基因靶向（精选7篇）
基因靶向 篇1
摘要：近年来, 基因治疗技术应逐年应用于临床实践中, 常在遗传、代谢病及肿瘤治疗等领域取得了较快的研究进展[1]。但目前, 基因治疗的有效性及安全性尚未得到认可, 这就要求相关医疗工作者能够对基因靶向治疗做出进一步研究, 以完善该治疗方法在临床中的应用[2]。
关键词：基因靶向,研究,进展
所谓基因靶向治疗是指将目的基因通过载体系统导入机体, 并特异性地在靶组织细胞中以可调控的方式进行表达, 在治疗疾病的过程中对患者正常细胞及组织不造成损伤的同时还可达到良好的治愈目的, 是近年来临床工作中较为推崇的一类新型治疗方式[3]。现笔者就基因靶向治疗中的基因靶向转移问题、靶向表达问题、原位修复及RNA干扰技术定点整合等方面综述如下。
1 基因的靶向转移
1.1 病毒载体
在基因靶向治疗过程中, 医疗工作者常利用病毒蛋白对人体细胞特殊的亲和作用而将目的基因特异性地导入靶细胞中, 例如可治疗神经系统疾病的单纯疱疹病毒[4]。而近年来, 有相关研究学者将有着各自优势的病毒治疗与基因治疗进行肿瘤的靶向-病毒治疗, 取得了较为突出的临床效果[5]。但值得注意的是, 不仅要求病毒载体能够在肿瘤细胞内进行特异性地复制, 还要求携带的外源基因的表达量可通过病毒的复制大大增高[6]。
1.2 非病毒载体
据相关临床资料显示[7], 病毒载体虽具有广泛的应用前景, 但因其存在免疫原性等特性可对患者的机体造成损害, 安全性还有待提升。而除病毒载体外, 还有一类非病毒载体可应用于基因靶向治疗中, 即非病毒类载体, 常见非病毒载体包括多聚阳离子聚合物、脂质体、细菌及蛋白等[8]。此类载体不仅提升了应用的安全性, 且具有生产量大等特点, 已被广大医疗工作者所重视, 但其存在转染效率低、体内表达不稳定等缺点, 还需进行进一步的研究[9]。
2 基因的靶向表达
2.1 调节基因表达的空间
据相关资料记载, 只有在组织特性的基因启动子与靶细胞中反式作用因子结合后, 才能激发外源因子的转录, 而在非靶细胞中外源基因的表达则不被激活[10]。其中包含甲胎蛋白启动子及癌胚胎抗原启动子等在内的肿瘤特异基因启动子常作为组织特异性的启动子, 另外, 还包括降钙素基因启动子在内的正常细胞中的特性蛋白基因启动子。上述基因启动子均可对载体进行构建表达[11]。
2.2 调节基因表达的时间
部分疾病所采用的基因治疗需要基因在一定时间内及水平上进行表达才具有临床疗效, 而需要应用包括四环素、蜕皮激素等小分子的药物进行口服起到调控目的基因的表达时间及水平的目的[12]。而这些小分子的作用机制则是通过进入患者体内后使得目的基因可在短时间内达到很高的水平, 从而影响着疾病治愈的进程[13]。
3 基因的原位修复
所谓基因的原位修复是指在疾病治疗的过程中采用野生的正常基因替换患者体细胞中突变或受损的基因, 常应用于遗传性疾病的诊断及治疗过程中[14]。以往采用的基因原位修复技术是通过基因重组完成的, 现随着医疗技术的不断发展, 有关学者研究出了一类新型的原位修复方式弥补了传统基因重组技术中效率较低的缺点, 即采用利用三链形成单链寡核苷酸、RNA与DNA嵌合分子以及寡核苷酸, 而此种技术已发挥出巨大的临床应用潜力[15]。
4 基因的定点整合
据相关数据统计指出, 在以往基因治疗的临床试验中常出现不良反应事件的发生, 其主要原因是由于病毒载体插入原癌基因位置附近, 激发了原癌基因的表达, 最终导致试验动物出现恶性肿瘤等疾病[16]。这就要求相关医疗工作者应注重将外源治疗基因能够准确的与宿主基因上的安全位点所结合, 其中最为常用的一项技术即为基因打靶技术, 此种技术可将基因定点整合过程按照预期方式所进行, 目的性较高, 同时提升了治疗的安全性[17]。
5 RNA干扰
RNA干扰技术作为基因靶向治疗中的一项新兴技术, 是指在该技术中利用双链RNA将体内特异性基因表达进行特异性的阻断, 同时具有操作简便、效率较高等特点, 已被广大研究人员所接受[18]。此种技术的目的在于能够高效的、目的性较强的将目的基因的表达进行抑制, 尤其在遗传性疾病、肿瘤疾病的临床治疗中具有显著的应用价值。同时需要研究人员对此种技术进行进一步的完善[19]。
6 展望
如今, 应用病毒为载体介导转基因治疗的安全性还需进一步进行提升, 对于研究人员来说该项技术仍为一项严峻的挑战, 而基因定点整合技术及RNA干扰术式有望解决这一问题的手段[20]。现随着科学事业的不断进步, 临床研究人员需对各个科学技术进行进一步的完善及相互渗透, 将不同的方法进行联合使用, 弥补互相的缺点, 帮助基因治疗靶向能够更加高效的、安全的发展, 以达到更加显著的临床效果, 提高患者的生存质量, 甚至挽救患者的生命。
基因靶向 篇2
分子靶向治疗针对肿瘤发病机制中的关键分子和关键事件, 选择性强, 毒副作用低, 是肿瘤治疗的发展方向和新的突破点。第三军医大学大坪医院肿瘤中心主任王东教授领衔的项目组, 以双功能基因APE1为主线, 在基础研究领域首次提出APE1与血管生成的关系, 并证实了APE1是肿瘤血管生成调控基因, 在8285例肿瘤病人临床研究中得到证实。
研究团队依据APE1的抗血管生成作用能抑制肿瘤新生血管生成, 使肿瘤细胞缺血缺氧, 致使肿瘤细胞凋亡这一原理, 敲除APE1的表达, 显著提高了抗血管生成治疗的敏感性, 抑制了APE1及肿瘤血管生成, 显著提高抗血管生成治疗药物的疗效。
项目组首先提出APE1的高表达和异位表达是肿瘤的预后和预测指标;通过制备APE1蛋白和抗体, 首次建立了血清APE1蛋白及抗体ELISA检测方法, 并证实了其在肿瘤中的诊断价值。此外, 项目组还发明了肿瘤特异感染的Ad5F/35APE1si RNA腺病毒载, 抑制APE1不仅对肿瘤细胞有单独的杀伤作用, 而且与放疗、化疗、光动力治疗有显著的协同作用, 从临床研究确证了APE1肿瘤治疗的分子靶点作用。
该项目获国家发明专利3项, 发表论文94篇, 为肿瘤化疗模式提供了新的临床治疗思路, 具有广泛的临床应用前景。
基因靶向 篇3
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物
实验所用动物为健康的新西兰纯种兔15只, 体重2.5 kg, 雄性。由南方医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂
质粒p Sec Tag2B、感受态细胞E.Coli JM109、中国仓鼠卵巢细胞系由亚能生物技术 (深圳) 有限公司提供;限制性内切酶Hind III, Kpn I, Bam HI和Xho I购自宝生物工程有限公司;Vent DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司;羊抗人t PA多克隆抗体、兔抗羊多克隆抗体、牛血清白蛋白、t PA ELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。全氟丙烷气体 (Halocarbon-218) 由广东佛山捷锐公司提供。
1.2 方法
1.2.1 p Sec Tag2B-t-PA重组质粒构建
t-PA基因序列网上Blast得到三段EST序列, 其Clone ID分别为:6251209, 4861268, 5190656。根据t-PA基因及三段EST序列自行设计引物, 如下序列:t-PA-1F:5'-CCCaagctt ATGGATGCAATGAAGAGAGGG-3', tPA-1R:5'-GGggtacc ACGGTAGGCTGACCCATTC-3', t-PA-2F:5'-GGggtacc CACAGCCTCACCGAGTCG-3', t-PA-2R:5'-CGggatcc AGCAGGAGCTGATGAGTATGCC-3', t-PA-3F:5'-CGggatcc TCTCTGCCGCCCACTGCT'-3', t-PA-3R:5'-CCctcgag GCGGTCGCATGTTGTCAC-3' (小写部分为酶切位点) 。以三个EST克隆质粒为模板扩增三条t-PA片段, 回收扩增产物并测序。质粒p Sec Tag 2B和三条t-PA片断t-PA-1、t-PA-2、t-PA-3分别经Hind III和Xho I, Hind III和Kpn I, Kpn I和Bam HI, Bam HI和Xho I双酶切消化, 经QIAGEN PCR Product Purification Kit纯化, T4DNA连接酶14℃连接过夜, 将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞, 经含氨苄青霉素LB平板挑出抗性菌落, PCR检测重组质粒, 提取重组质粒测序鉴定。重组质粒经磷酸钙共沉淀法转染至中国仓鼠卵巢细胞, 间接免疫荧光反应检测t-PA抗原表达。
1.2.2载基因纳米白蛋白超声微泡靶向造影剂制备
一步法制备载t PA基因白蛋白纳米粒并制备白蛋白超声微泡, Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。纳米粒做包封率检测和凝胶阻滞实验。将一次制备的白蛋白纳米粒 (含2 mg质粒) 加至10m L白蛋白微泡中, 加入50%戊二醛10μL溶液4℃下孵育2 h进行交联后离心 (速度200 r/min, 1min) , 取上浮泡沫悬液即得载体。调整微泡浓度为0.8~1.8×109个/m L。
1.2.3 动脉粥样硬化模型建立及靶向超声转染
实验兔用5%戊巴比妥静脉麻醉 (25 mg/kg) 后于大腿根部沿双侧股动脉切开皮肤并分离股浅动脉, 逆行插入直径2 mm×20球囊导管至髂总动脉分叉以上, 球囊充气加压 (5个大气压) 并缓慢回拉至动脉切口处, 共重复三次, 造成血管内皮剥脱, 常规结扎动脉, 缝合切口。实验组 (n=8) 于动脉内膜剥脱后经耳缘静脉注入制备的载t PA基因纳米白蛋白微泡剂5 m L (含t PA 1 mg) 并用二维超声观察肝脏 (超声显影参照器官) 显影增强, 立即经皮表对应损伤血管和周围大腿内侧肌群局部超声治疗 (频率1 k Hz, 强度:1.5 W/cm2, 时间:10 min) 并观察肝脏显影恢复正常。对照组 (n=7) 静脉输入等量生理盐水及同等条件超声的治疗。术后高胆固醇饮食喂养 (配方如下:基础饲料+3%胆固醇+5%猪油) , 两组均无抗凝治疗, 共观察2周。分别于术前、术后1周和观察结束采动脉血检测凝血酶原时间、t-PA和D-二聚体含量。
1.2.4 标本制作和检测
各组于观察结束后, 空气栓塞处死, 立刻经静脉加压滴注4%多聚甲醛适当固定, 取髂动脉和其周围肌肉组织, 常规石蜡包埋, 病理制片。采用间接法免疫组化法检测t PA抗原表达, 一抗为羊抗人t PA多克隆抗体 (1∶100稀释) , 用PBS取代一抗体作阴性对照。
1.3 统计学分析
实验结果以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验和χ2检测各组之间的差异。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 p Sec Tag2B-t-PA重组质粒的构建与表达
成功构建了p Sec Tag2B-t-PA重组质粒, 转染中国仓鼠卵巢细胞免疫荧光法显示t-PA呈强阳性反应。见图1。
A:p Sec Tag2B-t-PA重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞免疫荧光法显示t-PA呈强阳性反应。B:转染空白p Sec Tag2B质粒中国仓鼠卵巢细胞呈免疫荧光反应阴性。
2.2 载t PA基因白蛋白纳米粒和超声微泡物理表征
纳米粒径平均为132.0 nm, 表面Zeta平均+31.32-+41.42 m V。包封率检测平均为73.58%。凝胶阻滞分析和DNaseⅠ保护实验显示纳米粒对质粒DNA具保护作用。制备的超声微泡园球形囊泡状, 大小较一致, 分散良好, 直径2~5μm。含10%蔗糖的白蛋白微泡经4℃保存30 d形态学上未发生改变, 且对热稳定性良好 (40℃, 30 min) 。与白蛋白纳米粒交联后上述性状亦未发生明显变化。
2.3 超声显像和靶向治疗
实验组注入靶向载体后肝脏显影明显增强;经超声波腿部肌群和血管处理10 min后肝脏组织显像回复至注射前水平 (图2) 。对照组肝脏超声显像注射前后未见改变。
2.4 肌肉组织t PA抗原表达和血管壁病变
对照组7只兔双侧髂动脉共14支其中11支腔内有血栓形成, 血栓形成率为78.57%, 可见血管内膜不同程度增厚, 管腔变窄。实验组8只共16支血管仅有2支腔内血栓形成, 血栓形成率为12.50%;内膜仅轻度增厚。血栓形成率组间差异有显著性 (P<0.005) 。光学显微镜下:对照组血管内膜不规则明显增厚, 沿管壁分布的粥样硬化斑块, 主要由泡沫细胞构成, 偶见病变中心部坏死, 粥样物质形成。病变周围内膜中可见平滑肌细胞和纤维母细胞增生并伴有胶原纤维形成和细胞基质堆积, 偶可见少许炎细胞浸润。血管腔可见血栓形成 (图3) 。实验组血管内膜增厚较对照组明显轻微, 粥样斑块形成较少且病变较轻, 泡沫细胞多堆积较少, 血管腔血栓明显较少, 管腔狭窄大多不明显。实验组血管周超声波处理的骨骼肌组织表达t PA抗原呈散在分布 (图4) , 血管壁亦可见阳性反应。
