胰岛素降解酶（共6篇）
胰岛素降解酶 篇1
2 型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)作为一种系统性疾病,可引起一系列并发症,如糖尿病脑病、肾病、眼病等[1],其中T2DM对中枢神经系统的影响备受关注,特别是糖尿病认知障碍成为当前国内外研究的热点。研究发现,糖尿病患者认知功能异常或阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的发病率较对照人群高2~3 倍[2],但其确切机制尚未完全阐明。胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme,IDE)是一种含锌离子的水解蛋白酶,目前,研究证实IDE活性不仅与T2DM、AD有关[3,4],而且与认知功能有一定的联系[5]。因此本研究旨在探讨T2DM患者血清IDE活性与认知功能障碍的相关性。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2015 年5 月-2015 年7 月在唐山市工人医院内分泌二科住院的2 型糖尿病患者80 例为病例组,同期体检健康者80 例为对照组,入选标准:(1)符合1999 年世界卫生组织2 型糖尿病诊断标准;(2)所有入选患者知情同意,并自愿参加。排除标准:(1)先天性智能障碍,多次脑卒中,以及其他感染中毒肿瘤代谢等导致脑病可能;(2)经询问病史查体和查阅体检化验记录,有与免疫有关的疾病,曾经应用精神抑制药物或免疫抑制治疗;(3)检查前1 个月有明确感染史及手术创伤史;(4)甲状腺功能减退及肝肾功能障碍患者,酒精依赖患者;(5)文盲不能配合检查者。
1.2 研究方法
1.2.1一般临床资料收集
记录所有研究对象人口学资料,包括性别、年龄、受教育年限、体重指数(body mass index,BMI)、病程。收集其临床检验结果,包括超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,Hb A1c)、空腹胰岛素(fasting serum lisulin,FIN)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、稳态胰岛素评价指数(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=空腹胰岛素×空腹血糖÷22.5。
1.2.2血清IDE活性水平测定
患者于上午6∶00~7∶00抽取空腹静脉血5 ml,室温放置30 min后3 000 r/s离心15 min,收集上清液放入-80℃冰箱中待用。应用IDE活性试剂盒(Inno Zyme Insulysin/IDE Immunoca Pture Act)检测血清IDE活性水平,该试剂盒由德国默克公司提供。
1.2.3分组
将所有研究对象分为病例组和对照组,比较两组的一般临床资料及认知功能评分;此外,将病例组按照IDE活性中位数水平分为高IDE活性水平组和低IDE活性水平组,对两组的认知功能评分进行比较。
1.2.4认知功能测定
由经过神经心理学专人制作可重复的成套神经心理状态测量(Repeatable Battery for the Assessment of Neuropsychological Status,RBANS)量表评分测定认知功能。RBANS量表评分分别从词汇学习、故事复述、图形临摹、线条定位、图画命名、语义流畅性检验、数字广度、编码测验、词汇回忆、词汇再识、故事回忆、图形回忆这12项检查内容对人的5个认知领域(即时记忆、视觉广度、言语功能、注意力、延迟记忆)进行评估。将以上5个认知领域测验得分相加,经查表后获得一个校正年龄影响的总分。已经翻译成中文的RBANS量表在汉族人群中试用结果显示出良好的信度和效度,是评价认知功能的敏感工具。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析,正态数据用均数±标准差(±s)表示,非正态数据用中位数(四分位数间距)[M(Q25,Q75)]表示,组间比较用t检验或秩和检验,相关性分析用多元逐步回归检测方法,P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者一般资料和生化指标比较
与对照组比较,病例组患者病程长,BMI、FPG、Hb A1c、TC、TG、LDL-C、hs-CRP、Hcy、HOMA-IR水平较高,IDE活性水平降低(P <0.05),而年龄、性别、受教育年限、血压和HDL-C差异无统计学意义(P >0.05)。见表1。
2.2 两组患者RBANS量表评分比较
与对照组比较,病例组RBANS量表即刻记忆、言语功能、注意力、延迟记忆、总分降低(P <0.05)。见表2。
2.3 2 型糖尿病患者高、 低IDE活性水平组RBANS量表评分比较
在2 型糖尿病患者中,与高IDE活性水平组比较,低IDE活性水平组即时记忆、视觉广度、言语功能、注意力、延迟记忆评分以及总分降低(P <0.01)。见表3。
2.4 2 型糖尿病患者IDE活性与一般资料的相关性
在2 型糖尿病患者中,校正年龄、性别、病程、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、BMI、hs-CRP、Hcy、FPG、Hb A1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响,IDE活性与IR呈负相关(P <0.01)。见表4。
2.5 2 型糖尿病患者RBANS量表评分与一般资料的相关性
在2 型糖尿病患者中,校正年龄、性别、教育、病程、SBP、DBP、BMI、hs-CRP、Hcy、FPG、Hb A1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响,IDE活性与即刻记忆、视觉广度、言语功能、注意力、延迟功能、总分呈正相关(P <0.01);此外,hs-CRP、TG与即时记忆呈负相关(P <0.05);年龄与注意力呈负相关(P <0.05);教育与延迟记忆呈正相关(P <0.05)。见表5。
(n=80,±s)
(n=80,±s)
3 讨论
2 型糖尿病患者的发病率不断升高,预计该趋势将继续上升[6]。全国流行病学调查显示,我国糖尿病患病率已达9.7%,糖尿病前期患病率已高达15.5%[7]。越来越多的临床研究发现,糖尿病患者会出现认知功能障碍[8],使其注意力、执行功能、精神运动速度等方面下降[9]。有研究报道,随着糖尿病病程的进展,轻度认知功能障碍会发展为痴呆[10]。本研究结果显示,T2DM患者RBANS量表即时记忆、言语功能、注意力、延迟记忆评分及总分降低,表明认知功能下降,与当前研究结果一致。
胰岛素降解酶是一种金属蛋白酶,在肝、脑、肌肉等组织中产生,位于细胞浆及过氧化物酶体中,在淋巴细胞、小胶质细胞的培养液以及某些细胞表面也能检测到[11]。IDE的主要功能是高度特异性地降解胰岛素,生成短肽和氨基酸,此外,其在脑中还可以减少 β 淀粉样蛋白产生。
研究表明,T2DM患者IDE活性水平下降[12],本研究表明,T2DM患者血清IDE活性显著降低,并且IDE活性水平与IR呈负相关,目前Ho等[13]研究发现,高脂饮食导致的胰岛素抵抗与胰岛素降解酶的减少(活性水平降低)有关,但确切机制尚未阐明,可能与T2DM患者IDE基因突变有关,研究证实高胰岛素血症、高血糖、胰岛素抵抗等2 型糖尿病表型可因IDE基因突变造成,机制为IDE功能改变,胰岛素的生物学作用及降解产生异常[14]。
胰岛素降解酶广泛存在,用Northern blot方法检测大鼠组织中r IDE m RNA水平发现,大脑、舌、及睾丸中IDE m RNA含量最高。有研究表明,阿尔茨海默病患者脑脊液或血清IDE活性水平下降[15],并且IDE对AD模型具有神经保护作用[16],其机制为IDE拥有裂解 β 淀粉样蛋白和影响大脑中 β 淀粉样蛋白水平的功能,从而降低Aβ 的毒性作用[17]。血清IDE水平降低与认知功能下降相关,在外源性补充IDE后,认知功能得到改善[16]。上述研究可以得出,IDE对认知具有保护作用。本研究结果显示,血清IDE活性降低与T2DM患者认知功能下降相关。此外还发现年龄、CRP、TG与认知功能损伤相关,与目前患者的衰老[18]、炎症反应[19]、血脂异常[20]参与T2DM认知功能损伤的结论一致。
