赖氨酸脱羧酶（精选4篇）
赖氨酸脱羧酶 篇1
L-赖氨酸脱羧酶 (L-lysine decarboxy-lase EC 4.1.1.18) 是生物体内高度专一性酶, 催化L-赖氨酸脱羧生成尸胺 (1, 5-戊二胺) 和二氧化碳。L-赖氨酸脱羧酶是诱导性胞内酶, 需要磷酸吡哆醛作为辅酶促进脱羧反应[1]。细菌来源的赖氨酸脱羧酶有两种, 即组成型和诱导型, 组成型的赖氨酸脱羧酶表达量很低, 但与菌体生物量偶联。诱导型的需要在合适的诱导条件下才表达。
尸胺是赖氨酸脱羧的产物, 已有技术可以将尸胺精炼后和己二酸共聚合成为具有实用性的尼龙56[2]。现今尼龙生产主要是以石油中提炼出的己二胺及己二酸为原料。目前面临石油价格猛涨以及今后将面临的石油枯竭, 寻找新的己二胺替代物迫在眉睫。尸胺是很好的己二胺替代品, 可以通过微生物合成, 有可再生能力, 具有很好的应用前景。此外, 尸胺可以作为第二信使调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育, 外源施加尸胺可以改善坐果和促进果实发育[3,4,5]。尸胺可以利用微生物细胞内的赖氨酸脱羧酶使L-赖氨酸脱羧而获得。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
蜂房哈夫尼菌 (Hafnia alvei AS 1.1009) , 北京微生物研究所提供。
1.1.2 仪器
SKW-3型微量呼吸检压仪 (瓦勃氏呼吸仪) 。
1.1.3 培养基
种子培养基 (%) 蛋白胨1, 牛肉浸膏0.5, NaCl 0.5, 玉米浆 0.5, pH7.2。
优化前发酵培养基 (%) :蛋白胨1, 牛肉浸膏0.5, NaCl 0.5, 维生素B6 0.5, L-赖氨酸0.5, pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 摇瓶培养
自斜面取1环菌接入装有30mL种子培养基的三角瓶中, 35℃、170r/min震荡培养12h。以5%的接种量接入250mL三角瓶装有30mL发酵培养基中, 菌体生长阶段:35℃, 旋转式摇床170r/min振荡培养11h;诱导阶段:将pH调至5.5, 35℃静置培养7h。
1.2.2 赖氨酸脱羧酶活力测定:
采用瓦勃氏呼吸仪测定脱羧产生的CO2的方法。
含L-赖氨酸转化液的配制:1g L-赖氨酸溶解于0.2mol/L pH5.0乙酸-乙酸钠缓冲液100 mL中, 然后滴加数滴吐温-80, 供转化反应用。
酶活力测定:取1mL发酵液, 离心10min (5 000×g) , 用0.2mol/L pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液重悬, 取0.5mL加入反应瓶侧臂中, 保温震荡后与底物混合进行反应, 1h后读取测压管读数。以脱羧所形成的CO2来表示酶的活力, 即一个酶活力单位定义为:在反应温度为37℃时, 在pH 5.0的0.2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液体系中1h转化1μmol L-赖氨酸为CO2的酶量。
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式中:ΔV=ΔV2×K2-Δh1×K1, h1-对照瓶初读数, mm液柱;h2-样品瓶初读数, mm液柱;K1-对照反应瓶常数, μL/mm液柱;K2-样品反应瓶常数, μL/mm液柱;k-被测菌液稀释倍数;T为转化反应时间 (h) (将转化时间选定为1 h) 。以下每次试验重复3次取平均值。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 碳源对产酶的影响
碳源是培养基的主要成分之一, 是合成菌体成分的原料, 也是微生物获取能量的主要来源。试验中考察了以上述培养基为基础, 分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉等四种不同碳源, 各碳源添加浓度均为2%, 考察各碳源对产赖氨酸脱羧酶的影响, 结果见图1。从图1可知, 以葡萄糖为碳源时的酶活力最高, 达到35.96U/mL。