2.5 血检测指标的变化
附表显示各组实验前、后不同时期采集动脉血检测t-PA和D-二聚体含量的结果。在实验组, 术后1周血液t-PA和D-二聚体含量显著增加并持续到观察结束。而对照组于术后1周两个指标亦有所增加但两周时已回复至正常范围。实验同时观察到术前、术后各组不同时期血凝血酶原时间和INR值无显著变化 (实验未显示) 。
A:正常肝脏超声显像;B:注入靶向载体后肝脏显影明显增强;C:经超声波腿部肌群和血管处理10 min后肝脏组织显像回复至注射前水平
注:1) 与术前相比, P<0.05;2) 与术前相比, P<0.01
A:对照组血管内膜增厚, 管腔内混合性血栓形成。B:显示兔正常髂动脉血管。
A:血管周骨骼肌组织经超声靶向转染后表达t PA抗原, 箭头所示t PA抗体反应阳性的骨骼肌细胞;B:血管周未经t PA基因靶向转染的骨骼肌组织t PA抗体反应为阴性。
3 讨论
动脉内膜粥样斑块破裂诱发血栓形成是急性心、脑血管意外发生的主要原因, 稳定斑块和尽早抗凝预防十分重要。目前, 人们已能够构建t-PA基因的逆转录病毒载体并在体外转导内皮细胞获得t-PA蛋白的高表达。动物实验证实, 将这种转导的内皮细胞贴附于球囊支架表面或动脉桥吻合口可防止支架术后或血管搭桥术后血栓形成和再狭窄的发生, 明显提高手术的远期效果[4];构建其基因质粒转染心肌可预防实验性瓣膜置换术血栓形成[3];人重组t-PA已应用于冠心病急性心肌梗死、脑栓塞、肺梗死等的溶栓治疗[5];血t PA含量测定以及相关纤维蛋白降解物检测已作为监测心、脑血管疾病和其急性事件发生的重要指标[6]。本实验构建的t PA基因表达质粒, 经凝胶电泳和测序结果显示完全符合实验要求;体外转染CHO细胞获得了t PA蛋白的高表达, 为进一步体内实验提供了基因药物。
白蛋白是一种生物相容性好, 可降解, 无免疫源性和细胞毒性的高分子材料, 制备成纳米载体转基因效率高[7]。本实验采取包裹法[8]制备载t PA基因白蛋白纳米粒, 经粒度仪检测粒径大小为132.0 nm左右, 大小均匀, 分散性好, 包封率73.58%;凝胶电泳分析显示具有较好的DNA酶保护作用。基因导入体内的方式多为将其直接注射于靶组织, 具有创伤性, 限制其临床应用。超声造微泡具有靶向运载作用, 可以靶向传输基因或药物达到治疗疾病的目的[9]。以白蛋白作为液膜的微泡研究较多, 无毒性、易于制备, 缺点是稳定性较差, 在制备过程中加入一定量蔗糖 (10%蔗糖) , 其热稳定性增强且存放时间明显延长[10]。本组制备的白蛋白纳米t-PA基因载体与蔗糖白蛋白超声微泡连接, 借助超声场实现了靶向转染骨骼肌和局部血管组织获得了t PA基因有效表达;血t-PA、D-二聚体含量增高和t-PA活性增强, 成功抑制了实验性动脉粥样硬化血栓形成。
手术或损伤刺激血栓形成伴有血t-PA和D-二聚体含量增高 (对照组) 这是机体对损伤的正常反应, 随着损伤的修复而恢复正常。外源性t-PA基因转染可使t-PA活性持续增高, 最长时间可达1年, 无疑对血栓的预防是可行的[11]。靶向治疗其主要目的是增加局部组织t-PA含量和作用的特异性, 减少全身不良反应。在本实验中, t-PA基因转染后虽然血液D-二聚体持续增高, 但检测血凝血酶原时间和INR值在正常范围表明t-PA仅对纤溶系统产生影响而对凝血系统未见影响;肝脏是t-PA代谢的主要场所, 仅10 min就能将血t-PA完全清除[12];此外, 血液纤溶酶原激活物抑制因子-1也是t-PA灭活的重要途径[13]。这些可能是本实验靶向转染t-PA基因有效预防局部粥样斑块血栓形成但未造成全身出血等并发症的主要原因。
摘要：目的 观察构建的纳米白蛋白超声微泡载t-PA基因靶向转染骨骼肌和局部血管预防兔髂动脉粥样硬化血栓形成的效果。方法 制备兔髂动脉粥样硬化血栓形成模型;构建高表达白蛋白纳米t-PA基因超声微泡靶向载体并在超声波介导下靶向转染骨骼肌和局部血管壁, 动态观察对局部血栓形成的作用。免疫组化法检测转染骨骼肌组织t-PA抗原表达;ELISA法检测血t-PA和D-二聚体含量变化, 观察t-PA活性。结果 超声介导靶向转染基因获得局部骨骼肌和血管组织有效表达tPA抗原并伴有血tPA和D-二聚体含量增高、tPA活性增强, 有效预防了兔实验性髂动脉粥样硬化血栓形成。结论 成功建立了白蛋白纳米tPA基因超声微泡载体系统, 为血栓相关性疾病预防提供了实验依据。
基因靶向 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
慢病毒包装细胞293T细胞株(广州擎因)，口腔鳞癌高转移HN12细胞株(美国密歇根州立大学惠赠)，大肠杆菌菌株DH5a(宝生物工程公司);BamHI、EcoRI、T4 DNA Ligase、MluI(NEB)、质粒DNA提取试剂盒(OMEGA)、DMEM、胰蛋白酶(Gibco);Opti-MEM(Gibco公司)、鼠抗人CD106单克隆抗体(Abcam)、胎牛血清、pLVX-siRNA2 vector、Lenti-X 293T Cell Line、Lenti-X HTX Packaging System、Lenti-X Concentrator(Clontech)等。
1.2 方法
1.2.1 构建CD106 siRNA表达质粒
利用GenBank检索人CD106基因信息，利用www.clontech.com网站的siRNA设计工具针对CD106设计4个靶点siRNA序列，编号为Target 1、2、3、4，其中siRNA引物见表1，阴性对照(negative control,NC)采用通用阴性对照序列。经BLAST检索验证(同源性比对)，针对CD106设计的4条siRNA序列均100%命中序列，与CD106完全同源，且有明显排他性，特异性高;制备DNA oligo;连接入经限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切后的RNA干扰载体质粒p GCL-GFP;转化感受态细胞DH5a，挑取阳性克隆进行PCR鉴定与测序;连接成功的载体送测序(上海英骏)，对测序正确的克隆进行菌种的培养扩增并抽提质粒DNA。
1.2.2 慢病毒包装及滴度检测
