受体基因（共8篇）
受体基因 篇1
多囊卵巢综合征 (polycystic ovary syndrome, PCOS) 属于妇科领域中比较复杂内分泌代谢疾病, 主要由于女性体内过高的雄性激素及性激素平衡导致不能正常排卵的常见疾病, 该病不但会对女性的内分泌功能造成严重影响, 更加增大了女性发生心血管疾病、糖尿病、宫内肿瘤及其他妇科疾病的风险, 严重影响多数女性患者的健康[1]。所以, 近几年来, 关于研究多囊卵巢综合征 (PCOS) 患者的雄激素受体基因 (AR) 与性激素结合蛋白基因 (SHBG) 的相关性在国内外不断发展, 但是, 这两基因与该病的具体关系, 至今无一结论[2]。所以, 本研究对PCOS患者中雄激素受体基因 (AR) 、性激素结合蛋白基因 (SHBG) 的情况进行研究观察, 为临床研究工作提供有力的依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年11月-2015年7月本院接诊的62例PCOS患者为观察组, 对照组为同一时期由于生殖系统发生异常导致不孕的62例患者。PCOS患者均符合“中华医学会妇产科学分会内分泌学组及欧洲人类生殖和鹿特丹标准”[3]。对照组为生理期正常且非内分泌性不孕患者, 年龄20~36岁, 平均 (29.4±3.8) 岁;观察组患者年龄21~35岁, 平均 (31.7±2.4) 岁。纳入标准: (1) 所有患者均同意参与该研究, 签署知情同意书; (2) 患者自身没有其他内分泌系统的疾病; (3) 无严重的器官功能障碍; (4) 半年之内及以上未用过激素类药物; (5) 无糖尿病等病史。
1.2 方法
1.2.1 PCOS与雄激素受体基因 (AR)
所有研究对象进行3 m L静脉血的抽取, 再次加入枸橼酸钠进行抗凝, 将其存贮在-80℃的恒温箱中。将蛋白酶K和200μL的血液样本置于离心管中混合均匀, 随后加入缓冲剂反向混合。在55℃环境中, 放置混合液10 min, 在此期间进行5~8次反向混合, 液体变为清亮时为标准。再加入无水乙醇, 充分的均匀混合再加吸附柱[4]。经过离心、4次漂洗后, 静置于室温5 min。在无污染的离心管中, 加入缓冲剂, 静置离心。收集溶液, 测定DNA纯度。对AR目的基因应用PCR技术扩增, 对PCR的产物监测。鉴定CAG序列的多态性和重复次数[5]。
1.2.2 PCOS与性激素结合蛋白基因 (SHBG)
经过采样、提取DNA、扩增SHBG、PCR的产物检测、分析毛细管电泳序列进行鉴定TAAAA序列多态性和重复次数[6]。
1.3 统计学处理
采用软件SPSS 13.0统计学软件分析数据, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料比较采用字2检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCOS与AR的关系
2.1.1 两组AR-CAG片段重复多态的分布状况
统计分析研究对象的AR-CAG, 重复数范围在11~33。两组患者的重复数主要集中在21、22、23。观察组患者所占的比例分别为:28.03%、32.49%、30.84%;对照组患者所占的比例分别为:29.85%、36.66%、28.75%, 两组数据比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。
2.1.2 AR-CAG重复多态性分布情况
按照两组患者的AR-CAG重复多态性分布, 22作为分据点, 分为长、短两重复组。短重复组 (n≤22) 在观察组、对照组中的比例分别为48.39% (30例) 、51.61% (32例) ;长重复组 (n>22) 在观察组、对照组中的分布分别为51.61% (32例) 、48.39% (30例) , 两组数据比较差异均无统计学意义 (P=0.684、0.497) 。
2.1.3 观察组患者高雄激素血症与AR-CAG的重复多态性关系
根据观察组患者血清中睾酮的浓度值, 以0.7 ng/m L为界线点, 将其分为高雄激素血症组34例和雄激素正常组28例。观察组中, 短重复组在高雄激素血症组的分布为52.94% (18例) , 在雄激素正常组分布为42.86% (12例) ;而长重复组在高雄激素血症组的分布为61.76% (21例) , 在雄激素正常组的分布为39.29% (11例) , 上述数据比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。
2.1.4 观察组患者胰岛素抵抗与AR-CAG的重复多态性关系
根据血清中的胰岛素水平, 以空腹血清胰岛素水平60 pmol/L作为参考, 将观察组患者分为胰岛素抵抗组 (>60 pmol/L) 36例和非胰岛素抵抗组 (≤60 pmol/L) 26例。短重复组中胰岛素抵抗组分布比例为56.67% (17例) , 非胰岛素抵抗组分布比例为43.33% (13例) , 比较差异无统计学统计意义 (P>0.05) 。长重复组中胰岛素抵抗组分布比例为59.38% (19例) 、非胰岛素抵抗组的分布为40.63% (13例) , 比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。
2.2 PCOS与SHBG的关系
2.2.1 比较两组患者的SHBG-TAAAA分布情况
通过琼脂糖凝胶电泳检测、毛细管电泳序列分析, 能够检测出SHBG-TAAAA的13种基因型, 两组SHBG-TAAAA基因型的分布情况比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。
2.2.2 观察组患者SHBG-TAAAA重复多态性与胰岛素抵抗的关系
根据以上的分组方式, 观察组患者分别分为胰岛素抵抗组 (n=36) 和非胰岛素抵抗组 (n=26) 。两组患者的9/9基因型分布情况比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;其他分布比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。
3 讨论
多囊卵巢综合征 (polycystic ovary syndrome, PCOS) 的致病机制比较复杂, 导致该病发生的主要原因为内分泌不平衡和卵泡发育出现异常引起的。胰岛素抵抗和高雄激素血症属于内分泌失调病理基础, 而且卵泡发育发生停滞会减少成熟卵泡的生成量减少, 或者成熟卵泡的排出发生障碍[7,8]。最近几年来, 许多临床研究表明其与雄激素受体基因 (AR) 、性激素结合蛋白基因 (SHBG) 、卵泡发生异常及内分泌失调有密切联系。
雄激素受体影响着雄激素的发挥作用, 所以AR的表达会在雄激素活性中起着关键性作用。在机体的各个器官中雄激素均会有所表达, 生殖器官中该激素的表达达到最高[9]。编码AR的基因主要位于Xq11-12位点上, 其中含7个内含子、8个外显子。且种族及地域性对CAG产生不同的影响, 例如在欧洲在8~39, 美洲在8~30。近年来研究表明, 地域相同但不同种族的人CAG的多态性有着明显差异[10,11,12]。所以, AR基因表达也有相对稳定性。随着CAG重复次数的增长, AR基因的转录活性会减弱。
性激素结合蛋白在机体中可起到特异运输功能, 能把雄激素和雌激素送达到器官。且SHBG编码基因主要位于17p13-12位点, 且重复序列 (TAAAA) 的重复次数与编码基因的转录活性有密切联系[13,14,15]。性激素被运送各作用器官上, 还受血浆SHBG水平的多样性影响, 主要通过体液循环, 或者直接作用等影响方式。所以, 根据近年研究, 可以利用血浆中SHBG的水平能够用来判断体内胰岛素水平。