2.1.2 葡萄糖浓度对产酶的影响
由试验确定的葡萄糖为最佳碳源后, 在浓度为1.0%～4.0%之间调整葡萄糖浓度, 其它培养条件不变, 并测定酶活, 结果如图2所示。由图2可以看出, 葡萄糖浓度为2%时酶活达到最高, 继续提高糖浓度, 菌体产酶能力迅速下降, 表明高浓度的葡萄糖, 可能会因渗透压过高, 不利于菌体的生长及产酶。
2.1.3 不同氮源对产酶的影响
氮源主要用来构成菌体细胞物质和代谢产物。试验中考察了在上述优化好的碳源基础上将1%的蛋白胨和0.5%的牛肉膏替换成分别加入1.5%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、 (NH4) 2SO4、NH4NO3等六种不同氮源对菌体产酶的影响, 结果如图3所示。由图3可以看出, 采用1.5%的酵母膏为氮源时的酶活力最高达76.42U/mL, (NH4) 2SO4、NH4NO3等无机氮源发酵时, 酶活力较低, 这表明大多数迅速利用的无机氮源对菌体产酶存在氮分解代谢物阻遏作用。
2.1.4 不同酵母膏浓度对产酶的影响
酵母膏中含有丰富的氨基酸和生长因子, 因而是一种良好的氮源。本试验对不同浓度的酵母膏进行考察, 结果如图4所示。由图4可知, 采用2%酵母膏浓度时, 酶活力最高, 为92.7U/mL, 浓度大于2%时, 菌体产酶能力缓慢下降。
2.1.5 MgSO4浓度对产酶的影响
Mg2+为许多酶的激活剂, 考察了不同浓度MgSO4对酶活的影响, 结果如图5所示, 由图5可以看出, 当硫酸镁的浓度为0.03%时酶活最高, 达到126.45U/mL, 当浓度达到0.1%时酶活降低, 证明高浓度的Mg2+对酶活起抑制作用。
2.1.6 KH2PO4浓度对产酶的影响
磷酸盐除用于维持pH和渗透压外, 也是重要的能量传递者, 同时磷还可以改变菌体的能荷状态。因此试验中考察了不同浓度的KH2PO4对酶活的影响, 结果见图6。由图6可以看出, 当其浓度为0.01%时酶活力最高138.34U/mL。KH2PO4浓度过高会阻遏酶的生成, 表现出酶活力降低。
2.1.7 NaCl浓度对产酶的影响
NaCl对维持菌体渗透压起着重要作用, 考察不同浓度NaCl对酶活的影响, 结果如图7所示, 由图7可以看出, 当NaCl浓度为0.3%时酶活最高为146.12U/mL。
2.1.8 VB6加入量对酶活的影响
培养基中添加不同浓度的VB6, 考察其对酶活的影响, 结果如图8所示。由图8可以看出, 维生素B6对酶活的影响显著, 在VB6为0.1%时酶活最高, 可达到160.62U/mL。这是因为磷酸吡哆醛 (VB6) 是L-赖氨酸脱羧酶的辅酶, 对脱羧反应有很强的促进作用。不添加VB6时也有酶活, 是由于天然培养基成分中本来就含有一定量的VB6, 超过1%时酶活略有下降。
2.1.9 生长因子——玉米浆浓度对产酶的影响
玉米浆中通常含有一定量的生物素, 而加适量的生物素对细胞膜通透性有一定的影响。试验中考察了不同玉米浆浓度对产酶的影响, 结果如图9所示。由图9可知, 当玉米浆浓度小于4%时, 随着培养基中玉米浆浓度的提高, 菌体的脱羧酶活力逐步提高。玉米浆浓度为4%时, 酶活力可达180.85U/mL, 增加玉米浆浓度, 菌体产酶下降。其原因在于高浓度的玉米浆对脱羧酶的产生存在氮分解代谢物阻遏。
2.2 Plackett-Burman试验设计筛选对酶活影响显著的因素
选用N=12的Plackett-Burman试验, 对赖氨酸脱羧酶产酶培养基中的8个因素进行考察。每个因子取高 (1) 低 (-1) 两个水平, 各参数及其水和平方差分析结果见表1。由表1可知, 产酶培养基显著影响 (置信度大于96%) 的因素有酵母膏、玉米浆和葡萄糖。其中三个因素对酶活都呈正效应。这三个因素对产酶的影响可用方程:Y1=164.2608+0.299167X1+9.4175X2+8.015833X3-0.1225X4+4.089167X5-2.145833X6+0.495833X7-2.805833X8表示。该方程的决定系数R2为99.28%, 表明该回归方程拟合良好。