将对数生长期的293T细胞接种于25 ml细胞培养皿，细胞密度约70%时将Lenti-X 293T Cell Line、Lenti-X HTX Packaging System、Lenti-X Concentrator用磷酸钙共转染至病毒包装细胞293T，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入新鲜的细胞培养液继续培养。收集转染72 h的293T细胞上清液，于4℃、6 000 r/min离心10 min以除掉细胞碎片，0.45μm滤器过滤后置于25 000 r/min超速离心90 min，以冰PBS液重悬病毒沉淀，分装置于-80℃冰箱中保存。取1μl病毒溶液采用逐孔稀释滴度测定法:滴度(TU/ml)=观察到带有荧光的细胞个数/病毒原液量。
1.2.3 靶向CD106RNAi慢病毒载体对HN12细胞CD106基因敲减效果验证
感染重组病毒48 h后观察慢病毒基因GFP的表达情况，感染效率大于50%者继续培养，待感染时间达到72 h后收集细胞，分别抽提RNA、蛋白质按照TaKaRa(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)逆转录试剂盒和蛋白质印迹检测试剂盒(Western Lightning Plus-ECL,NEL105001EA,PEL)进行realtime PCR、Western Blot检测实验。
2 结果
2.1 siRNA慢病毒表达载体的构建
将CD106基因siRNA的寡核苷酸序列与慢病毒pLVX-siRNA2-GFP骨架质粒连接重组，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行PCR鉴定及测序，结果分别见图1～2。
2.2 慢病毒载体的包装及滴度测定
将构建有效siRNA靶点的重组pLVX-siRNA2-GFP载体与辅助载体共转染293T细胞，收集病毒并进行浓缩。Target 1、2、3、4及阴性对照组滴度分别测定为6.0×109、1.0×109、1.0×109、5.0×109、1.0×109TU/ml，滴度满足后续的实验要求，说明病毒成功包装。
2.3 重组慢病毒转染HN12细胞72 h后
各组均可见强的GFP荧光表达(图3)。
2.4 靶向CD106RNAi慢病毒载体对口腔鳞癌HN12细胞CD106基因的敲减作用
Real time PCR结果显示(图4):转染72 h后相对NC组，Target1、Target2、Target3和Target4组对HN12细胞中CD106 mRNA的表达均有显著敲减效果(P<0.05)，敲减效率分别为85.53%、70.57%、72.98%、34.03%，其中Target1组的敲减效率最显著;NC组与CK组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(CK组为空白对照组，即口腔鳞癌HN12细胞组)。
Western blot结果同样显示(图5):经计算机灰度扫描并与内参照(β-Actin)比较分析显示:Target1、Target2、Target3和Target4组CD106蛋白表达量较NC组下调明显(P<0.05)，表明在转染重组慢病毒后，CD106蛋白的表达受到明显抑制。CK组与NC组CD106蛋白量的差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
RNA干扰是一种通过触发同源RNA降解使目的基因沉默的技术，具有特异性、高效性、稳定性[6,7,8]。近来，利用病毒载体表达的shRNA在多个人源、鼠源的RNAi实验中取得成功。因此，针对癌基因在肿瘤细胞中引发RNAi效应，将有可能拓展肿瘤基因治疗的新领域。
CD106是一种重要的细胞黏附分子，属免疫球蛋白超家族成员。通过在其D1和D4结构域与其受体迟现抗原(VLA-4)特异性结合参与多种病理生理过程，如调节炎症反应、诱导新生血管生成、促使淋巴细胞的归巢和再循环、促使肿瘤的生长和转移等[9]。Wu认为高表达CD106的肾癌细胞可促使T细胞迁移离开肿瘤细胞[10]。Chen研究发现:CD106在肿瘤细胞微环境中通过行使类似“分子开关”的作用，不仅可以招募肿瘤血管生成相关的黏附分子，有利于肿瘤细胞生长;而且能够通过感知周围环境介导内皮细胞与细胞外基质的黏附，如增加粘附蛋白、糖蛋白等细胞外间质成分的聚集，达到肿瘤侵袭、转移的目的[11]。这些研究结果说明CD106在肿瘤浸润、转移过程中具有重要作用。
口腔鳞状细胞癌由于其特殊的解剖结构及功能，早期发生淋巴结转移的概率较高。CD106是本课题组筛选的与口腔癌浸润、转移相关基因，对于其与口腔癌浸润、转移的关系仍缺乏足够的研究，因此本研究通过构建CD106基因的RNAi载体，开展其功能研究，为口腔鳞癌的基因治疗提供了一个有效的新靶点。在此研究中，我们成功构建CD106的RNAi慢病毒载体，病毒滴度达1.0×109TU/ml。CD106的RNAi慢病毒载体的构建将为深入研究CD106的生物学功能及其与口腔癌浸润、转移的关系奠定基础。
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基因靶向 篇5
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株和菌株
人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/ADM购自广西医科大学附属肿瘤医院,其亲本细胞株SKOV3由潍坊医学院肿瘤内科馈赠;大肠杆菌DH5a由潍坊医学院微生物学教研室保存。
1.1.2 主要试剂及来源
空质粒pSilencer2.1-U6 neo购自Ambion公司;大提质粒试剂盒购于Omega公司;阳离子脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2000购自普利莱公司;Trizol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、dNTP均购自上海生工公司;兔抗人Twist-抗、SABC(兔IgG)—POD试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;阿霉素为齐鲁制药冻干型制剂;MTT (四甲基偶氮唑盐)为Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 小干扰RNA的构建
利用Ambion公司在线设计程序,设计为能表达其发卡结构的小RNA(shRNA)的DNA序列顺义链和反义链。正义和反义寡核苷酸链由上海生工合成,各由2.0 OD加ddH2O(去离子水)配制成3 mg/ml溶液。