本研究主要对POCS患者的AR进行观察, 结果显示, 两组患者在CAG重复序列多态性上比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 且所有患者在短重复组和长重复组的分布状况比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。研究结果也表明PCOS的患病率与CAG重复序列多态性无直接联系, 但是也不能排除该基因在PCOS的发病上有潜在因素的可能[16,17,18,19]。另外, 对62例PCOS患者单独研究, 短重复组在高雄激素血症组的分布为52.94% (18例) , 在雄激素正常组分布为42.86% (12例) ;而长重复组在高雄激素血症组的分布为61.76% (21例) , 在雄激素正常组的分布为39.29% (11例) , 该结果表明AR-CAG的多态性在高雄激素血症发生率上起着重要作用, 且短重复组更易引起雄激素血症的发生相比于长重复组。主要原因由于短重复序列会提高雄激素的转录活性, 加速了雄性激素的分泌, 机体的内分泌发生失衡, 更加引起高雄激素血症的发生[20,21,22]。所以, AR-CAG的多态性也是PCOS发生的另外潜在致病因素。短重复组中胰岛素抵抗组分布比例为56.67% (17例) , 非胰岛素抵抗组分布比例为43.33% (13例) , 差异无统计意义 (P>0.05) 。长重复组中胰岛素抵抗组分布比例为59.38% (19例) 、非胰岛素抵抗组的分布为40.63% (13例) , 进一步表明胰岛素抵抗与AR-CAG的多态性无直接相关性, 可能是由于AR-CAG的多态性是在影响雄激素水平的同时, 间接影响胰岛素的分泌。
本研究发现, 与国外相关报道的所有患者的SHBG-TAAAA的13种基因型存在明显差异相比, 本文并未得出相似结果, 这可能与患者的种族、地域不同有关;也可能与该研究的所选取的患者例数有关系, 该结论目前还未被认可。在对62例PCOS患者单独研究中发现, 9/9基因型的分布在胰岛素抵抗组和非胰岛素抵抗组中存在显著性差异 (P<0.05) 。该结果可以推断出, PCOS患者的胰岛素抵抗会与9/9基因型TAAAA的多态性有一定的联系。
综上所述, PCOS的发生与AR、SHBG有一定关系, 可对PCOS的检查指标、PCOS防治、及早诊断起重要作用。
摘要：目的:研究观察多囊卵巢综合征 (polycystic ovary syndrome, PCOS) 患者的雄激素受体基因和性激素结合蛋白基因的情况。方法:选取2014年11月-2015年7月本院接诊的62例PCOS患者为观察组, 同一时期由于生殖系统发生异常导致不孕的62例患者为对照组。提取所有患者血液标本的DNA进行基因扩增、琼脂糖凝胶、毛细管电泳等检测, 观察研究PCOS患者的雄激素受体和性激素结合蛋白基因的情况。结果:观察组SHBG-TAAAA基因型多态性与胰岛素抵抗的研究中, 发现9/9基因型的分布在胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗两组中存在统计学差异 (P<0.05) ;观察组中, 短重复组在高雄激素血症组的分布为52.94%, 在雄激素正常组分布为42.86%;而长重复组在高雄激素血症组的分布为61.76%, 在雄激素正常组的分布为39.29%, 两组数据比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论:雄激素受体基因和性激素结合蛋白基因与PCOS相关, 可对PCOS的检查指标、PCOS防治、及早诊断起重要作用。
关键词：多囊卵巢综合征,雄激素受体基因,性激素结合蛋白基因
受体基因 篇2
诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定
目的: 构建适于原核表达的.人诱骗受体DcR3基因, 并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定.方法: 查得人DcR3 Cdna全序列, 将其分段设计引物, 通过重叠PCR获得DcR3基因.构建Pet-22b(+)/DcR3表达载体, 转化大肠杆菌Rosseta-gami, IPTG诱导表达, Ni柱纯化.采用ELISA进行特异性鉴定.结果: 通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 蛋白纯度达95%以上.ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合.结论: 诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化, 为进一步的功能研究奠定了基础.
作 者：李文珠 陶惠然 颜江华 张长弓 苏金华 王阶平杨桂旺 庄国洪 作者单位：李文珠,王阶平,杨桂旺,庄国洪(厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005)陶惠然,颜江华,张长弓,苏金华(厦门大学医学院抗癌研究中心,福建,厦门,361005)
刊 名：细胞与分子免疫学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(2) 分类号：Q786 关键词：DcR3 基因构建 基因表达马铃薯转基因受体系统的建立 篇3
关键词：马铃薯,转基因,受体系统
马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 是茄科茄属蔬菜, 其地下块茎可供食用。是世界上主要的经济和粮食作物之一, 又是重要的蔬菜作物, 在我国农业生产中占有相当重要的地位。自Magro J在1938年首次从离体马铃薯植株的培养诱导了块茎的发生以后, 几十年来马铃薯的组织培养工作有了很大的进展, 分别对茎[1]、叶[2]、块茎[3]、花药[4]等进行了愈伤组织的诱导试验并获得了再生植株。但具相关文献报道, 不同品种间, 其再生体系存在显著差异[5,6]。因此, 针对不同品种开展再生体系的研究是有必要的。在前人研究的基础上对“Wen-40”和“紫花白"2个马铃薯品种叶片的离体培养与植株再生进行了研究探讨, 为利用转基因技术进行马铃薯品种改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
马铃薯品种“Wen-40”“紫花白”无菌苗均由种苗生物工程国家重点实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的获得
选取培养20 d左右生长健壮的组培苗, 将叶片剪成0.5 cm大小, 茎段剪成1 cm大小, 分别接种在下列培养基中:
S2:MS+6-BA0.3 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1
S3:MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+GA35.0 mg·L-1
S4:MS+6-BA2.0 mg·L-1+2, 4-D 0.5 mg·L-1
以上培养基如无特别说明, 琼脂浓度均为0.7%, 蔗糖浓度均为30 g·L-1, pH 6.0, 培养条件为:温度 (25±2) ℃, 光照14 h·d-1, 光照强度2 000～3 000 lx (下同) 。21 d后统计外植体的出愈率以及愈伤组织的形态。
1.2.2 不定芽的分化和生根
将带有芽点的愈伤组织接种在下列分化培养基中:
SY2:MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
SY3:MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
SY4:MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
SY5:MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
21 d后调查统计各种培养基上的出芽率、有效芽数以及芽生长势。待芽长至1 cm左右时, 将其从愈伤组织上剥离下来接种在MS培养基中进行生根培养。
1.2.3 抗生素敏感性试验
