谷氨酸受体

谷氨酸受体（共6篇）

谷氨酸受体 篇1

学习和记忆是脑的高级功能, 是一个相当复杂的生理过程, 目前认为学习记忆机制是突触传递效能的长时程增强 (Long-term potentiation, LTP) , 被认为是学习与记忆的一个细胞模型[1]。LTP 的形成与突触前递质的释放、突触后相关受体通道以及各种蛋白激酶、逆行信使、即早基因等密切相关。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质, 主要在谷氨酸受体的介导下实现其在脑内的众多功能。谷氨酸受体被激活后除参与快速的兴奋性突触传递外, 还可以调节神经递质的释放、突触的可塑性、LTP和长时程抑制 (long-term depression, LTD) 以及学习和记忆等中枢神经系统正常的生理功能[2] 。本文就离子型谷氨酸受体参与学习和记忆的分子机制研究进展进行了综述。

1 离子型谷氨酸受体概念及其组成

离子型谷氨酸受体 ( ionotropic glutamate receptor, iGluR) 为配体门控离子通道型受体, 它们与离子通道耦联形成受体通道复合物, 介导快信号突触传递。根据特异选择性激动剂的不同, 离子型谷氨酸受体主要分为3 种亚型:①N-甲基-D-门冬氨酸 (N-Methy1-D-aspartic acid, NMDA) 受体;②α-氨基羟甲基恶丙酸 (α-amino-3-hydroxy-5-methy1-4-isoxazole propionic acid, AMPA) 受体;③海人藻酸 (kainic acid, KA) 受体。NMDA受体由NR1、NR2、NR3 3个亚单位, NR2 亚单位又可以进一步分为NR2A-D4 个亚型;AMPA 受体由GluR1、GluR2、GluR3、GluR4 4 个亚型构成;GluR5、GluR6、GluR7 和KA1、KA2构成了KA受体。

2 学习记忆的生理基础

2.1 LTP的发现及概念

1973年, Bliss等[3]发现家兔海马神经元在短暂高频刺激后, 兴奋性突触后电位 (excitatory postsynaptic potential, EPSP) 增大, 海马突触传递可在数秒内增强, 其增强效果能持续数小时至数周, 他们把这一现象称为突触传递的长时程增强。目前普遍接受LTP是单突触受到重复刺激或两组突触共同活化后产生的谷氨酸盐兴奋性突触后反应的增强, 这种突触后反应的增强可引起突触传递效能的持续变化。根据LTP的持续时间将其分为早时相LTP (early phase LTP, E-LTP) 和晚时相LTP (late phase LTP, L-LTP) , 前者持续1 h～3 h, 不需要合成蛋白[4];后者可持续24 h以上, 需要合成新的蛋白[5]。

2.2 LTP的特征

LTP有三个基本特征, ①协同性:诱导LTP需要很多纤维同时被激活;②联合性:有关纤维和突触后神经元需要以联合的形式一起活动;③特异性:所诱导的LTP对被激活的通路是特异的, 在其他通路上不产生LTP。

2.3 LTP产生机制

LTP是突触可塑性的一种模式, NMDA受体与递质结合后, 导致细胞内级联反应, 触发神经元内一系列生化反应, 最终改变突触后膜的性质, 建立LTP。LTP的形成一般分为诱导与表达两个阶段[6], LTP的诱导以突触后膜成分变化为主, 主要包括: (1) 突触后膜去极化; (2) NMDA受体的激活; (3) 钙离子内流。其表达则是由突触前膜和突触后膜共同参与的过程, 主要包括: (1) 突触前膜递质释放增加; (2) 突触后膜受体与递质作用效应增强; (3) 突触形态学变化使突触的整合效应增强; (4) 逆行信使向突触前释放。

3 离子型谷氨酸受体与学习记忆

3.1 NMDA受体

3.1.1 NMDA受体对于学习记忆形成的机制 NMDA受体对于学习记忆的重要作用已经得到肯定, 但是其作用的机制还都主要集中在Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ) 途径上。Miyamoto[7]报道, NMDA受体是一种电压、配体双重门控通道, 既受电压门控, 也受递质门控, 主要对Ca2+高度通透, 对Na+和K+有一定的通透性。在静息电位下, 突触前释放的兴奋型氨基酸可同时作用于NMDA受体和非NMDA受体, 此时Na+和K+可通过非NMDA受体通道, 但不能通过NMDA受体通道, 因为静息水平的膜电位不能使Mg2+移开, NMDA受体因与Mg2+结合而受到阻滞, NMDA受体通道也就不能打开。而当外界刺激信号刺激机体使得突触后膜去极化后, 堵塞通道的Mg2+就可以移开, 此时兴奋型氨酸与NMDA 受体结合使通道打开。当递质与受体结合导致通道开放后, Ca2+大量进入胞内与钙调蛋白 (CaM) 结合, Ca2+/CaM复合物结合于自动抑制序列的临近序列, 去除后者与CaMKⅡ的催化结构域的结合, CaMKⅡThr286发生自身磷酸化而活化, 活化后的CaMKⅡ变为不依赖于Ca2+ /CaM的形式, 并且移位于突触后致密结构 (postsynaptic density, PSD) 内形成复合物参与NMDA受体磷酸化的调节, cAMP依赖性蛋白激酶的激活等过程, 从而启动下游一系列生化反应包括cAMP反应元件结合蛋白 (cAMP response element-binding protein, CREB) 的转录因子磷酸化、CREB与DNA分子上的特定区域也称为cAMP反应元件 (CRB) 结合、基因的表达的启动等形成LTP产生学习记忆, 此为学习记忆形成的经典途径。同时Hawkins等[8]报道, 学习记忆形成时包括短时记忆和长时记忆的产生, 短时记忆的产生涉及3 条途径, 即突触前膜cAMP-PKA、Ca2+/CaMKⅡ途径以及瞬时性的Ca2+内流、K+外流;长时记忆的产生涉及突触前膜PKA-MAPK-CREB、PKC 以及突触后膜Ca2+ /CaMKⅡ 3条途径。但是NMDA受体对于学习记忆的调节是否还有其他途径还有待进一步的研究。

3.1.2 NMDA受体亚单位对学习记忆的作用 NR1是NMDA受体的功能亚单位, 是NMDA受体的必需组分, 在脑内各区广泛表达, 通过调节Ca2+内流而保持神经元正常的生理功能。选择性敲除小鼠海马CA1区锥体细胞的NR1亚单位后, 其NMDA受体诱导的LTP被破坏, 在小鼠表现为空间记忆障碍[9]。最近的研究发现, NMDA受体介导的信息参与皮层内突触结构和功能的调节[10]。在皮层NR1亚单位对树突棘的发育有重要影响, 通过共聚焦显微镜和电镜成像技术, 发现皮层2/3层的锥体细胞树突棘头部体积增大, 同时突触前的轴突终扣体积和PSD区域明显增大, PSD厚度是反映突触功能的活性指标, 在突触的可塑性中发挥重要的作用。皮层NR1亚单位基因敲除的小鼠, 减少了NMDA受体的反应, PSD厚度变小, 突触功能活性降低, 突触传递效率减退, 引起学习记忆能力减退。同时有报道显示, 癫痫患者学习记忆发生障碍的原因之一既是NR1 mRNA 表达减少所致, 铅暴露以后损伤学习记忆也和海马区NR1 mRNA转录和蛋白表达减少有关[11], 因此, 认为NR1亚单位与学习记忆关系非常密切, 是学习记忆形成过程中必不可少的NMDA受体亚基。

