胰岛素受体基因（精选6篇）
胰岛素受体基因 篇1
基因突变在疾病的发生、发展过程中起着重要作用,肝脏移植是终末期肝病患者有效的治疗方法,术后3～5年的生存率达70%～80%,并得到广泛应用。肝脏移植后的主要并发症有糖尿病、高血脂症、高血压以及肥胖症等。肝脏移植术后1年糖尿病的发病率约13%,胰岛素受体基因突变是其中重要的发病因素[1,2,3]之一。
胰岛素受体基因位于染色体19q13.2～13.3,全长超过170 kb,含22个外显子和21个内含子。1～11号外显子编码α亚基,12～22号外显子编码β亚基[4,5,6,7]。目前发现的胰岛素受体基因突变约有60余个不同位点,其影响大致有以下6个方面:(1)影响胰岛素受体的合成;(2)影响受体转运至细胞膜的过程;(3)降低受体与胰岛素的亲和力;(4)影响受体与胰岛素的解离;(5)影响来自受体自身磷酸化及酪氨酸磷酸酶的活性;(6)影响胰岛素受体与下游底物蛋白的结合[8,9]。
本研究采用PCR-SSCP技术对30例肝移植后并发2型糖尿病患者和30例肝移植后未并发2型糖尿病的对照者INSR基因第17号外显子进行了研究,以探讨肝移植并发2型糖尿病与INSR基因突变的关系。
1 材料与方法
1.1 仪器
Icycler PCR IQTM扩增仪;TGC-16M高速台式冷冻离心机;XK96-A快速混匀器;HH.W21.420型电热恒温水箱;高压电泳仪;BIOB超净工作台;相关型号加样枪。
1.2 试剂
引物由上海生工生物工程公司合成,扩增片段长度为317 bp,引物1(Upstream primer):5'-CCAAG GATGCTGTGTAGATAAG-3';引物2(Downstream primer):5'-TCAGGAAAGCCAGCCCATGTC-3';4种dNTPs、T aqDNA聚合酶;8%聚丙烯酰胺分离胶、裂解液(4℃保存),氯仿,异丙醇(-20℃预冷);75%乙醇(用Dnase Free水配制,-20℃预冷),0.5%冰乙酸;Sigmacote(Sigma CAT.#SL-2),TBE电极缓冲液(10×TBE缓冲液稀释至1×TBE)。
1.3 方法
1.3.1 标本收集
按照1999年WTO糖尿病诊断及分型的标准收集湘雅三医院和湖北同济医院30例肝脏移植后并发现2型糖尿病患者的全血标本(EDTA-K2抗凝)300μL,同时收集30例肝移植后未并发现2型糖尿病的全血标本(EDTA-K2抗凝)300μL做对照。
1.3.2 DNA抽提步骤
(1)取0.5 m L离心管灭菌,(2)每管加入150μL裂解液后,分别加入待测样本50μL,用吸头反复混匀,再加入50μL氯仿,混匀器上震荡混匀5 s或颠倒混匀15次(不宜过于强烈,以免产生乳化层)。沸水浴5 min,(3)离心13 000r/min,15 min,(4)弃上清后,各加入100μL异丙醇,混匀静置15 min,(5)离心13 000 r/min,15 min(注意固定离心管方向),轻轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,粘干液体;加入300μL 75%乙醇,颠倒洗涤,(6)离心13 000 r/min,15 min(注意固定离心管方向),轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,粘干液体;(7)离心13 000 r/min,5 s,加入15 depc水,-20℃保存。
1.3.3 PCR扩增
反应体系40μL,含模板DNA2μL、25 mmol/L KCl、5 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、0.75 mmol/L Mg Cl2、dNTP、上下游引物。PCR循环设置:95℃预变性2 min后,94℃变性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,循环29次。
1.3.4 琼脂糖凝胶电泳
对PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,确定扩增后所获的DNA片段为317 bp。
1.3.5 PCR-SSCP电泳
(1)电泳槽玻璃板的处理。(2)制胶。按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积,使用8%的凝胶。使用液的温度控制为18～20℃。(3)扩增产物电泳。取10μLPCR产物,加入10μL变性剂(95%甲酰胺,10 mmol/LEDTA,0.02%溴酚蓝)、30μL石蜡油,煮沸5 min,取出立刻放入冰浴中2 min以上,然后将水相全部上样,10～15℃下电泳。起始电压300 V电泳5 min,然后将电压控制在120 V电泳8 h,温度控制在4℃。(4)银染色。将PAG板用去离子水洗2次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min,再次用去离子水洗2次后浸入0.2%AgNO3溶液中10 min。用去离子水洗3～5次,然后浸入1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液中显色固定7 min后用0.75%NaCO3终止显色。(5)置于阅片灯上观察结果并照相。