在前期试验的基础上, 在表现良好的愈伤诱导培养基中分别加入0、25、 50、 75、100 mg·L-1 卡那霉素 (Km) 和0、100、200、300、400、500 mg·L-1 头孢霉素 (Cef) , 研究马铃薯愈伤诱导时对抗生素的敏感性。28 d后调查统计抗生素对马铃薯愈伤诱导的影响。
2 结果与分析
2.1 愈伤诱导
由表1可知, 不同品种、不同外植体、不同培养基对马铃薯愈伤组织的诱导都有显著的影响。虽然不同品种的茎段和叶片在不同培养基上均能诱导出愈伤组织, 但出愈率、愈伤组织的形态都有差异。总的看来, 茎段的出愈情况明显好于叶片, 其诱导出的愈伤组织形态大体分为:水渍状、块状、颗粒状、絮状 (见图1) , 无论是“Wen-40”, 还是“紫花白”在S2、S4培养基中诱导出的愈伤组织都呈水渍状、块状、絮状, 不利于不定芽的分化, 只有“Wen-40”在S3培养基上诱导出的愈伤组织为颗粒状, 利于芽的分化。
2.2 芽分化
将“Wen-40”茎段在S3培养基上诱导出的颗粒状愈伤组织分别接种在分化培养基SY2、SY3、SY4、SY5中, 4周后调查统计数据显示 (见表2) :愈伤组织在各种分化培养基中都能分化出芽, 但由于分化培养基成分不同, 其分化率和平均有效芽数均存在显著差异, 其中SY3和SY5培养基中的出芽率和平均有效芽数较多, 明显高于SY2、SY4。但相对于SY3培养基上诱导出的芽, SY5培养基上诱导出的芽较粗, 生长势明显好于SY3 (见图2) 。
注:大于0.5 cm的芽为有效芽 (下同) 。
2.3 生根
待芽长至1 cm左右时, 将其从愈伤组织上剥离下来接种在MS培养基中, 1周后便有根长出 (见图3) , 3周后, 根全部长出, 植株生长正常 (见图4) 。
2.4 抗生素敏感性
将“Wen-40”茎段切成1 cm左右, 分别接种在添加不同浓度Km和Cef的S3培养基上。由表3可知, Km对马铃薯“Wen-40”茎段愈伤诱导有明显的抑制作用。当Km浓度为25 mg·L-1时, 茎段就不能诱导出愈伤组织 (见图5) , 且随着浓度的增加, 抑制作用增强。
由表4可知:在一定浓度范围内, Cef对马铃薯“Wen-40”茎段愈伤诱导影响不明显, 但当浓度达到一定高度时, 其对愈伤诱导的影响显著。研究表明:当Cef浓度≤100 mg·L-1时, 其对马铃薯“Wen-40”茎段愈伤诱导的影响不显著, 当浓度≥200 mg·L-1时, 虽然愈伤大小并没有显著影响, 但出愈率却显著低于对照, 且随着浓度的进一步增加, Cef对茎段愈伤诱导的抑制作用加强 (见图6)
3 讨论
建立高效再生体系是进行马铃薯遗传转化的前提, 而影响马铃薯植株再生频率的因素较多, 其内在因素主要是马铃薯的基因型和外植体种类, 而外在因素主要是培养基的激素种类浓度[7]。试验结果表明:两个品种的不同外植体在不同培养基中虽然都能诱导出愈伤组织, 但差异较大, 这与前人的研究结果一致。在本研究中, 无论是茎段还是叶片, “Wen-40”都能分化出芽, 建立高效再生体系, 而“紫花白”却不能, 这说明马铃薯作为受体进行遗传转化时, 选择高植株再生率的基因型可能比选择外植体类型更重要。同时, 高浓度的6-BA和高浓度的GA3对马铃薯愈伤组织诱导有促进作用, 而一定浓度的IAA有利于马铃薯芽的分化。
在利用农杆菌介导法进行基因转化时, 转化后期为抑制农杆菌的生长和筛选具有抗生素抗性标记的转化体, 常在培养基中加入一定浓度的抗生素。适合的抗生素浓度既要能有效地抑制非转化细胞生长, 又要不影响转化细胞的正常生长。因此, 建立基因转化受体系统时必须针对不同的受体材料确定适合的筛选浓度。Km是一种很强的细胞生长抑制剂, 也是植物转基因技术中用于抗性筛选的抗生素, 而Cef是一种广谱的抗菌剂, 能有效抑制农杆菌的生长。本研究结果表明:25 mg·L-1的Km能完全抑制马铃薯茎段的诱导分化, 而200 mg·L-1的Cef对马铃薯茎段的诱导分化有显著的抑制作用。因此, 在开展马铃薯转基因技术研究时, 25 mg·L-1的Km是合适的转基因植株的抗性筛选, 而在进行除菌培养时, Cef浓度低于200 mg·L-1为宜。
参考文献
[1]齐恩芳, 张金文, 王一航.马铃薯茎段再生的植物激素配比优化[J].甘肃农业大学学报, 2006 (6) :14-17.
[2]白建明, 李先平, 杨万林, 等.彩色马铃薯叶片再生体系的研究[J].西南农业学报, 2006, 19 (9) :83-88.
[3]王晓杰, 乔利仙, 张敏凤, 等.马铃薯微型薯切块离体再生的研究[J].青岛农业大学学报, 2008, 25 (2) :120-122.
[4]王梓全, 卢翠华, 邸宏, 等.马铃薯花药培养再生植株的诱导与鉴定[J].东北农业大学学报, 2008, 39 (8) :10-14.
[5]王红梅, 李淑洁, 张正英.不同基因型马铃薯试管薯的诱导及其再生研究[J].甘肃农业大学学报, 2008, 43 (5) :55-58.
[6]蒋敏华, 黄先群, 李丽, 等.基因型和激素对转基因马铃薯植株再生的影响[J].种子, 2007, 26 (8) :1-4.
受体基因 篇4
EGFR已成为近年来肿瘤治疗研究和抗肿瘤药物筛选的热点,有关EGFR突变与肿瘤发生以及EGFR突变在分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。EGFR突变是癌症患者是否对酪氨酸激酶抑制剂敏感的强预测因子,因此EGFR基因突变的检测能为肿瘤靶向治疗提供依据。目前常用的EGFR突变检测方法有PCR-直接测序[2]、PCR-焦磷酸测序法、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)[3]、突变体富集PCR荧光探针法、探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)荧光探针法[4]、高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)、变性高效液相色谱法(denaturing high-
1. 检测方法
1.1 测序法
目前,DNA测序法是进行EGFR突变检测的可靠方法,也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析,过程比较繁琐、耗时长,且对取材和技术要求比较高,更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高,只能对含量大于20%的突变基因进行检测。因此,此方法在临床应用中还存在一定的限制,不适于大量临床样品分析。
1.2 探针扩增阻滞突变系统(amplification refrac-tory mutation system,ARMS)荧光探针法
ARMS又名等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS-PCR)。原理为:利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性,PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,针对不同的已知突变,设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时,在引物3'端设计一错配碱基,一个与野生DNA互补,一个与突变DNA互补,使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量PCR(real-time PCR)测定进行分析。蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions ARMS)是将ARMS和Scorpions实时PCR技术相结合的一种新技术。该技术所用探针为Scorpion探针,Scorpion探针是一种新型的探针,由一条发夹结构的探针和一条引物构成,探针的5'端和3'端分别标有报告荧光和淬灭荧光,3'端通过PCR blocker(一个非扩增的单体,防止探针退火后的延伸)与引物的5'端相连。在自由状态,报告荧光和淬灭荧光很接近,不产生荧光。变性阶段茎环结构打开,退火时引物与模板结合并延伸,环performance liquid chromatograph,DHPLC)、流式荧光杂交法等。如何评价这些试剂盒,如何为临床提供科学合理的依据是我们面临的问题。区与新合成的目的基因的互补区域结合,此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上,是分子内的结合。由于发夹结构打开,报告荧光和淬灭荧光分离,因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。
