋巴结肿大, 有暗红色, 切面出血, 切面周围出血明显, 整个呈红白相间的大理石样的血斑, 脾脏不肿大, 表面及边缘可见出血性梗死, 突出被膜表面, 肾脏不肿大, 有散在的出血点, 盲肠、回盲口及结肠出现大小不一圆形的纽扣状溃疡, 喉头, 会厌软骨, 膀胱黏膜, 心外膜, 肺外膜, 浆膜有出血点。

3.2.3 左胁骨、软骨明显联合处有一条呈黄色, 螺旋钙化线永不消失。

3.3 诊断

3.3.1 临床诊断。

详细了解, 发病经过, 头数, 传染途径, 临床症状, 精神状态, 体温变化, 食欲、粪便形状, 凡是发病5~7 d, 生长猪、呆滞, 怕冷, 食欲减退, 呈稽留热, 41℃左右, 淋巴结肿大、便秘、腹泻交替进行, 结合、解剖、肾脏、淋巴结有出血点, 有大理石花纹, 肠道有纽扣状溃疡, 根据临床资料及解剖资料, 即可诊断为猪瘟。

3.3.2 实验室诊断。

荧光抗体法, 采取病猪的淋巴结, 经小块, 用冰冻切片, 放入荧光显微镜观察, 如图片观察, 呈现黄绿色荧光, 即可诊断为病料中含有猪瘟病毒。

4 猪瘟的防治

4.1 防治措施

虽然没有特效药可以治疗, 可以对症治疗和防治继发感染。

4.1.1 用优质高效的猪瘟弱毒疫苗紧急接种6~10头份。

4.1.2 三步骤治疗:

(1) 用聚能一号与猪瘟疫苗同时进行; (2) 3 d后, 可用聚能核肽配合氟苯尼考配合治疗; (3) 水肿加电解多维, 黄芪多糖粉进行治疗。

4.2 预防措施

4.2.1 用三联苗 (猪瘟、猪丹毒、猪肺疫) 免疫接种。

4.2.2 开展免疫检测, 抗体含量是否达标。

4.2.3 加大剂量对母猪, 配种前注射4倍量的疫苗。

4.2.4 制订科学合理的免疫程序。

(1对于散养农户实行春、秋两季集中强制免疫; (2) 对于公母猪每年两次集中免疫, 小猪双月免疫; (3) 初生小猪乳免疫一次; (4) 母猪断奶或产后20日龄随同小猪一起进行; (5) 养殖场外购仔猪, 购回后一次免疫。

5 体会

5.1 日兴镇是仪陇县生猪养奖励大县项目镇, 严格按照猪瘟防疫流程处理零星散在的猪瘟发生的疫点, 本镇已取得了无猪瘟发生的乡镇。

5.2 猪瘟是全世界流行性的疾病, 一定要严格按照规程, 克服资金不足, 防疫猪瘟的观念淡薄, 人力不足的困难, 确保本镇无猪瘟病等重大疾病的发生。

摘要：猪瘟是由猪瘟病毒引起的一类传染病。不同性别、年龄、品种的猪, 母猪、野猪都可感染, 一年四季可发病, 临床上较难控制, 治疗效果不理想, 就算治愈好了可能成为带病猪, 感染其它猪, 病死率高。文章对猪瘟的流行物点临床症状进行了介绍, 提出了相应的防治措施。

关键词：猪瘟,病原学,诊断,防治

参考文献

[1]蔡宝祥.家畜传染病学第四版, 中国农业大学出版社, 2001.

[2]陆永平.兽医微生物学第三版, 中国农业出版社, 2001.

猪瘟的诊断及防治 篇7

猪瘟是一种高度接触性传染病。表现为急性、慢性、不典型性或不显病状的病程。急性猪瘟由强毒引起,其特点是高热稽留和局部器官的广泛出血、坏死,发病率和死亡率高。

猪瘟病毒(HCV)属于黄病毒科,瘟病毒属。猪肾细胞是最常用的培养猪瘟病毒的细胞。病毒在细胞浆内复制,不产生病变。本病毒主要存在于病猪的血液和组织中,以淋巴结脾脏和血液含度量最高。病猪的粪便及分泌物中也含有较多量的病毒。