2.3 最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman法筛选出的显著因子效应大小设计他们的步长, 进行最陡爬坡试验设计, 寻找最大产酶区。试验设计及结果如表2所示。由表2可知, 培养基最佳成分在0+2△和0+3△之间, 故以0+2△的条件作为响应面实验因素水平中心点。
2.4 Box-behnken设计统计分析结果
根据最陡爬坡试验确定的中心点, 进一步进行Box-Benhnken实验。其中在影响赖氨酸脱羧酶酶活的8个因素中, 酵母膏、玉米浆和葡萄糖对酶活的影响最为显著, 因此在Box-Benhnken实验中主要对三者的最佳添加量进行优化。
Box-Benhnken实验组和设计对影响赖氨酸脱羧酶酶活的关键因素进行15组试验, 来寻求上述三个因素的最佳添加量。实验因素水平及编码如表3所示, 试验设计及结果如表4所示。
利用Statistica软件, 对Box-behnken实验结果进行二次多项回归拟合, 获得酵母膏、玉米浆和葡萄糖浓度的多元二次回归方程:
Y=180.3633+10.06625X1+2.22875X2+3.9775X3-6.179157Xundefined-1.305X1X2-4.1875X1X3-5.329167Xundefined-5.5125X2X3-4.176667Xundefined
式中Y是赖氨酸脱羧酶的酶活 (U/mL) , X1、X2、X3分别为葡萄糖、酵母膏和玉米浆添加量。从该方程的方差分析表 (表略) 可知, 本试验所采用的模型高度显著, Radj2值为0.9165, 表明酶活的91.65%的变异分布在方程的9个因子中, 总变异中仅有8.35%不能由模型解释, R2值为97.02%, 表明酶活的预测值和实际值之间具有较好的拟合度。该模型可用于预测蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶酶活的实际情况。
将回归方程 (1) 分别对其自变量 (X1、X2、X3) 求一阶偏导并均令其为0, 即可得到一个三元一次方程组, 通过借此方程组得到比酶活的最大值和对应的极值点。极值点为X1=0.035, X2=0.4013, X3=-0.05515, 相当于三者的最适浓度分别为葡萄糖1.84%, 酵母膏2.20%, 玉米浆3.66%。
2.5 拟合优化的验证
在上述求得的最优条件下, 预测酶活的最高值, 验证试验的设计及结果见表5。由表5可知酶活的预测最高值为204.53U/mL。为了验证模型的准确性和有效性, 在预测最优条件下进行发酵试验, 得到酶活为203.14±0.2U/mL (试验重复3次, 3次试验结果分别为202.16U/mL、204.08U/mL、203.18U/mL, 进一步证明了该模型能准确预见实际发酵情况。
3 讨论
石油价格不断增长并在不久的将来可能面临枯竭, 这使许多原料依赖石油的化工生产必须寻找石油代替品。微生物具有培养方便, 快速繁殖, 可再生等诸多优点, 成为很多化工原料理想的“生产者”。作者以赖氨酸这种微生物代谢产物为原料, 利用微生物的赖氨酸脱羧酶将其转化成合尸胺。目前一些日本学者在从事此方面的研究, 并取得一定成果, 国内关于此方面研究极少, 此课题在实验室水平上初步探讨生产尸胺的方法, 为今后我国拥有自主知识产权的尸胺工业化生产技术奠定基础。酶活达到203.14U/mL, 比优化前的比酶活提高28.9倍。
参考文献
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[3]陈学好, 于杰, 李伶利.高等植物开花结实的多胺研究进展[J].植物学报, 2003, 20 (1) :36-42.
[4]刘宽灿, 梁秋芬, 赵丽红, 等.多胺在植物生长发育过程中的生理作用[J].氨基酸和生物资源, 2005, 27 (1) :22-26.
[5]王晓云, 邹琦.多胺与植物衰老关系研究进展[J].植物学通报, 2002, 19 (1) :11-20.