NR2亚单位主要分布在前脑和海马脑区, 是NMDA受体的调节亚单位, 对NMDA 受体通道功能起一个修饰作用, 完整的有功能的NMDA受体必须至少要有1个NR2亚单位参与组成。Rondi-Reig等[12]发现, 由不同的NR2亚单位参与组成的NMDA受体对学习记忆功能的贡献不一样, 其中NR2A和NR2B在学习记忆形成的过程中都有表达, 并且二者有着一致性的关系, 即随着神经系统的发育成熟NR2A的表达增加而NR2B的表达减少, NR2C的表达局限在丘脑并且是在学习记忆产生的后期才有表达;与此相反, NR2D是在学习记忆形成的早期表达并且是在丘脑和下丘脑有表达。NR2B转基因动物表现为海马LTP增强、海马NMDA受体通道长久开放, 用NR2B选择性拮抗剂艾芬地尔阻断杏仁核内的NR2B后, 动物表现为剂量依赖的情绪学习能力的损害。同时有报道显示, 缺血/再灌注动物模型后期记忆功能损害是由NR2B基因表达减少所致, 大鼠重复注射氯胺酮以后会使学习记忆功能受损, 与此同时可以检测到海马内NR2A、NR2B含量减少[13], 由此可以证明NMDA受体的NR2也是参与学习记忆产生过程中必不可少的一种亚单位。

NR3亚单位的功能目前尚不清楚, 但是Madry等[14]利用Western blot方法检测到, 不管是在胚胎还是成人大脑皮质中, NR3的含量都是非常丰富的, 具有和NR1一样的甘氨酸结合位点, 因此有可能替代NR1亚基的作用, 将人类NR3克隆发现其还有一个和胞内SH3序列结合的聚脯氨酸位点, 由此假设NR3结合于SH3序列再构架在特异性增强突触后膜致密物 (postsynaptic density, PSD-95) 中, 从而达到对学习记忆的调节。但是利用不同的蛋白序列将PSD-95和NR3结合在一起, 无论在体外还是体内都无法发挥作用, 因此NR3参与学习记忆的调节的具体机制还是没有得到阐述, NR3可能与NR1和NR2一起形成多聚体, 参与甘氨酸的激活。

3.1.3 NMDA受体对学习记忆的双重影响 一方面NMDA受体促进学习记忆。当递质与NMDA受体结合后, 通过其信号转导级联反应经典途径, 导致突触后神经元产生LTP生理效应, 促进学习与记忆。另一方面引起学习记忆障碍。目前认为主要机制是NMDA受体介导的兴奋毒作用, 其机制主要有两种:①由NMDA受体过度兴奋介导的神经细胞迟发性损伤, 可推迟数日发生, 主要与Ca2+超载有关, 这种迟发性损伤是谷氨酸兴奋性毒性损伤的主要途径, 与海马区细胞迟发性神经元坏死密切相关[15];②谷氨酸超常释放造成海马区内病理性LTP并造成了以后的信息传递障碍形成学习记忆障碍[16]。

3.2 AMPA受体

AMPA受体是由GluR1～GluR4 4种结构极为相似的亚基组成的同聚性或异聚性五聚体, 介导中枢神经系统中快速的突触传递。目前有关AMPA受体功能的研究大多集中在海马的联接上[17]。海马LTP的形成需要通过两条途径强化AMPA受体的作用:其一, AMPA受体GluR1亚单位第831位丝氨酸在钙离子/CaMKⅡ作用下磷酸化, 使整个受体通道电导增加从而使量子流增大;其二, CaMKⅡ易化储备的AMPA受体从胞质动员, 插入突触后细胞膜, 从而使神经末稍释放的量子化谷氨酸有更多突触后反应位点。

在成年啮齿类动物的海马CA1、CA2、CA3区的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞中, 大部分AMPA受体都是GluR1/2异二聚体通道, 一些是GluR2/3异二聚体通道, 极少数为GluR1同二聚体通道。GluR1和GluR3敲除小鼠的学习测试显示, 是GluR1而不是GluR3敲除导致了小鼠空间记忆的损害[18]。成年GluR1敲除小鼠在大部分行为模式中都是正常的[19], 提示含有GluR1的AMPA受体对于规则的快速兴奋性传递并非必需。然而, GluR1丢失可能导致以下损害:损害空间工作记忆;在CA1突触外区缺乏AMPA受体;无法诱发CA3-CA1突触的场LTP (field LTP) [20]。所有三种表型损害都可以通过转基因控制的GluR1在成年GluR1敲除小鼠海马锥体细胞中的再表达而部分恢复, 表明含有GluR1亚单位的AMPA受体对于空间工作记忆极为关键[21]。

GluR2是AMPA受体的一种控制Ca2+渗透的关键亚单位。在AMPA受体的四个亚单位中, GluR2是唯一一种经过RNA编码后在M2区域含有精氨酸残基的亚单位。GluR2亚单位的Q/R位置影响AMPA受体对二价阳离子的通透性。缺乏GluR2的AMPA受体具有极高的Ca2+渗透性, 表现出双曲线性I/V关系, 而含有GluR2的AMPA受体Ca2+不可渗透, 表现出线性I/V关系[22]。GluR2基因敲除小鼠表现为运动协调性差、探测能力低下[23], 其中枢神经系统最有可能被AMPA受体介导的Ca2+流入所诱发的长时程改变所介导。而这些长时程改变在出生后前脑主要神经元条件性GluR2缺失的基因修饰小鼠中可以被探测到[24]。在前脑特异性GluR2基因敲除小鼠, 尽管突触的兴奋性增加, 但兴奋性突触的CA3-CA1传递反而减少。这些变化没有改变CA3-CA1 LTP, 但海马环路的改变影响到空间学习和记忆[24]。

3 KA受体

近年来, 分子生物学及药理学技术的发展大大加快了对KA受体的研究进程。迄今为止, 已经克隆出五种KA 受体的亚型 ( GluR5, GluR6, GluR7, KA1, KA2) , 他们广泛的分布于中枢和外周神经系统内, 不仅存在于突触前膜调节神经递质的释放, 而且存在于突触后膜在突触传递中发挥作用。由于KA受体在海马区, 尤其在苔状纤维和CA3区锥体细胞分布密集, 功能特性较为典型, 目前围绕此区域有关KA受体的研究较多。

研究显示KA受体拮抗剂LY382884可选择性阻断海马CA3区的突触前KA受体, 进而阻碍苔藓纤维LTP的产生, 可能与KA受体易化谷氨酸释放有关[25], 在不影响AMPA和NMDA受体的情况下, 发现KA受体拮抗剂LY382884对NMDA受体依赖性LTP无效, 但可阻断苔藓纤维非NMDA受体依赖性LTP, 说明KA受体作为突触传递LTP的触发点, 对LTP的形成起促进作用。