2 结果
以实验组和对照组各30例标本的g DNA为模板进行PCR扩增,INSR基因第17号外显子均扩增出预期大小(约317 bp)的PCR产物,提示INSR基因组结构在肝移植后并发2型糖尿病患者的全血基因中不存在同源性缺失(见图1)。采用SSCP方法均未检测到INSR基因第17号外显子点突变,见图2。
1～5:对照组;6～10:实验组;11:阴性对照
1～10:对照组;11～20:实验组
3 讨论
肝移植是治疗终末期肝脏疾病的最终方法,移植后由于多种因素也可引起糖尿病,与肾脏等器官移植后引起的糖尿病,统称为移植后糖尿病,发病机制目前不很清楚。对于肝脏移植后糖尿病发病的机制有待进一步探讨。
胰岛素受体是一种膜结合蛋白,在胰岛素信号的跨膜传导中起重要作用,其功能区包括胰岛素结合区自动磷酸化位点及酪氨酸激酶区[10]。人胰岛素受体基因位于19p 13.23.3,由22个外显子和21个内含子组成。其中第17～21外显子编码胰岛素受体酪氨酸激酶的活性,进而影响胰岛素的作用或抑制胰岛素的调节,造成胰岛素抵抗[11]。O’RAHILLY[12]对2型糖尿病患者酪氨酸激酶区第17～21外显子进行研究,发现1例第18外显子Lys 1068 Glu突变,1例第17外显子Val 985 Met突变。此外,COCOZZA等[13,14,15]在研究中也认为第17外显子Val 985 Met突变,与高血糖症有关,是2型糖尿病的危险因素。KAN等[16]对日本2型糖尿病患者INS2R所有22个外显子进行了筛查并测序,认为日本人2型糖尿病患者中该基因的突变频率至少为6%,BRUNING等[17]通过对小鼠骨骼肌中胰岛素受体基因的敲除实验,发现肌肉组织专一性胰岛素受体浓度及早期的胰岛素信号传递下降了95%以上,而体质量、血浆甘油三酯、游离脂肪酸浓度均上升。本研究利用PCR-SSCP法对30例肝移植并发2型糖尿病患者和肝移植排除2型糖尿病的患者胰岛素受体基因第17外显子进行了探讨,结果在肝移植并发2型糖尿病和肝移植排除2型糖尿病的所有患者的标本中均未见异常带型,提示该基因突变可能与肝移植后并发2型糖尿病无关。本研究的结论与KAN等[16]及沈捷等[18,19]的研究结论相悖。沈捷等[18]为阐述胰岛素受体基因缺陷与胰岛素抵抗发生机制间的关系,运用PCR-SSCP技术对该基因17外显子筛查并对其中带型异常者进行了DNA直接测序确认。结果发现了3个错义突变和5个沉默多态性(silent polymorphism),即杂合子突变Val 983→Met,纯合突变Gln1004→Lys、纯合突变Gly1022→Lys、Pro980(CCA→CCC)、Leu1002(CTG→CTT)、Gln1004(CAA→CAG)、Gly1008(GGC→GGT)、Glu1034(GAG→GAA)。
本文研究显示肝移植患者并发2型糖尿病与INSR基因突变无关,未发现INSR基因突变,可能的原因为:(1)本文样本数量可能少,收集的标本无胰岛素受体基因突变。(2)DNA片段长度为317 bp,据报道通常对于<200 bp的DNA片段,SSCP可发现其中70%的变异;对于300 bp左右的DNA片段则只能发现其中50%的变异;而>500 bp的片段,则仅能检出10%～30%的变异。(3)区域影响因素:本文研究对象集中在湖南、湖北地区,覆盖面欠代表性,存在个体差异,致胰岛素受体基因的检出率低。(4)收集标本的条件差异,2型糖尿病患者常见的临床变化期包括前期的高胰岛素血症,到中期的高糖、高胰岛素血症,再到后期的高糖、低胰岛素血症。本研究侧重的是肝移植,未关注2型糖尿病的变化因素,也可能是未检测到胰岛素受体基因17号外显子突变,而沈捷的实验所选择的患者均有明显的高胰岛素血症(空腹胰岛素水平5 816≥16 010 m IU/L),已知在胰岛素受体基因蛋白激酶活性区有9个绝对保守的氨基酸残基序列,这9个位点及与此相邻的一些同源性保守序列在酪氨酸激酶活性的发挥中起关键作用[20],在17外显子中有Tyr965、Tyr972和10031030 3个这样的的ATP保守序列结合区。已有研究显示,胰岛素受体基因970位突变引起该基因m RNA表达丰度的降低[21],发生于该基因985位的突变与胰岛素抵抗和高血糖发生直接相关。可能也是未能检测出阳性突变结果的原因之一。
沈捷在17外显子也检测到了Pro980、Leu1 002、Gln1004、Glu1034沉默突变[18]:即和Gly1008沉默多态性,在沉默改变的性状检得者中并未发现严重的胰岛素抵抗,可能是由于这些性状并未改变编码氨基酸的种类,从而仅会影响到该基因的表达丰度,而不会造成更为严重的后果。本研究并未在患者中检测出该外显子突变。
本次未检测到胰岛素受体基因17号外显子突变,可能部分肝移植患者并发2型糖尿病与INSR基因17号外显子点突变无关。
能促进胰岛素分泌的胰腺甜味受体 篇2
胰腺β细胞对胰岛素的正常分泌发挥着关键作用。过去有部分学者提出胰腺中存在甜味受体, 日本群马大学的研究人员从2008年起即对此展开研究。而近日, 他们的研究人员发现, 小鼠的胰腺β细胞中的确存在一种甜味受体, 能够促进胰岛素的分泌, 该研究成果将有助于开发治疗糖尿病的新方法。
