耳聋基因突变

耳聋基因突变（共5篇）

耳聋基因突变 篇1

耳聋是最常见的残疾之一, 其发病率高、病因复杂、治疗困难, 给个人、家庭及社会带来巨大的压力和沉重的负担。据各国统计, 每1 000名新生儿中, 有1～3例听力障碍儿童, 其中至少一半与遗传因素有关。研究表明, 线粒体 (mtDNA) 12SrRNA基因A1555G点突变能引起氨基糖苷类药物敏感性耳聋 (aminoglycoside antibiotics induced deafness, AAID) [1], 占遗传性聋1%～2%[2]。目前国内用于检测线粒体12S rRNA基因第1555位A>G均质性突变的方法为:PCR扩增线粒体DNA片段, 限制性内切酶分析 (RFLP) 和DNA序列分析[3]。本文采用常规流行病学的研究方法结合分子生物学的手段, 于2006年7月～2010年10月对内蒙古鄂尔多斯市特殊教育学校102名非综合征型感音神经性耳聋患者的mtDNA A1555G点突变进行检测, 以了解耳聋和该突变的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择内蒙古鄂尔多斯市特殊教育学校学生102例。这些学生从内蒙古鄂尔多斯市下属的各个旗、县招生。其中, 男56例, 女46例;年龄6～23岁, 平均15.65岁;蒙古族10例, 汉族92例。

1.2 方法

1.2.1 病史资料采集

首先, 通过学校给家长或监护人发放知情同意书;然后由学生和家长共同填写调查问卷。问卷包括患者的一般情况, 如姓名、性别、出生年月;特别要关注患者的耳聋病史、家族中是否有同样的耳聋患者、是否用过耳毒性药物、耳聋是否与外伤有关、是否患过腮腺炎等可以引起耳聋的传染病疾病史。对患者的耳鼻喉科进行正规的专科检查和听力学评估。对所有患者行纯音测听和声导抗检查。在学校对所有患者抽取外周静脉血3 ml, 低温冷冻保存。在实验室进行全基因组DNA的提取, 然后进行A1555G点突变的筛查。1.2.2基因组DNA的制备用DNA提取试剂盒 (QIA amp DNA Blood Mini Kit 250) 提取耳聋患者的全基因组DNA, 取适量用紫外分光光度计进行纯度检测, 将提取的DNA置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 引物设计与合成

用Primer 3 input数据库设计引物, 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。正向引物序列:5'-CCGCCATCTTCAGCAAACCCTG-3';反向引物序列:5'-TAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG-3'。

1.2.4 PCR扩增

PCR反应体系包括1×PCR缓冲液、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 mol/L正反向引物、40 ng基因组DNA、1U Taq DNA聚合酶 (PCR反应试剂均为北京Fermentas公司产品) , 去离子灭菌水补足至20μl。PCR反应在DNA热循环仪 (BIO RAD PTC-200, 美国BIO RAD公司) 上进行。反应条件:95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 62℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 经30个循环, 最后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR产物4μl与1μl溴酚蓝混合, 1.5%琼脂糖凝胶电泳 (120 V, 40 min) , DL2000 DNA Ladder (北京天根公司) 标记, 化学发光成像系统下进行PCR产物鉴定。

1.2.5 限制性内切酶分析

酶切总体系30μl, 针对mtDNA12SrRNA的PCR扩增产物, 经琼脂糖凝胶电泳验证后取10μl, 加入Alw26I (酶切位点:5'-GAGAC) 限制性内切酶 (北京Fermentas公司) 1μl, Buffer Tango缓冲液2μl, 去离子灭菌水补足至30μl。酶切条件:37℃水浴箱中温育消化过夜, 经琼脂糖凝胶电泳验证, 酶切切开者为150 bp和295 bp两个条带, 为突变阴性;如只见445 bp的一个条带, 说明存在mtD-NA A1555G突变;均设阳性和阴性对照。不能切开的或是酶切显示不清的送测序验证。

1.2.6 DNA序列测定

扩增出的PCR产物经QIAGEN PCR纯化试剂盒纯化, 纯化产物经电泳证实后, 再做Cycle Sequencing反应。用扩增模扳的引物行测序反应, 然后在3100毛细管测序仪上该片段进行DNA序列测定。取DNA库内正常人混合基因组DNA做正、反向测序, 作为单链DNA测序的阳性对照。反应条件:95℃预变性2 min, 95℃变性10 s, 50℃退火5 s, 60℃延伸4 min, 循环25次。反应产物用Gentri-Sep Spin columns除去过量的dye terminators保证反应产物适合在3100毛细管测序仪内进行。测序结果经过3100测序分析系统软件进行分析。