GluR5基因敲除小鼠的海马脑片突触生理功能并无异常, 兴奋性突触后电流 (excitatory postsynaptic current, EPSC) 也无改变;GluR6基因敲除小鼠的苔藓纤维LTP显著减弱并且EPSC完全丧失, 证明GluR6亚单位是KA受体的关键亚单位, 其表达增强对学习记忆有促进作用。KA2亚单位是苔藓纤维突触前和突触后KA受体功能的重要决定因子。KA2基因突变小鼠的苔藓纤维突触前和突触后KA受体功能均发生改变。突触前KA受体对外源性激动剂的亲和力下降, 突触后由低浓度KA刺激产生的EPSC幅度未增大, 且EPSC的半衰期缩短[26], 可能与KA受体抑制谷氨酸释放有关, 其对学习记忆的分子作用机制有待进一步研究。

4 小 结

离子型谷氨酸受体通过影响LTP的诱导和维持从而发挥对学习记忆功能的调节作用, 但是离子型谷氨酸受体对于学习记忆调节的具体的机制还存在一些疑惑:①离子型谷氨酸受体除了在突触后参与学习记忆的调节外, 在突触前是否有调节作用及其作用的方式怎样尚未明确;②NMDA受体在突触后的作用除了通过Ca2+-Ca2+/CaMKⅡ、cAMP依赖性蛋白激酶-生化反应途径外是否还有其他途径, 还有待进一步研究。

谷氨酸受体 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

m Glu R5原位杂交检测试剂盒, 胃蛋白酶, 预杂交液, m Glu R5寡核苷酸探针杂交液, 封闭液, 生物素化鼠抗地高辛, SABC-POD, 生物素化过氧化物酶, DAB显色试剂盒, 原位杂交专用PBS缓冲液。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组

健康Wistar雄性大鼠75只, 体重240~300 g, 由内蒙古大学动物试验中心提供。按照随机数字表法分为:正常对照组、脑缺血后1、3、6、12、24 h及3 d、14 d组 (手术组) 及相应的假手术对照组, 每组5只。

1.2.2 动物模型制备

采用左侧大脑中动脉 (MCAO) 线栓法[3,4]。大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉, 取仰卧位固定于鼠台上, 消毒后颈部正中切口, 暴露左颈总动脉和颈内外动脉, 结扎并切断颈外动脉, 结扎翼腭动脉, 血管夹夹闭颈内、颈总动脉, 在颈总动脉近分叉处剪一约0.3 mm小口, 将头部蘸硅橡胶的尼龙鱼线经小口处插入, 沿颈内动脉入颅, 进线从分叉处算约19~21 mm, 稍感阻力时停止, 此时已至大脑中动脉, 结扎颈总动脉进线处, 剪去多余的栓线, 缝合手术切口。

1.2.3脑组织的处理

于上述规定时间点, 将大鼠深麻后快速断头取出脑组织, 固定、脱水、浸蜡、包埋脑组织, 再制成6μm厚冠状切片。

1.2.4 进行原位杂交

将石蜡切片烤箱内过夜, 经常规脱蜡至水, 用胃蛋白酶混匀, 经预杂交、杂交后洗涤, 滴加封闭液、SABC及生物素化过氧化物酶, DAB显色后用苏木素复染后充分水洗, 经酒精脱水、二甲苯透明后用树胶封片。

1.2.5 观察病理变化

在400倍显微镜视野下观察各组脑皮质缺血区相应的病理变化。

1.3 图像分析

采用江苏省捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析, 每张切片随机选取10个单位面积, 测量原位杂交的灰度值。灰度值降低表明m Glu R5 m RNA表达升高, 灰度值越小, 说明m Glu R5 m RNA表达升高越明显, 反之亦然。

1.4 统计学处理

采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示, 比较采用t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原位杂交分析结果

与正常对照组相比, 假手术对照组m Glu R5 m RNA表达无明显改变 (P>0.05) 。手术组与正常对照组和假手术对照组相比, 脑缺血后1 h缺血皮质区m Glu R5 m RNA灰度值明显降低, 即缺血皮质区m Glu R5 m RNA胞浆内表达明显升高, 比较差异均有统计学意义 (P<0.01) 。m Glu R5 m RNA胞浆内表达6 h达到高峰 (F=5.328, P<0.01) , 3 d后表达开始下降 (P<0.01) , 14 d基本降至正常对照水平 (P>0.05) 。手术组各时间点缺血皮质区m Glu R5 m RNA胞浆内表达与手术组缺血6 h比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.2 组织形态学改变

光镜下假手术组未表现神经元形态异常;手术组皮质部分神经元结构表现出坏死样改变, 包括细胞核浓缩、胞浆红染加深、细胞结构不清、呈梭形或三角形改变, 异常结构呈小灶分布, 见图1~4。

*与手术组比较, P<0.01;△与手术组缺血6 h比较, P<0.05

3 讨论

Glu R按与配体结合后的效应的不同分为两类:一类是i Glu R, 包括NMDA受体、AMPA受体和KA受体, 另一类是m Glu R[5]。m Glu R5是1992年国外研究者由m Glu R1做探针从鼠脑的c DNA文库中首次分离[6,7]。m Glu R5在脑内分布广泛, 正常情况下m Glu R5的表达在成年大鼠脑内皮质浅层及多个核团内是广泛存在的, 研究表明人类与大鼠的m Glu R5氨基酸序列有94.5%的同源性, 推测m Glu R5 m RNA高表达区也是纹状体、海马及大脑皮质[8,9]。

有研究发现手术组m Glu R5 m RNA表达多于假手术组及对照组, 脑组织病理检测也证实手术组脑细胞明显水肿和神经元坏死的病理形态学改变[10]。因此, 本文推测m Glu R5是起神经损伤作用的, 在脑缺血性损害时, Glu介质大量释放, 激活m Glu R5而引起脑细胞一系列生化反应及病理变化。原位杂交实验显示大鼠缺血后大脑皮层m Glu R5 m RNA表达在缺血后1 h即有明显增加, 到缺血后6 h达到高峰, 3 d表达开始下降, 14 d基本降至正常对照组水平。推测其实验显示变化过程主要与钙离子超载有很大关系。而正常对照组与各假手术对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 说明单纯的手术操作对m Glu R5 m RNA表达无明显影响。根据上述研究, 可选择性地将m Glu R5作为治疗脑缺血神经损伤的靶点, 为脑梗死的防治提供了新的思路, 具有一定的临床应用前景[11,12]。

摘要：目的:观察急性脑缺血大鼠脑组织中mGluR5 mRNA在不同时段的表达变化的规律, 探讨mGluR5mRNA与脑梗死的相关性。方法:75只雄性Wistar大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、手术组1、3、6、12、24 h及3 d、14 d组及其相对应的假手术对照组, 采用大鼠MCAO模型, 利用原位杂交技术, 检测各组mGluR5mRNA的表达。结果:与正常对照组相比, 假手术对照组mGluR5 mRNA表达无明显改变 (P>0.05) 。手术组mGluR5 mRNA各时间段表达均显著高于假手术对照组及正常对照组, 缺血1 h其表达即有升高, 比较差异均有统计学意义 (P<0.01) 。mGluR5 mRNA表达6 h达到高峰 (F=5.328, P<0.00) , 3 d后表达开始下降 (P<0.01) , 14 d基本降至正常对照水平 (P>0.05) 。结论:mGluR5在脑缺血后升高, 提示mGluR5在脑梗死中有着重要作用, 从而对我们的临床研究指出一条途径。