总之,T2DM患者伴有认知功能下降、血清IDE活性降低,并且其IDE活性降低与认知功能下降相关。因此,对于存在T2DM认知功能障碍的患者,通过外源性补充适量的IDE,有可能改善该类患者的认知功能,为临床治疗T2DM认知功能障碍提供一条新思路。
胰岛素降解酶 篇2
本试验从吉林市左家林地土壤中分离出一株纤维素降解菌, 由菌丝、菌落形态以及16S r DNA初步鉴定为散囊菌纲 ( Uncultured Eurotiomycetes) 。其具有较强纤维素酶产酶活性, 对于纤维素的降解转化具有积极意义, 菌种具有进一步研究价值。
1材料与方法
1.1试验材料与试剂
1.1.1试验材料
土壤样品, 采自吉林省吉林市左家地区林地;化学试剂均为分析纯, 购于北京化学试剂厂;羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 购自生工生物工程 (上海) 有限公司。Biospin凝胶回收试剂盒, 购自Bio Flux公司;
1.1.2 培养基
富集培养基:Mg SO·7H2O 4 0.1g, Fe SO4·7H2O 0.1g, K2HPO41.0g, Mn SO45×10-4g, CMC-Na 10.0g, 蛋白胨10.0g, 酵母膏10.0g, 水1000ml, 自然p H, 121℃灭菌30min。
刚果红筛选培养基:KNO32.0g, Mg SO40.5g, KH-2PO41.0g, Na Cl 1.0g, Na2HPO41.0g, 蒸馏水500ml, 加热溶解后加入CMC-Na 20.0g、琼脂20.0g、刚果红0.2g充分溶解后, 蒸馏水定容至1000ml, HCl调p H直至达到7.0 ~ 7.2, 121℃灭菌30min, 摇匀后倒平板。
纤维素钠筛选培养基:CMC-Na 5.0g, 蛋白胨10.0g, 酵母提取物5.0g, 琼脂12.0g, , 水1000ml, 121℃灭菌30min, 摇匀后到平板。
产酶培养基:Na2HPO43.0g, NH4NO30.8g, Ca Cl20.5g, Zn SO40.01g, Fe SO4·7H2O 0.01g, Mg SO4·7H2O 0.5g, Mn SO4·H2O 0.01g, CMC-Na 10.0g, 蛋白胨1.0g, 酵母膏1.0g, 水1000ml, HCl调p H值7.0 ~ 7.2, 121℃灭菌30min, 摇匀后到平板。
PDA培养基:马铃薯200g, 去皮切成小块, 用蒸馏水1000ml小火沸煮30min, 8 层纱布过滤, 滤液补水至1000ml, 调p H6.5。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集与菌种分离
于左家地区林地, 取腐殖质表层土壤5g土样于三角瓶中, 加入50ml无菌水, 震荡5min, 至分散均匀。取5ml悬液于50ml富集培养基, 28℃, 80r/min震荡培养5 ~ 7d。取富集培养液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释, 涂布于刚果红筛选培养基, 静置30min后, 28℃倒置培养, 分离有明显透明水解圈的菌落。若菌落重叠可划线分离菌株。
1.2.2 菌株纤维素降解能力测定
将分离获得的菌株, 液体培养后, 按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释后涂布于刚果红筛选培养基, 静置30min后, 28℃倒置培养, 待菌落直径1.0 ~ 5.0mm, 取下培养基, 于1% 刚果红溶液浸泡1h, 弃去刚果红溶液, 于1mol/L Na Cl溶液浸泡0.5h, 弃去Na Cl溶液, 观察并测量水解圈大小。
1.2.3 纤维素酶活力测定
采用DNS法 (3, 5- 二硝基水杨酸法) 测定纤维素酶活力[2]。酶活力定义为:1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1IU。
1.2.4 菌株表型特征鉴定
取无菌水一滴至于干净玻片, 接种环挑取少许菌丝涂布, 风干固定, 显微观察菌株形态。
1.2.5 菌株的18S r DNA鉴定
CTAB法提取菌株基因组DNA, 分析18S r DNA进行军中鉴定。PCR反应体系 (50μL) :dd H2O 34.0μL, 10×buffer 5.0μL, d NTP4.0μL, FP2μL, RP2μL, Taq酶1μL, 模板DNA 2μL。引物序列:FP 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3';RP 3' –CCGATCCCTAGTCGGCATAG-5'。PCR反应条件:94 ℃, 5min;94 ℃ 变性1min, 60℃退火1min, 72℃延伸1min, 35 个循环;72℃, 10min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 送至英潍捷基公司测序。序列于Gene Bank由BLAST进行序列同源性分析, 确定菌种属。
2结果与分析
2.1 菌株的分离和纤维素降解能力初步鉴定结果
由刚果红筛选培养基水解圈初步判断, 实验分离得到多种具有纤维素降解能力的菌株。其中3 种疑似真菌类菌株, 具有较为明显纤维素降解能力。
取这3 种菌株, 于刚果红筛选培养, 用1% 刚果红溶液浸泡后1mol/L Na Cl溶液浸泡脱色, 测量水解圈大小, 结果见表1。由表1 可知, 1 号菌水解圈直径/ 菌落直径为8.8, 远高于2 号菌和3 号菌。初步表明, 1 号菌具有较明显纤维素降解能力。
2.2 菌株的纤维素酶活力测定结果
取1 号菌、2 号菌、3 号菌, DNS法测定纤维素酶活力, 结果见图1。由图1 可知, 在3 种菌株中, 1 号菌纤维素酶活力最高, 为2.32IU/m L。将1 号菌命名为JN510。由纤维素酶活力判断, 其具有进一步研究的价值。
2.3 JN510 菌株表型特征鉴定结果
JN510 菌株于PDA培养基28℃下培养, 生长快速。3d后呈白色绒毛状气生菌丝;继续培养, 菌落转为绿褐色;继而颜色逐渐加深。菌落毛绒状。镜检结果见图2。
2.4 18S r DNA序列分析结果
JN510 菌株基因组DNA进行PCR扩增, 产物进行琼脂糖电泳, 结果见图3。由图可知, 引物对18S r DNA序列扩增效果良好, 扩增片段约500bp。
回收片段, 送英潍捷基公司测序。获得序列经Gene Bank比对, 该菌种与序列号为EU368286.1 的Uncultured Eurotiomycetes具有99% 的亲缘关系, 结合文献所列形态学特征的描述, 将其鉴定为散囊菌纲 (Uncultured Eurotiomycetes) [3,4]。
3讨论
吉林市左家地区林地腐殖质表层土壤中存在大量可以降解纤维素的纤维素酶产生菌。其可应用于生物化工过程, 如秸秆发酵生产燃料乙醇等工艺。这些菌对于富含纤维素的的转化利用以及农业秸秆回收利用具有重要意义。
纤维素酶包括 β- 葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶。3 者协同作用降解纤维素生成葡萄糖。不同菌种产生上述3 种酶的浓度与活力不同。虽然自然界中纤维素降解菌种类较多, 但是秸秆等生物质中的纤维素往往与木质素、脂质等交联存在。使得自然界中纤维素降解菌的降解能力不理想, 降低了秸秆等富含纤维素生物质的开发利用。因此可以考虑构建不同纤维素降解菌, 以及纤维素降解菌与木质素降解菌等降解菌的混合菌系。以此来转化纤维素, 提高降解效率。
本实验获得的纤维素降解菌JN510 具有较强纤维素降解能力, 具有良好的开发前景, 值得进一步研究。
参考文献
[1]顿宝庆, 吴薇, 王旭静, 等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报, 2008, 10 (1) :113-117.