猪瘟病毒对环境的抵抗力不强,60℃10 min可使细胞培养液失去传染性,而脱纤血中的病毒在68℃30min上不能灭活。含毒的猪肉和猪肉制品几个月后仍有传染性。2%氢氧化钠是最合适的消毒药。

2流行病学

猪是本病的唯一宿主,病猪是最主要的传染源。易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。感染猪在发病前即可从口、鼻、及泪腺分泌物、尿和粪中排毒,并延续整个病程。康复猪在出现特异性抗体后停止排毒。因此,强毒株感染在10~20 d内排出大量病毒,而低毒株出生后感染以排毒期短为特征。强毒株比低毒株在猪群中传播速度快,造成的发病率高,慢性的感染猪不断排毒或间歇排毒。

猪群引进外表健康的感染猪是猪瘟爆发最常见的原因。病毒可通过猪肉和猪肉制品传播。未经煮沸消毒含毒残羹是重要的传播媒介。人和其他动物也能机械性的传播病毒。在自然条件下,病毒的传染途径是口、鼻腔、间或通过结膜、生殖道黏膜或皮肤腺进入。经口和注射感染后,病毒复制的主要部位是扁桃体;经淋巴管进入淋巴结继续增殖,随即到达外周血液。病毒在脾、骨髓、内脏淋巴和小肠淋巴组织繁殖到高浓度导致高水平的病毒血症。

3症状

根据临床诊断和其他特征,猪瘟可分急性型、慢性型和迟发型三种类型。

3.1急性型

病初猪群内仅有少数显示临诊症状,表现呆滞,被驱赶时站立一旁,弓背或怕冷状,或低头垂尾。同时食欲减少进而停食,体温升高至14℃上下,两眼有多量浓液性分泌物,时而眼完全封闭,体温升高之初便秘,随后发生下痢,有的发生呕吐,少数病猪可发生惊厥,常在几小时内或至多几天内死亡,随着病程的发展,猪群更多的猪发病,最初出现步态不稳,随后常发生后肢麻痹,病初的皮肤充血到后期变为紫绀区或出血变化,大多数病猪在感染后10~20 d死亡。

3.2慢性型

慢性型猪瘟主要表现为消瘦,贫血,全身衰弱,常伏卧,行走时缓慢无力,时有轻热,食欲不振,便秘和腹泻交替,有的皮肤可见紫斑和坏死痂,病程可达一个月以上,有的能够自然康复。

3.3迟发型

先天性感染猪在出生几个月可表现正常。随后发生轻度食欲不振,精神沉郁、结膜炎、皮炎、下痢、运动失调。体温正常,大多数能存活6个月以上,但最终死亡。先天性感染可导致流产、胎儿木乃伊、畸形、死胎、死产产出有颤抖病状的弱仔或外表健康的感染仔猪。

4猪瘟的病理变化

最急性的常缺乏明显病变,急性和亚急性呈现从多发性出血为特征的败血症变化,此外,消化到、呼吸道和泌尿生殖道有卡他性、纤维素性和败血性炎症反映。淋巴结水肿、出血、肾脏的出血以皮质表面最常见,此外,全身浆膜、黏膜和心、肺、膀胱、胆囊均可出现大小不等,多少不一的出血点或血斑。脾脏梗死是猪瘟最有诊断意义的病变。慢性猪瘟的出血和梗死变化不大。迟发型猪瘟的突出变化是胸腺萎缩,外周淋巴器官严重缺乏淋巴细胞和生化滤泡。先天性猪瘟病毒感染可引起胎儿木乃伊化,死胎和畸形。死产的胎儿最显著的病变是全身皮下水肿,皮肤和内脏器官有出血点。

5诊断

诊断目前多是根据流行病学特点,临床表现和病理变化综和诊断,必要时应作实验室检查和类似症状疾病鉴别诊断。

5.1一般诊断

5.1.1流行病学调查一般在流行开始,猪群内仅有1~2头发病,并显急性过,然后1~3周出现发病高峰,同时了解猪群免疫注射情况,药物治疗效果。

5.1.2临床诊断最急性型死亡迅速,病状不典型。最有诊断的是急性型的临床特征,精神萎靡,食欲底下,高热稽留,白细胞和血小板减少,全身衰弱,后驱无力,可溶性结膜炎,先便秘后腹泻,病初皮肤出现紫斑,中后期有出血点,公猪包皮积尿,幼龄猪出现特殊精神病状等。