该大学的研究人员在新一期《科学公共图书馆·综合》发表文章说, 他们通过基因比对发现, 小鼠β细胞中存在的一种蛋白质和构成舌头的甜味受体的蛋白质的碱基序列完全一样。研究人员用糖精等人造甜味剂刺激β细胞中的这种蛋白质后发现, 胰岛素分泌确实得到促进。本项研究成果提示, 如果能很好地刺激胰腺β细胞中的甜味受体, 就有可能研发出糖尿病的新疗法。
马铃薯转基因受体系统的建立 篇3
关键词：马铃薯,转基因,受体系统
马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 是茄科茄属蔬菜, 其地下块茎可供食用。是世界上主要的经济和粮食作物之一, 又是重要的蔬菜作物, 在我国农业生产中占有相当重要的地位。自Magro J在1938年首次从离体马铃薯植株的培养诱导了块茎的发生以后, 几十年来马铃薯的组织培养工作有了很大的进展, 分别对茎[1]、叶[2]、块茎[3]、花药[4]等进行了愈伤组织的诱导试验并获得了再生植株。但具相关文献报道, 不同品种间, 其再生体系存在显著差异[5,6]。因此, 针对不同品种开展再生体系的研究是有必要的。在前人研究的基础上对“Wen-40”和“紫花白"2个马铃薯品种叶片的离体培养与植株再生进行了研究探讨, 为利用转基因技术进行马铃薯品种改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
马铃薯品种“Wen-40”“紫花白”无菌苗均由种苗生物工程国家重点实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的获得
选取培养20 d左右生长健壮的组培苗, 将叶片剪成0.5 cm大小, 茎段剪成1 cm大小, 分别接种在下列培养基中:
S2:MS+6-BA0.3 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1
S3:MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.01 mg·L-1+GA35.0 mg·L-1
S4:MS+6-BA2.0 mg·L-1+2, 4-D 0.5 mg·L-1
以上培养基如无特别说明, 琼脂浓度均为0.7%, 蔗糖浓度均为30 g·L-1, pH 6.0, 培养条件为:温度 (25±2) ℃, 光照14 h·d-1, 光照强度2 000～3 000 lx (下同) 。21 d后统计外植体的出愈率以及愈伤组织的形态。
1.2.2 不定芽的分化和生根
将带有芽点的愈伤组织接种在下列分化培养基中:
SY2:MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
SY3:MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
SY4:MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
SY5:MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1
21 d后调查统计各种培养基上的出芽率、有效芽数以及芽生长势。待芽长至1 cm左右时, 将其从愈伤组织上剥离下来接种在MS培养基中进行生根培养。
1.2.3 抗生素敏感性试验
在前期试验的基础上, 在表现良好的愈伤诱导培养基中分别加入0、25、 50、 75、100 mg·L-1 卡那霉素 (Km) 和0、100、200、300、400、500 mg·L-1 头孢霉素 (Cef) , 研究马铃薯愈伤诱导时对抗生素的敏感性。28 d后调查统计抗生素对马铃薯愈伤诱导的影响。
2 结果与分析
2.1 愈伤诱导
由表1可知, 不同品种、不同外植体、不同培养基对马铃薯愈伤组织的诱导都有显著的影响。虽然不同品种的茎段和叶片在不同培养基上均能诱导出愈伤组织, 但出愈率、愈伤组织的形态都有差异。总的看来, 茎段的出愈情况明显好于叶片, 其诱导出的愈伤组织形态大体分为:水渍状、块状、颗粒状、絮状 (见图1) , 无论是“Wen-40”, 还是“紫花白”在S2、S4培养基中诱导出的愈伤组织都呈水渍状、块状、絮状, 不利于不定芽的分化, 只有“Wen-40”在S3培养基上诱导出的愈伤组织为颗粒状, 利于芽的分化。
2.2 芽分化
将“Wen-40”茎段在S3培养基上诱导出的颗粒状愈伤组织分别接种在分化培养基SY2、SY3、SY4、SY5中, 4周后调查统计数据显示 (见表2) :愈伤组织在各种分化培养基中都能分化出芽, 但由于分化培养基成分不同, 其分化率和平均有效芽数均存在显著差异, 其中SY3和SY5培养基中的出芽率和平均有效芽数较多, 明显高于SY2、SY4。但相对于SY3培养基上诱导出的芽, SY5培养基上诱导出的芽较粗, 生长势明显好于SY3 (见图2) 。
注:大于0.5 cm的芽为有效芽 (下同) 。
2.3 生根
待芽长至1 cm左右时, 将其从愈伤组织上剥离下来接种在MS培养基中, 1周后便有根长出 (见图3) , 3周后, 根全部长出, 植株生长正常 (见图4) 。
2.4 抗生素敏感性