[2]Ghose TK.Measurement of cellulase activities[J].Pure Appl Chem, 1987, 59 (2) :257-268.
[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社, 1979:129-135.
胰岛素降解酶 篇3
本实验采用正交试验优化交联透明质酸钠(Cross-linked sodium hyaluronate,CHA)支架材料的制备工艺参数,建立体外抗酶降解性的测定方法,以抗酶系数作为支架材料的评价指标,考察影响交联反应的重要因素,获得最佳制备工艺参数,以期获得体外抗酶降解性较好的CHA支架材料,为该材料作为软骨细胞支架在组织工程领域中的应用奠定基础。
1 实验
1.1 试剂与仪器
发酵法生产的透明质酸钠(Sodium hyaluronate,SH,山东福瑞达生物化工有限公司);BDDE(美国Sigma-Aldrich);咔唑(中国医药集团上海化学试剂公司);玻璃酸酶(Hyalu-ronidase type I-S from bovine testes,EC 3.2.1.35,简称HAase,美国Sigma-Aldrich);其他试剂均为分析纯化学试剂。
8453型紫外-可见分光光度计(美国Agilent公司),12-14048型恒温箱(德国BINDER公司),H1650-W台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司),康乐牌恒温水浴锅(上海医器械化厂),320 型pH计(瑞士Mettler Toledo公司),JJ-1增力电动搅拌器(江办金坛医疗仪器厂),AE200型电子分析天秤(瑞士Mettler Toledo公司),HZS-D型水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司),CLZ-02型冻干机(上海浦东冷冻干燥设备有限公司),SZ-93A自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。
1.2 CHA支架材料的制备
按1∶1的比例分别取平均分子量为1850kDa和350kDa的SH,加入适量0.2%的NaOH溶液,搅拌溶解,然后加入适量BDDE,搅拌均匀,倾倒于底面光滑无渗透性的模具中,按模具底面积的大小,倾倒量为0.2mL/cm2。将模具置于冷冻干燥机中进行第一次冷冻干燥,获得厚度1.5~2mm的白色膜片,质地均匀、致密。将干燥样品置于适宜温度保温反应4h,膜片呈类白色或浅黄色,置于70 ℃注射用水中溶胀呈无色透明凝胶块,将溶胀后的凝胶置于冷冻干燥机中再次进行干燥,得到厚度2~5mm的白色膜片,质地均匀、柔软。干燥样品置于干燥器中室温放置24h,备用。
1.3 体外抗酶降解性的测定方法
将支架样品裁剪为0.2cm×0.2cm的小片,称取5mg,每个样品2份,试验组加入120U/mL的HAase溶液2mL,对照组加入相同体积的PBS,补加磷酸盐缓冲溶液(PBS)至5mL,置37 ℃恒温水浴2h,100 ℃加热30min,离心处理后,取上清液1 mL作10 倍稀释,按糖醛酸的含量测定方法[7]显色,在530nm处测定对照样品的吸收度A0和测试样品的吸收度An,以 ΔAn=An-A0表示酶降解量。
抗酶系数的计算:以正交试验样品1的酶降解量 ΔA1为100%、抗酶系数为1,其他样品的抗酶系数为 ΔAn/ΔA1。
1.4 正交试验设计
在预试验的基础上,设计以透明质酸钠浓度(A)、交联剂投入量(B)、反应温度(C)、溶胀时间(D)为影响因素,利用L9(34)正交表安排进行四因素三水平正交试验(表1),试验步骤按1.2操作,每次试验重复2次,所得交联产物按1.3操作测定抗酶系数(ΔAn/ΔA1),作为正交试验的评价指标。
2 结果与讨论
2.1 体外抗酶降解性的测定
评价CHA支架在体外的抗酶降解性有多种方法,如考马斯亮兰法、平皿分析法和咔唑法[8，9]等,由于受到支架制备工艺和产物形状的限制,本实验制备的支架材料适宜采用咔唑法。
2.1.1 玻璃酸酶的干扰
120U/mL的HAase溶液按糖醛酸的含量测定方法显色,在200~900nm波长范围扫描,紫外图谱见图1。由图1可见,在400~600nm波长范围内无吸收峰,表明HAase对本测定方法无干扰。
图1玻璃酸酶的干扰紫外吸收Fig.1 UV absorbance spectrum of HAase
2.1.2 不同底物量对酶降解反应的影响
考察了底物量1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg时酶解产物的吸收度,见图2。结果显示,在酶浓度相同的条件下,底物量在1~3mg之间,酶解产物随底物量的增加而增加,当底物量超过3mg时,酶解产物趋于稳定,底物量4mg、5mg和6 mg的酶解产物基本相同,因此,本测定法选择5mg作为底物量。
图2不同底物量对玻璃酸酶水解反应的影响Fig.2EffectofreactionsubstrateondegradationbyHAase
2.1.3 不同降解时间对酶降解反应的影响
图3反映了在降解时间0.5~5h范围内,酶解产物吸收度的变化。从图3可以看出,随着降解时间的延长,降解反应的速度逐渐减慢,在0.5~3h范围内,降解曲线呈直线,降解速度稳定,因此,本测定法选择2h作为降解时间。
2.1.4 HAase浓度与CHA支架降解产物的线性关系
考察浓度为0U/mL、12U/mL、24U/mL、36U/mL、48U/mL、60U/mL、72U/mL的HAase溶液,CHA支架酶解产物吸收度的变化。以吸收度A作为纵坐标、酶的浓度(U/mL)为横坐标绘制曲线(图4),并作直线回归。结果显示,酶解产物随着酶浓度的增加而增加,直线回归方程Y =0.0076 X+0.063,相关系数r=0.9996。 吸收度(A)与HAase(U/mL)的关系见表2和图4。
图3不同降解时间对玻璃酸酶水解反应的影响Fig.3EffectofreactiontimeondegradationbyHAase
图4不同浓度玻璃酸酶降解 CHA支架的降解曲线Fig.4AbsorbancecurveofdegradationproductbydifferentconcentrationofHAase
2.1.5 测定方法的精密度、重现性及稳定性
对6份CHA支架样品小片进行体外抗酶降解性的测定,酶降解量为0.46×(1±0.55%),说明本测定方法精密度良好。
重复玻璃酸酶浓度与CHA支架降解产物的线性试验6次,考察测定方法的重现性,计算直线斜率,结果为0.0076×(1±0.33%),说明本测定方法重现性良好。
考察经HAase水解后的稀释液置4℃冰箱20h,以及经糖醛酸的含量测定方法显色后的显色液于室温避光放置5h后的吸收度,结果为0.43×(1±1.23%)。结果表明酶解样品的稀释液在4 ℃放置20h内、显色样品在5h内稳定。