5.1.3尸体解剖多数淋巴结特别是内脏淋巴结边缘出血,脾脏边缘有出血性梗死状,肾脏有出血点,扁桃体肿胀,出血坏死。咽喉、胆囊、膀胱、直肠、心脏内外膜均有出血点,病程长的亚急性或慢性型,盲肠结肠尤其是回肠口有扣状溃疡。

5.2细菌学检查

5.2.1采取病猪心包液、心血、肝、脾、淋巴结等进行涂片(触片),染色、镜检或作分离培养均为阴性,猪瘟可能性大。

5.2.2兔体交换免疫检查猪瘟病毒不能使家兔发病,但能使之产生免疫,而兔化猪瘟病毒则能使家兔产生热反应。将病猪的病理材料,经抗生素处理后接种兔体,经7 d后在有兔化猪瘟病毒静脉注射,每隔6 h测温一次,连续3 d,如发生定性热反应则不是猪瘟,如无任何反应即是猪瘟。

5.2.3荧光抗体法采用可疑病猪的扁桃体、淋巴结、肝肾等,制作冰冻切片、组织切片或组织压片。用猪瘟荧光抗体处理后,在荧光显微镜下观察,如见细胞中有亮绿色荧光斑点,为阳性。青灰或带橙色为阴性,2~3d天即可做出诊断。

5.2.4鉴别诊断急性猪瘟在诊断上与急性猪丹毒、最急性猪肺疫、急性猪副伤寒类似,在临床是要加以鉴别。

6猪瘟的防治

6.1日常预防措施

6.1.1要做到杜绝传染源的传入和传播媒介的传播,提高猪群抗病力。严格执行“自繁自养”,必须引进新猪时应从非免疫区进入;即使免疫接种,运回后隔离观察2~3周。保持猪场圈舍清洁卫生,坚持定期消毒;严禁非工作人员、车辆和其他动物进入;加强饲料管理,利用残羹饲喂应充分煮沸,严格对猪市场交易,运输和屠宰进出口检疫。

6.1.2预防接种是预防猪瘟发生主要的措施。目前使用疫苗有兔化弱毒苗和组织培养弱毒苗两种类型。接种后5月龄猪4~6 d产生免疫力,免疫期达18个月。因此对育肥猪可采取“一猪一针”和种猪“一年一针”进行免疫接种。一月龄左右的哺乳仔猪,由于受母源抗体干扰和产生免疫低弱,可以维持6个月,因此要判断后及时补充。

6.2发病时紧急预防措施

6.2.1尽快确诊及早如实上报疫情,开立隔离病猪或扑杀病猪,对污染场用2%~3%氢氧化钠溶液彻底消毒。

6.2.2流行地区严禁向疫区外运出活猪,畜产品饲料等,并停止生猪市场交易。

6.2.3扑杀病猪和死猪深埋处理,处理病死猪场地、废物、废水用具和工作人员衣物等都应严格消毒。

猪瘟的诊断与防制 篇8

一、流行病学

猪瘟病毒仅对猪有易感性, 不同品种、年龄和性别的猪均可感染。近些年来, 其流行形式已从频发的大流行转变为多地区散发性流行, 有时表现为波浪形、周期性, 尤其是大多数表现为温和型猪瘟, 其症状显著减轻, 死亡率较低, 或呈亚临床感染, 母猪发生繁殖障碍, 导致长期带毒、散毒, 成为猪瘟预防免疫效果差、反复发生以至暴发的重要原因。本病一年四季均可发生, 但低温有利于病毒的存活和散播, 气候多变等应激因素导致发病增加。10日龄内及断奶前后发病最多, 3月龄以上者发病减少, 经免疫过的猪群仍有发病, 从市场购入的猪苗发病率明显高于自繁自养。

二、临床表现及病理变化1典型猪瘟

潜伏期5~7天, 急性型和亚急性型者较多。患猪体温于41℃以上高热稽留, 耳、腹下、四肢皮肤呈现紫色出血斑块, 眼常有脓性分泌物, 减食乃至绝食。先便秘后腹泻。有后肢麻痹, 运动失调等神经症状。病程1~4周, 病死率在70%以上, 耐过猪多成为“僵猪”。近些年典型猪瘟己很少见。