将“Wen-40”茎段切成1 cm左右, 分别接种在添加不同浓度Km和Cef的S3培养基上。由表3可知, Km对马铃薯“Wen-40”茎段愈伤诱导有明显的抑制作用。当Km浓度为25 mg·L-1时, 茎段就不能诱导出愈伤组织 (见图5) , 且随着浓度的增加, 抑制作用增强。
由表4可知:在一定浓度范围内, Cef对马铃薯“Wen-40”茎段愈伤诱导影响不明显, 但当浓度达到一定高度时, 其对愈伤诱导的影响显著。研究表明:当Cef浓度≤100 mg·L-1时, 其对马铃薯“Wen-40”茎段愈伤诱导的影响不显著, 当浓度≥200 mg·L-1时, 虽然愈伤大小并没有显著影响, 但出愈率却显著低于对照, 且随着浓度的进一步增加, Cef对茎段愈伤诱导的抑制作用加强 (见图6)
3 讨论
建立高效再生体系是进行马铃薯遗传转化的前提, 而影响马铃薯植株再生频率的因素较多, 其内在因素主要是马铃薯的基因型和外植体种类, 而外在因素主要是培养基的激素种类浓度[7]。试验结果表明:两个品种的不同外植体在不同培养基中虽然都能诱导出愈伤组织, 但差异较大, 这与前人的研究结果一致。在本研究中, 无论是茎段还是叶片, “Wen-40”都能分化出芽, 建立高效再生体系, 而“紫花白”却不能, 这说明马铃薯作为受体进行遗传转化时, 选择高植株再生率的基因型可能比选择外植体类型更重要。同时, 高浓度的6-BA和高浓度的GA3对马铃薯愈伤组织诱导有促进作用, 而一定浓度的IAA有利于马铃薯芽的分化。
在利用农杆菌介导法进行基因转化时, 转化后期为抑制农杆菌的生长和筛选具有抗生素抗性标记的转化体, 常在培养基中加入一定浓度的抗生素。适合的抗生素浓度既要能有效地抑制非转化细胞生长, 又要不影响转化细胞的正常生长。因此, 建立基因转化受体系统时必须针对不同的受体材料确定适合的筛选浓度。Km是一种很强的细胞生长抑制剂, 也是植物转基因技术中用于抗性筛选的抗生素, 而Cef是一种广谱的抗菌剂, 能有效抑制农杆菌的生长。本研究结果表明:25 mg·L-1的Km能完全抑制马铃薯茎段的诱导分化, 而200 mg·L-1的Cef对马铃薯茎段的诱导分化有显著的抑制作用。因此, 在开展马铃薯转基因技术研究时, 25 mg·L-1的Km是合适的转基因植株的抗性筛选, 而在进行除菌培养时, Cef浓度低于200 mg·L-1为宜。
参考文献
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胰岛素受体基因 篇4
EGFR已成为近年来肿瘤治疗研究和抗肿瘤药物筛选的热点,有关EGFR突变与肿瘤发生以及EGFR突变在分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。EGFR突变是癌症患者是否对酪氨酸激酶抑制剂敏感的强预测因子,因此EGFR基因突变的检测能为肿瘤靶向治疗提供依据。目前常用的EGFR突变检测方法有PCR-直接测序[2]、PCR-焦磷酸测序法、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)[3]、突变体富集PCR荧光探针法、探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)荧光探针法[4]、高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)、变性高效液相色谱法(denaturing high-
1. 检测方法
1.1 测序法
目前,DNA测序法是进行EGFR突变检测的可靠方法,也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析,过程比较繁琐、耗时长,且对取材和技术要求比较高,更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高,只能对含量大于20%的突变基因进行检测。因此,此方法在临床应用中还存在一定的限制,不适于大量临床样品分析。
1.2 探针扩增阻滞突变系统(amplification refrac-tory mutation system,ARMS)荧光探针法
ARMS又名等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS-PCR)。原理为:利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性,PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,针对不同的已知突变,设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时,在引物3'端设计一错配碱基,一个与野生DNA互补,一个与突变DNA互补,使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量PCR(real-time PCR)测定进行分析。蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions ARMS)是将ARMS和Scorpions实时PCR技术相结合的一种新技术。