2.2 正交试验
在DPS8.05数据处理平台进行直观分析和方差分析,结果见表3和表4。
极差R反映了试验中不同因素对指标的影响。直观分析表明,本实验中因素对结果影响的大小程度依次为A、B、D、C,即透明质酸钠的浓度影响最大,交联剂投入量次之,反应温度的影响最小。采用反应条件A2B2C2D1能得到抗酶降解性较强的支架。
方差分析表中,因C因素影响最小,将因素C即反应温度并入误差。结果显示,因素A(透明质酸钠浓度)和B(交联剂投入量)的影响差异显著,具有统计学意义。
3 结论
本研究通过试验建立了CHA支架材料的体外抗酶降解性的测定方法,结果表明HAase对本测定方法无干扰,且CHA支架材料体外抗酶降解性较强的测定条件是:底物量5mg、降解时间2h。经方法学验证,表明本方法准确性高、精密度高、重现性好。
胰岛素降解酶 篇4
关键词：桦剥管菌,纤维素酶,半纤维素酶,诱导物,温度,pH值,酶学性质
纤维素是地球中存储量最大的可再生资源,通过物理、化学或生物转化的方式可以生成能源替代物质。在地球资源日益枯竭而人类能源消耗迅速增加的今天,开发生产石化能源的替代品已成为全世界关注的焦点[1]。传统纤维素的转化主要通过物理或化学手段,转化效率较低,对环境污染较大。真菌微生物是木质纤维素主要的降解生物[2],利用真菌微生物分泌的胞外酶降解木质纤维素,可低污染、低能耗、高效率地转化利用自然界中的生物质能源。
桦剥管菌(Piptoporus betulinus,P.betulinus)是一种木材褐腐真菌,可以分泌纤维素和半纤维素酶,高效分解纤维素。木材腐朽菌将木纤维分解为简单的碳水化合物,供木腐菌有机体腐生,是森林生态系统中微生物的重要组成部分,在森林生态系统中具有重要作用[2]。揭示木腐菌的木材降解机制,有利于木材保护和森林病害防治。研究和开发利用木质纤维素降解相关酶,在生物质能源利用和环境保护、食品生产和饲料加工、纺织印染和医药生产等诸多领域拥有广阔应用前景[3]。
桦剥管菌属于非褶菌目多孔菌科剥管菌属,专性寄生桦木属树干木质部,褐色腐朽,为药用真菌,嫩时可食用,子实体可分离多孔菌酸、蹄菌酸等多种药用物质,有抑制分枝杆菌、抵抗化脓小球菌生长、抑制小白鼠肉瘤、抵抗小白鼠及猴子的脊髓灰质炎等作用。目前,国内外对桦剥管菌菌种发酵条件以及抗肿瘤物质的研究较多,但系统性研究桦剥管菌生物学特性以及酶学性质较少[4,5]。
本研究采用常规生物学检测,分析不同培养条件下桦剥管菌产两种纤维素酶和两种半纤维素酶的变化,系统地探讨了桦剥管菌中两种半纤维素降解相关酶部分酶学性质,以期为开发新型高效木质纤维素酶系的工程菌提供技术支持,为木材生物防腐剂的开发及经济真菌的培养提供理论依据,为桦剥管菌的药用价值研究提供理论基础。
1 材料
1.1 菌株
桦剥管菌,于2013年东北林业大学凉水自然保护区采集白桦枯立木真菌子实体,用组织分离法得到纯菌丝[6],接种到木屑麦麸培养基中,并于-4℃保存。
1.2 主要试剂
羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、D-葡萄糖、榉木聚糖、D-木糖、甘露聚糖、D-甘露糖、3,5-二硝基水杨酸(DNS),均购自Sigma-Aldrich公司。
2 方法
2.1 菌丝生长速度的测定
取少许木屑、麦麸培养基中的纯菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)的中心位置,待菌丝覆盖整个培养基后取直径约为1.50 cm的菌饼接种于另一个PDA培养基中心(培养皿直径为9 cm),封口后标明接种日期分别放入23℃、28℃气候培养箱中培养,每个温度处理设3个重复,每24 h测量培养基中菌落直径变化,直到菌丝长满整个平皿[7]。
2.2 菌种培养及纤维素酶和半纤维素酶粗酶液的制备
木屑培养基中桦剥管菌菌丝接种到PDA培养基平板上,培养7~10 d;待白色絮状菌丝铺满培养皿,钻取2个相同大小的菌饼,置于2 g产酶固体培养基,于人工气候培养箱中23℃培养数天;向培养基中加入5倍纯化水浸泡12 h;用纱布过滤,去除固体培养物,4 000 r/min离心10 min,得上清液即为粗酶液,用于纤维素、半纤维素酶活性测定[8],每个处理样品做3个重复。
2.3 木质纤维素降解相关酶活性的检测
以1%羧甲基纤维素钠溶液为底物,在40℃、p H值为5.4的条件下反应30 min,还原产物为D-葡萄糖;以2%微晶纤维素溶液为底物,在40℃、p H值为4.8的条件下反应2 h,还原产物为D-葡萄糖;以0.67%榉木聚糖溶液为底物,40℃、p H值为5.0的条件下反应30 min,还原产物为D-木糖;以0.67%榉木聚糖溶液为底物,40℃、p H值为5.0的条件下反应60 min,还原产物为D-甘露糖;均以DNS为显色剂,沸水浴反应10 min,在540 nm处测酶解反应前后吸光度变化。分别用绘制的D-葡萄糖标准曲线、D-木糖标准曲线、D-甘露糖标准曲线计算反应液中还原糖含量及纤维素内切酶的活力和纤维素外切酶的活力[9]、木聚糖酶的活力及甘露聚糖酶的活力[10]。
2.4 不同培养基对桦剥管菌产酶变化的影响
以云杉木屑、白桦木屑、麦麸3种物质为唯一碳源制备固体培养基,以不加诱导物的PDA培养基为对照,用2.2方法培养桦剥管菌,检测粗酶液中的两种纤维素酶活性,每个处理样品设3个重复。以云杉木屑、白桦木屑、玉米秸秆、麦麸4种物质为唯一碳源制备固体培养基,用2.2方法培养桦剥管菌,每3 d取一次菌样,检测粗酶液中的两种半纤维素酶活性,每个处理样品设3个重复。
2.5 两种半纤维素酶部分酶学性质
以白桦木屑为碳源配制产酶固体培养基,在人工气候箱中23℃培养桦剥管菌,取第18天菌样制备粗酶液,检测不同条件下酶活值,探究两种半纤维素酶部分酶学性质;每个处理样品设3个重复[11]。在p H值为3.0~9.0的不同缓冲液条件下,初步测定粗酶液中两种半纤维素酶酶活,寻找酶反应最适p H值。在4℃条件下,将粗酶液分别于p H值为3.0~9.0的不同缓冲液中放置1 h和24 h,测定两种半纤维素酶酶活,计算酶相对活性以探究p H值对酶活稳定性的影响(其中,以初测值的最适p H时的酶活值为100%,相对于最高酶活值,不同p H处理1 h和24 h后的酶活以百分数表示,为相对酶活性)。最适p H值的条件下,分别测定30~80℃不同反应温度时粗酶液中两种半纤维素酶酶活,寻找酶反应最适温度。将粗酶液在30~80℃不同温度下分别保温1 h和24 h,在最适p H值的条件下测定两种半纤维素酶酶活,探究温度对酶稳定性的影响(其中,以初测值的最适温度时的酶活值为100%,不同温度处理1 h和24 h后的酶活性,以百分数形式表示相对酶活性)。在50℃和最适p H值条件下,分别在反应体系中加入下列金属离子:Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+和金属离子抑制剂EDTA,平衡时浓度为5 mmol/L和10 mmol/L,参照样不加金属离子,测定粗酶液两种半纤维素酶酶活。在50℃和最适p H值的条件下,测定粗酶液中两种半纤维素酶在不同底物浓度时的酶活,采用Lineweaver-Burk作图法作米氏方程,确定米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax),初步研究两种半纤维素酶反应动力学性质。