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赖氨酸脱羧酶 篇2
谷氨酸脱羧酶(Glutamate Decarboxylase,GAD)是唯一一种能够利用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅因子不可逆地催化L-谷氨酸(L-GLu)的α位脱羧反应生成重要的抑制性神经递质GABA的酶,因此提高GABA产量的关键是GAD,但有关其分离、纯化及特性研究很少。鉴于GABA的工业效益,GAD已经被高效表达在各种细菌用于提高GABA的产量。例如,在清酒乳杆菌B2-16(Lactobacillus sakei B2-16)中成功高效表达出胚芽乳酸菌ATCC14917谷氨酸脱羧酶基因,获得了1.35倍的GABA含量[9]。也有报道称敲除了GABA转氨酶基因的大肠杆菌菌株经过高效表达的谷氨酸脱羧酶以及谷氨酸的逆向转运由10 g/L的谷氨酸单钠(MSG)获得5.5 g/L的GABA产物[10]。GAD是一种依赖于PLP的脱羧酶,PLP对GAD的活性来说是必须的,同时也可通过增加谷氨酸浓度、Ca2+与钙调和蛋白(Ca M)的比例来增强GAD的活性,H+对GABA的积累有重要作用[11]。试验拟对PLP的影响进行初步的讨论研究。现已经合成的转基因酿酒酵母(S.cerevisiae)YSC4515-98811386可提高GABA的产量,为了解该酿酒酵母GAD的相关情况,本试验对转基因酿酒酵母进行了培养、诱导、谷氨酸脱氢酶的分离纯化及其活性的研究。
1 材料
1.1 菌种
酵母菌(S.cerevisiae,YSC4515-98811386,ORF Name为YOR120W),由日本爱媛大学生化学研究室-70℃超低温冷冻室提供。
酵母提取物及胰蛋白胨(3×YP)+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基,自制。
1.2 仪器
ProfiniaTM蛋白质纯化系统(Bio-Rad)、紫外分光光度计(岛津的UV-1800型)、离心机、细胞破碎仪、SDS-PAGE电泳仪,均由日本爱媛大学生物化研究室提供。
2 方法
2.1 菌种的活化及生长情况
将S.cerevisiae放入28℃普通培养基中激活培养24 h,然后将激活培养的酵母菌分别接种到3×YP+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基中培养,并分别测定5,10,19,24,29,34,42,47,52,66小时的OD600值,并绘制生长曲线值。
2.2 S.cerevisiae的收集
取1个培养基中的液体30 m L置于离心管中3 000 r/min离心5 min;吸取上清液,在沉淀中加入生理盐水再次离心(3 000 r/min,5 min),重复3次将酵母菌洗净,备用。
2.3 融合蛋白的纯化
将上步悬浊液粉碎10 min后沉淀离心,通过ProfiniaTM蛋白质全自动高速纯化,获得融合蛋白。
2.4 SDS-PAGE电泳
将分离出的产物即融合蛋白进行SDS-PAGE电泳,90 min TE ORIOLE荧光染色,将凝胶通过紫外线照射仪观察并拍照。
2.5 酶活力的测定
取2支离心管,向其中分别加入0.4 m L纯化水和0.4 m L PLP(10 mmol/L),各加入酵素液(纯化的蛋白质50μL+纯化水150μL)0.2 m L,于37℃培养10 min;再分别加入谷氨酸(10 mmol/L)-酒石酸钠(100 mmol/L)缓冲液(p H值为4.5[12])1.4 m L,于37℃反应0,0.5,1,2,3 h;分别取2.0 m L于离心管中,于4℃、15 000 r/min离心10 min;取上清液1.5 m L,用柠檬酸钠缓冲液(p H值为2.2)稀释10倍,过滤器过滤,置于600μL的氨基酸分析系统进行分析。
3 结果与分析
3.1 S.cerevisiae在不同培养基中的生长情况