该技术所用探针为Scorpion探针,Scorpion探针是一种新型的探针,由一条发夹结构的探针和一条引物构成,探针的5'端和3'端分别标有报告荧光和淬灭荧光,3'端通过PCR blocker(一个非扩增的单体,防止探针退火后的延伸)与引物的5'端相连。在自由状态,报告荧光和淬灭荧光很接近,不产生荧光。变性阶段茎环结构打开,退火时引物与模板结合并延伸,环performance liquid chromatograph,DHPLC)、流式荧光杂交法等。如何评价这些试剂盒,如何为临床提供科学合理的依据是我们面临的问题。区与新合成的目的基因的互补区域结合,此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上,是分子内的结合。由于发夹结构打开,报告荧光和淬灭荧光分离,因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。
1.3 变性高效液相色谱法(denaturing high-performanceliquid chromatograph,DHPLC)
DHPLC能以3种方式操作:(1)在不变性温度条件下,可分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段,类似于RFLP分析。(2)在充分变性温度条件下,单链DNA或RNA分子能被区分,适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制。(3)在部分变性的温度条件下可进行基因突变检测、SNPs。
DHPLC技术的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”,在部分加热变性的条件下,更易于解链形成Y形结构,与固定相的结合能力降低,所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来,通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。DHPLC可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段。缺失或插入突变非变性方法和部分变性方法都能较好地检测出来,但利用非变性方法的检测结果中,野生型和突变型的区别更容易判断。
1.4 高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是基于核酸的物理性质,通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种技术,它是在常规PCR基础上增加一种饱和染料,无需使用序列特异性探针。其原理是由于扩增产物的序列、长度和碱基组成等决定了熔解曲线的变化,所以可通过熔解曲线的变化反映核酸性质的差异。HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限,可应用于基因分型、短片段重复序列的分析、序列匹配、突变扫描、甲基化和RNA编辑等多方面。目前熔解曲线法已经发展到采用特异性探针结合,通过探针和靶序列结合后熔解温度的差异来进行突变检测。
2. EGFR基因突变检测试剂盒质量评价
肿瘤细胞的突变属于体细胞突变,即突变的肿瘤细胞仅占肿瘤细胞的一定比例,并不是所有肿瘤细胞均突变。因此,如何科学有效地评价现有的以及可能出现的新的试剂盒检测突变体的准确性、在野生型背景中检测突变体的灵敏度以及特异性等技术指标,保障临床检测试剂盒的质量可靠、检测结果可信是我们面临的问题。
首先应明确试剂盒适用肿瘤的组织类型、适用的样本类型(石蜡包埋组织样本、新鲜冷冻组织样本或其他样本)。部分试剂盒宣称可以用于外周血EGFR基因突变检测,PCR-TaqMan法、DHPLC法、ARMS法、酶切富集法PCR法均有对外周血检测的报道,尽管在比较配对肿瘤组织和外周血样本EGFR突变研究中具有比较好的一致性,但是在针对突变阳性样本的检测中阳性样本检出比例相差甚远,因此针对试剂盒声称可以用于外周血EGFR基因突变检测需要进一步研究。
临床应用结果表明EGFR基因靶向药物的疗效不仅与靶点基因EGFR突变类型相关,而且与EGFR突变丰度相关[5]。因此EGFR基因突变检测不能仅仅局限在检测是否突变,还要检测其突变的相对丰度,为临床提供更合理的用药指导。如何科学合理地检测EGFR基因突变,如何科学合理地确定突变比例阈值与临床用药相关性,也是EGFR基因突变检测试剂盒质量评价的部分内容。
在针对特异性评价方面需要考虑不同浓度的野生型核酸样本、不同突变类型间进行交叉反应。
2.1 EGFR基因突变体参考品的建立
目前人类EGFR突变主要是在第18、19、20和21外显子上发生的29种突变,在这些突变中,第19位外显子的缺失突变,以及第21位外显子核苷酸的2576T–G(L858R)突变在非小细胞肺癌(NSCLC)中频繁出现,这些突变被认为是经典的突变,带有这些突变的病人对治疗药物易瑞沙敏感。中国食品药品检定研究院已经构建了29种人类EGFR基因突变体参考品,基本覆盖了目前最为常见EGFR基因突变,为EGFR基因突变检测试剂盒评价和临床实验室质量评价提供了质控物质,可用于国内大多数试剂盒的性能评价要求,具有十分重要的应用价值。
2.2 行业标准的建立