3 结果与分析
3.1 桦剥管菌生物学特性
见图1。
由图1可见,桦剥管菌于28℃培养,前2 d处于调整期,生长速度缓慢,第3天进入快速生长期,第5天生长速度减慢,第6天菌丝长满整个培养基,经计算平均菌落直径变化为1.3 cm/d。在23℃条件下,前3 d菌落直径变化较小,在第4天进入快速生长期,第7天生长速度减慢,于第8天菌落直径达到9.0 cm,经计算平均菌落直径变化为0.94 cm/d,可见桦剥管菌在28℃培养环境生长速度快于23℃培养环境。
3.2 不同培养基中纤维素和半纤维素降解相关酶活性变化
3.2.1 纤维素外切酶活性检测结果
见图2。培养初期对照样酶活相对较高,培养6天时3个诱导样中的酶活变化不大,酶活仍低于对照样,培养后期麦麸持续诱导桦剥管菌产纤维素外切酶,于12天达到峰值,高于其他培养基产酶量,白桦木屑、云杉木屑诱导样酶活较低;12天白桦木屑诱导样酶活下降。从检测结果看麦麸对桦剥管菌纤维素外切酶诱导作用最强,优于无诱导对照样和云杉木屑和白桦木屑。
3.2.2 纤维素内切酶活性检测结果
见图3。培养初期4个处理中酶活均逐渐降低,除麦麸诱导样,12天酶活均略有所上升。由于缺乏诱导物的存在,对照组产酶量最低,培养时间内酶活相对稳定,12 d内的酶活变化不大。相对于其他两个诱导样,白桦木屑诱导样产酶量较低,略高于对照组;麦麸样品与其他样品酶活差异较大,3 d酶活远高于其他处理,12 d内酶活持续下降。云杉木屑诱导样酶活相对较高,12天酶活迅速增高,远高于其他处理酶活。从检测结果看,云杉木屑对桦剥管菌纤维素内切酶诱导作用最强,优于麦麸和白桦木屑。
3.2.3 木聚糖酶活性检测结果
见图4。云杉木屑、白桦木屑、玉米秸秆3种培养基中,15~21 d木聚糖酶酶活性差异不明显,24 d酶活开始下降;麦麸培养基中该菌酶活逐渐增高,24 d酶活达到最高值,还有继续增高趋势,经计算,麦麸21天酶活是玉米秸培养基最高酶活(21天)的1.24倍,是白桦木屑培养基(21 d)最高酶活的1.57倍。从检测结果看,麦麸对桦剥管菌木聚糖酶诱导作用最强,草本植物秸秆诱导作用优于云杉木屑、白桦木屑两木本植物纤维。
3.2.4 甘露聚糖酶活性检测结果
见图5。培养初期,4种培养基中酶活都迅速上升,玉米秸秆中酶活上升相对较快,18天时酶活高于其他培养基;21天时各培养基中酶活均达到峰值;第24天各培养基中酶活均有所下降,玉米秸中酶活下降不明显,麦麸降幅最大。从检测结果看,各培养基可诱导桦剥管菌产较高甘露聚糖酶,但就持续诱导能力而言,玉米秸秆对桦剥管菌产甘露聚糖酶诱导作用优于麦麸,草本植物秸秆作用优于白桦木屑、云杉木屑培养基。
3.3 两种半纤维素酶部分酶学性质研究
3.3.1 反应最适p H值及p H值稳定性
以白桦木屑为碳源配制产酶固体培养基,在人工气候箱中23℃培养桦剥管菌,取第18天菌样,分别以0.67%榉木聚糖、0.67%甘露聚糖,检测桦剥管菌产木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶在不同p H值酶促环境中活性变化。p H值对木聚糖酶活性的影响见图6。由图6可见,最适p H值为5.0,p H值4.5~6.0之间酶活较高,经计算相对酶活大于最高酶活75%;p H值8.0酶活下降,相对酶活低于25%;p H值9.0酶活性略有升高,相对酶活高于50%。
p H值对甘露聚糖酶活性的影响见图7。由图7可见,酶在p H值4.5~7.0之间酶活力较高,相对酶活在50%以上;最适p H值为6.0,p H值8.0时酶活略有下降,相对酶活为40%;p H值9.0时酶活略有上升,相对酶活大于50%。
在4℃条件下,将粗酶液在不同p H值缓冲液中放置1 h和24 h,检测木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶残存酶活力,结果见图8、图9。由图8可见,p H值6.0时木聚糖酶酶活最为稳定,p H值稳定范围在5.0~6.5之间,在最适p H值5.0时酶活定性并不是最高,粗酶液在此p H值范围内放置1 h,相对酶活均能保持在70%以上;放置24 h相对酶活均能保持在60%以上。结果说明桦剥管菌木聚糖酶p H值稳定性较好。
由图9可见:不同p H值处理粗酶液1 h,酶在最适p H值6.0酶活的稳定性较好;p H值稳定范围在4.5~6.5之间,相对酶活均能保持在75%以上;不同p H值处理粗酶液24 h,相对酶活均低于10%。检测结果说明桦剥管菌甘露聚糖酶的p H值稳定性较差。
3.3.2 酶反应最适温度及热稳定性
以白桦木屑为碳源配制产酶固体培养基,在人工气候箱中23℃培养桦剥管菌,第18天取菌样,以0.67%榉木聚糖、0.67%甘露聚糖为底物,最适p H值条件下,检测桦剥管菌产木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶在不同温度(30~80℃)酶促环境中活性变化,木聚糖酶活变化见图10。由图10可见:酶活性随温度升高逐渐增加,50℃时达到酶活峰值;温度继续升高酶活逐渐下降,在45~65℃之间酶活相对较高,可保持在最高酶活60%以上,温度升至80℃时相对酶活降至最高酶活的20%。
温度对甘露聚糖酶活性的影响见图11。随温度升高该酶活性逐渐增加,50℃时甘露聚糖酶达到最大酶活值。温度继续升高酶活逐渐下降,在30~60℃之间,相对酶活较高,活性保持在50%以上;当温度达到70℃时残存酶活低于20%。
将粗酶液在不同温度水浴中放置1 h和24 h,最适p H值条件下,检测木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶残存酶活力。木聚糖酶活稳定性见图12。在低于50℃的水浴保温1 h后,测得相对酶活随着处理温度升高而逐渐升高;60℃时残存酶活为90%,当处理温度继续升高时残存酶活将会下降。在低于60℃的水浴处理24 h,检测相对酶活不低于60%;当处理温度高于60℃时,随处理温度升高残存酶活性才逐渐下降。结果说明桦剥管菌木聚糖酶常温状态热稳定性较好,适宜在常温条件下贮存。
甘露聚糖酶活稳定性见图13。在低于50℃水浴保温1 h后,相对酶活随着处理温度的升高而逐渐升高;处理温度高于60℃时,相对酶活随处理温度升高而降低。在低于50℃的水浴保温24 h后,相对酶活性保持在60%以上;处理温度高于70℃时,随处理温度提高残存酶活性有所下降,但残存酶活仍不低于30%。说明桦剥管菌甘露聚糖酶常温条件稳定性较好,可在常温保存运输。
3.3.3 金属离子与EDTA对两种半纤维素酶活性影响