谷氨酸受体 篇3

1 Eph A2的结构和功能

Eph受体家族在肿瘤形成、胚胎发育以及细胞转化、增殖、生长过程中都发挥出了较为重要的生理功能, 能够向细胞核传递外界刺激信息, 然后使之成为细胞效应的信号。而Eph受体家族中第1个基因编码产物是Eph A2, 它是1990年Lindberg在人角化上皮细胞c DNA文库中筛选得到, 在人类上皮来源的细胞进行了较为广泛地表达。Eph A2结构包括胞内酶结构域、跨膜结构域、胞外配体结合区。其中胞内区由PDZ结构域、SAM结构域、结构域 (TK) 为结合基序组成, 而胞外区则由两个粘连蛋白III型重复区 (FNIII) 、一个独特的基序 (富含半胱氨酸) 及N端球状结构域 (GIb) 构成。通过研究, Eph A2参与肿瘤血管形成及细胞转化、增殖、生长过程[3]。

2 Eph A2与肿瘤的关系

研究表明[4], 在许多肿瘤组织中, Eph A2都会呈现出较为明显的过度表达, 特别是体现在高侵袭性的肿瘤细胞中。若Eph A2过量表达时可加速肿瘤的转移、浸润及侵袭, 导致肿瘤的形成;而若Eph A2正常表达时, 则可维持细胞骨架的稳定, 调节细胞的运动、黏附。通过进一步的研究可以发现, 在肿瘤中Eph A2出现过度表达的主要原因在于恶性肿瘤组织中的各个细胞之间没有建立起稳定的联系, 导致Eph A2磷酸化缺失、降低。

研究显示[5], Eph A2过量表达的口腔鳞癌患者大概在50%左右, 且还存在着预后不佳、淋巴结转移率高、分化差的情况。有学者研究表明[6], Eph A2的表达与淋巴结转移以及肿瘤的复发、分级、位置存在着较为密切地相关。最近研究表明, 手术后肿瘤再发生的时间也与Eph A2的表达存在着较为密切的联系, 因此, 在对肿瘤患者的预后情况以及肿瘤的恶性程度进行预测的过程中, 可以采用Eph A2表达水平为指标。

2.1 与肿瘤血管形成的关系

肿瘤血管的生成涉及到许多不同分子信号的多步骤的过程, 对于肿瘤的转移、侵袭、生长存在着较为密切的联系, 若发现肿瘤组织的直径大于l mm, 则说明会出现广泛的血管形成。酪氨酸激酶受体 (RTK) 主要包括Eph RTKs、Tie和VEGFR等生长因子受体, 是一种反映血管生成的重要的信号分子。研究表明, Eph A2会表达于肺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌等多种癌症组织中, 同时还可以对Eph A2的活化进行抑制, 进而还会对肿瘤的血管形成造成削弱。

2.2 与血管形成拟态的关系

国外学者Maniotis等[6]学者在1999年发现了血管形成拟态, 经过深入的研究发现, 血管形成拟态并不是一种继发性反应, 而是侵袭性肿瘤的生物学特性表现, 有可能会不独立于血液循环。通过三维细胞培养研究表明, 在形成VM管道和血管时, laminin 5γ2、Eph A2、VE-cadherin等管道/血管生成分子往往会起到较为重要的作用, 进一步引发瀑布效应, 形成网络状管道结构。

3 Eph A2与OSCC的关系

3.1 在OSCC中的表达和意义

口腔鳞状细胞癌也被称为鳞癌, 3%的全身恶性肿瘤患者都是口腔鳞状细胞癌患者, 这是一种较为常见于口腔颌面部的恶性肿瘤。尽管国内外医学界治疗口腔鳞状细胞癌的技术不断进步, 口腔鳞状细胞癌的总体死亡率有所降低, 但是仍然很高。因此, 早期诊断口腔鳞状细胞癌就显得尤为重要, 但是其早期诊断极为困难。有学者对10例正常组织标本和59例舌鳞状细胞癌患者标本用免疫组化方法来进行试验, 并行CD34染色, 接着再对微血管密度 (MVD) 进行测定[6], 结果表明, 与正常黏膜相比, 舌鳞状细胞癌中Eph A2的染色情况要更为明显, 存在着较为明显的差异 (P<0.05) 。Eph A2的表达和MVD与复发远处转移、淋巴结转移、临床分级、肿瘤大小存在着较为明显的正相关 (P<0.01) 。研究还发现, Eph A2受体同样会在肿瘤血管内皮细胞呈现出高表达, 而不仅只是在肿瘤细胞中呈现出高表达。而过度表达Eph A2则往往会形成肿瘤新血管, 造成肿瘤的恶性转化。

3.2 在OSCC淋巴结转移中的表达及意义

影响患者预后的首要因素通常被确定为口腔鳞癌的淋巴转移。口腔鳞癌的淋巴结转移并不单单只与单位淋巴管密度、癌巢的淋巴管生成、癌症周围组织淋巴管自身结构等有关, 还与不同组织层次、不同部位淋巴管在的分布及密度存在着较为密切的关系, Eph A2在口腔鳞癌转移淋巴结内的染色强度与原发灶存在着较为密切的联系。

摘要：Eph受体家族中第1个基因编码产物是Eph受体酪氨酸激酶A2 (Eph A2) , 它是1990年Lindberg在人角化上皮细胞c DNA文库中筛选得到, 在人类上皮来源的细胞进行了较为广泛地表达。研究发现在多种肿瘤中, Eph A2均呈高表达, 这可能与肿瘤血管形成及肿瘤的迁移、生存、生长有关。本文就Eph A2在口腔鳞癌中的研究进展进行了较为深入的探讨, 具有一定的参考价值。

关键词：Eph受体酪氨酸激酶A2,口腔鳞癌,研究进展

参考文献

[1]Kataoka H, Igarashi H, Kanamori M, et al.Correlation of EPHA2overexpression with high microvessel count in human primary colorectal cancer[J].Cancer Science, 2004.

[2]Miyazaki T, Kato H, Fukuchi M, et al.Eph A2 overexpression correlates with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J].International Journal of Cancer, 2003.

[3]Fox BP, Kandpal RP.Invasiveness of breast carcinoma cells and transcript profile:Eph receptors and ephrin ligands as molecular markers of potential diagnostic and prognostic application[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004.

[4]Liu D P, Wang Y, Koeffler H P, et al.Ephrin-A1is anegative regulator in glioma through down-regulation of Eph A2and FAK[J].International Journal of Oncology, 2007.

[5]Sulman EP, Tang XX, Allen C, et al.Eck, a human eph-related gene, maps to 1p36.1, a common region of alteration in human cancers[J].Genomics, 1997, 40:371-374.