1.3 变性高效液相色谱法(denaturing high-performanceliquid chromatograph,DHPLC)
DHPLC能以3种方式操作:(1)在不变性温度条件下,可分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段,类似于RFLP分析。(2)在充分变性温度条件下,单链DNA或RNA分子能被区分,适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制。(3)在部分变性的温度条件下可进行基因突变检测、SNPs。
DHPLC技术的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”,在部分加热变性的条件下,更易于解链形成Y形结构,与固定相的结合能力降低,所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来,通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。DHPLC可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段。缺失或插入突变非变性方法和部分变性方法都能较好地检测出来,但利用非变性方法的检测结果中,野生型和突变型的区别更容易判断。
1.4 高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是基于核酸的物理性质,通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种技术,它是在常规PCR基础上增加一种饱和染料,无需使用序列特异性探针。其原理是由于扩增产物的序列、长度和碱基组成等决定了熔解曲线的变化,所以可通过熔解曲线的变化反映核酸性质的差异。HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限,可应用于基因分型、短片段重复序列的分析、序列匹配、突变扫描、甲基化和RNA编辑等多方面。目前熔解曲线法已经发展到采用特异性探针结合,通过探针和靶序列结合后熔解温度的差异来进行突变检测。
2. EGFR基因突变检测试剂盒质量评价
肿瘤细胞的突变属于体细胞突变,即突变的肿瘤细胞仅占肿瘤细胞的一定比例,并不是所有肿瘤细胞均突变。因此,如何科学有效地评价现有的以及可能出现的新的试剂盒检测突变体的准确性、在野生型背景中检测突变体的灵敏度以及特异性等技术指标,保障临床检测试剂盒的质量可靠、检测结果可信是我们面临的问题。
首先应明确试剂盒适用肿瘤的组织类型、适用的样本类型(石蜡包埋组织样本、新鲜冷冻组织样本或其他样本)。部分试剂盒宣称可以用于外周血EGFR基因突变检测,PCR-TaqMan法、DHPLC法、ARMS法、酶切富集法PCR法均有对外周血检测的报道,尽管在比较配对肿瘤组织和外周血样本EGFR突变研究中具有比较好的一致性,但是在针对突变阳性样本的检测中阳性样本检出比例相差甚远,因此针对试剂盒声称可以用于外周血EGFR基因突变检测需要进一步研究。
临床应用结果表明EGFR基因靶向药物的疗效不仅与靶点基因EGFR突变类型相关,而且与EGFR突变丰度相关[5]。因此EGFR基因突变检测不能仅仅局限在检测是否突变,还要检测其突变的相对丰度,为临床提供更合理的用药指导。如何科学合理地检测EGFR基因突变,如何科学合理地确定突变比例阈值与临床用药相关性,也是EGFR基因突变检测试剂盒质量评价的部分内容。
在针对特异性评价方面需要考虑不同浓度的野生型核酸样本、不同突变类型间进行交叉反应。
2.1 EGFR基因突变体参考品的建立
目前人类EGFR突变主要是在第18、19、20和21外显子上发生的29种突变,在这些突变中,第19位外显子的缺失突变,以及第21位外显子核苷酸的2576T–G(L858R)突变在非小细胞肺癌(NSCLC)中频繁出现,这些突变被认为是经典的突变,带有这些突变的病人对治疗药物易瑞沙敏感。中国食品药品检定研究院已经构建了29种人类EGFR基因突变体参考品,基本覆盖了目前最为常见EGFR基因突变,为EGFR基因突变检测试剂盒评价和临床实验室质量评价提供了质控物质,可用于国内大多数试剂盒的性能评价要求,具有十分重要的应用价值。
2.2 行业标准的建立
在EGFR突变检测中存在几个技术难点:肿瘤组织中肿瘤细胞及非肿瘤细胞并存,EGFR突变分子与野生型分子的并存;组织块或血浆也影响EGFR突变的检测,外周血中基因组本底相对高,突变分子比例相对低,而且含量也低;样本中多少比例的突变可导致药物敏感/耐药未知。行业标准的建立是一个复杂的过程,目前检测突变阈值的设定仅仅依靠方法的检测限来确定,还没有和临床疗效进行结合,因此在对EGFR突变试剂盒进行评价时还没有上升到和临床结合的层次。需要对患者进行研究分析,阐明在多少比例的突变能导致靶向药物的敏感/耐药,从而制定科学合理的检测限,保障患者充分的权益。对组织样本和血浆样本的检测试剂盒应采用不同的要求。在技术指标的设定上需要进行选择性、检测限、特异性、准确性等指标的考核。
通过统一参考品的建立和应用、行业标准的建立,可以很好地规范产品,提升产品质量,保障临床检测质量,更好地为临床服务,为患者服务,也是我们对试剂质量检测和考核的目标。
参考文献
[1]Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,Gurubhagavatula S,Okimoto RA,Brannigan BW,et al.Activating mutations in theepidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med,2004;350:2129-39.
[2]Miyamae Y,Shimizu K,Mitani Y,Araki T,Kawai Y,et al.Mutation detection of epidermal growth factor receptor andKRAS genes using the smart amplification process version 2 from formalin-fixed,paraffin-embedded lung cancer tissue.JMol Diagn;2010;12:257–264.
[3]Zhang X,Zhao Y,Wang M,Yap WS,Chang AY.Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutationsin cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer.Lung Cancer 2008;60:175–82.
[4]Zhou C,Ni J,Zhao Y,Su B,Rapid detection of epidermal growth factor receptor mutations in non-small cell lung cancerusing real-time polymerase chain reaction with TaqMan-MGB probes.Cancer J;2006;12:33–39.