2 结果

2.1 病史资料

聋哑学校的102例非综合征型耳聋患者中, 三代人中可发现2例耳聋患者的有11例, 1例是父母近亲结婚, 其余均为散发性耳聋。

2.2 听力损失评估

极重度聋占大多数, 共89例, 其次是重度聋, 共10例, 中度聋和中重度聋3例。声导抗测试:鼓室压图:大多数为A型鼓室曲线共58例;其次是As型鼓室曲线共30例;B型鼓室曲线共13例;Ad型鼓室曲线仅有1例。镫骨肌反射:57例双耳都没有引出镫骨肌反射, 31例可引出镫骨肌反射者, 但反应阈较高, 另外14例听力较好耳可引出镫骨肌反射。1.5岁以下发现耳聋82例, 1.5～5.0岁发现耳聋20例。

2.3 药物性耳聋情况

用氨基糖苷类抗生素后发现耳聋54例。其中以使用庆大霉素最多见为33例, 其次是链霉素共13例。卡那霉素与上述二种药物联合使用2例。三种药物两两联合使用5例, 三种联合使用1例。因感冒发热使用48例, 其他病因使用6例。

2.4 线粒体A1555G基因突变酶切结果

本实验扩增的片段是从线粒体基因核苷酸1261到1705, PCR产物共有445 bp。含有GAGAC核苷酸序列的DNA片段可被限制性内切酶Alw26I识别。如果发生突变, 这个识别位点消失, PCR产物不被酶切, 经该酶孵育过的电泳检测仍为445 bp一条带;如果未发生突变, 扩增产物被酶切后就被分为295 bp和150 bp两个片段。7例患者的PCR产物经Alw26I酶切后无识别位点的丢失, 电泳检测为一条445 bp的带, 阳性率是6.9% (7/102) , 有氨基糖苷类用药史54例, 该点突变的发生率为13.0% (7/54) 。部分病例酶切结果见图1。

2.5 mtDNA 12SrRNA A1555G基因测序结果

7例存在线粒体基因A1555G位点突变, 与酶切结果相吻合。见图2。

3讨论

人类线粒体是一个双链闭环分子, 由16 569 bp的核苷酸序列组成。与其他细胞器诸如溶酶体和过氧化物酶等特化膜结构相比, 线粒体具有自己的遗传物质, 因而是一种半自主复制体。这是指mtDNA能够独立地复制、转录和翻译[4,5]。当mtDNA出现突变时, 核苷酸序列和空间结构发生改变, 导致mtDNA亚单位rRNA的结构与细菌蛋白核糖体的结构极为相似, 改变了结构的rRNA与氨基糖苷类抗生素有极高的亲和力。而野生型rRNA却不能与氨基糖苷结合[6]。这是氨基糖苷类抗生素致聋的的机制之一。

在临床工作中, 有的患者由于患有结核病等原因, 使用氨基糖苷类抗生素可达3个月之久, 却没有发生听力下降;有些患者仅用了少量的氨基糖苷类抗生素, 结果发生了极为严重的听力下降而导致聋哑症。可见个体对氨基糖苷类抗生素的敏感性有巨大的差异性, 这是由基因决定的。本研究资料也说明, 该地区有明显的抗生素滥用倾向, 只要有发热就使用氨基糖苷类抗生素。因此, 停止滥用抗生素对降低耳聋的发生也是非常有效的方法之一。由于本研究有7例患者存在mtDNA A1555G点突变, 全部有氨基糖苷类抗生素用药史, 说明mtDNA A1555G点突变是他们患病的遗传学基础。但是, 另外的47例却没有检测到该位点的的突变, 不能排除mtDNA其他位点的突变;如线粒体A7445G点突变, C1494T等的点突变[2,3,4,5,6,7]。也不能排除核基因的调控和环境因素的影响。贾婧杰等[8]对山东省滨州市特教学校74例耳聋学生进行了12S rRNA基因A1555G点突变的检测, 5例为阳性, 阳性率为6.76% (5/74) 与本文结果一致。该群体线粒体A1555G位点的突变率高于以往的报道, 携带有该突变的个体对氨基糖苷类抗生素有高度易感性, 因此该基因突变是感音神经性耳聋的原因之一。鲍晓林等[9]对西北地区245例患者行A1555G点突变检测, 86例有氨基糖苷类药物应用史, 检测到21例线粒体DNA 12SrRNA A1555G同质型突变, 突变检出率为24.4% (21/86) ;在东北地区188例患者中, 66例有氨基糖苷类药物应用史, 检测到2例同质型突变, 1例异质性突变, 突变检出率为4.5% (3/66) 。两地区比较差异有统计学意义, 西北地区线粒体DNA 12SrRNA A1555G突变检出率显著高于东北地区。