S.cerevisiae分别在3×YP+6%棉子糖液体培养基和3×YP+6%半乳糖液体培养基中培养。其中在3×YP+6%棉子糖液体培养基中酵母菌的含量是最高的,所有培养基中的酵母菌在50小时左右都达到了一个生长的高峰,由此可知该种酵母菌最适培养基为3×YP+6%棉子糖液体培养基。见表1。
3.2 GAD的分离纯化结果
以ProfiniaTM低压液相色谱纯化后可知,在3×YP+6%半乳糖液体培养基的酵母菌基因表达产物较3×YP+6%棉子糖液体培养基的显著,见图1、图2。
3.3 棉子糖与半乳糖诱导表达GAD的结果
由棉子糖诱导的S.cerevisiae没有纯化到GAD,见图3。由半乳糖诱导的S.cerevisiae得到GAD,经SDS-PAGE凝胶电泳检测可知分子质量为67 ku,见图4。
3.4 PLP对S.cerevisiae GAD活性的影响
经过600μL的氨基酸分析系统自动分析,表示出L-Glu与GABA含量变化关系来间接反映PLP对S.cerevisiae GAD活性的影响,说明PLP对GAD活性有一定的活化作用,见图5、图6。
A.棉子糖培养原液;B.Wash-1;C.Wash-2;D.纯化物。
A.半乳糖培养原液;B.Wash-1;C.Wash-2;D.纯化物。
4 讨论
试验对S.cerevisiae GAD的纯化以及酶学性质进行了初步的研究,通过反复清洗、离心,利用ProfiniaTM蛋白质纯化系统从酿酒酵母细胞中有效纯化到GAD。结果表明,3×YP+6%半乳糖培养基能够诱导重组酵母表达产生GAD的目的基因。通过SDS-PAGE检测其GAD分子质量为67 ku,该数值相对于GAD氨基酸分子序列的标准值(65.897 ku)偏大,可能是其中存有其他蛋白质导致。GAD是一种依赖于吡哆醛的脱羧酶,PLP对GAD的活性来说是必须的,图5和图6显示了额外的添加PLP对酿酒酵母S.cerevisiae GAD活性的影响,结果表明,PLP对GAD的活性有一定的促进作用,原因可能是S.cerevisiae GAD与辅酶PLP紧密整合形成相对于更加完整的GAD,进而增加其活性[13]。本试验结果为进一步研究酿酒酵母YSC4515-98811386 GAD的构象、酶学性质以及与PLP的相互作用机制打下基础。
M.标准物;1.培养液;2.粗制的GAD;3.纯净水对照;4.纯化的GAD。
M.标准物;1.酵素液;2.培养液;3.粗制的GAD;4.纯净水对照;5.纯化的GAD。
摘要：为了了解酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)谷氨酸脱羧酶(GAD)的情况,分别用酵母提取物及胰蛋白胨(3×YP)+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基进行诱导培养,粉碎破碎酵母,采用ProfiniaTM蛋白质纯化系统纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子质量,同时研究了磷酸吡哆醛(PLP)对酿酒酵母谷氨酸脱羧酶(S.cerevisiae GAD)活性的影响。结果表明:转基因酿酒酵母在28℃振动培养47 h,3×YP+6%棉子糖培养基OD600值为7.4,3×YP+6%半乳糖培养基OD600值为6.8。棉子糖诱导的酿酒酵母没有表达目的基因,没有纯化到GAD;相反,半乳糖诱导的酿酒酵母表达了目的基因,纯化到了GAD,其分子质量为67 ku。PLP对GAD的活化作用较显著。
赖氨酸脱羧酶 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 底物
由蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、赖氨酸1%、0.2%BCP 5 ml构成、调p H值为p H 5.0~5.3、分装成0.5 ml/支, 115℃高压蒸汽灭菌10 min, 放冰箱中保存备用。
1.1.2 Vitamin B6水溶液
含0.1%Vitamin B6水溶液, 用0.2μm滤器过滤除菌备用。
1.1.3 实验菌株