在EGFR突变检测中存在几个技术难点:肿瘤组织中肿瘤细胞及非肿瘤细胞并存,EGFR突变分子与野生型分子的并存;组织块或血浆也影响EGFR突变的检测,外周血中基因组本底相对高,突变分子比例相对低,而且含量也低;样本中多少比例的突变可导致药物敏感/耐药未知。行业标准的建立是一个复杂的过程,目前检测突变阈值的设定仅仅依靠方法的检测限来确定,还没有和临床疗效进行结合,因此在对EGFR突变试剂盒进行评价时还没有上升到和临床结合的层次。需要对患者进行研究分析,阐明在多少比例的突变能导致靶向药物的敏感/耐药,从而制定科学合理的检测限,保障患者充分的权益。对组织样本和血浆样本的检测试剂盒应采用不同的要求。在技术指标的设定上需要进行选择性、检测限、特异性、准确性等指标的考核。
通过统一参考品的建立和应用、行业标准的建立,可以很好地规范产品,提升产品质量,保障临床检测质量,更好地为临床服务,为患者服务,也是我们对试剂质量检测和考核的目标。
参考文献
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胰岛素受体基因 篇5
1 一般资料
1.1 研究对象
收集2012年1月至2014年8月我院手术切除、病理诊断明确的子宫肌瘤病例1 372例, 将因子宫肌瘤切除子宫的、手术前至少3月内没有经过任何激素治疗的病例纳入研究范围, 随机选择150例作为研究组, 对应的子宫肌层组织作为对照组, 切白片3张, 做ER、PR及WT-1标记。1 372例患者按年龄分5组:<30岁组, 30~39岁组, 40~49岁组, 50~59岁组, >59岁组, 将标记结果按照-、+、++统计归类。
1.2 临床表现
月经量增多1 210例, 月经紊乱531例, 下腹痛192例, 贫血521例, 下腹包块221例, 白带增多231例, 合并其他疾病者232例。其中:合并宫颈癌27例, 合并子宫内膜癌11例, 合并腺肌症122例, 合并腺瘤样瘤18例, 合并妊娠8例, 合并卵巢肿瘤45例, 合并侵袭性葡萄胎1例。
1.3 试剂及方法
本项目随机选择多发、单发内膜下、肌层及浆膜下子宫肌瘤病例150例, 同时取对应的子宫肌层组织作为对照, 所有标本均采用4%甲醛固定, 石蜡包埋、HE染色。采用免疫组化法 (SP) , 切片厚4μm, 切白片3张, 高温修复或酶消化, 4℃冰箱过夜, 以PBS缓冲液代替第一抗体作为阴性对照, 已知的阳性组织作为阳性对照。免疫组化试剂ER、PR、WT-1及SP试剂盒购自迈新公司, 操作按试剂盒说明书要求进行。
1.4 结果判读
ER、PR及WT-1阳性表达定位在细胞核, 以看到棕黄色颗粒分布为阳性。 (1) 选染色均匀有表达的区域, 以阳性细胞占视野的比例进行分级:0:<5%;1:6%~25%;2:26%~50%;3:>50%。 (2) 按着色强弱分:0:阴性;1:弱, 淡黄色;2:中等, 黄色;3:强, 棕褐色。 (1) (2) 相加判读结果:0~2为 (-) , 3~4为 (+) , 5~6为 (++) 。
1.5 统计学分析
所有数据均采用SPSS 18.0软件进行处理, 以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 子宫肌瘤在不同年龄段的分布情况
1 372例子宫肌瘤患者中, 40~49岁918例, 占66.91%, 其中单纯子宫肌瘤831例, 占90.52% (见表1) 。
2.2 ER、PR及WT-1在子宫肌瘤组织和子宫肌层组织中的表达情况
ER、PR在子宫肌瘤组织和子宫肌层组织中的表达, 有显著性差异 (P<0.05) ;而WT-1在子宫肌瘤组织和子宫肌层组织中均高表达, 但二者之间的差异无显著性 (P>0.05) , 见表2、表3。
3 讨论
(1) 子宫肌瘤是女性生殖器最常见的良性肿瘤, 多见于30~50岁妇女, 其中40~50岁发病率高达51.2%~60.0%[1]。本组资料显示:本地区子宫肌瘤患者亦多见于30~50岁女性, 以40~49岁组发病率最高, 占66.91%, 单纯因子宫肌瘤切除子宫的占所有切除子宫患者数的71.43%。子宫肌瘤的临床表现因肌瘤所在部位、多少、大小而不同, 如位于浆膜层、肌层、内膜下, 多发或单发, 临床症状主要是月经量增多、月经紊乱、下腹坠痛、贫血、下腹包块等。子宫肌瘤在本地区发病率较高, 也是导致子宫肌瘤病种医疗费用不断增高的原因之一, 并且严重影响女性身心健康和生活质量, 所以, 全社会都应该重视该病的预防、治疗。开展子宫肌瘤的非手术治疗, 对于降低医疗费用, 提高女性生活质量, 具有重要意义。
(2) 雌、孕激素与子宫肌瘤的关系:雌、孕激素与子宫肌瘤的发生、发展关系密切, 一直被认为是子宫肌瘤发生和发展的促进剂, 当外源性给予雌激素或妊娠时, 子宫肌瘤迅速增大, 绝经后肌瘤停止生长甚至萎缩、消失, 表明子宫肌瘤具有激素依赖性。相关资料显示:雌、孕激素水平在肌瘤组织中的表达高于正常肌层组织, 说明二者在肌瘤的发生、发展中起促进作用。本组资料亦显示ER、PR在肌瘤组织中高表达, 明显高于周围肌层组织, 这与文献报道[2]一致。临床上对于子宫肌瘤患者采用米非司酮治疗[3], 已取得显著效果, 对于围绝经期子宫肌瘤患者, 采取期待疗法, 同样取得了一定效果。