由于本次研究只针对内蒙古鄂尔多斯聋哑学校学生进行检测, 这些学生大多为重度-极重度非综合征型耳聋患者, 而本文只检测了mtDNA A1555G突变, 还应有该基因其他位点的突变。所以内蒙古鄂尔多斯地区的线粒体基因突变的频率应该高于单个点突变6.9%的比率。这一地区mtDNA高突变率的遗传学因素, 氨基糖苷类药物的高使用率是这一地区高聋哑症发生率的原因。因此, 氨基糖苷类抗生素的使用应该非常慎重, 对非用不可的患者要仔细询问其耳聋家族史, 进行mtDNA A1555G点突变的检测, 对该位点阴性的个体先行常见其他位点的检测, 必要时行全部基因组mtDNA的检测。如果有mtDNA的点突变则避免使用氨基糖苷类抗生素, 防止人为因素造成的听力损害。这对防聋将产生重大而深远的意义。

摘要：目的:通过分析内蒙古鄂尔多斯市特殊教育学校非综合征型耳聋患者群体中mtDNA 12SrRNA A1555G突变, 以探讨该群体与线粒体突变的关系。方法:对鄂尔多斯市特殊教育学校102名非综合征型耳聋患者进行耳聋病因问卷调查、纯音听阈测试、声导抗测试、提取外周血DNA, 聚合酶链反应扩增mtDNA目的片段, 对扩增片段进行限制性内切酶检测, 对阳性标本进行DNA序列分析。结果:该校102名学生中, 全部为感音性耳聋, 其中54例使用过氨基糖苷类抗生素, 7例 (6.9%) 存在线粒体基因A1555G位点突变。结论:该群体线粒体A1555G位点的突变率高于以往的报道, 携带有该突变的个体对氨基糖苷类抗生素有高度易感性, 该基因突变是感音神经性耳聋的原因之一。

关键词：耳聋,线粒体DNA,突变

参考文献

[1]Guan MX.Molecular pathogenetic mechanism of maternally inheriteddeafness[J].Ann N Y Acad Sci, 2004, 1011 (1) :259-271.

[2]李琦, 戴朴, 黄德亮.遗传性聋线粒体DNA分子流行病学[J].国际耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2008, 32 (4) :210-212.

[3]蔡筠, 罗彩群, 谢建生, 等.PCR-高效液相色谱法检测线粒体DNA A1555G突变[J].临床检验杂志, 2011, 29 (2) :87-88.

[4]Anderson S, Bankier A T, Barrell BG, et al.Sequence and organizationof the human mitochondrial genome[J].Nature, 1981, 290 (5806) :457-465.

[5]李建瑞, 陈瑛, 王宇, 等.母系遗传性聋线粒体基因的突变[J].中国耳鼻咽喉头颈外科, 2005, 12 (10) :645-648.

[6]Erik CB.Mutant A1555G Mitochondrial 12S rRNA and AminoglycosideSusceptibility[J].Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54 (7) :3073-3075.

[7]卜云飞, 吕晓光, 汪洋, 等.22例非综合征型耳聋患者的致病基因突变位点分析[J].南京医科大学学报:自然科学, 2010, 30 (3) :390-393.

[8]贾婧杰, 袁永一, 戴朴, 等.山东省滨州市特教学校耳聋学生分子病因学分析[J].中华耳科学杂志, 2010, 8 (4) :407-410.

[9]鲍晓林, 郭玉芬, 刘晓雯, 等.西北地区与东北地区耳聋先证者线粒体DNA 12SrRNA A1555G突变特点分析[J].听力学及言语疾病杂志, 2010, 18 (4) :387-388.