肠道致病菌及条件致病菌115株, 其中标准菌株11株, 来自中国科学院微生物研究所, 其余104株从临床的腹泻便、食品、水及环境样品中分离, 均经过API 20E鉴定系统或按《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定。
1.1.4 质控菌株
阳性菌株-产气肠杆菌ATCC49701, 阴性菌株-阴沟肠杆菌CMCC43501。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备
取18~24 h的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物, 用5.0 ml吸管吸取3~5 ml稀释液加入斜面试管内, 反复吹吸, 洗下菌苔, 将洗液制成1×109~5×109CFU/ml菌悬液。
1.2.2 接种与结果判定
将菌悬液加到0.5 ml底物中, 再加入1滴Vitamin B6水溶液, 混匀后, 上面滴加1层无菌液体石蜡, 约0.5 ml, 37℃培养1~2 h判定结果。底物由黄色变紫或深紫色为赖氨酸脱羧试验阳性, 底物仍为黄色或黄褐色为赖氨酸脱羧试验阴性。同时以常规法作对照, 用标准菌株质控。
2 结果
2.1 赖氨酸脱羧试验底物微量快速法的敏感性和符合性
赖氨酸脱羧试验是观察细菌脱羧酶将氨基酸的羧基脱出形成胺和二氧化碳, 从而使培养基变成碱性的能力。Vitamin B6是脱羧基的一种辅酶, 可加快氨基酸代谢。赖氨酸脱羧试验底物微量快速法应用Vitamin B6作为赖氨酸脱羧试验的辅酶以提升赖氨酸脱羧试验反应速度, 通过对肠杆菌科的埃希菌属、哈弗尼亚菌属、克雷伯菌属、沙门菌属、沙雷菌属、志贺菌属、变形杆菌属及肠杆菌属等8个菌属115株细菌进行该试验。同时以常规法作对照[2], 用标准菌株质控。赖氨酸脱羧试验底物微量快速法37℃培养1~2 h, 即可准确判断结果, 而常规法需培养24 h读结果, 因此, 快速法具有较高的敏感性, 并且与常规法24 h培养结果相一致, 符合率达到100%。结果见表1。
2.2 赖氨酸脱羧试验底物微量快速法的稳定性观察
将质控合格的底物和辅酶置4~8℃条件下保存。用质控菌株 (质控菌株:阳性菌株-产气肠杆菌ATCC49701, 阴性菌株-阴沟肠杆菌CMCC43501) 对新配置和保存的底物、辅酶进行质控, 每月质控1次, 连续作6次。结果显示, 在4~8℃条件下保存的底物、辅酶与新制备的底物、辅酶试验结果一致, 符合率达100%。因此, 认为该底物和辅酶在4~8℃条件下可保存6个月。
3 讨论
赖氨酸脱羧试验可用于鉴别菌属如爱德华菌属、沙门菌属、亚利桑那菌属与弗氏柠檬酸菌属;区别不产气、无动力的大肠埃希菌与志贺菌属;还用于鉴别菌种如产气肠杆菌、蜂房哈弗尼菌与阴沟肠杆菌以及成团肠杆菌;用于侵袭性大肠埃希菌和沙门菌属的初筛[3]。因此, 赖氨酸脱羧试验在鉴定肠杆菌科细菌中具有广泛的应用价值。笔者研究建立的赖氨酸脱羧试验底物微量快速法, 将待检菌悬液加到0.5 ml底物中, 再加入1滴辅酶, 混匀后, 滴加1层无菌液体石蜡, 37℃培养1~2 h即可快速准确的判定结果。该方法可缩短检测时限, 操作简捷, 成本低廉, 便于推广使用。
摘要：目的 探讨赖氨酸脱羧试验底物微量快速法的建立与应用。方法 采用赖氨酸脱羧试验底物微量快速法、常规方法对肠道致病菌及条件致病菌共115株进行赖氨酸脱羧试验的敏感性和符合性试验。结果 赖氨酸脱羧快速试验法37℃培养12 h, 即可准确判断结果, 而常规法需培养24 h读结果。因此, 快速法具有较高的敏感性, 并且与常规法24 h培养结果相一致, 符合率达到100%。结论 该方法可缩短检测时限, 操作简捷, 成本低廉, 便于推广使用。
关键词：赖氨酸脱羧酶,底物微量,快速,试验
参考文献
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赖氨酸脱羧酶 篇4
1 资料与方法
1.1 病例选择