1.2.2重组质粒pTWIST-shRNA鉴定和纯化
已构建好的两条寡核苷酸链退火形成双链,与质粒pSilencer2.1-U6neo连接为pTWIST-shRNA转化大肠杆菌DH5a,用含氨苄青霉素的LB平板筛选,挑选阳性克隆并提取质粒,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,并测序证实插入序列为所设计的发卡序列。按大提质粒试剂盒的步骤提取并纯化质粒,待转染。
1.2.3细胞培养与转染
将对数生长的SKOV3/ADM细胞加入阿霉素使其终浓度为20μg/ml,作用1 h。间歇作用诱导细胞耐药,采用该方法连续诱导3次。耐药的SKOV3/ADM细胞分4组进行转染:空载体转染组、非特异转染组、pTWIST-shRNA转染组和非转染组。转染前24 h进行细胞计数,接种于6孔板,每孔2×105个细胞,细胞达90%融合时,进行转染。转染Twist-siRNA后48 h收集细胞分别进行RT-PCR和免疫细胞化学实验。
1.2.4 RT-PCR检测Twist mRNA表达
按Trizol试剂说明书的要求提取各组细胞总RNA。按Reverse Transcription System的说明书采用特异性下游引物法反转录成cDNA。聚合酶链(PCR)反应,Twist上游引物:5'-AACACAGTG-GAGCGAATTCCTTT-3';下游引物:5'-GGAAGTCCATCGA-CATGTTGCT-3’,扩增产物长262 bp。以β-actin为内参照,94℃预变性5 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min 45 s,循环30次后,72℃延伸10 min,4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外线透射观察仪观测、照相,用Band Scan图像分析软件对结果进行分析,以Twist与β-actin相对比值,比较各组细胞Twist mRNA的表达差异。
1.2.5 免疫组化法检测细胞Twist表达
未转染及转染48 h后的细胞爬片,然后按照说明书进行固定、染色、脱色、封片,在显微镜下观察并照相。
1.2.6 MTT检测细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50)
实验分四组:空载体转染组、非特异转染组、pTWIST-shRNA转染组和非转染组。取对数生长的SKOV3/ADM,制成1×105个/ml细胞悬液,接种96孔板,每孔100μl培养液,约含2×103个细胞,37℃、5%C02培养过夜;转染组细胞在细胞90%融合时开始转染,转染24 h后设6个加药孔,分别加入不同浓度的DDP(终浓度1.25μg/ml至40μg/ml),药物浓度按两倍比增加,每样本设4个平行孔,对照组不加药物,另设调零孔加RPMI 1640培养液,每孔200μl。转染72 h后按照说明书进行MTT检测。
1.2.7 流式细胞技术检测
细胞分组:SKOV3/ADM、SK-OV3/ADM+阿霉素、非特异转染组+阿霉素、特异性转染组+阿霉素。将SKOV3/ADM细胞接种于6孔板中,转染后48 h后加0.01 mol/L阿霉素。24 h后收集细胞,用PBS洗涤两遍,再用-20℃预冷的75%乙醇固定18 h。流式细胞仪检测,重复检测3次。
1.3 统计学分析
采用SPSS 1310软件进行单因素方差分析、独立样本t检验(组间)配对样本t检验(组内)处理,实验数据以均数±标准差()表示,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Twist-siRNA的鉴定和定量
Twist-siRNA经BamH I、HindⅢ双酶切,其产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳出现两条带,条带的位置与设计相符。质粒的测序结果证明插入片段的序列完全正确。将合成的siRNA稀释后测定260 nm的吸光度值提示合成的siRNA产量在200～380μg/ml之间。
2.2 RNA干扰前后SKOV3/ADM细胞中Twist基因的转录水平
各组细胞在相对于262 bp处均见扩增条带,且在100bp以上处可见内参β-actin的条带,各组间其亮度差异无统计学意义(P>0.05)。用Band Scan图像分析软件对结果进行分析,pTWIST-shRNA转染组与空载体转染组、非特异转染组和非转染组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。与非转染组比较,pTWIST-shRNA转染组细胞Twist mRNA的抑制率达45.5%。
2.3 pTWIST-shRNA对细胞Twist蛋白质表达的影响
免疫细胞化学染色法显示,pTWIST-shRNA转染组细胞Twist蛋白表达明显低于非转染组、空载体转染组和非特异性转染组,差异有统计学意义(P<0.05),而空载体转染组、非特异性转染组与非转染组之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。。
2.4 MTT检测各组细胞对阿霉素的半数抑制浓度
不同质粒转染入各组细胞,并暴露于阿霉素48 h后,各组细胞存活率均随阿霉素浓度的增加而降低,其中特异性转染组降低最为显著。非转染组SKOV3/ADM的IC50(16.54±0.23)μg/ml,其亲本细胞SKOV3为(6.04±0.11)μg/ml,测其耐药指数约为2.8,与该耐药细胞株所属医院提供的数值相符;pTWIST-shRNA转染后的SKOV3/ADM细胞对阿霉素的敏感性提高了约2.5倍,空质粒转染组与其他两组相比差异均有统计学意义(P<0.01),而空质粒转染组、非特异性转染组与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 pTWIST-shRNA对SKOV3/ADM周期和凋亡的影响
经阿霉素作用后,特异性转染组的细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例都明显高于空白对照组、未转染细胞、非特异转染组,差异均有统计学意义(P<0.01),而S期细胞所占比例显著低于后三者,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组、未转染细胞、非特异转染组之间的细胞周期分布及凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