耳聋基因突变 篇2

生物必修二《基因突变与基因重组》一节重点是基因突变的概念、特点以及基因突变的原因。难点是基因突变和基因重组的意义。

在整个教学过程中，概念枯燥，学生参与的时间少，如何化繁为简用具体的、形象的实例去剖析概念，就成为突破本节难点的关键。对基因突变概念的理解和把握，我采用分析联系遗传学上的典型病例——镰刀形细胞贫血症进行突破，然后让学生总结，概括出基因突变的定义。采用资料分析的方法突破“基因突变的特点”，学生通过具体的资料，直观的得出结论，归纳出特点。关于基因突变的意义，通过简单的数学计算，分析基因突变为生物进化提供了原始材料。利用图示引导学生回忆减数第一次分裂过程中，基因重组是在什么时期发生的，如何发生的，有什么样的意义。最后针对本节课进行课堂小结，比较基因突变与基因重组，加深学生的印象。

本节课的不足之处在于分析基因突变特点过程中，没有用实例将基因突变的不定向性与随机性进行分析比较，学生理解起来困难。在讲解基因突变的类型时，由于很多同学前面的减数分裂知识的遗忘，导致对减数分裂过程中染色体行为的不理解，进而对基因重组发生的时间和类型的不理解。

耳聋基因突变 篇3

1资料与方法

1.1 临床资料

41例来自巨鹿县医院就诊者21例, 年龄:出生2个月～25岁;10岁以下患者11例。同时进行家族病史调查20例。在咨询门诊经解释宣教的基础上, 同意接受筛查者或亲属签署知情同意书, 再进行采集标本。

1.2 方法

1.2.1 采血:

采集受检者外周血3～5ml, 血液放入EDTA抗凝剂的真空采血管, 统一编号。应用小剂量全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA, 进行定量和纯度检测。

1.2.2 耳聋基因突变筛查:

选用常见耳聋致病基因有:GJB2 (235delC、35delG、176 del16、299delAT) 、GJB3 (538C>T) 、SLC26A4 (PDS) (2168A>G、IVS7-2A>G) 、线粒体DNA 12SrRNA (1494C>T、1555A>G) 四个基因9个位点。测试由北京博奥生物有限公司提供。

2结果

应用基因芯片方法检测耳聋21例及其家系中相关亲属20例, 发现携带235delC突变5例, 携带GJB2 299delAT突变6例, 携带SLC26A4 2168A>G突变2例, 携带SLC26A4 IVS7-2A>G突变、2168>G位点杂合突变各1例, 耳聋及亲属中检出基因突变阳性率为36.59%。患者同时2～3个基因突变携带者3例, 占突变基因的20.00%。

3典型病例

患儿, 女, 3岁, 重度耳聋, 携带GJB2 235delC杂合突变, 同时携带SLC26A4 IVS7-2A>G杂合突变和2168A>G位点杂合突变。但家族病史调查中没有找到她的父母。GJB3基因和线粒体DNA12SrRNA基因未检出突变, 其基因突变阳性率为32.56%。

4讨论

本研究的中国常见4个基因9个位点筛查, 中国人的热点突变为233-235delC[3], 河北省巨鹿县重度耳聋调查结果发现GJB2基因235delC杂合突变检出率高达41.67%。其次GJB2基因299delAT杂合突变检出率为33.33%。SLC26A4基因2168A>G杂合突变检出率为16.67%。SLC26A4基因IVS7-2A>G杂合突变检出率为8.33%。本研究数据显示了该地区基因突变的重要地位及特点, 对今后开展耳聋的遗传咨询、婚前咨询、产前诊断有非常重要的指导意义。

进行聋病易感基因筛查, 目前能够进行致病基因突变筛查的方法有很多, 常用的有直接测序、目标基因位点特异性筛查, 如酶切、基因芯片、变性高效液相色谱分析、飞行时间质谱、四引物扩增受阻PCR等, 检测单位会根据筛查的不同需要选择最合适的方案, 既要保证良好的经济效益比, 也要尽力保证筛查方案的快速和准确。

我国有听力语言障碍的残疾人约1700万。耳聋给正常生活、学习和社会交往带来不便。从预防出生缺陷角度考虑应从婚前检查对高危人群进行耳聋基因检测, 目前基因芯片检测阳性率高, 通过基因芯片, 我们发现基因携带者较高, 高危人群耳聋基因筛查, 易标准化, 结果快速可靠, 适合在临床应用中推广, 这必将产生大的社会效益。

关键词：耳聋病因,基因芯片,基因突变,遗传性耳聋

参考文献

[1]第二次残疾人抽样调查办公室.全国第二次残疾人抽样调查主要数据手册[M].北京:华夏出版社, 2007:2, 38.