谷氨酸受体 篇4

1 资料与方法

1.1 对象及分组

所有研究对象均为初次单胎怀孕,排除内科慢性疾病和其他妊娠合并症,为子痫前期新发病例,诊断及分类标准依据乐杰主编《妇产科学》第7版,均为2009年9月至2011年12月在温州医学院附属第二医院及温州市第三人民医院门诊及住院的子痫前期孕妇。轻度子痫前期38例,平均年龄30.0±3.9岁,平均孕期26.4±2.3周;重度子痫前期32例,平均年龄31.0±3.3岁,平均孕期26.5±2.7周;正常对照组为同期门诊的正常妊娠产妇40例,无任何并发症和合并症,妊娠经过正常,胎儿发育正常,平均年龄29.0±1.3岁,平均孕期26.0±2.8周。3组孕妇年龄、孕周差异无统计学意义(P>0.05)。轻度子痫前期和重度子痫前期的孕妇于采血前未经任何相关的治疗和用药。

1.2 标本采集

3组孕妇于空腹采肘静脉血3 ml,待凝固后低温3000 r/min离心10分钟,分离血清,置-70℃冰箱集中待测;同时采集孕妇随意中段尿液3 ml,经低温3000 r/min离心10分钟,取上清液,置-70℃冰箱集中待测。

1.3 试剂与检测方法

PLGF和sFlt-1采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定,试剂均购自美国R&D System 公司,操作严格按照说明书;PLGF试剂盒批内及批间变异系数分别为4.3%和5.2%,sFlt-1试剂盒批内及批间变异系数分别为4.5%和5.5%;酶标比色仪为安图斯酶标仪anthos 2010。

1.4 统计方法

实验结果均以表示,多个样本均数比较用F检验,两样本组间比较行t检验,血清及尿液中sFlt-1/PLGF比值对子痫前期的诊断价值用ROC曲线分析,以P<0.05为差异有统计学意义;用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。

2 结 果

2.1 3组孕妇血清PLGF和sFlt-1浓度水平比较

见表1。3组血清分别行PLGF、sFlt-1的F检验,3组间差异有统计学意义(F=18.715,F=23.439,均P<0.01)。轻度子痫前期组的血清PLGF低于正常对照组(P<0.01),而血清sFlt-1高于正常对照组(P<0.05);重度子痫前期组的血清PLGF低于轻度子痫前期组,而血清sFlt-1高于轻度子痫前期组(均P<0.01)。

①轻度子痫前期组与正常对照组相比,P<0.01;②轻度子痫前期组与正常对照组相比,P<0.05;③重度子痫前期组与轻度子痫前期组相比,P<0.01

2.2 3组孕妇尿液中PLGF和sFlt-1浓度水平比较

见表2。

①轻度子痫前期组与正常对照组相比,P<0.05;②重度子痫前期组与轻度子痫前期组相比,P<0.01

3组间尿液PLGF、sFlt-1差异均有统计学意义(F=20.542,F=24.678,均P<0.01)。轻度子痫前期组的尿液PLGF低于正常对照组,而尿液sFlt-1高于正常对照组(均P<0.05);重度子痫前期组的尿液PLGF低于轻度子痫前期组,而尿液sFlt-1高于轻度子痫前期组(均P<0.01)。

2.3 尿液PLGF、sFlt-1与血清PLGF、sFlt-1的相关性分析

将所有尿液PLGF与血清PLGF及尿液sFlt-1与血清sFlt-1进行Person相关分析,尿液的PLGF与血清PLGF具有正相关性(r=0.692,P<0.05);尿液sFlt-1与血清sFlt-1亦具有正相关性(r=0.784,P<0.05)。

2.4 3组孕妇血清及尿液中sFlt-1/PLGF比值的变化

见表3。3组间血清、尿液中sFlt-1/PLGF差异均有统计学意义(F=30.542,F=22.417,均P<0.01)。轻度子痫前期组血清、尿液sFlt-1/PLGF比值高于正常对照组,重度子痫前期组sFlt-1/PLGF比值高于轻度子痫前期组,各组之间的差异均有统计学意义(均P<0.01)。

①轻度子痫前期组与正常对照组相比, P<0.01;②重度子痫前期组与轻度子痫前期组相比, P<0.01

2.5 血清及尿液中sFlt-1/PLGF比值对子痫前期的ROC曲线分析

ROC曲线分析见图1、图2。血清sFlt-1/PLGF比值对轻度子痫前期的曲线下面积(AUC)为0.921(SD 0.031;95%CI 0.861～0.982),最佳诊断界值为7.93(灵敏度0.865,特异度0.913);尿液sFlt-1/PLGF比值对轻度子痫前期的AUC为0.935(SD 0.027;95%CI 0.882～0.987),最佳诊断界值为20.67(灵敏度 0.881,特异度 0.921)。血清sFlt-1/PLGF比值对重度子痫前期的AUC为0.959(SD 0.022;95%CI 0.913～0.995),最佳诊断界值为19.34(灵敏度0.985,特异度0.975) ;尿液sFlt-1/PLGF比值对重度子痫前期的AUC为0.972(SD 0.016;95%CI 0.928～0.998),最佳诊断界值为87.95(灵敏度 0.989,特异度 0.983)。血清中sFlt-1/PLGF比值的AUC与尿液中sFlt-1/PLGF比值的AUC相比差异均无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨 论

妊娠是极其复杂的过程,胎盘的正常发育对正常妊娠的维持至关重要,胎盘组织所分泌的与血管新生、内皮细胞和滋养细胞功能相关的生长因子在胎盘形成和发育中起重要作用。病理研究显示[3]:子痫前期孕妇胎盘存在生理性血管重铸障碍、绒毛面积减少、密度减低、绒毛血管减少等病理表现。

PLGF是一种分泌性同二聚体糖蛋白,属于血管内皮生长因子(VEGF)家族中的一个新成员,基因位于人14号染色体[4],其丰富表达于胎盘,主要合成部位是滋养细胞。与PLGF高度特异结合的受体是VEGFR-1(Flt-1),Flt-1受体以膜型和可溶型(sFlt-1)[4]两种形式存在,循环中sFlt-1是由Flt-1基因的选择性剪接形成,具有拮抗性;它最初发现是在人类脐静脉内皮细胞上,而高浓度被检测到是在绒毛和绒毛外细胞上。研究表明,PLGF有如下生物特性[5]:①促进滋养细胞增殖与分化;②促进血管生成及扩血管作用。PLGF在胎儿发育中有很强的促血管生成特性,在胎盘血管生成起重要的作用。而sFlt-1有抗血管生成特性,能够对抗PLGF的生物学特性,而缺氧能使滋养细胞表达sFlt-1增加。

正常妊娠孕妇血清中PLGF随妊娠进展分泌水平呈峰形,孕早期较低,15周后明显上升,孕28～30周达高峰,随后又下降。为了排除由于孕周的不同导致的PLGF和sFlt-1值不同,本文中3组孕妇孕期无差别。研究发现[6],在子痫前期患者中,血清PLGF下降的幅度与病情严重程度有关,其较正常妊娠组差别越大,提示病情越严重。陈茜等[7]发现在正常孕妇、轻度子痫前期患者、重度子痫前期患者的胎盘中sFlt-1 mRNA的表达水平高于正常者,且随疾病的加重sFlt-1 mRNA的水平升高。子痫前期患者出现的高血压、蛋白尿在某种程度上可能与循环中的sFlt-1水平升高有关[8]。在子痫前期患者存在肾小球血管内皮损伤,内皮细胞间隙增大[9],一些蛋白成分能通过肾小球内皮细胞间隙从尿液排泄,故尿液中PLGF、Flt-1也有相应的变化。本研究结果显示,子痫前期患者血、尿PLGF低于正常妊娠孕妇,而sFlt-1高于正常妊娠孕妇,且随病情的加重PLGF有递减的趋势,而 sFlt-1有递增的趋势;血PLGF、Flt-1和尿PLGF、Flt-1变化相一致,且呈正相关性(r=0.692,P<0.05;r=0.784,P<0.05)。且血与尿中sFlt-1/PLGF比值的AUC比较差异无统计学意义(P>0.05),可以考虑尿液sFlt-1/PLGF检测替代血液sFlt-1/PLGF检测。