在50℃和最适p H值条件下,分别在反应体系中加入金属离子Mg2+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+和金属离子抑制剂EDTA,反应体系中金属离子浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L,对照样不加金属离子,测定粗酶液三种半纤维素酶酶活。结果表明:Ca2+、Co2+、Cu2+对木聚糖酶活均具有促进作用,Fe2+、Fe3+和Mg2+对木聚糖酶活均具抑制作用。Fe2+、Fe3+、Co2+对甘露聚糖酶活均具有促进作用;Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+对甘露聚糖酶活均具有抑制作用;金属离子抑制剂EDTA在5 mmol/L和10 mmol/L两种浓度时,对两种半纤维酶酶活均有较强抑制作用。
3.3.4 两种半纤维素酶反应动力学研究
结果见图14、图15。采用Lineweaver-Burk作图法得米氏方程,最终得到木聚糖酶在50℃时,对榉木聚糖酶底物的Km为0.072 mmol/L,Vmax为0.071 mmol/(L·min),其木聚糖酶与榉木聚糖亲和力较大,该酶对榉木聚糖偏好性较强,但催化速率较慢。甘露聚糖酶底物的Km为3 746.7 mmol/L,Vmax为0.267mmol/(L·min),其甘露聚糖酶对底物甘露聚糖亲和力较小,对甘露聚糖底物偏好性不高,催化速率尚可。
4 讨论
桦剥管菌在23℃、28℃两种不同温度培养下,其生长速度相差较大。在28℃培养时,平均生长速度为1.3 cm/d,生长速度更快,长势更旺。在23℃培养条件下生长缓慢,平均生长速度为0.85 cm/d,可见桦剥管菌的生长受温度影响较大,喜中高温的生长环境。28℃培养,桦剥管菌接种初期长势较弱,3 d后迅速生长,最后生长速度趋于平缓,其在PDA培养的生长速度符合微生物的生长规律,与多数真菌生长速度曲线类似[12]。
纤维素外切酶更偏好麦麸诱导,麦麸对桦剥管菌纤维素外切酶诱导作用优于无诱导对照样,优于云杉木屑和白桦木屑。纤维素内切酶更偏好云杉木屑诱导,云杉木屑对桦剥管菌纤维素内切酶诱导作用优于麦麸和白桦木屑。木聚糖酶更偏好麦麸底物诱导,其对桦剥管菌木聚糖酶诱导作用最强,诱导作用优于玉米秸秆,草本植物秸秆诱导作用优于云杉木屑、白桦木屑两种木本植物纤维。4种培养基均可诱导桦剥管菌产较高甘露聚糖酶,但就持续诱导能力而言,玉米秸对桦剥管菌产甘露聚糖酶诱导作用优于麦麸,草本植物秸秆作用优于白桦、云杉木屑培养基。桦剥管菌纤维素酶和半纤维素酶具有底物偏好性及响应方式的差异,其具体原因还有待于进一步探究。
在酶促反应体系中加入浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L的8种金属离子及EDTA,以检测粗酶液中两种半纤维素酶酶活,结果表明,Ca2+、Co2+、Cu2+对木聚糖酶活均具有促进作用,Fe2+、Fe3+对木聚糖酶活均具有抑制作用;Fe2+、Fe3+、Co2+对甘露聚糖酶活均具有促进作用,Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+对甘露聚糖酶活均具有抑制作用。EDTA两不同浓度对两种半纤维酶酶活均有较强抑制作用。这一结果与尚洁等[13]的结果不太一样,可能原因是金属离子对酶活力的影响因酶的来源不同而有所差异。由于桦剥管菌半纤维素酶性质研究报道较少,未能找到试验条件设定的可参考依据,酶促反应温度、p H值环境、金属离子相对浓度等相关因素,是否对金属离子与酶分子间相互作用的影响尚不清楚,这几种金属离子对酶活影响作用有待进一步探讨。
对两种半纤维素酶进行酶学性质初步研究,以白桦木屑为碳源,23℃培养18 d桦剥管菌产木聚糖酶的反应最适p H值为5.0,p H值稳定范围为5.0~6.5,反应最适温度为50℃,耐受温度低于60℃,热稳定性较好,适宜在常温条件下贮存;50℃、p H值为5.0时,以榉木聚糖为底物,木聚糖酶Km值为0.072 mmol/L,Vmax为0.071 mmol/(L·min)。应用于工业生产的木聚糖酶必须具有耐碱性和耐高温性,郄卫那等[14]认为真菌一般只产低分子质量的耐碱性木聚糖酶,最适反应p H值为4.0~7.0,最适反应温度为40~60℃。嗜热真菌(Talaromyces thermophilus)来源的耐高温木聚糖酶,最适反应酶活为75℃,酶活p H值稳定范围较宽泛,在4.0~9.0之间,p H值在5.0,9.0时,酶活存在两个峰值[15]。本研究中木聚糖酶在p H值为7.0亦有2个峰值,p H值9.0相对酶活力高于50%,p H值稳定性较好,适于工业用耐碱性酶的生产开发。
胰岛素降解酶 篇5
随着工业技术的发展,染料废水因色度高、碱性大、难降解、水量大等特点成为较难治理的工业废水[6,7,8]。碱性紫5BN作为三苯甲烷类染料,被广泛应用于纺织、印染、油墨等工业领域。采用物化法降解碱性紫5BN运行费用高,药剂加入量大,且产生大量难处理的污泥[9,10]。酶催化反应由于反应条件温和、反应效率高、操作范围宽,受到越来越多研究者的关注。漆酶在催化过程中产生的惟一副产物是水,因此成为环境保护用酶的研究热点[11,12,13]。目前,国内外对于漆酶降解废水中有机物的研究展开了大量的工作,并将其应用于难降解工业有机废水的治理[14,15,16]。漆酶的主要生产菌株是大型丝状真菌担子菌中的白腐菌,这些菌株普遍存在产酶周期长、产酶量低等问题,使得漆酶的规模化应用受到限制[17]。
本课题组分离得到一株漆酶生产量高、生长速率快、易培养的杂色云芝菌(Coriolus Versicolor)。本工作对该菌产漆酶的培养基进行优化,并使用粗酶液对染料碱性紫5BN进行降解研究,为漆酶工业化生产及绿色应用奠定了基础。
1 实验部分
1.1 试剂、材料和仪器
实验用试剂均为分析纯。
杂色云芝菌由本实验室筛选保藏。
斜面培养基(质量浓度,g/L):麦芽汁30,蛋白胨3,琼脂20。斜面培养基pH 5.6。
种子培养基(质量浓度,g/L):麦芽汁30,蛋白胨3。种子培养基pH 5.6。
初始发酵培养基(质量浓度,g/L):葡萄糖15,酵母膏5,KH2PO4 1,MgSO4 0.25,CaCl2 0.05。初始发酵培养基pH 3.5。
HVE-50型高压灭菌锅:日本Hirayama公司;752型紫外-可见分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;GL-21M型冷冻离心机:上海市离心机械研究所。
1.2 漆酶粗酶液的制备
斜面培养:将保存的菌种接种于斜面培养基上,于25 ℃恒温培养3 d,置于4 ℃冰箱中保存备用。
种子培养:用灭菌后的竹签将斜面上的菌丝刮到含有玻璃珠的30 mL无菌水中,将其打散,然后吸取2 mL菌悬液加入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,在25 ℃、转速为160 r/min的条件下,摇床震荡培养3 d。