[2]刘学忠, 欧阳小梅, Yah D, 等.中国人群遗传性耳聋研究进展[J].中华耳科学杂志, 2006, 4 (2) :81-89.

基因突变和基因重组的教案 篇4

《基因突变和基因重组》是人教版高中生物必修二《遗传与进化》第5章第1节的教学内容，主要学习基因突变的概念、特点和原因，基因突变和基因重组的意义。

二、教学目标

(一)知识方面

1.举例说明基因突变的概念、原因、特点;

2.举例说出基因重组;

3.说出基因突变和基因重组的意义。

(二)能力方面

1.学会数据处理，类比推理等科学方法;

2.培养学生自学能力，发散思维及综合能力。

(三)情感态度价值方面

1.在基因突变的学习中懂得生物界在丰富多彩的本质，从而进行辩证唯物主义的思想教育;

2.在基因突变的学习中懂得如何确立健康的生活方式。

3.引导学生从生物学角度对基因突变和基因重组作科学的了解，形成正确的科学价值观，激发学生的责任感。

三、教学重点难点

耳聋基因突变 篇5

关键词：一步法定点突变,单核细胞增生李斯特菌,bsh

定点突变技术(site-directed mutagenesis)是生物化学与分子生物学中的一种常规实验技术,在基因和蛋白质结构与功能领域具有广泛的应用[1]。本研究介绍了一种高效便捷的定点突变方法,该方法的基本原理是利用完全互补的并带有突变位点的引物PCR扩增整个模板质粒DNA,由于从细菌细胞提取的模板质粒DNA具有甲基化位点,而PCR扩增产物不具有甲基化位点,因此采用能特异识别甲基化位点的DpnⅠ酶,就能去除PCR产物中剩余的模板DNA。最后将PCR扩增的线型突变质粒转化入大肠杆菌,利用大肠杆菌自身的修饰酶系统使线型质粒环化。该方法简单高效,PCR产物无需纯化,只要把握好对引物设计,高保真的DNA聚合酶、PCR扩增程序以及模板DNA浓度的选择,突变率可以达到100%。

本研究以构建单核细胞增生李斯特菌(简称LM)中编码胆碱水解酶(Bile Salt Hydrolase,简称BSH)的bsh基因突变启动子为例,具体介绍一步法定点突变技术的要点及其操作步骤。BSH能水解肠道胆汁酸盐,促使细菌在肠道环境中的生存[2],是LM中重要的毒力因子之一。其编码基因bsh启动子上既有LM毒力基因转录调控蛋白PrfA (Positive Regulatory Factor A)的结合位点PrfA-box(TTAAAAATTTTTAA),同时也存在压力胁迫调节因子σB因子的结合位点SigB-box[GGGTAT(-10区)和GTTA(-35区)],暗示σB和PrfA在调控细菌耐受肠道胆汁酸盐的机制中可能起着重要且复杂的作用。本研究成功构建了bsh启动子(以下称Pbsh)的三种突变:PrfA-box突变;SigB-box(-10区)突变;PrfA-box和SigB-box(-10区)同时突变,为进一步研究PrfA和SigB在bsh转录表达中的作用奠定了坚实的基础,该方面的研究工作在国内外尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)标准株EGD和大肠杆菌DH5α菌株以及pUC18质粒为本实验室保存。

1.1.2 试剂

(1)XbaⅠ、Pfu、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、CIAP酶购自上海赛百盛基因技术有限公司。

BHI(Brain Heart Infusion,脑心浸液)为Betcon,Dickinson & Company公司产品。其它所有化学试剂均为进口或国产分析纯。

(2)试剂盒:

①基因组DNA提取试剂盒,PCR产物回收试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司;②质粒小量提取试剂盒,凝胶回收试剂盒购自Omega公司。

(3)引物:

由上海赛百盛基因技术有限公司合成(带有下划线的代表突变位点)。

1.1.3 仪器

离心机:Centrifuge5415D、5415R、5804R(eppendorf);PCR仪:Master cyclerg radient (eppendorf);电热恒温培养箱:HPP-9082(北京东联哈尔滨仪器制造有限公司);电转化仪:Gene Pulser Xcell Electroporation System(BIO-RAD)。

1.1.4 培养基

LB(Luria-Bertani)培养基:酵母抽提物5g/L,胰蛋白胨10g/L,氯化钠5g/L,pH 7.0,121℃高压蒸汽灭菌20min备用。

BHI培养基:BHI 37g/L,121℃高压蒸汽灭菌20min备用。

1.2 方法

1.2.1 突变模板Pbsh-XbaⅠ-pUC18重组质粒的构建

利用基因组提取试剂盒从EGD菌株中提取总DNA,然后以提取的总DNA为模板,以Pbsh-XbaⅠ-1F/Pbsh-XbaⅠ-1R为引物, 扩增带有XbaⅠ酶切位点的bsh基因启动子序列(Pbsh)。PCR程序:95℃ 2min;[95℃ 45s,53℃ 45s,72℃ 30s]30×;72℃ 5min。XbaⅠ酶切Pbsh和pUC18载体后用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物,然后用CIAP酶处理pUC18-XbaⅠ片段,防止pUC18连接。XbaⅠ酶切后的Pbsh和pUC18载体经T4连接酶连接后,转入大肠杆菌DH5α菌株,涂布添加了Ampicillin(100μg/mL)的LB平板。经酶切筛选的阳性克隆送英俊公司测序确认。

1.2.2 定点突变过程中模板浓度的选择

本研究通过预实验来确定PCR反应中的模板质粒Pbsh-XbaⅠ-pUC18的浓度,以保证在PCR成功扩增的同时,模板质粒能被DpnⅠ酶完全消化,提高突变效率。选择的模板浓度分别为20ng、40ng和60ng,PCR结束后取10μL上样进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 运用定点突变技术构建突变启动子

Pbsh上有PrfA和SigB的结合位点:PrfA-box和SigB-box(-10区)。本实验运用PCR介导的定点突变技术,利用设计的引物bsh-MprfA-1F/bsh-MprfA-1R和bsh-MsigB-1F/bsh-MsigB-1R构建携带:①PrfA-box突变的质粒—mPrfA-Pbsh-XbaⅠ-pUC18;②SigB-box(-10区)突变的质粒—mSigB-Pbsh-XbaⅠ-pUC18。然后以PrfA-box突变的质粒DNA为模板,以bsh-MsigB-1F/bsh-MsigB-1R为引物构建③PrfA-box与SigB-box(-10区)同时突变的质粒—mPrfA-mSigB-Pbsh-XbaⅠ-pUC18。

PCR反应体系:1μL质粒DNA模板、2μL dNTPs (10mmol/L)、1μL 10×pfu buffer、1μL pfu、引物(100pmol)各1μL,添加ddH2O至50μL。PCR程序:95℃ 2min;[95℃ 45s,51℃ 1min,68℃ 9min]18×;72℃ 10min。

PCR反应完成后,取PCR产物20μL加入1μL的DpnⅠ酶和2.3μL的DpnⅠ buffer在37℃温育1h后,直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,然后涂布添加了Ampicillin (100μg/mL) 的LB平板,随机挑取10个克隆,送英俊公司测序检测。

2 结果与分析

2.1 突变模板Pbsh-XbaⅠ-pUC18重组质粒的构建结果

PCR扩增获得bsh启动子片段经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,可见一条清晰的约380 bp的电泳条带,与预期片段379bp大小相符,见图1A。

M: Marker DL5000;1: Amplification of bsh promoter by PCR; 2:Pbsh-XbaⅠ-pUC18 digested with XbaⅠ.

获得的重组质粒Pbsh-XbaⅠ-pUC18用XbaⅠ酶切鉴定,结果如图1B所示:酶切后可见两条清晰的条带,与预期的Pbsh片段长度(379bp)以及pUC18载体 (2674bp) 的片段长度一致,表明重组质粒Pbsh-XbaⅠ-pUC18构建成功。

2.2 定点突变过程中模板浓度的确定

为确保扩增后剩余模板能被DpnⅠ酶完全消化,提高突变率,本研究通过预实验来选择合适的模板浓度。选择的模板浓度分别为20ng、40ng和60ng,PCR结束后,取10μL上样进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示:三种浓度均能成功扩增,得到所需的PCR产物,尽管随着模板浓度的增高,PCR扩增产物的亮度也有所增加,显示产物的浓度也随之增加,但为了保证突变的成功率,我们选择了模板为20ng的PCR扩增产物用于DpnⅠ酶切。酶切后直接转化大肠杆菌感受态,随机挑取10颗转化子进行测序,阳性突变率达到100%,表明该浓度适于做为本研究的PCR反应的模板工作浓度。

M: Marker DL5000; 1: 60ng template; 2: 40ng template; 3: 20ng template.