有学者[10]假设怀孕大鼠血压高、胎盘灌注量降低,与血浆中低PLGF、高Flt-1相关,并通过实验证明研究结果支持假设。Lapaire等[11]认为PLGF、Flt-1可以作为子痫前期的检测指标,可以作为判定疾病严重程度的辅助手段。De Vivo等[12]亦前瞻性研究得出PLGF、Flt-1可被用来作为标记,用于预测子痫前期,其指出sFlt-1/PLGF更能预测子痫前期的发生风险,可能比出现临床症状(血压、尿蛋白)早几周预示子痫前期的发生。从本文结果所示,轻度子痫前期患者的血清、尿sFlt-1/PLGF高于正常妊娠孕妇,而重度子痫前期患者又高于轻度子痫前期患者,差异均有统计学意义,说明sFlt-1/PLGF比值升高的程度与病情的严重程度相关,亦说明sFlt-1/PLGF比值在鉴别轻、重度子痫前期中有一定意义;血清、尿sFlt-1/PLGF诊断轻度子痫前期的ROC曲线的面积分别为0.921、0.935,诊断重度子痫前期的ROC曲线的面积分别为0.959、0.972,说明血清、尿sFlt-1/PLGF对子痫前期的诊断价值较高。

由于子痫前期病因不明确,病情发展迅速,一直以来没有一项特别理想的实验室指标预测子痫前期的发生风险,血清、尿液PLGF和sFlt-1及sFlt-1/PLGF比值的发现无疑预示着找到了一条经济可行的提高诊断及识别预防子痫前期的方法,而且尿液PLGF、 sFlt-1及sFlt-1/PLGF的标本留取方便、无创伤,更容易让患者接受,望能在将来的子痫前期的临床预测与诊断中代替血液发挥作用。当然,本文中只是选取了特定孕期的病例,更大的孕期范围我们可以进一步研究;血清、尿sFlt-1/PLGF在子痫前期病情的随访方面的作用我们也将进一步关注。

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谷氨酸受体 篇5

1 NMDA受体的概述

谷氨酸是哺乳动物及人类中枢神经系统中最丰富、最重要的兴奋性神经递质,在大脑中分布广泛,参与突触传递及维持神经细胞正常的生理功能。在生理条件下,谷氨酸的摄取、释放、重吸收处于动态平衡;在病理条件下,如脑缺血、癫痫发作时谷氨酸摄取障碍或过度释放,导致谷氨酸大量积聚,脑内浓度积聚升高,过度激活神经元受体,产生严重的神经毒性损害[2]。谷氨酸受体分为两类:一类为离子型受体,主要位于突触后膜致密区,包括N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、海人藻酸受体(KAR)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR),它们与离子通道偶联,形成受体通道复合物,介导快信号传递;另一类属于代谢型受体,与膜内G-蛋白偶联,调节细胞内第二信使的产生,介导较缓慢的生理反应。

NMDA受体分子结构复杂,由7个亚单位(NR1、NR2A-D、NR3A-B)构成的四聚体复合物[3],在哺乳动物的神经组织内,NMDA受体至少含有1个NR1亚基和1个NR2亚基,NR1是NMDA受体的基本亚单位,NR2是调节亚单位,NR2辅助NMDA受体形成多元化结构,NMDA受体依赖NR2亚单位的不同亚型表达不同的受体功能。NMDA受体在神经系统发育过程中发挥着重要的生理功能,是重要的中枢神经系统兴奋性氨基酸受体,如可调节神经元的存活,调节神经元轴突、树突结构的发育等,亦在神经元回路的形成中起着关键作用,有研究表明,NMDA受体是学习与记忆过程中一类至关重要的受体。NMDA受体是配体门控离子通道,它的激活除了需要神经递质谷氨酸的存在,同时也需要甘氨酸的参与[4],当NMDA受体被神经递质激活后,其蛋白构象发生改变,离子通道开放,阳离子如K+、Na+、Ca2+可进出细胞,使细胞膜去极化神经元兴奋。NMDA受体所构成的阳离子通道对Ca2+有高度通透性,比Na+或K+的通透性高10倍[5],使其在突触可塑性及兴奋性神经毒性方面具有重要意义[6]。在病理条件下,NMDA受体异常激活产生的兴奋性毒性缘于细胞外大量的Ca2+涌入配体门控Ca2+通道[7],细胞内Ca2+浓度升高,导致钙超载引起下游一系列损伤反应,包括线粒体功能障碍[8]、氧化应激及激活多种酶类破坏细胞骨架等,促进神经细胞不可逆损伤[9]。因此,NMDA受体阻断或缺失,可影响其正常的生理功能,如神经元发育受阻致大量凋亡、学习记忆能力下降等;NMDA受体过度激活亦可导致不可逆的神经元坏死。

2 DAPK1的概述

DAPK1是一种凋亡的正性调节因子[10],广泛表达于人和大鼠的正常组织中[11],参与p53、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、自杀相关因子(Fas)、活性c-Myc等引起的多种细胞凋亡因子的传导途径。是由Kimchi的研究小组用Knock Out法首次分离鉴定出来,发现DAPK1在C2-神经酰胺诱导的P12细胞凋亡中起着关键作用[12]。现已确认,DAPK家族至少有5个成员:DAPK1、DRP-1/DAPK2(DAPK相关蛋白/DAPK-related protein kinase)、DLK/ZIPK(死亡相关蛋白样激酶/链接相互作用蛋白激酶,DAP like kinase/zipper interacting protein kinase)、DRAK1(DAPK相关蛋白诱导激酶1)和DRAK2(DAPK相关蛋白诱导激酶2)。DAPK1是DAPK基因家族的主要成员,DAPK1位于9q34.1[13]染色体的钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其编码序列全长4293bp,其编码的蛋白质相对分子质量约为160×103。DAPK的蛋白结构具有多个不同的区域,包括1个位于N末端受钙调蛋白调节的蛋白激酶区及紧随其后的1个包含钙调素的结合区片段构成其接触反应中心,另有8个锚蛋白重复序列区,2个P-Loops环,1个细胞骨架结合区和1个C端死亡区构成非接触反应中心[14],其与DAPK的调节和定位有关。DAPK1的最重要结构区是激酶区,N末端突起形成一个环,并在特定的多肽连接区域形成一个帽状结构,该环在DAPK家族中高度保真,具有特异性,DAPK的功能依赖于其激酶区的催化活性,它的作用是使该酶特定的底物蛋白磷酸化,在启动细胞凋亡过程中起重要作用。