发酵培养:将培养好的种子以4%(体积分数)的接种量接入到发酵培养基中,在30 ℃、转速为180 r/min的条件下,摇床震荡培养一定时间。
取适量发酵液在4 ℃、转速为10 000 r/min的条件下离心10 min,得到上清液即为漆酶粗酶液。
1.3 碱性紫5BN溶液的脱色实验
将初始质量浓度为10 mg/L的碱性紫5BN溶液加入到一定酶活力的漆酶粗酶液中,在反应温度为40 ℃、pH为3的条件下进行脱色反应。
1.4 分析方法
采用2,2′-连氮-双(3-乙基并噻-6-磺酸)(ABTS)法测定酶活力(单位体积酶液中每1 min转化1 μmol ABTS的酶量, U/mL)[18,19];采用紫外-可见分光光度计在最大吸收波长589 nm处测定碱性紫5BN溶液的吸光度,并计算溶液脱色率。
2 结果与讨论
2.1 发酵培养时间对杂色云芝菌产漆酶酶活力的影响
在采用初始发酵培养基配方的条件下,发酵培养时间对漆酶酶活力的影响见图1。由图1可见:随发酵培养时间的延长,漆酶酶活力先增大后减小;杂色云芝菌在发酵培养168 h后漆酶酶活力达到最高值。说明杂色云芝菌在发酵培养168 h后逐步进入了衰亡期。因此,将杂色云芝菌漆酶的发酵培养时间确定为168 h。
2.2 碳源对杂色云芝菌产漆酶酶活力的影响
2.2.1 单一碳源对漆酶酶活力的影响
改变初始发酵培养基中碳源的配方,考察不同碳源对漆酶酶活力的影响,实验结果见图2。由图2可见:以麦芽糖作为碳源时,漆酶酶活力最低;以羧甲基纤维素钠作为碳源时漆酶酶活力最高,培养168 h后酶活力达37.5 U/mL。这可能是因为复杂碳源更有利于杂色云芝菌产漆酶。
2.2.2 复合碳源对漆酶酶活力的影响
多糖难以被直接利用,影响菌体生长,但有利于漆酶的分泌;相反单糖则有利于菌的吸收,但不利于漆酶的分泌。因此以质量浓度为15 g/L的羧甲基纤维素钠与质量浓度为2 g/L的其他碳源组成复合碳源,考察不同复合碳源对漆酶酶活力的影响,实验结果见图3。由图3可见:分别以葡萄糖和蔗糖与羧甲基纤维素钠形成复合碳源时的漆酶酶活力较高;其中以葡萄糖和羧甲基纤维素钠作为复合碳源时,培养168 h后产漆酶酶活力可达51.5 U/mL。
以葡萄糖和羧甲基纤维素钠作为复合碳源,在羧甲基纤维素钠质量浓度为15 g/L的条件下,ρ(羧甲基纤维素钠) ∶ρ(葡萄糖)对漆酶酶活力的影响见图4。由图4可见:随ρ(羧甲基纤维素钠) ∶ρ(葡萄糖)的增加,漆酶酶活力先增大后减小;当ρ(羧甲基纤维素钠) ∶ρ(葡萄糖)为12时,产漆酶酶活力最高达134.5 U/mL。这是由于葡萄糖作为单糖有利于杂色云芝菌的生长而被优先利用,导致羧甲基纤维素钠的利用过程滞后;随羧甲基纤维素钠质量浓度的增加,过多的羧甲基纤维素钠使培养基的黏性增加,影响其溶氧量,不利于菌体的生长产酶。因此确定复合碳源的最佳配方ρ(羧甲基纤维素钠) ∶ρ(葡萄糖)为12,即羧甲基纤维素钠的质量浓度为15 g/L,葡萄糖的质量浓度为1.25 g/L。
2.3 氮源对杂色云芝菌产漆酶酶活力的影响
改变初始发酵培养基中的氮源——酵母膏的质量浓度,考察酵母膏质量浓度对漆酶酶活力的影响,实验结果见图5。由图5可见,当酵母膏质量浓度为15 g/L时,漆酶酶活力最高。
2.4 诱导剂对杂色云芝菌产漆酶酶活力的影响
2.4.1 不同诱导剂对漆酶酶活力的影响
漆酶是一种诱导酶[20],在发酵培养基中添加小分子芳香化合物作为诱导剂可促进漆酶的分泌,提高漆酶产量。在诱导剂加入量为2 mmol/L的条件下,不同诱导剂对漆酶酶活力的影响见图6。由图6可见,以2,5-二甲基苯胺作为诱导剂对杂色云芝菌分泌漆酶的诱导作用最明显,发酵168 h后漆酶酶活力达到2 305.0 U/mL,是不加诱导剂时的4.4倍。
2.4.2 Cu2+和诱导剂的加入时间对漆酶酶活力的影响
在杂色云芝菌生长前72 h加入诱导剂2,5-二甲基苯胺会明显抑制菌株的生长发育,同时产漆酶的能力也会受到影响。这是因为芳香化合物对菌体的生长有明显的抑制作用,因此选择适当的加入时间十分重要。研究还表明适量加入Cu2+对真菌产漆酶有一定的促进作用。在Cu2+和诱导剂加入量均为2 mmol/L的条件下,Cu2+和诱导剂的加入时间对漆酶酶活力的影响见图7。由图7可见,在发酵72 h时加入2,5-二甲基苯胺、发酵96 h时加入Cu2+对杂色云芝菌产漆酶的诱导作用最明显,发酵168 h后酶活力达到3 319.2 U/mL。
2.5 漆酶对碱性紫5BN溶液的脱色作用
漆酶粗酶液酶活力对脱色率的影响见图8。
由图8可见,随漆酶粗酶液酶活力的增加,染料溶液的脱色率逐渐降低。这是由于过多的漆酶与小分子介质反应,不仅减少了参与脱色作用的漆酶的量,同时也使ABTS丧失了作为小分子介质促进反应的能力。当漆酶粗酶液酶活力为0.01 U/mL时,反应10 h,脱色率可达93.91%。
3 结论
a)通过对杂色云芝菌进行发酵培养生产漆酶。实验结果表明杂色云芝菌产漆酶的最佳发酵条件为:以质量浓度为15 g/L的羧甲基纤维素钠和质量浓度为1.25 g/L的葡萄糖作为复合碳源,以质量浓度为15 g/L的酵母膏作为氮源,在发酵72 h时加入浓度为2 mmol/L的2,5-二甲基苯胺,发酵96 h时加入浓度为2 mmol/L的Cu2+。发酵培养168 h后,酶活力达到3 319.2 U/mL。
b)采用所制备的漆酶粗酶液对碱性紫5BN溶液进行脱色处理,当漆酶粗酶液酶活力为0.01 U/mL时,反应10 h,脱色率可达93.91%。
摘要：通过实验对杂色云芝菌产漆酶的发酵条件进行了优化,结果表明杂色云芝菌产漆酶的最佳发酵条件为:以质量浓度为15 g/L的羧甲基纤维素钠和质量浓度为1.25 g/L的葡萄糖作为复合碳源,以质量浓度为15 g/L的酵母膏作为氮源,在发酵72 h时加入浓度为2 mmol/L的2,5-二甲基苯胺,发酵96 h时加入浓度为2 mmol/L的Cu2+。发酵培养168 h后酶活力达到3 319.2 U/mL。采用该菌株产漆酶对碱性紫5BN溶液进行脱色处理,当漆酶粗酶液酶活力为0.01 U/mL时,反应10 h,脱色率可达93.91%。
胰岛素降解酶 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
Wistar雄性大鼠,体重(220±24)g,随机分为T1DM大鼠模型组(48只)与正常对照组(48只),两者均用基础饲料喂养,模型制备方法参考文献[3]。
1.2 方法