受体基因 篇5
CCR5是细胞内β趋化因子RANTES、MIP-1α、MIP-1β的受体,具有调控T细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫功能,主要于记忆性的静止期T淋巴细胞、单核细胞、未成熟的树突状细胞等的细胞膜上表达。因此,CCR5多与炎症反应,且与免疫缺陷性疾病有关。随着对其不断的了解,CCR5已被证实作为辅助受体参与艾滋病病毒(HIV-1)入侵机体免疫细胞的过程[3,4],为研究CCR5与病毒病的关系提供了模型。研究发现,CCR5还参与糖尿病并发症、风湿性关节炎、免疫排斥反应、肿瘤、癌(如食管上皮癌、乳腺癌等)、阿尔茨海默病(AD)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等各种疾病的发生[2,5,6,7,8,9,10,11,12]。姜培娟等[13]研究显示,CD4+T细胞上CCR3、CCR5和CXCR3的表达异常可能在自然流产的发病中起作用。朱莉等[14]认为,人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中CCR5参与β淀粉样蛋白(Aβ)引起的T淋巴细胞的跨内皮迁移。
CCR5正逐渐成为人们的研究热点,但有关猪CCR5的研究则很少。王艳伟[15]研究显示,猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)能够诱发产生大量RAN-TES,说明CCR5可能在猪呼吸与繁殖综合征(PRRS)疾病中发挥作用。因此,试验选取猪CCR5基因作为研究对象,利用PCR、DNA重组等技术克隆CCR5,不仅有助于研究猪CCR5分子结构与生物学功能,而且可以在此基础上进一步研究CCR5颉颃剂抵抗病毒传染的特性,为治疗PRRS寻找新的先导化合物。
1 材料
1.1 质粒、菌株及组织
真核表达载体p Easy-T3和pc DNA3.1、大肠杆菌DH5α感受态细胞,均由扬州大学兽医学院保存;新鲜猪肉,市购。
1.2 主要试剂及仪器
DNA提取试剂盒,北京全式金生物科技有限公司生产;T4 DNA连接酶、XbaⅠ内切酶、HindⅢ内切酶,美国Promega公司生产;Axy Prep质粒小提试剂盒、Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒,杭州Axygen公司生产;电热压力蒸汽消毒器(型号为2000W),上海华线医用核子仪器有限公司生产;电泳仪(型号为EPS-300)、凝胶成像仪(型号为Tanon-2500),北京天能公司生产;台式高速离心机(型号为5810R),Themo公司生产;PCR仪(型号为AB-2720),Applied Bios公司生产;隔水式恒温培养箱(型号为GNP-9160BS-Ⅲ),北京新苗有限公司生产;超净台(型号为SW-CJ-1F),苏州净化有限公司生产。
2 方法
2.1 引物设计
根据NCBI递交的猪CCR5基因序列(Gen Bank号为AB119272.1),编码CCR5蛋白的CDS序列为连续的外显子,全长为1 059 bp。引物序列:上游引物5'-CCCAAGCTTATGGATTATCAAACGACGAGTC CCTTC-3',下游引物5'-GCTCTAGAGCCAGGTCA-CAAGCCGACAGAGATTTC-3'。“AAGCTT”为HindⅢ酶切位点,“GGATCC”为XbaⅠ酶切位点,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.2 猪CCR5基因的扩增及回收
按照DNA提取试剂盒的方法提取猪基因组DNA,并以其为模板,进行PCR扩增。反应条件:95℃2 min;95℃1 min,56℃1 min,72℃90 s,共35个循环;72℃10 min。产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。按照凝胶回收试剂盒说明书进行纯化、回收,做好标记后于-20℃保存,备用。
2.3 CCR5-T3载体的构建
连接体系:取回收的CCR5基因4.0μL,p EasyT3载体1.0μL,置于37℃水浴15 min。连接产物按照p Easy-T3试剂盒方法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于含2μL/m L氨苄青霉素(Amp)的LB平板上,倒置于37℃培养箱中过夜培养。
2.3.1 CCR5-p Easy-T3重组质粒的提取
从LB平板上挑取单个菌落分别接种于含Amp的LB液体5.0 m L试管中,37℃、220 r/min振荡培养约14 h,然后按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒,做好标记后于-20℃保存,备用。
2.3.2 猪CCR5基因的回收
酶切体系(20μL):灭菌dd H2O 7.8μL,RE Buffer 2.0μL,胎牛血清(BSA)0.2μL,CCR5-T3 8.0μL,HindⅢ1.0μL,XbaⅠ1.0μL。37℃水浴3.5 h,用1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。按照凝胶回收试剂盒说明书进行纯化、回收,做好标记后于-20℃保存,备用。
2.4 CCR5-pc DNA3.1(+)载体的构建
2.4.1 CCR5基因与pc DNA3.1(+)载体的连接
连接体系(20μL):dd H2O 2.0μL,5×T4 Buffer4.0μL,pc DNA3.1(+)2.0μL,CCR5基因10.0μL,T4 DNA连接酶2.0μL。16℃水浴过夜,次日转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于含Amp的LB平板上,倒置于37℃培养箱中过夜培养。
2.4.2 CCR5-pc DNA3.1(+)重组质粒的提取
从LB平板上挑取4个单个菌落分别接种于5 m L LB液体试管中(已加Amp 10μL),37℃、220 r/min振荡培养约14 h至液体浑浊,然后按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒,并进行下一步鉴定。
2.4.3 CCR5-pc DNA3.1(+)的鉴定
双酶切鉴定体系(20μL):dd H2O 7.8μL,RE Buffer 2.0μL,BSA0.2μL,CCR5-pc DNA3.1(+)8.0μL,HindⅢ1.0μL,XbaⅠ1.0μL。37℃水浴3.5 h后,进行1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。
PCR鉴定体系(50μL):dd H2O 18.0μL,T3-载体4.0μL,Sen P 2.0μL,Ant P 2.0μL,Mix 24.0μL。进行1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。
基因测序鉴定:经PCR和双酶切鉴定均为阳性的CCR5-pc DNA3.1(+)送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。
3 结果与分析
3.1 CCR5基因的PCR扩增(结果见图1)
由图1可知,猪CCR5基因的PCR扩增产物泳带大小与预期片段大小(1 059 bp)相符,结果表明,扩增片段正确,可以进行回收试验。
3.2 猪CCR5-p EASY-T3的酶切(结果见图2)
由图2可知,试验构建的CCR5-p EASY-T3样品经双酶切出现3 000 bp和1 000 bp以上2个条带,泳带大小与预期的CCR5(1 036 bp)和p EASY-T3载体(3 036 bp)相符,结果表明,CCR5基因已成功连接到p EASY-T3载体上。