3 NMDA受体NR2B亚单位的结构、功能及分布

NR2B亚单位由1 456个氨基酸组成,相对分子质量为180×103,属跨膜糖蛋白,细胞膜内C-末端有蛋白激酶磷酸化位点,细胞膜外N-末端含有糖基化位点,主要参与配体识别、胞质内蛋白相交互作用的调控。亲水性分析发现,NR2B亚单位有4个疏水性跨膜域,约20个氨基酸序列构成,即M1-M4,细胞膜外N-末端的M3和M4之间形成一个环状结构,构成细胞膜受体与谷氨酸的结合位点;M2是一个面向胞质向膜内反折的膜袢区[15],M2环上的色氨酸可调节Mg2+的阻断作用,NR1亚单位和NR2B亚单位之间的M2环构成NMDA受体的离子通道[16],对Ca2+有很高的通透性。NR1亚单位N-末端的M3和M4之间形成的环状结构是甘氨酸的结合位点,当甘氨酸和谷氨酸同时结合于NR1、NR2B亚单位的结合位点时,膜电位去极化,使Mg2+移开,解除对通道的阻断作用,NR1亚单位和NR2B亚单位之间的M2环构成的离子通道开放,Ca2+内流,激活一系列下游反应,完成信号转导过程[17]。单独的NR2B亚单位没有受体通道活性,只有与NR1亚单位结合后才具有受体功能活性[18]。在胚胎发育过程中,脑皮质、脊髓、丘脑有较低水平的NR2B m RNA表达,新生鼠大脑组织中NR2B亚单位蛋白呈高水平表达,后逐渐下降至成年水平[19]。成年期NR2B亚单位主要分布在皮层、嗅球、海马、纹状体等前脑区,尤其在皮层区域分布最多。

4 DAPK1与NMDA受体的NR2B亚单位结合激活神经细胞死亡通路

最近发现,脑卒中后活化的DAPK1与神经元突触外NMDA受体的NR2B亚单位结合,激活神经细胞死亡通路,在缺血性脑卒中中倍受关注[20]。在神经突触外,NMDA受体是谷氨酸受体的主要亚型,参与多种细胞内引发的不可逆的神经元坏死的分解代谢活动。有研究表明,在成年小鼠脑缺血过程中被诱发的神经元DAPK1,可进入大脑皮层与NMDA受体NR2B亚单位的C末端1 292~1 304位氨基酸(NR2BCT)结合,形成活化的DAPK1,使NR2B亚单位的1303位丝氨酸磷酸化,从而激活NR1/NR2B受体通道,使细胞外Ca2+内流增加,最终导致神经元损伤。如果在不影响小鼠正常神经功能的情况下,用遗传学技术将DAPK1基因敲除掉,或者给予不能与DAPK1结合的NR2BCT,使活化的DAPK1从NMDA的NR2B亚单位上解离下来,由于缺乏DAPK1导致突触外NMDA受体通道失活,阻断钙内流,从而有效地保护了神经元免受脑缺血性损伤[21]。

5 展望

NMDA受体广泛参与中枢神经系统中各种生理和病理过程,一直是神经科学领域中最热门的课题,是哺乳动物中枢神经系统内最重要的受体,也是目前研究最深入的神经受体之一,但是多年来,国内外研究学者一直没有破解NMDA受体的病理信号通路机制,无法研发出对脑卒中最有效的药物和治疗方案。早在多年前,SCHUMACHER等[22]检测了大鼠脑缺血缺氧模型中DAPK1的活力,与正常对照组相比,大鼠脑缺血7 d后DAPK1活力增高,推测DAPK1可能在神经系统疾病中有重要作用,抑制DAPK1的催化活力可能防止神经元死亡。最近研究表明,死亡蛋白激酶DAPK1通过与NMDA受体的NR2B亚型结合激活神经细胞死亡通路,引发一系列信号反应,加速神经细胞死亡,造成脑卒中。最为重要的是,DAPK1仅介导NMDA的病理功能,并不影响NMDA的正常生理功能[23],这样通过研制DAPK1阻断剂治疗脑卒中,可减少广谱NMDA受体拮抗剂对NMDA受体发挥广泛作用而产生的不良反应。可认为神经元凋亡是由于通过谷氨酸受体通路流入过量的钙引起的,DAPK1的激活对这一Ca2+的流入起到了促进作用,两者共同导致了脑血管疾病的发生、发展。随着科研的不断进步,更深入地了解脑卒中的病理机制,研制出更安全、更有效、针对性更强的神经元保护剂,是今后研究的方向。

作者声明 本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：脑卒中是临床常见病、多发病,是目前危害人类健康最重要的疾病之一,且发病率、病死率、致残率呈逐年上升趋势,然而,脑卒中后神经功能损伤机制尚未明确,仍缺乏有效的治疗手段,寻找神经保护机制,对治疗脑卒中具有重要意义。目前有研究发现,脑卒中时死亡相关蛋白激酶1(death-associated protein kinase 1,DAPK1)作为一种特异性的细胞死亡信号被活化,与神经元突触外N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体结合引发神经元缺血性坏死,若将DAPK1从NMDA受体复合物上解离下来可保护神经元免受损伤,这成为治疗脑卒中的一个新靶点。

谷氨酸受体 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

健康雄性Wistar大鼠(SPF级)50只,体重(210.5±40.6)g,购自华中科技大学同济医学院附属同济医院动物实验中心,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。

胆固醇、胆酸钠和丙基硫氧嘧啶(上海如吉生物科技发展有限公司),ADMA和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)(Sigma),TRLzol Rengent(invitrogen公司),SYBR Green real-time PCR Master mix(TOYOBO公司),LightShiftTMChemiluminescent EMSA Kit(PIERCE公司),山羊抗LOX-1多克隆抗体(Santa Cruz),PVDF膜(Millipore公司),带正电荷的尼龙膜(PHARMA-CIA公司),SLAN全自动实时荧光定量PCR检测(上海宏石医疗科技有限公司),Quantity One软件(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及干预

50只健康雄性大鼠随机分为4组:(1)正常对照组(n=10):给予标准大鼠饲料喂养。(2)H组(n=12):给予高脂饲料喂养。(3)A+H组(n=14):给予高脂饲料,ADMA[0.2 mg/(kg·d)]灌胃,每日1次。(4)P+A+H组(n=14):给予高脂饲料,PDTC[40 mg/(kg·d)]腹腔注射30 min后在给予ADMA[0.2 mg/(kg·d)]灌胃,均为每日1次。正常对照组、H组均予等体积的生理盐水腹腔注射和灌胃,均为每日1次;A+H组予等体积的生理盐水腹腔注射,每日1次。

高脂饲料的配制:3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、10%蛋黄粉和71.3%标准大鼠饲料。

除对照组外,其余3组在喂养开始时一次性腹腔注射维生素D30.6 MIU/kg[4],对照组注射等体积的生理盐水。饲养18周。

1.2.2 取材

18周后以30%乌拉坦(1.5 g/kg)肌肉注射麻醉大鼠,自主动脉根部至髂动脉分支处剥离主动脉全长,去除血管外脂肪,用4℃生理盐水冲洗干净,以滤纸吸去水分,迅速投入液氮中,4 h后转入-80℃冰箱保存。