卵巢癌是我国常见恶性肿瘤之一,死亡率高,在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位,在部份地区的农村中则占第二位,仅次于胃癌。我国每年死于卵巢癌约11万人,占全世界卵巢癌死亡人数的45%。根治性切除者五年生存率达53.0%,其中多为小卵巢癌或大卵巢癌缩小后切除者,姑息性切除仅12.5%,药物治疗少见生存5年以上者。治疗的难点为卵巢癌细胞的转移及对化疗药物——尤其是一线化疗药阿霉素、顺铂等产生耐药性,严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应,从而导致综合治疗的失败。而耐药性的产生与肿瘤细胞对凋亡的敏感性降低有关[3,4]。国内外大多数学者主要采用RNAi技术对多药耐药基因MDR[5]、核苷酸切除修复家族成员ERCC1等基因进行研究,对Twist的研究较少。
Twist是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因,与细胞凋亡、肿瘤转移和血管生成密切相关,并在多数恶性肿瘤中过度表达[1,2]。另外,抑制Twist表达增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[3,4]。本实验针对Twist基因设计的特异性序列与质粒pSilencer2.1-U6 neo连接为重组质粒pTWIST-shR-NA,转染入卵巢癌耐药细胞株SKOV3/ADM,研究RNAi技术对SKOV3/ADM中Twist基因表达和凋亡的影响,及耐药细胞株对化疗药物阿霉素的敏感性的变化,证实RNAi技术可以从多方面抑制Twist基因的表达,从而逆转SKOV3/ADM对化疗药物的耐药性。
3.1 重组质粒的构建
选取Twist基因cDNA序列起始点280个核苷酸之后的连续19nt作为RNA干扰的特异性序列,设计为能表达其发卡结构的小RNA(shRNA)的DNA序列,两端加上BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,两条寡核苷酸链退火形成双链,与线性化质粒pSilencer2.1-U6 neo连接,取名为pTWIST-shRNA。克隆后重新提取质粒pTWIST-shRNA,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后测序,其序列与所设计的特异性序列相符,证明特异性质粒重组成功。
3.2 RNAi技术逆转SKOV3/ADM细胞阿霉素耐药的机制
本实验是将针对Twist设计的双链RNA寡核苷酸导入SK-OV3/ADM,其与TWIST基因的mRNA互补结合并使之降解,沉默Twist基因,降低其在卵巢癌耐药细胞株中的表达,逆转了耐药细胞株对阿霉素的耐药性。
3.3 靶向Twist基因的小干扰
RNA对SKOV3/ADM细胞凋亡的影响研究表明RNA干扰有很强的抑制目的基因的作用[6],比反义寡核苷酸抑制目的基因的效果更强。多种肿瘤利用此方法对Twist基因的靶向进行了研究,被干扰的肿瘤细胞出现生长抑制、凋亡增加、侵袭性下降及对化疗药物敏感性增强的现象[1,2,3,4]。上述研究均为笔者将Twist基因作为基因治疗靶,特异性诱导卵巢癌耐药细胞凋亡、逆转其化疗耐药性提供了有力的理论依据。
综上所述,RNA干扰技术有效地调节SKOV3/ADM细胞中Twist基因的表达,能够逆转卵巢癌耐药细胞对化疗药物的耐药性,成为抗肿瘤基因治疗的新方法。
摘要：目的 探讨载体表达的小干扰RNA(siRNA)影响卵巢癌耐药细胞株Twist基因的表达、促进凋亡并逆转其阿霉素耐药的可行性。方法 体外构建Twist小发卡状RNA(shRNA)的表达质粒,脂质体法介导将其转染入SKOV3/ADM细胞。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Twist mRNA的表达;使用免疫细胞化学法(ICC)检测Twist蛋白的表达;使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定各组细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测其对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果 Twist shRNA转染组细胞Twist mRNA的表达与其他两组相比明显减弱,Twist蛋白表达明显下调,差异均有统计学意义(P＜0.01);阿霉素敏感性比正常对照组提高了约2.5倍;流式细胞仪显示阿霉素作用24 h后,特异性转染组细胞周期分布发生明显改变,G0/G1期细胞比例增多,而S期细胞比例减少,凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 针对TWIST合成的siRNA能够有效地抑制TWIST mRNA和蛋白的表达,促进卵巢癌耐药细胞凋亡并能恢复其对阿霉素的敏感性。应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性。
关键词：卵巢癌肿瘤,Twist,RNA干扰,逆转耐药,凋亡
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基因靶向 篇6
1 材料与方法
1.1 实验材料细菌及主要试剂
婴儿双歧杆菌 (编号1.1853) 、含目的片段pcDNA3.1 (+) -DCN质粒由本实验室保存, , 含PGEX-4T-1质粒的大肠杆菌DH5a菌由山西医科大学寄生虫实验室王海龙老师惠赠, EcoR I、Not I核酸内切酶、T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司, 厌氧袋、厌氧发生器、PYG培养基、BS培养基购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计与合成
据实验要求, 设计引物。其中P1端引入EcoR I酶切位点, P2端引入Not I酶切位点。引物由上海生工公司合成。
1.2.2 目的基因的扩增及鉴定
以pcDNA3.1 (+) -DCN质粒为模板, PCR扩增DCN基因序列。取PCR扩增产物5.0μL, 于琼脂糖凝胶电泳45min, 凝胶成像分析系统观察结果, 鉴定为目的基因, 并将其余PCR产物进行回收。
1.2.3 目的载体的提取与鉴定