(3) WT-1与子宫肌瘤的关系:有资料显示, 胰岛素样生长因子2 (IGF-2) 、胰岛素样生长因子1受体 (IGF-1受体) [4]、表皮生长因子 (EGF) 、转化生长因子β (TGF-β) 、Bcl-2和C-myc基因等, 在子宫平滑肌瘤的发生中通过抑制细胞凋亡或促使子宫平滑肌瘤分泌、旁分泌的方式, 促进子宫平滑肌瘤细胞增殖和生长。WT-1基因[5]于1990年在肾的Wilm肿瘤中作为抑癌基因被分离克隆, 其染色体位于11P13, 能与IGF-1、TGF-β、EGF、Bcl-2、C-myc等生长调控因子及其受体结合, 调节这些生长因子的转录。我们研究发现:WT-1在子宫肌层和子宫平滑肌瘤中均有过表达, 证明子宫肌层及肌瘤中均有WT-1基因存在, 而肌瘤中WT-1的表达与肌层中有一定差异, 提示WT-1参与了肌瘤的发生。资料显示, WT-1能与上述调控因子及其受体结合, 激活或抑制生长因子转录, 因此我们推测:子宫局部雌、孕激素水平增高, 导致部分生长因子及其受体含量增加, WT-1基因可能以不同的异构体形式与以上调控因子结合, 激活了其转录作用, 导致子宫平滑肌瘤的发生、发展。目前国内对ER、PR及WT-1在子宫平滑肌瘤中的表达情况, 尚无相关报道。
WT-1可以与多种生长因子结合, 但其在女性胃壁和肠壁平滑肌组织中均呈阴性, 在正常子宫肌壁内高表达, 提示WT-1过度表达可能与雌、孕激素水平有关。因此, 使用激素拮抗剂, 不仅可以有效控制肌瘤生长, 而且可以通过降低或抑制WT-1表达, 达到抑制上述生长因子, 阻止肌瘤生长, 甚至使其萎缩、消失, 或通过选择干预位点, 进行靶点治疗, 达到治疗子宫平滑肌瘤的目的, 为子宫平滑肌瘤的药物治疗提供理论依据。
总之, 我们认为:子宫平滑肌瘤是多因素、多种生长因子共同作用的结果, 降低性激素水平, 阻断WT-1基因位点, 均能达到阻止肌瘤生长或使其萎缩甚至消失的目的。
摘要：目的 检测子宫肌瘤组织中雌激素受体 (ER) 、孕激素受体 (PR) 和Wilms瘤基因 (WT-1) 的表达情况, 探讨子宫肌瘤的发病机制与原因。方法 应用免疫组化法 (SP) 测定150例子宫平滑肌瘤和相应子宫肌层组织ER、PR、WT-1的表达情况。结果 ER和PR在子宫肌瘤及子宫肌层组织中的表达有显著性差异 (P<0.05) , 而WT-1在子宫肌瘤与子宫肌层组织中均高表达, 二者之间的差异无显著性 (P>0.05) 。结论 ER、PR均是反映子宫肌瘤生物学行为的指标, 子宫肌瘤中WT-1的表达与肌层中的表达有一定差异, 提示WT-1参与了肌瘤的发生, 且WT-1在女性胃壁和肠壁平滑肌组织中均呈阴性, 在正常子宫肌壁内高表达, 提示WT-1过度表达可能与雌、孕激素水平较高有关。因此, 选择使用激素拮抗剂, 不仅可以有效控制肌瘤生长, 而且可以通过降低或抑制WT-1表达, 阻止肌瘤生长, 甚至使其萎缩、消失, 达到治疗子宫平滑肌瘤的目的, 为药物治疗提供理论依据。
关键词：子宫肌瘤,雌激素受体,孕激素受体,Wilms瘤基因
参考文献
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胰岛素受体基因 篇6
1 GHR结构与特性
生长激素(GH)能促进动物肌肉和骨骼的生长,并能调节体内的物质代谢,是调节动物生长发育和三大物质代谢过程的一个重要内分泌因子。GH主要通过抑制肌肉及脂肪组织利用葡萄糖,同时促进肝脏中的糖异生作用并对糖元进行分解,从而使血糖升高;生长激素可促进脂肪分解,使血浆中游离脂肪酸含量升高。饥饿时胰岛素分泌减少,生长激素分泌增多,于是血中葡萄糖利用减少而脂肪利用增多,因此血浆中葡萄糖及游离脂肪酸含量上升。但是,由于GH为生物大分子,不能直接透过细胞膜,必须经过与靶细胞表面的GHR结合,由GHR介导通过不同的途径将信号传到细胞内,从而产生一系列的生理效应。因此,组织中GHR含量多少、功能正常与否都影响GH生理效应,影响到动物的生长发育和相关性状。
GHR普遍分布于生物体各种组织中,尤其大量存在于肝脏和脂肪细胞中,有报道淋巴细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、软骨细胞、β-胰岛素细胞和造骨细胞中也存在GHR。GHR是由单一基因编码的,大约含有620个氨基酸的单链跨膜糖蛋白,其胞外区、跨膜区及胞内区分别由约246个、24个、350个氨基酸残基所组成,不同物种的氨基酸确切数目稍有不同。
多数动物的GHR分子量在100~130k Da之间。b GHR基因被定位于20号染色体,由10个外显子和9个内含子组成。GHR基因的一个重要特性是在许多物种中具有3个以上可供选择的第1外显子,所以存在几个不同的5′-UTR,它们选择性地参与转录是导致GHR分子多态性的重要原因之一。在胞外区,GHR有5个保守的糖基化位点,是与配体结合的部位。在胞外区特定的位置上有7个半胱氨酸残基,其中有6个形成二硫键,起着维持GHR胞外区段特定空间结构的作用;在胞外区近细胞膜的位置上有一WSX WS(X为任意氨基酸)样序列(WSXWS-like motif),即由Try-Gly-Glu-Phe-Ser 5个氨基酸组成的保守序列,它可能在GH与GHR的结合过程中起关键作用。在胞内区,发现了2段保守序列,其中靠近细胞膜的序列框1(Box1)编码8个氨基酸残基,以脯氨酸残基为主,是GHR与酪氨酸激酶JAK2结合的1个位点;序列框2(Box2)则编码15个氨基酸残基,距Box1 30个氨基酸残基。如果这2段保守序列编码的某一个氨基酸残基发生突变,GH将失去促进生长的作用,这表明Box1、Box2在GHR介导的信号转导过程中起着关键的作用。