1.2.3 R eal-Time PCR检测LOX-1 mR NA表达引物由Invitrogen公司合成。

Trizol法提取组织总RNA,测RNA浓度;按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成c DNA;荧光定量PCR反应。LOX-1引物序列:Sense:5'-TGACAAGATGAAGCCTGTGAAT-3';Antisense:5'-TTGGTATTGCTTTAGGAGGTCA-3',扩增片段190 bp。内参照Actin引物序列:Sense:5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3',Antisense:5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3';扩增片段110bp。反应总体系25μL:SYBR Green mix 12.5μL、Plus solution 2.5μL、Primer mix 2μL、去离子水5.5μL、c DNA 2.5μL。反应条件:95℃预变性2 min两组比较差异有显著性(P<0.05)。表明ADMA能进一步上调大鼠主动脉LOX-1蛋白表达,而PDTC可明显抑制ADMA的这一作用。

注:1:阳性对照组;2正常对照组;3:H组;4:A+H组;5:P+A+H组;1)与正常对照组比较,P<0.05;2)与H组比较,P<0.05;3)与A+H组比较,P<0.05

2.3 各组NF-κB活性的比较 图3

A+H组(9083.87±586.36)NF-κB活性较正常对照组(6341.95±510.82)和H组(7027.63±320.57)均明显升高,两组相比差异均有显著性(均为P<0.05);P+A+H组(5709.13±362.40)中NF-κB活性较A+H组明显降低,两组相比有显著差异(P<0.05)。结果表明:在AS形成过程中,ADMA可进一步激活NF-κB。

2.4 相关分析

将各组NF-κB活性与LOX-1 m RNA及蛋白表达量作两变量相关分析显示:NF-κB活性与LOX-1 m RNA及蛋白表达量呈显著正相关(相关系数r分别为0.79、0.81,P<0.05)。

3 讨论

ADMA是内皮源性一氧化氮合酶(NOS)的竞争性抑制剂,生理状态下人体血浆ADMA浓度约为1μmol/L,但在机体应激、组织细胞缺血或再灌注损伤时,血浆ADMA浓度会明显升高。当血浆ADMA浓度达到3～15μmol/L时,即可导致内皮功能紊乱,抑制NOS活性,使NO合成减少,促进动脉内膜增生[5]。ADMA也可呈浓度依赖性激活NF-κB、增强内皮细胞与单核细胞的黏附性,促进动脉血管壁粥样硬化斑块的形成[6,7]。

LOX-1是1997年日本学者SAWAMURA等首先在牛主动脉内皮细胞上发现并克隆成功的Ⅱ型单链跨膜蛋白[8],在结构上属于C型血凝素家族。LOX-1能够结合、吞噬、降解ox LDL。LOX-1与ox LDL结合后可通过激活多种信号途径促进AS发生和发展,如:ROS、MAPK、MCP-1和NF-κB等。而且LOX-1自身也是一种炎性因子,可诱导黏附分子、趋化因子等的释放,促进血管平滑肌细胞和巨噬细胞吞噬大量ox LDL形成富含脂质的泡沫细胞,参与AS的发生。LOX-1还可识别、黏附单核细胞及淋巴细胞,通过识别细胞表面暴露的磷脂及磷脂酰丝氨酸而介导活化的血小板、衰老的红细胞及凋亡细胞黏附于内皮细胞[9],促进血栓形成,诱发急性冠脉综合征的发生。

LOX-1基因启动子nt-2131至nt-2247之间框架区是转录活性的必要区域,该区域包括一个具有转录活性的NF-κB结合位点[10]。血管紧张素Ⅱ可通过激活NF-κB而诱导LOX-1基因启动子活化[11];葡萄糖亦可促进核蛋白与LOX-1基因启动子上NF-κB调节序列结合[12];在人脐静脉内皮细胞中,ADMA可通过激活NF-κB信号途径上调LOX-1表达[13]。SMIRNOVA等也曾提出假设:在已分化的HL-60细胞中,ADMA可能通过减少NO生成、增加氧自由基来激活NF-κB信号途径使LOX-1表达上调[3],但这一假设并未用实验研究证实。

本研究结果显示:在大鼠主动脉粥样硬化病变形成过程中,NF-κB结合活性明显增加,同时LOX-1在基因水平和蛋白水平上的表达均明显增强;在给予ADMA干预后,NF-κB结合活性、LOX-1表达均进一步增强;而在给予NF-κB特异性抑制剂PDTC预处理后,NF-κB结合活性明显降低,LOX-1在基因和蛋白水平上的表达亦明显减少,即NF-κB特异性抑制剂PDTC明显抑制了ADMA增强NF-κB结合活性及上调LOX-1表达这一效应;相关分析显示NF-κB结合活性与LOX-1 m RNA及蛋白表达均呈正相关。这一实验结果揭示了在大鼠主动脉粥样硬化形成过程中,AD-MA可通过激活NF-κB而上调LOX-1表达,抑制NF-κB活性可减少LOX-1表达。因此,本研究推测:在AS形成过程中,血浆升高的ADMA通过激活NF-κB而增加LOX-1表达,LOX-1通过诱导各种炎症因子的释放、氧化应激等损伤血管内皮,同时做为表达上调的膜受体使血管壁上平滑肌细胞、巨噬细胞对氧化修饰脂蛋白的摄取大大增加,且不受自身负反馈机制的调节,从而促进了泡沫细胞的形成及在血管壁上的沉积,促进了AS的发生发展。

因本实验只观察了NF-κB对ADMA诱导大鼠主动脉表达LOX-1的影响,未涉及ADMA激活NF-κB后下游其他产物,如TNF-是否变化及其对LOX-1表达的影响,以及NF-κB上游抑制蛋白及可能存在更高水平蛋白酶的调节等问题,所以其中的机制及关系仍需深入研究。

摘要：目的 探讨非对称性二甲基精氨酸(ADMA)上调大鼠主动脉氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的表达是否是由NF-κB调控。方法 Wistar大鼠50只随机分为4组:①正常对照组(n=10):标准饲料喂养。②H组(n=12):高脂饲料喂养。③A+H组(n=14):高脂饲料喂养,ADMA[0.2mg/(kg.d)]灌胃,每日1次。④P+A+H组(n=14):高脂饲料喂养,吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)[40 mg/(kg.d)]腹腔注射、ADMA[0.2mg/(kg.d)]灌胃,均为每日1次。18周后麻醉大鼠、取主动脉。以实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测LOX-1 mRNA和蛋白表达,以电泳迁移率变动分析(EMSA)和增强化学发光法(ECL)检测NF-κB活性。结果 ①A+H组LOX-1 mRNA和蛋白表达量较正常对照组和H组升高(P<0.05),P+A+H组较A+H组LOX-1 mRNA和蛋白表达量降低(P<0.05)。②A+H组NF-κB活性较正常对照组和H组均显著升高(P<0.05),P+A+H组NF-κB活性较A+H组明显降低(P<0.05)。③相关分析:NF-κB活性与LOX-1 mRNA和蛋白表达量均呈正相关(相关系数r分别为0.79,0.81;P<0.05)。结论 ADMA可能通过NF-κB途径上调LOX-1表达而促进动脉粥样硬化的发生发展。