含载体PGEX-4T-1质粒的DH5a菌低温条件下迅速接种于含氨苄青霉素的LB培养基中, 37℃振荡培养过夜。次日取菌液, 按试剂盒说明提取PGEX-4T-1质粒。之后将所得物进行琼脂糖凝胶电泳, 证实为PGEX-4T-1质粒。
1.2.4 目的基因与载体连接
DCN基因及PGEX-4T-1质粒分别取30μL, 在10×buffer反应体系中使用EcoR I、Not I内切酶进行双酶酶切2h, 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据DNA Marker的标志, 使用刀片切取1.1 kbp及5.0 kbp长度的DNA凝胶片段。并将两段凝胶装入EP管中, 分别利用凝胶提取纯化试剂盒说明回收其中所含的DNA基因。将回收的PGEX-4T-1目的载体和DCN目的基因分别取10μL、30μL, 加入到含2μLT4 DNA连接酶, 5μL 10×buffer、3μL PEG4000反应体系中, 22℃连接, 4℃水浴过夜。后从上述连接体系中取3μL样品, 同时另取5μL产物进行EcoR I、Not I内切酶双酶酶切, 之后应用琼脂糖凝胶电泳检测其片段长度。
1.2.5 重组目的载体转化入双歧杆菌
将过夜培养的婴儿双歧杆菌接种于PYG培养基中。37℃厌氧培养至OD600nm=0.6, 低温离心收集菌体。预冷去离子水清洗3次, 10%甘油洗涤一次。后加入7μL质粒PGEX-4T-1-DCN, 补加10%甘油至100μL。将混合液盛于预冷的电击杯中, 并置于冰上5min。将电穿孔仪调节至电场强度:20kV/cm、电容:25μF、电阻:200Ω, 电击后使重组质粒转化入婴儿双歧杆菌。电击完毕, 即刻向电击杯中加入1mL PYG液体培养基, 充分混匀, 后将液体移至1.5mL EP管中, 37℃厌氧培养1h, 待目的载体充分表达后, 将余下菌液平铺至一含氨苄青霉素的BS固体培养基中, 37℃厌氧环境培养。待72h后, 从培养基中挑选出一生长良好的单菌菌落, 接种至含氨苄青霉素的PYG液体培养基的试管中, 37℃厌氧培养过夜, 次日取出试管, 按照质粒提取纯化试剂盒说明提取纯化PGEX-4T-1-DCN重组质粒。后将提取物进行双酶酶切并进行琼脂糖凝胶电泳, 验证酶切片段为PGEX-4T-1-DCN重组质粒。后取提取物, 送上海生工公司做测序处理。
2 结果与分析
2.1 DCN基因、PGEX-4T-1质粒检测
利用上述合成的相应引物p1/p2对DCN进行PCR扩增, 获得扩增产物用PCR纯化试剂盒纯化;37℃过夜培养含PGEX-4T-1载体的DH5a菌, 用质粒提取试剂盒提取PGEX-4T-1质粒, PCR纯化后的产物与提取质粒跑1%琼脂糖凝胶电泳, 结果显示, 各自片断在1.1kbp和5.0kbp处形成一明亮的条带, 与预计片断大小一致 (图1) 。
(1泳道为MARKER, 2泳道为DCN片段, 3泳道为PGEX-4T-1质粒)
2.2 重组质粒的检测
连接后的重组质粒与经双酶切后的重组质粒同时进行琼脂糖凝胶电泳, 电泳图谱可见重组片段大小约为6.1kbp, 而双酶切重组片段后得到两条电泳条带, 大小分别是1.1kbp和5.0kbp, 分别与DCN基因和载体片段大小相符 (图2) 。
(1泳道为MARKER, 2泳道为双酶切前片段, 3-4泳道为双酶切后片段)
2.3 婴儿双歧杆菌阳性菌落检测
用电穿孔法将PGEX-4T-1-DCN重组质粒转化婴儿双歧杆菌, 72h后在含氨苄青霉素的BS固体培养基平板上可见散在菌落生长, 而同期转化的婴儿双歧杆菌在含氨苄青霉素的BS固体培养基平板上未见生长。挑选阳性单个菌落, 培养后提取质粒, 双酶切后取所得产物电泳, 得到两条条带, 大小为5.0kbp和1.1kbp, 分别与目的载体和目的基因大小相符 (图3) 。
(1泳道为MARKER, 2-3泳道为转化入双歧杆菌菌后双酶切片段)
2.4 测序鉴定
测序结果证明提取到的质粒为所要基因, 且其DNA序列没有发生突变, 最终结果表明, 构建重组载体成功。
3 讨论
核心蛋白聚糖 (decorin, DCN) 是蛋白聚糖 (proteoglycan, PG) 家族的一个小分子组分。具有多种生物学功能, 如调节细胞增殖、分化及基质形成等。近年大量资料表明DCN在体内充分表达或者做为重组基因均可发挥其抑制不同组织来源肿瘤细胞生长的特性, 使肿瘤组织的成瘤性、浸润性及恶性表型降低[5,6]。还有研究表明:DCN能逆转肿瘤细胞抗药性[7]。故证明DCN具有良好的抗肿瘤作用, 尤其在预防肿瘤发生及转移中发挥其极为重要的作用。本实验室前期实验, 充分表明了DCN对肝癌细胞及胃癌细胞的生长有明显的抑制作用, 并可诱导二者细胞株发生凋亡。同时我们已构建了DCN的原核及真核表达体系, 并对其生物学活性进行了体内外研究, 结果表明, DCN转基因治疗能诱导肿瘤细胞凋亡、显着抑制肿瘤生长并能够下调免疫抑制分子的表达。此类研究为临床使用DCN生物治疗肿瘤细胞的新方法提供了科研依据及基因学学线索, 同时增加了DCN表达及使用外源重组片段或转入其他载体均可能成为一种独立及联合治疗肿瘤的生物学方法。
本实验室选用的双歧杆菌是人体一种不产生内外毒素的重要生理菌。经过多年研究发现, 双歧杆菌本身具有优异的抗肿瘤和免疫调节功能及免疫激活[5]作用, 可增强巨噬细胞、淋巴细胞的活性, 直接杀伤肿瘤细胞, 其表面活性物质可通过调控肿瘤细胞凋亡相关基因的表达, 诱导肿瘤细胞自然凋亡[6]。双歧杆菌可直接或间接地清除致癌物质, 通过酸化肠道环境, 加速致肿瘤物质排泄, 缩短致肿瘤物质与肠黏膜的接触时间;还可以抵抗体内一些有害菌的生长, 减少内源性致肿瘤物质的产生, 以降低肿瘤的发生率。双歧杆菌做为新型的肿瘤生物治疗载体, 即可发挥菌体本身的抗肿瘤作用, 又可成为其他基因载体, 发挥联合作用。理论上, 一些针对实体瘤具有生物学治疗作用的基因, 例如血管生长抑制因子的基因、肿瘤自杀基因、校正和修复突变的癌基因的片段、具有杀伤肿瘤细胞的细胞因子基因等, 均可使用双歧杆菌做为其导向载体。因此, 双歧杆菌做为新型的生物学载体已为恶性肿瘤的治疗提供了新的方向。
参考文献
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[6]Reed CC, Waterhouse A, Kirby S, et al.Decorin prevents metastatic spreading of breast cancer[J].Oncogene, 2005, 24 (6) :1104-1110.