2、非典型或温和型猪瘟

这是近些年猪曾发生的主要形式, 可以分成以下几种类型。

2.1持续感染 (亚临床隐性感染) 猪感染猪瘟病毒, 但不表现临床症状, 可持续向外排毒。

2.2母猪繁殖障碍 (妊娠母猪带毒综合征) 表现流产、早产、产死胎或木乃伊胎, 不发情或不孕等。

2.3仔猪先天性感染 (胎盘垂直感染) 仔猪生后, 衰弱, 拉稀便, 陆续死亡, 也有在20日龄左右或断奶前后发生严重死亡, 偶有发生先天性震颤。

2.4免疫耐受 (免疫力低下) 虽用合格的猪瘟疫苗及正规的操作进行免疫, 但抗体仍达不到保护水平, 猪瘟还时有发生, 这种情况多见于育成猪。

还应注意, 近些年猪瘟的发病, 大多有严重的混合感染, 导致病情复杂, 临床表现不一, 确诊更加困难。

典型猪瘟的剖检病理变化主要是肾脏点状出血, 脾脏边缘梗死, 心内、外膜有出血点, 淋巴结肿大、边缘出血和大理石样花纹状出血, 回盲瓣附近同心圆溃疡等。但近些年典型猪瘟极少见, 而大量发生的非典型猪瘟又多为混合感染, 因此很难见到典型病变。

三、实验室诊断

仅根据流行病学、临床症状和剖检很难做出确诊, 必须通过实验室诊断方能确诊, 常用的实验室诊断方法有以下几种。

1、正向间凝 (IHA) 用于检测猪瘟抗体水平高低, 帮助免疫程序的制定, 但不能作为是否感染猪瘟的依据。

2、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 一般用于检测猪瘟的抗体水平, 有的方法可区分强毒抗体或弱毒抗体。

3、免疫荧光 (IFA) 可检测强毒抗原, 能检出带有猪瘟强毒的隐性猪, 对猪瘟的净化有重要价值。

4、琼脂扩散试验 (AGPT) 操作简单, 易于判定, 可测抗原或抗体, 但敏感度低。

5、兔体交互免疫试验可检出被检病料中存在的猪

瘟强毒、兔化弱毒或系未感染猪瘟, 较准确可靠, 对试验设备、条件和技术要求不高, 但费时费事。

四、防制对策

猪瘟疫苗接种后1周内可产生免疫力, 保护期一般为一年, 对猪瘟应采取以免疫为主的综合防制措施。

1、制定科学的免疫程序。

每头猪一次免疫剂量应不低于600RID。一般地区应在仔猪25日龄及65日龄左右各免疫一次。后备母猪在配种前15天、经产母猪在断奶时各免疫一次, 尽量不要在配种或怀孕期间注射猪瘟疫苗。种公猪每年免疫2次。并应注意与其它疫苗接种的间隔和抗生素的干扰。

2、正确严格地采用超前免疫。

可在被猪瘟严重污染的猪场使用, 但必须严格操作, 如专人执守, 每产出一头仔猪立即注射疫苗, 并编号放入保姆箱中, 于90分钟后方可令其吮乳。稀释后的疫苗应贮存在带冰的冰瓶中随时取用。在猪25~35日龄或60~70日龄时还应加强免疫一次。

3、选择疫苗要讲究。

必须选用正规厂家生产的疫苗。乳前及25日龄左右猪瘟免疫应使用猪瘟单苗, 不要使用猪瘟、猪肺疫、猪丹毒三联苗。“三联苗”可用于小型场户的第二、三次加强免疫。猪瘟发病严重场、区, 还可考虑用猪瘟组织苗。

4、严格技术操作。

疫苗贮运和使用要全程冷藏, 用前应检验是否失真空。每头猪换用一个经煮沸消毒的针头。稀释液应使用生理盐水。气温在15℃~27℃时应在3小时内用完, 过时废弃。不要打“飞针”。

5、淘汰带有强毒抗原的种猪。

通过抗体监测找出并坚决淘汰亚临床感染种猪, 从源头切断猪瘟传染和免疫抑制问题, 可有效减少猪瘟的发生。

6、实行全进全出, 对病死猪及产出的死胎、胎衣等

应做无害化处理, 做好消毒、隔离等切断传染源的全方位措施。