2.3 测序鉴定定点突变结果

构建的突变质粒送到英俊公司,应用M13-Reverse引物测序结果如下:

2.3.1 重组质粒Pbsh-XbaⅠ-pUC18的测序结果

模板重组质粒Pbsh-XbaⅠ-pUC18的测序结果如图3所示:野生型bsh基因启动子的PrfA-box碱基序列为TTAAAAATTTTTAA,SigB-box(-10区)为GGGTAC。

The sequence TTAAAAATTTTTAA between 241-255bp is PrfA-box and the sequence GGGTAC between 342-348bp is SigB-box(-10box).

2.3.2 PrfA-box突变质粒mPrfA-Pbsh-XbaⅠ-pUC18的测序结果

PrfA-box突变质粒mPrfA-Pbsh-XbaⅠ-pUC18测序结果如图4所示:PrfA-box中的TAA碱基突变为GGC,突变结果与预期一致。

2.3.3 SigB-box(-10区)突变质粒mSigB-Pbsh-XbaⅠ-pUC18测序结果

SigB-box(-10区)突变质粒mSigB-Pbsh-XbaⅠ-pUC18的测序结果如图5所示:SigB-box(-10区)中的GGG碱基突变为ATA,与预期一致。

2.3.4 PrfA-box与SigB-box(-10区)同时突变质粒mPrfA-mSigB-Pbsh-XbaⅠ-pUC18的测序结果

PrfA-box与SigB-box(-10区)同时突变的mPrfA-mSigB-Pbsh-XbaⅠ-pUC18的测序结果如图6所示:PrfA-box中的TAA碱基突变为GGC,SigB-box(-10区)中的GGG碱基突变为ATA,突变结果与预期一致。

3 讨论

定点突变技术是研究基因和蛋白质结构和功能的有力工具之一,也是实验室研究基因表达调控的主要手段。目前国内外采用的定点突变的方法很多,如重叠延伸PCR定点突变技术[3]、寡核苷酸引物介导的定点突变技术[4]、大引物PCR定点突变技术[5]等;同时,商业公司还开发出多种定点突变试剂盒,如Stratagene公司的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit和QuikChange XL site-directed mutagenesis kit,Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit等。与以上这些定点突变技术相比,本方法的关键及特色在于:

The sequence GGC between 241-255bp is the mutated points in the PrfA-box

The sequence ATA between 362-364bp is the mutated points in the SigB-box(-10box)

The sequence GGC between 247-249bp is the mutated points in the PrfA-box and the sequence ATA between 346-348bp is the mutated points in the SigB-box(-10box)

(1)突变过程中PCR反应程序的设定。PCR程序大体为:95℃ 2min;[95℃ 45s,50-55℃ 1min,68℃ N min]12～18×;72℃ 10min。“N”根据所需扩增的突变模板DNA长度来确定,一般pfu酶的扩增效率为0.5kb/min。本研究所用的重组质粒大约为3kb,为了保证能充分扩增出整个质粒,以及避免质粒二级结构干扰扩增效率,我们最终设定的扩增时间为9min。扩增循环数的选择:若进行一个碱基的突变则为12个左右循环,两个碱基的突变为16个左右循环,多个碱基的突变则为18个左右的循环,为了提高突变的效率,扩增循环数应控制在此范围内。循环数太少,难以得到足量用于转化大肠杆菌所需的突变产物;而扩增循环数太多则有可能引入随机突变。本实验设定的PCR程序为95℃ 2min;[95℃ 45s,51℃ 1s,68℃ 9min]18×;72℃ 10min,一次PCR实现了对三个碱基的同时突变。