2009年3月至2010年二月我院门诊及内分泌科患者, 其中需胰岛素治疗组患者104例。以2型糖尿病发病, 发病年龄>30岁, 非胰岛素治疗半年, 出现酮症或酮症酸中毒, 改用胰岛素治疗, 其中男49例, 女55例, 平均年龄56.4岁, 平均发病年龄40.6岁, 平均病程8.6年。降糖药治疗有效的糖尿病组患者为254例, 无酮症病史, 其中男152例, 女102例, 平均年龄61.2岁, 平均发病年龄52.4岁, 平均病程11.2a。
1.2 方法
GADA酶免疫试剂盒、ICA酶免疫试剂盒为美国BioMerica公司产品, 严格按试剂盒说明书操作。结果GADA的阳性判断:以质控血清 (值为0.5, 1.1, 1.6, 2.1) 的吸光度值制作浓度反应曲线, 并输入各样本的吸光度值, 得各标本的GAD值。其值<1.0为阴性, >1.05为阳性, 中间为可疑。若阴性质控血清的吸光度值>0.300, 则该次检测失败。测得结果的准确性为93.6%, 特异性为94.2%, 灵敏度为90.1%。
1.3 统计学分析
检测结果用表示, 均数比较用t检验, 率的比较用χ2检验。254例2型糖尿病患者中, 检出GADA阳性68例, 占26.77%, ICA阳性34例, 占13.39%, 对照组未检出GADA和ICA阳性者。见表1。
2 讨论
LADA与1型糖尿病均为胰岛β细胞受损、胰岛素分泌缺乏所致。GADA比ICA、胰岛素自身抗体等出现早, 持续时间长, 阳性率高, 故诊断1型糖尿病, 尤其是对LADA而言, GADA的测定优于I-CA。
调查发现胰岛素缺乏组GADA和ICA的阳性率分别为53.24%和30.84%, 明显高于非胰岛素缺乏组的26.77%和13.39%, 说明GA-DA的阳性率随着对INS依赖程度的加重而升高, 提示GADA阳性与胰岛素功能的减退有关。同时, 联合C肽 (CP) 检测, 发现GADA阳性者CP水平低 (P<0.01) , ICA的阳性率高, 故GADA可用于从2型糖尿病中识别LADA, 结果与文献报道基本一致。
糖尿病非酮症起病的患者发病年龄约30岁以上, BMI低, INS分泌不足, 为LADA的早期诊断提供了重要线索。如果GADA和/或I-CA阳性, 则对LADA的早期诊断更有价值。
与2型糖尿病比较, LADA具有显著的人类白细胞相关抗原HLA DQB﹡0201基因频率和显著低的DQB﹡0301基因频率, 提示LADA与2型糖尿病有明显不同。由此可见, 基因型分析对LADA的诊断亦有重要价值。
GADA和/或ICA阳性可预测和诊断2型糖尿病, 有助于从2型糖尿病中筛选出LADA, 二者联合检测, 可提高诊断的敏感性, 并进一步提高诊断的准确性, 以便尽早确诊, 为临床及早应用胰岛素治疗, 以保护残存的胰岛β细胞功能提供了依据, 改善了LADA的预后。
摘要：目的探讨谷氨酸脱羧酶抗体 (GADA) 与胰岛细胞自身抗体 (ICA) 的联合检测, 早期诊断成人迟发性自身免疫性糖尿病。方法采用ELISA法对358例糖尿病患者的血清进行GADA与ICA的联合检测。将患者分为两组, A组为胰岛素依赖性 (1型) 糖尿病患者组, B组为2型糖尿病患者组, 比较两组患者的检测结果。结果1型糖尿病患者组GADA阳性率为52.34%, ICA阳性率为30.84% (P<0.005) 明显高于2型糖尿病组 (GADA阳性率为26.77%, ICA阳性率为13.39%) 。GADA与ICA联合检测, 则1型糖尿病组的阳性率为69.56%, 2型糖尿病组为24.62%。结论GADA在1型糖尿病患者血清中有较高的阳性率, 可作为1型糖尿病的免疫诊断指标, GADA与ICA的联合检测可提高1型糖尿病的检出率。对2型糖尿病而言, GADA、ICA各有一定的阳性率, 其联合检测, 可提高成人隐匿性自身免疫性糖尿病 (LADA) 的及早筛出与治疗, 并为临床及早应用胰岛素治疗, 以保护残存的胰岛β细胞功能提供了依据。
关键词：1型糖尿病,2型糖尿病,谷氨酸脱羧酶抗体,胰岛细胞抗体,自身抗体
参考文献
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[2]潘孝仁, 杨文英, 肖建中, 等.成人晚发自身免疫性糖尿病的特点及诊断要点探讨[J].中华内科杂志, 1997, 36 (3) :159-164.