3.3 CCR5-pc DNA3.1(+)的鉴定(结果见图3、图4)
由图3可知,试验构建的CCR5-pc DNA3.1(+)样品经过双酶切出现5 000 bp和1 000 bp以上2个泳带,与预期的pc DNA3.1(+)质粒(5 428 bp)和CCR5(1 036 bp)大小相符,初步判定CCR5-pc D-NA 3.1(+)真核表达载体构建成功。
由图4可知,CCR5-pc DNA3.1(+)样品经过PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳出现1 000 bp以上的泳带,与预期的CCR5(1 036 bp)大小相符,初步判定真核表达载体CCR5-pc DNA 3.1(+)构建成功。
根据英潍捷基(上海)贸易有限公司返回的测序结果,经DNA Star,Editseq和Megalign软件分析,结果显示,所构建的目的基因序列与NCBI数据库序列完全相同,认为猪CCR5基因真核表达载体CCR5-pc DNA3.1(+)构建成功。
4 讨论
CCR5作为G蛋白耦联因子超家族(GPCR)成员的细胞膜蛋白,是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,因此利用颉颃竞争的方法使CCR5颉颃剂成为阻断HIV-1感染细胞的途径[16],可使被感染的细胞数目大大减少。除了作为HIV-1早期侵染所必需的辅助受体外,还具有调控T细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫的功能。张远浩[17]研究显示,CCR5还对增长期同种异体移植存活率具有重要作用,CCR5颉颃剂还可以有效治疗一些临床疾病,包括器官移植、哮喘[18]、风湿性关节炎、多发性硬化症与糖尿病等。
王东霞等[19]研究发现,IFN-α作为一类很好的免疫调节、抗病毒生物制剂,不同剂量在一定范围内会对细胞CCR5的表达有显著影响,这为临床治疗相关疾病提供新的依据和途径。卫艳萍等[20]利用双黄连、黄芩等药物实现了对人CCR5的调控。
受体基因 篇6
1 GHR结构与特性
生长激素(GH)能促进动物肌肉和骨骼的生长,并能调节体内的物质代谢,是调节动物生长发育和三大物质代谢过程的一个重要内分泌因子。GH主要通过抑制肌肉及脂肪组织利用葡萄糖,同时促进肝脏中的糖异生作用并对糖元进行分解,从而使血糖升高;生长激素可促进脂肪分解,使血浆中游离脂肪酸含量升高。饥饿时胰岛素分泌减少,生长激素分泌增多,于是血中葡萄糖利用减少而脂肪利用增多,因此血浆中葡萄糖及游离脂肪酸含量上升。但是,由于GH为生物大分子,不能直接透过细胞膜,必须经过与靶细胞表面的GHR结合,由GHR介导通过不同的途径将信号传到细胞内,从而产生一系列的生理效应。因此,组织中GHR含量多少、功能正常与否都影响GH生理效应,影响到动物的生长发育和相关性状。
GHR普遍分布于生物体各种组织中,尤其大量存在于肝脏和脂肪细胞中,有报道淋巴细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、软骨细胞、β-胰岛素细胞和造骨细胞中也存在GHR。GHR是由单一基因编码的,大约含有620个氨基酸的单链跨膜糖蛋白,其胞外区、跨膜区及胞内区分别由约246个、24个、350个氨基酸残基所组成,不同物种的氨基酸确切数目稍有不同。
多数动物的GHR分子量在100~130k Da之间。b GHR基因被定位于20号染色体,由10个外显子和9个内含子组成。GHR基因的一个重要特性是在许多物种中具有3个以上可供选择的第1外显子,所以存在几个不同的5′-UTR,它们选择性地参与转录是导致GHR分子多态性的重要原因之一。在胞外区,GHR有5个保守的糖基化位点,是与配体结合的部位。在胞外区特定的位置上有7个半胱氨酸残基,其中有6个形成二硫键,起着维持GHR胞外区段特定空间结构的作用;在胞外区近细胞膜的位置上有一WSX WS(X为任意氨基酸)样序列(WSXWS-like motif),即由Try-Gly-Glu-Phe-Ser 5个氨基酸组成的保守序列,它可能在GH与GHR的结合过程中起关键作用。在胞内区,发现了2段保守序列,其中靠近细胞膜的序列框1(Box1)编码8个氨基酸残基,以脯氨酸残基为主,是GHR与酪氨酸激酶JAK2结合的1个位点;序列框2(Box2)则编码15个氨基酸残基,距Box1 30个氨基酸残基。如果这2段保守序列编码的某一个氨基酸残基发生突变,GH将失去促进生长的作用,这表明Box1、Box2在GHR介导的信号转导过程中起着关键的作用。
2 GHR基因多态性国外研究进展
Falaki等(1996)[2]报道,在编码牛GHR基因细胞内部C端的DNA序列中发现了9个RFLP-Taq1基因型,并且该位点的多态性与意大利荷斯坦牛的乳蛋白百分含量相关。Moisio等(1998)[3]从牛GHR基因c DNA3′侧翼区选择了1条303bp的片段(30bp的编码区和273bp的非编码区)进行PCR扩增,发现GHR基因的侧翼区有311bp、320bp、325bp等3种长度的变异和1个碱基替代多态性。Aggrey等(1999)[4]在牛GHR基因的P1启动区内发现了3个限制性片段长度多态性(RFLPs),分别被限制性内切酶Alu I、Acc和Stul所识别,其中在含Alu标记的个体中,Alu I(-/-)具有更好的肥育育种值(P<0.05),他认为Alu的多态性可以作为奶牛标记辅助选择的遗传标记。Lucy等(1998)[5]对牛GHR基因启动区进行了微卫星分析,发现了1个(GT)n的微卫星存在于牛GHR基因转录起始点下游90bp处,经分析得到了5个等位基因,其扩增长度分别为94bp、104bp、106bp、108bp、112bp,分别含有11个、16个、17个、18个、20个TG重复。Hale等(2000)[6]通过分析发现,(TG)11主要存在于瘤牛中,而(TG)16-20主要存在于普通牛群中,其纯合基因型对安格斯牛的断奶重和胴体重有明显影响,并得出S等位基因与安格斯牛群的低生长率有关,但是Curi等(2005)[7]却发现S等位基因与L等位基因的杂合型具有较高的日增重和体重(P<0.05)。Lucy等(1998)[8]在牛GHR的第1外显子下游发现了LINE-1,它属于反转录转座子家族的成员,长1 206bp,后来发现它只存在于普通黄牛中,瘤牛中没有发现该序列的插入。然而,在波兰地方品种的波兰红牛和黑白花牛中却没有发现到LINE-1元件的插入现象,可能LINE-1在普通黄牛中的插入具有多态性。Ge等(2000)[9]在GHR基因第10外显子内发现了4个单核苷酸多态性(SNPs),分别位于76bp(T-C)、200bp(G-A)、229bp(T-C)和257bp(A-G)处,其中200bp和257bp处的SNP引起氨基酸Ala/Thr和Ser/Gly的替代,另外2个发生无义突变。
Blott等(2003)[10]报道在黑白花奶牛(Holstein-Friesian)牛群中GHR基因部分编码区和内含子内发现了7个SNPs,其中,第8外显子出现T/A替代,导致了受体跨膜区F297Y氨基酸的替换,从而影响了牛的产奶性状,产奶量显著增加,乳蛋白率和乳脂率显著降低,并且屠体重有所下降。Maj等(2005)[11]采用RFLP对牛GHR基因5′端进行了多态性分析,用Fnu4HI/Tsel和Sau96I酶切后发现了2个单核苷酸多态,一个位于Q1启动子下游的LINE-1反转录转座子内(-1 104bp),另一个位于P1启动子内(-262bp),两处都发生了C/T替代,经研究发现,Sau96I基因型与LINE-1的插入或缺失有绝对的关系。Distasio等(2005)[12]研究了GHR基因的第10外显子257bp处的单核苷酸多态与14个产肉性状和4个肉质性状的关系,发现GHR基因型对肉品质有不利影响。Maj等(2006)[13]也研究了5′-UTR的4个SNPs与波兰黑白花牛产肉性能的相关性,进行了单个和合并基因型的分析,结果发现,单个基因型对生产性状没有影响,不过RFLP-Alul(-/-)基因型具有较高的屠体重和瘦肉率,RFLP-Nsil(+/+)基因型具有较好的屠体参数,采用合并基因型分析发现其多态性对饲料利用率、屠体重影响很大,且差异显著。