基因靶向 篇7
1 材料与方法
1.1 病例资料
自2008年10月-2010年6月,在本院收治的IIIb～Ⅳ期肺腺癌患者42例,其中男性17例,女性25例,年龄30～83岁,<40岁者2例，40～49岁者10例，50～59岁者10例，60～69岁13例，≥70岁者7例，平均年龄(59.3±10.7)岁，中位年龄62岁。组织类型全为肺腺癌，所有患者均在知情同意后采集血样。
1.2 EGFR基因检测
经前臂静脉采集外周血液约5 m L,4℃放置过夜后离心分离血清。血清游离DNA提取后检测，检测内容：EGFR基因的外显子19(E19）和外显子21(E21）；检测方法：突变富集-液相芯片联用法；主要材料：surplexTM肿瘤靶向治疗靶标检测液相芯片（系列）；主要设备：液相芯片阅读仪；检测单位：广州益善生物技术有限公司。
1.3 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKi）的治疗
治疗方案是口服吉非替尼250 mg/d或厄罗替尼150mg/d，直至病情进展。治疗开始后前3个月每月评估疗效,随后每2个月评估1次。疗效评判标准依据实体肿瘤疗效评估指南。
1.4 统计学方法
统计学处理采用SPSS 13.0软件进行方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 42例肺腺癌患者外周血游离DNA的EGFR基因突变和临床情况见表1,总体EGFR基因检测结果：突变率47.6%（20/42例），E19缺失28.1%（11/42例），E21突变35.7%（15/42例）。42例中有11例长期大量吸烟（>400年支），突变型患者中仅3例，野生型有8例。
2.2 20例EGFR基因突变者，女性患者11例，占55.0%，服用TKIs疗效RR 60.0%(12/20)，DCR 85.0%(17/20)，TTP 72～637天，中位TTP172.5天；22例野生型服用特罗凯疗效RR 13.6%(3/22例)，DCR36.4%(8/22例)，TTP 36～221天，中位TTP 108天。组间ORR、DCR、中位TTP比较,差异存在统计学意义。见表2。
3 讨论
在晚期NSCLC的一线化疗后的总生存期（OS）是7.4～10.3个月，1年生存率为26%～43%，近年来疗效没有得到进一步的提高，因此在临床上需要一些新的治疗策略来改善患者的生存。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）的应用，为肺癌的治疗带来了新的希望。大量的临床研究证实，小分子TKIs药物（吉非替尼或厄洛替尼）对EGFR突变患者疗效较好。EGFR突变主要指19外显子的缺失和21外显子的点突变，占EGFR突变的绝大多数。IPASS研究、厄洛替尼西班牙SLCG研究、SATURN研究结果显示，EGFR突变的NSCLC患者在生存和缓解率获益令人印象深刻，毋庸置疑，EGFR突变是EGFR-TKIs个体化治疗的第一个明确靶点，也是NSCLC治疗的新里程碑。
但如何获取更准确，更简单易行的检测手段，一直是探讨的热点，近年国内外开始尝试血清循环DNA检测EGFR基因突变。业已证明,实体肿瘤(包括肺癌)患者的血循环中存在游离的肿瘤DNA,其来源主要是肿瘤组织中癌细胞凋亡后,癌细胞内的DNA释放入人体外周血,经癌组织来源的循环DNA中基因变异与循环血中DNA相一致,且肿瘤患者外周血游离DNA含量比正常健康人增高10倍[1,2]。EGFR基因突变是肿瘤特异性的体细胞遗传改变,这类突变基因仅存在于癌细胞中,体内所有正常细胞均属于野生型[3]。因而通过检测血清游离DNA的EGFR基因,可以筛选到这类肿瘤特异性的药效评估标志,从而为临床用药提供依据。最近,Kimura等[4]曾对27例Ⅲb～Ⅳ期非小细胞肺癌患者进行了血清EGFR检测,共检出突变13例(48.1%),吉非替尼的客观有效率为53.8%(7/13例),病情控制率为84.6%(11/13例),中位无进展生存时间为200 d,中位生存时间为611 d。而对EGFR野生型肺癌,吉非替尼的客观有效率为14.3%(2/14例),病情控制率为42.9%(6/14例),中位无进展生存时间为46 d,中位生存时间仅为232 d,2组间差异极为显著(P<0.01)。
本研究专门选择肺腺癌患者42例，血样中检出EGFR突变20例,突变率为50.0%,16例EGFR基因突变者进行TKIs靶向治疗,客观有效率为60.0%,疾病控制率为85.0%；TTP 72～637天，中位TTP172.5天。22例野生型TKIs治疗RR 13.6%，DCR 36.4%；TTP 36～221天，中位TTP 108天。突变型与野生型在客观疗效和疾病控制和中位TTP方面比较，差异有统计学意义。提示：依据外周血游离DNA中EGFR基因突变检测结果进行选择性靶向治疗,可以为部分肺腺癌患者提供了指导作用，尤其对于不耐受化疗兼无法获取组织学检测的腺癌患者，或多程放化疗后尚未使用TKi的肺腺癌病人。尽管尚存在一些需要解决的问题，但是由于晚期肺腺癌的组织难于获取，故外周血游离DNA中EGFR基因突变检测仍不失是一种临床治疗中可资参考的补充手段。而且血样采集方便，患者易于接受，该项技术值得临床应用。
参考文献
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