2 GHR基因多态性国外研究进展
Falaki等(1996)[2]报道,在编码牛GHR基因细胞内部C端的DNA序列中发现了9个RFLP-Taq1基因型,并且该位点的多态性与意大利荷斯坦牛的乳蛋白百分含量相关。Moisio等(1998)[3]从牛GHR基因c DNA3′侧翼区选择了1条303bp的片段(30bp的编码区和273bp的非编码区)进行PCR扩增,发现GHR基因的侧翼区有311bp、320bp、325bp等3种长度的变异和1个碱基替代多态性。Aggrey等(1999)[4]在牛GHR基因的P1启动区内发现了3个限制性片段长度多态性(RFLPs),分别被限制性内切酶Alu I、Acc和Stul所识别,其中在含Alu标记的个体中,Alu I(-/-)具有更好的肥育育种值(P<0.05),他认为Alu的多态性可以作为奶牛标记辅助选择的遗传标记。Lucy等(1998)[5]对牛GHR基因启动区进行了微卫星分析,发现了1个(GT)n的微卫星存在于牛GHR基因转录起始点下游90bp处,经分析得到了5个等位基因,其扩增长度分别为94bp、104bp、106bp、108bp、112bp,分别含有11个、16个、17个、18个、20个TG重复。Hale等(2000)[6]通过分析发现,(TG)11主要存在于瘤牛中,而(TG)16-20主要存在于普通牛群中,其纯合基因型对安格斯牛的断奶重和胴体重有明显影响,并得出S等位基因与安格斯牛群的低生长率有关,但是Curi等(2005)[7]却发现S等位基因与L等位基因的杂合型具有较高的日增重和体重(P<0.05)。Lucy等(1998)[8]在牛GHR的第1外显子下游发现了LINE-1,它属于反转录转座子家族的成员,长1 206bp,后来发现它只存在于普通黄牛中,瘤牛中没有发现该序列的插入。然而,在波兰地方品种的波兰红牛和黑白花牛中却没有发现到LINE-1元件的插入现象,可能LINE-1在普通黄牛中的插入具有多态性。Ge等(2000)[9]在GHR基因第10外显子内发现了4个单核苷酸多态性(SNPs),分别位于76bp(T-C)、200bp(G-A)、229bp(T-C)和257bp(A-G)处,其中200bp和257bp处的SNP引起氨基酸Ala/Thr和Ser/Gly的替代,另外2个发生无义突变。
Blott等(2003)[10]报道在黑白花奶牛(Holstein-Friesian)牛群中GHR基因部分编码区和内含子内发现了7个SNPs,其中,第8外显子出现T/A替代,导致了受体跨膜区F297Y氨基酸的替换,从而影响了牛的产奶性状,产奶量显著增加,乳蛋白率和乳脂率显著降低,并且屠体重有所下降。Maj等(2005)[11]采用RFLP对牛GHR基因5′端进行了多态性分析,用Fnu4HI/Tsel和Sau96I酶切后发现了2个单核苷酸多态,一个位于Q1启动子下游的LINE-1反转录转座子内(-1 104bp),另一个位于P1启动子内(-262bp),两处都发生了C/T替代,经研究发现,Sau96I基因型与LINE-1的插入或缺失有绝对的关系。Distasio等(2005)[12]研究了GHR基因的第10外显子257bp处的单核苷酸多态与14个产肉性状和4个肉质性状的关系,发现GHR基因型对肉品质有不利影响。Maj等(2006)[13]也研究了5′-UTR的4个SNPs与波兰黑白花牛产肉性能的相关性,进行了单个和合并基因型的分析,结果发现,单个基因型对生产性状没有影响,不过RFLP-Alul(-/-)基因型具有较高的屠体重和瘦肉率,RFLP-Nsil(+/+)基因型具有较好的屠体参数,采用合并基因型分析发现其多态性对饲料利用率、屠体重影响很大,且差异显著。
3 GHR基因多态性国内研究进展
高雪等(2005)[14]在对南阳牛、中国西门塔尔牛的研究中,利用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCB)和PCR-RFLP技术研究了GHR基因的第8外显子、第9外显子、5′端、第3外显子的遗传变异,没有发现PCR-SSCP多态及HaeⅢ、HindⅢ、PstⅠ、SpeⅠ、MspⅠ、RsaⅠ酶切多态。秦巧梅等(2007)[15]在对南阳牛、利木赞牛、盖洛威牛的研究中,对GHR基因的第10外显子部分序列进行单核苷酸多态性研究,结果表明在这3个品种中存在6种基因型(AA、BB、CC、AB、AC、BC),χ2检验表明该试验群体在这一位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。赵高峰等(2007)[16]利用PCR-SSCP技术研究秦川牛GHR基因第10外显子多态性,所研究的秦川牛群体GHR基因该座位存在多态性,发现了A、B、C等3个等位基因,其基因频率依次为0.595 6、0.290 5、0.114 0,并且群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。
4 结语