3 GHR基因多态性国内研究进展
高雪等(2005)[14]在对南阳牛、中国西门塔尔牛的研究中,利用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCB)和PCR-RFLP技术研究了GHR基因的第8外显子、第9外显子、5′端、第3外显子的遗传变异,没有发现PCR-SSCP多态及HaeⅢ、HindⅢ、PstⅠ、SpeⅠ、MspⅠ、RsaⅠ酶切多态。秦巧梅等(2007)[15]在对南阳牛、利木赞牛、盖洛威牛的研究中,对GHR基因的第10外显子部分序列进行单核苷酸多态性研究,结果表明在这3个品种中存在6种基因型(AA、BB、CC、AB、AC、BC),χ2检验表明该试验群体在这一位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。赵高峰等(2007)[16]利用PCR-SSCP技术研究秦川牛GHR基因第10外显子多态性,所研究的秦川牛群体GHR基因该座位存在多态性,发现了A、B、C等3个等位基因,其基因频率依次为0.595 6、0.290 5、0.114 0,并且群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。
4 结语
受体基因 篇7
1 材料与方法
1.1 试验样品
试验选用大庆市大同区北方种鹅场健康的籽鹅100只。从1日龄开始饲养, 饲养方式及免疫程序按照该种鹅场的饲养管理规程进行。在籽鹅1日龄、1月龄、2月龄、3月龄、4月龄、5月龄和8月龄时分别选取5只, 屠宰后采取卵巢组织样品, 液氮冷冻后置于-80℃冰箱保存。
1.2 主要仪器和试剂
GeneAmpPCRSystem 9700, 购自AppliedBiosystems公司;Line-GeneK荧光定量PCR, 购自杭州博日科技有限公司;M-MLV ReverseTranscriptase, 购自Invitrogen公司;RNAisoReagent、SYBRPremixEx TaqTM和pMD 18-TVector, 购自TaKaRa公司;E.coli JM 109为黑龙江八一农垦大学分子生物学实验室保存菌。
1.3 引物的设计与合成
根据GenBank发表的GAPDH、ESR 1和ESR 2基因序列, 使用Primer 5.0软件设计基因特异性引物 (见表1) , 委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4 卵巢组织总RNA的提取
用RNAisoReagent提取卵巢组织总RNA, 方法参照试剂盒说明书。用核酸蛋白质定量仪测定总RNA浓度和纯度, 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。
1.5 反转录 (RT) 反应
反应体系为20μL, 包括总RNA 5μL, 加入500μg/mL的Oligo (dT) 181μL, 各10mmol/L的dNTP混合物1μL, DEPC处理的水5μL, 65℃5min, 迅速置于冰上3min。再加入5×Buffer 4μL, 1μL的RNasin (40U/μL) , 2μL的DTT (0.1mol/L) 混匀, 37℃2min。加入1μL的M-MLV (200U/μL) 混匀, 37℃50min, 70℃15min终止反应。反应产物置于-20℃保存, 备用。
1.6 定量PCR反应
cDNA样品分别以GAPDH、ESR 1和ESR 2引物进行定量PCR。反应体系含模板cDNA 1μL, SYBRPremixExTaqTM (2×) 25μL, 上下游引物 (10μmol/L) 各1μL, 灭菌去离子水补充至50μL。反应条件经优化后进行实时定量PCR。反应条件为94℃预变性10s;94℃变性5s, 56℃退火30s, 72℃延伸20s, 45个循环, 72℃20s结束时采集荧光信号。应用博日公司荧光定量PCR仪配套的Line-GeneK软件进行分析, 以GAPDH为内参标准化反应结果, 得出目的基因相对于GAPDH持家基因的相对表达量。
1.7 统计分析
采用SAS 9.0统计软件进行Student'st检验, 结果用平均值±标准差来表示。
2 结果
2.1 反转录PCR
以卵巢组织cDNA为模板分别扩增GAPDH、ESR 1和ESR 2, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图1。
由图1可知, 扩增条带的大小与预期扩增片段大小一致, 并且3个PCR扩增产物条带单一、亮度适中, 表明试验过程无样品污染, 引物特异性强, PCR产物产率高, 可用于下一步的实时定量PCR试验。
2.2 卵巢组织中ESR 1和ESR 2的表达变化 (见图2、图3)
以持家基因GAPDH为内标, 用SYBRGreenⅠ染料法对ESR 1和ESR 2在卵巢组织中的表达进行相对定量PCR检测。结果表明, 从1日龄开始, 籽鹅卵巢组织中ESR 1的表达量逐渐增加 (P<0.05) , 2月龄开始表达量略有下降, 到3月龄的表达量下降到最低, 但是仍显著高于1日龄 (P<0.05) ;从4月龄开始, ESR 1的表达量开始上调, 但是ESR 1的表达量在1, 2, 3, 4月龄之间无显著差异 (P>0.05) ;5月龄和8月龄时ESR 1的表达量显著高于其他月龄, 到8月龄 (产蛋期) 时ESR 1的表达量达到最大 (见图2) 。
由图3可知:从1日龄到3月龄, 籽鹅卵巢组织中ESR 2的表达量逐渐增加, 与1日龄的表达量相比差异显著 (P<0.05) , 但是1月龄和2月龄之间差异不显著 (P>0.05) , 2月龄和3月龄之间差异也不显著 (P>0.05) , 3月龄ESR 2的表达量显著高于1月龄 (P<0.05) ;到4月龄ESR的表达量略有下降, 但与1, 2和3月龄相比显著不差异 (P>0.05) ;5月龄时ESR 2的表达量重新又开始上调, 与前几个月龄相比差异显著 (P<0.05) ;至8月龄ESR 2的表达量达到最大, 显著高于其他月龄 (P<0.05) 。
3 讨论与结论
受体基因 篇8
试验以蛋鸡为试验动物,采用放射性免疫和实时定量PCR技术检测产蛋过程中血液孕酮、雌二醇含量及输卵管子宫部受体mRNA表达的动态变化,初步了解激素在蛋鸡生殖活动中的变化机理,为进一步研究产蛋过程中孕酮、雌二醇及其受体基因的表达变化对蛋壳钙化形成的作用以及产蛋的分子调控机制奠定基础。
1材料与方法
1.1试验动物
选取石河子大学动物科技学院实验站饲养的产蛋率90%左右的32周龄健康海兰褐蛋鸡200只,连续30 d观察每只鸡的产蛋时间,计算产蛋间隔,根据蛋在输卵管各部位的停留时间,在蛋进入输卵管子宫部前1小时,蛋进入输卵管子宫部45分钟、5小时、 15小时,蛋排出时,产蛋后1小时共6个时间点分别翅静脉采集血样20只,屠宰,采集子宫6只。血样室温放置1 ~2 h后离心,吸取上层血清置于-20 ℃保存; 子宫迅速投入液氮冷冻,然后置于-80 ℃保存。
1. 2主要试剂及试剂盒
Trizol,购自美国Invitrogen公司; Taq酶,购自MBI公司; DNA MarkerⅠ,购自北京博迈德生物技术有限公司; 反转录试剂盒Primescript RT reagent kit with gDNA Eraser和荧光染料SYBR Premix Ex TAP, 购自大连TaKaRa公司; 孕酮、雌二醇放射免疫分析盒( 均为双抗体标记的放射免疫分析试剂盒) ,购自北京北方生物技术研究所。
1. 3试验设计与测定项目