(2)高保真DNA聚合酶的选用。本实验采用了高保真的pfu聚合酶,降低了PCR扩增过程中随机突变的几率,但实验中我们发现该酶仅对于扩增全长小于4kb的DNA序列的效果较好,如需扩增更长片段,则应选取能扩增长片段的高保真DNA聚合酶。张宝真[6]等使用的高保真耐热DNA聚合酶Phusion(购自New England Biolabs公司,可以扩增10 kb以上的DNA片段)成功的对长度大于7kb的质粒进行了定点突变。朱大兴[7]等利用的Pyrobest DNA聚合酶(购自宝生物工程有限公司)也成功的对长度大于7kb的质粒进行了定点突变。

(3)有效选取了定点突变模板的浓度,确保DpnⅠ酶的工作效率。PCR扩增产物中剩余模板DNA能否被DpnⅠ酶完全消化,是关系到突变成功率的关键因素之一,从理论上讲,模板DNA浓度越低,扩增后产物中剩余的模板量越少,越易被DpnⅠ酶消化完全。但是,模板浓度过低又会导致PCR反应效率低下,产物的浓度过低,从而得不到阳性转化子。王宏梅[8]等建议为了保证DpnⅠ酶的充分消化,在PCR结束后可进行电泳验证,确认产物的浓度,如果产物浓度很高,可以减少消化的产物量或适当延长酶切时间。此方法存在一定的局限,一是因为影响PCR产物浓度高低的因素较多,模板浓度高不一定就意味PCR产物浓度就高;二是产物浓度降低到多少才能保证DpnⅠ酶的充分消化,需要经过多次反复摸索才能确定,从而增加了实验的操作步骤和成本。而通过预实验选取有效且较低的定点突变模板浓度,可以确保DpnⅠ酶的工作效率,减少由于测序来筛选正确突变子所需的时间和成本。

(4)操作简化,成本降低。重叠延伸PCR定点突变技术、寡核苷酸引物介导的定点突变技术、大引物PCR定点突变技术都需要多对引物及多轮PCR,且突变过程需要繁琐的提纯步骤才能得到最终的突变子。与这些传统方法相比,本研究只需要一对引物,整个PCR过程只需一步就可得到突变质粒,简化了由于传统的多对引物带来的繁琐的提纯步骤,增加了得到突变子的几率。

(5)应用范围广。与近年来广为使用的“设计限制酶辅助突变”(Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis, DREAM) 技术相比, 本研究介绍的方法所利用的原理与其大体相似,但DREAM技术是通过引进的限制性内切酶位点对转化子进行鉴定,虽然避免了使用测序法对突变产物的筛选[6,9],但由于设计和引入的限制性酶切位点必需与突变位点相匹配,因此存在很大的局限性,而本实验介绍的定点突变方法可以将目的基因碱基按照要求任意突变,因此可广泛应用于基因调控以及蛋白质结构与功能之间的研究。

综上所述,本研究介绍了一种经济、高效、简便快捷的定点突变方法,为基因表达调控以及蛋白质结构和功能的研究提供了技术支撑。

参考文献

[1]谢振华,史小军,蔡国平.在单个PCR管内快捷完成定点突变[J].中国生物化学与分子生物学报,2006,22(8):681-684.

[2]Didier Cabanes,Pierre Dehoux,Marc Lecuit.Listeria monocytogenes bilesalt hydrolase is a PrfA-regulated virulence factor involved in the intestinal andhepatic phases of listeriosis[J].Molecular Microbiology,2002,45(4):1095-1106.

[3]何震宇,李月琴,林元藻.重叠延伸PCR对DAN片段进行定点双突变[J].氨基酸和生物资源,2007,29(3):78-82.

[4]Wei D,Li M,Zhang X,et al.An improvement of the site-directed muta-genesis method by combination of megaprimer,one-site PCR and DpnⅠtreat-ment[J].Anal Biochem,2004,331(2):401-403.

[5]张碧乾,邓会群,宫彩霞,等.大引物PCR定点突变方法的改进[J].湖北大学学报,2009,31(1):79-81.

[6]张宝中,冉多良,刘大斌,等.利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变[J].中国生物工程杂志,2008,28(11):77-81.

[7]朱大兴,周清华,王艳萍,等.利用Pyrobest DNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变[J].生物技术通讯,2007,18(4):590-593.

[8]王宏梅,赵心清.一步PCR法对拟南芥ATPK64基因的快速定点突变[J].华中农业大学学报,2008,27(1):19-21.