(1)T1DM大鼠处死前抽血测定血清Ins含量,采用微粒子化学发光酶免疫分析法(仪器:美国雅培Axsym免疫发光分析仪),原厂试剂;(2)同时提取T1DM大鼠与对照组胰腺,分离胰岛β-细胞;(3)胰岛β-细胞TERT测定:采用原位杂交法(试剂由博士德生物工程有限公司提供),具体操作步骤按说明书进行,用博士德公司提供的已知TERT阴、阳性对照(阳性:细胞核呈深棕黄色;阴性:细胞核呈深蓝色)。用德国Leiz ASM68K图像分析仪在每张片上随机选取5个高倍视野(×400)测算胰岛组织中阳性β-细胞与可观察β-细胞总数的比值,取平均值作为阳性指数代表该切片表达强度;(4)Southern Blot法:端粒长度测定试剂盒(Telo TAGGG Telomere)由Roche公司提供。β-细胞DNA提取:用限制性内切酶Hinfl、Rsal酶切,琼脂糖凝胶电泳,变性,转膜,DIG Easy Hyb液预杂交。端粒酶探针DIG Easy Hyb液杂交,洗膜,化学发光显影测定端粒DNA限制性酶切片段(telomete restricted fragment,TRF)长度[4]。图像扫描及软件分析:用Q550cw彩包图像分析扫描X线片图像,用软件分析,算出β-细胞DNA的端粒长度;(5)T1DM大鼠血清Ins水平与TERT表达强度及端粒长度作相关分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS13.0软件对数据进行分析,计量资料组间差异性选用单因素方差分析,各组实验数据以表示,P<0.05为差异有显著性,并进行q检验和相关分析,求出r和P值。
2 结果
2.1 T1 DM组大鼠血清Ins含量与β-细胞TERT阳性表达率及端粒长度
T1DM组大鼠血清Ins含量显著低于对照组(P<0.01),胰岛β-细胞TERT阳性表达率显著高于对照组(P<0.01),端粒长度明显低于对照组(P<0.05),见表1。
2.2 T1DM组大鼠血清Ins水平与胰岛β-细胞TERT阳性表达率及端粒长度的相关分析
T1DM组大鼠血清Ins水平与胰岛β-细胞TERT阳性表达率两者具有高度负相关(r=-0.8942,P<0.01),与端粒长度具有高度正相关(r=0.9238,P<0.01),见表2。
3 讨论
端粒酶是由一条单键RNA与多个蛋白质组成的核糖核蛋白复合物,它包括端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和TERT[5]。T1DM是在遗传基础上,由T淋巴细胞介导的细胞毒作用胰岛β-细胞的特异性自身免疫疾病,自身免疫累及的胰岛β-细胞其端粒酶的活性表达与T1DM胰岛的病理生理改变密切相关[4]。本文显示随着T1DM大鼠病情发展而TERT活性升高,直至高度表达,与正常对照组比较差异有显著性(P<0.01)。TERT是端粒酶活性的决定因素,是研究端粒酶基因表达调控的主要对象[6]。由此推断T1DM发病及其进展与β-细胞中TERT的基因表达调控有关。
T1DM的发生与病变的加剧主要是由于胰岛β-细胞受损影响其功能与作用,导致Ins分泌不足,严重时甚至不能合成和分泌。实验表明T1DM大鼠血清Ins含量减少与胰岛β-细胞TERT活性表达增强呈高度负相关(r=-0.8942,P<0.01),提示胰岛β-细胞TERT的活性表达与胰岛β-细胞的损害程度有关,从而表明TERT是影响Ins合成与分泌程度的一个独立因素。自身免疫在T1DM发病机制中可能影响胰岛β-细胞端粒的基因表达,导致基因缺失、基因融合和序列缩短[7]。实验表明T1DM大鼠血清Ins含量减少与胰岛β-细胞的端粒长度的缩短呈高度正相关(r=0.9238,P<0.01),提示胰岛β-细胞端粒长度的变化可能与T1DM胰岛的损伤程度有关。本文研究显示,T1DM组大鼠β-细胞的端粒长度为(6.86±0.57)kb,明显短于正常对照组(9.28±0.78)kb,两者比较差异具有显著性(P<0.05)。由此进一步证实TERT为阳性而端粒的长度却比正常短的现象[8]。由于自身免疫累及胰腺组织导致胰岛淋巴细胞浸润,随着T1DM病情加重,胰岛β-细胞端粒缩短达到一定程度时,TERT在某些因素作用下就被激活,TERT的活性表达强度与T1DM病程、病期、病情转归有关,其活性表达可能进一步加重自身免疫对靶细胞的损伤,最终导致胰岛β-细胞破坏,分泌Ins功能完全丧失。
参考文献
[1]LEEJ,SUNG YH,CHEONG C,et al.TERT promotes cellular and organismal survival independently of telomerase activity[J].Oncogene,2008,27:3754-3760.
[2]ZHANG YD,LI XB,ZHANG ZJ,et al.Inhibition of HepG2cells by PEG-Chitoson nanoparticles loaded with antisenseoligodeoxynucleotide of hTERT mRNA.China Journal of Modern Medicine,2007,17(18):2192-2195.Chinese
[3]陈电容,张更荣.糖尿病大鼠中枢胰岛素、谷氨酸脱羧酶抗体变化与外周关系的研究[J].中国病理生理杂志,2007,23(5):1022-1026.[3]CHEN DR,ZHANG GR.The research on the relationship of the change of insulin and glutamate decarboxylase antibody in the nerve center and periphery in diabetic rat[J].Chinease Journal of Pathophysiology,2007,23(5):1022-1026.
[4]鲁燕,陈轶群,程绪杰,等.1型糖尿病患者外周白细胞端粒长度的变化及其意义[J].江苏医药,2007,33(2):127-128.[4]LU Y,CHEN YQ,CHENG XJ,et al.alteration and significance of telomere length of peripheral white blood cells in patients with type1diabetes mellitus[J].Jiangsu Medical Journal,2007,33(2):127-128.
[5]WU KD,MOORE MA.Detemination of telomerase activity and telomere length.Methods Mol Med,2005,113:207-223.
[6]YE FM,CHEN X.Expression of mouse telomerase catalytic sub-unit mTERT geme in testis of SD rats and its significance.Huazhong Univ sci Tech Med sci,2003,23(3):173-175.[6]陈健萌.自身免疫性疾病中的短端粒[J].国外医学:免疫分册,2001,24(2):78-80.
[7]CHEN JM.Short telomere in autoimmune disease[J].Foreign Medical Sciences:Section of Immunology,2001,24(2):78-80.