1. 3. 1血清生殖激素的测定应用试剂盒并采用放射性免疫分析方法( RIA) 测定孕酮( P4) 、雌二醇( E2) 含量,测定程序按照试剂盒说明书进行。
1. 3. 2总RNA的提取及反转录称取50 mg输卵管子宫组织,采用TRIzol法提取子宫中总RNA,1. 2% 琼脂糖凝胶电泳检测,用分光光度计测定浓度和纯度,结果RNA浓度范围为100 ~ 2 000 ng/L,A260/ A280= 1. 8 ~ 2. 0。用含有gDNA Eraser的试剂盒对总RNA进行反转录,整个过程都在冰上操作。cDNA产物保存于-20 ℃,备用。
1. 3. 3PCR引物设计与PCR扩增从GenBank数据库下载鸡的 β - actin( NM_205518) 、PGR( NM_ 205262. 1 ) 和ERα ( HQ340611 ) mRNA序列,利用Primer 5. 0设计引物( 见表1) ,引物由北京华大基因公司合成。PCR反应体系20 μL: 10 × PCR Buffer ( Mg + Plus) 3 μL,10 mmol/L dNTP Mix 1. 5 μL, 5 U / μL Taq DNA polymerase 0. 25 μL,RT反应产物1 μL,上下游引物各1 μL,去离子水12. 25 μL。
1. 3. 4PCR产物的克隆测序及序列分析扩增目的基因 β - actin、PGR和ERα,将PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。将回收纯化后的 β - actin、 PGR和ERα 连接到pMD19 - T载体上,并转化感受态E. coli DH5α 菌株,挑取单克隆菌株,摇菌后提取质粒进行菌液PCR鉴定,阳性克隆送北京华大基因公司进行测序。测序结果与GenBank上已知鸡的PGR和ERα 核苷酸序列进行同源性比较,同源性为100% ,说明是所需要的目的基因。
1. 3. 5实时荧光定量PCR应用Thermal Cycle Dice Real Time PCR扩增仪进行表达分析,每个样品做3个重复,反应体系( 25 μL) : 1 μL cDNA产物,上下游引物各0. 5 μL,12. 5 μL 2SYBR Premix Ex Taq, 10. 5 μL ddH2O。 反应程序: 95 ℃ 预变性4 min; 95 ℃ 15 s,退火30 s或40 s,72 ℃ 1 min,40个循环; 95 ℃ 1 min,退火30 s或40 s; 95 ℃ 30 s。
1. 4数据的处理与统计分析
1. 4. 1放射免疫试验数据处理与分析百分结合率计算: B0管作空白对照,标准管或样品管计数为B, 非特异性计数为NSB,百分结合率计算公式: B/B0= ( B - NSB) /( B0- NSB) × 100% ; 标准品及样品logit计算公式logit = In[( B/B0) ( 1 - B/B0) ],以标准浓度取log值为横坐标、对应的logit值为纵坐标做标准曲线图,根据各样品的logit值即可求出样品浓度。 1. 4. 2统计分析试验数据采用SPSS17. 0 For Windows软件进行数据分析。利用2- △△Ct相对定量的方法计算样品的相对表达量[3],公式: 平均相对含量= 目的样品的相对含量∕对照样品的相对含量= 2- △△Ct,△△Ct = △Ct目的样品- △Ct对照样品,△Ct目的样品= Ct目的样品- Ct内参,△Ct对照样品= Ct对照样品- Ct内参,Ct是热循环仪检测反应体系中荧光信号的强度值,内参为鸡的 β - actin基因。
2结果
2. 1血清中的孕酮含量( 见图1)
1. 蛋进入输卵管子宫部前 1 小时; 2. 蛋进入输卵管子宫部 45 分钟; 3. 蛋进入输卵管子宫部 5 小时; 4. 蛋进入输卵管子宫部 15小时; 5. 蛋排出时; 6. 产蛋后 1 小时。大写字母不同表示差异极显著( P <0. 01) ; 小写字母不同表示差异显著( P <0. 05) ，相同表示差异不显著( P >0. 05) 。
蛋进入输卵管子宫前1小时孕酮含量最高,与其他时间点相比差异极显著( P <0. 01) ; 随着蛋进入输卵管子宫部钙化开始,孕酮含量开始逐渐下降,直到蛋壳基本形成,孕酮含量降到最低,等下一个卵子将排出时,即产蛋后1小时,孕酮含量开始上升,产蛋后1小时孕酮含量与蛋进入输卵管子宫部45分钟、5小时、15小时、蛋排出时相比差异显著( P <0. 05) 。
2. 2血清中的雌二醇含量( 见图2)
1.蛋进入输卵管子宫部前1小时;2.蛋进入输卵管子宫部45分钟;3.蛋进入输卵管子宫部5小时;4.蛋进入输卵管子宫部15小时;5.蛋排出时;6.产蛋后1小时。大写字母不同表示差异极显著(P<0.01);小写字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。
蛋壳形成过程中雌二醇含量呈升高- 下降- 升高的趋势。蛋排出时雌二醇含量最低,蛋进入输卵管子宫部15小时最高,二者相比差异极显著( P < 0. 01) 。
2. 3 PGR mRNA相对表达量( 见图3)
PGR mRNA相对表达量呈下降- 上升- 下降的趋势,蛋进入输卵管子宫部15小时PGR表达量最高,与蛋进入输卵管子宫部45分钟、蛋排出时和蛋排出后1小时相比差异极显著( P <0. 01) 。
2. 4 ERαmRNA相对表达量( 见图4)
ERα mRNA表达量呈先上升后下降的趋势,在蛋进入输卵管子宫部45分钟时ERα mRNA表达量最高,与蛋排出时、产蛋后1小时相比差异极显著( P <0. 01) ,与其他时间点相比差异显著( P < 0. 05) 。
1. 蛋进入输卵管子宫部前 1 小时; 2. 蛋进入输卵管子宫部 45 分钟; 3. 蛋进入输卵管子宫部 5 小时; 4. 蛋进入输卵管子宫部 15小时; 5. 蛋排出时; 6. 产蛋后 1 小时。大写字母不同表示差异极显著( P <0. 01) ; 小写字母不同表示差异显著( P <0. 05) ，相同表示差异不显著( P >0. 05) 。
1.蛋进入输卵管子宫部前1小时;2.蛋进入输卵管子宫部45分钟;3.蛋进入输卵管子宫部5小时;4.蛋进入输卵管子宫部15小时;5.蛋排出时;6.产蛋后1小时。大写字母不同表示差异极显著(P<0.01);小写字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。
3讨论与小结
3. 1蛋壳形成过程中孕酮、雌激素含量变化
在生理状况下,孕酮主要与雌激素共同作用于雌性动物,通过协同和颉颃作用调节生殖活动。本试验结果表明: 蛋进入子宫前1小时孕酮含量最高,随着蛋进入输卵管子宫部( 即蛋壳钙化的开始) ,孕酮含量开始逐渐下降; 直到蛋产出体外,孕酮含量降到最低; 下一个卵子排出之前( 即产蛋后1小时) ,孕酮含量开始上升。蛋壳的形成主要在输卵管子宫部,蛋进入子宫后,需要大量的钙形成蛋壳,而此时孕酮含量的下降与子宫中钙增加的变化趋势不一致,表明孕酮不能促进子宫内钙的转运。
有关雌激素的报道表明,雌二醇的变化以产蛋期最高,就巢时急剧下降,醒抱后逐渐恢复,表明高浓度的雌激素对排卵和蛋的形成具有促进作用。本试验结果表明,蛋壳形成过程中雌二醇含量出现2个峰值,蛋进入输卵管子宫部15小时和产蛋后1小时雌二醇含量较高。B. E. Senior等[4]研究表明,雌二醇在排卵前6小时左右出现高峰,与本试验结果基本一致。
3.2蛋壳形成过程中PGR mRNA、ERαmRNA表达变化
PGR作为转录因子能与DNA特定序列结合,增强或抑制基因表达,从而调节生殖生理过程[5 -6]。本试验结果表明: 蛋壳形成的不同时间点输卵管子宫部PGR mRNA表达量先呈上升趋势,在蛋进入子宫部15小时达到最高值,随后PGR mRNA表达量又逐渐下降,与血液中孕酮含量的变化趋势基本相反。在反刍动物研究中也发现,随着孕酮分泌的增加,会导致PGR mRNA表达降低,与本试验结果有相似之处[7]。