谷氨酸脱羧酶

谷氨酸脱羧酶（精选4篇）

谷氨酸脱羧酶 篇1

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种含有4个碳原子的非蛋白质的游离氨基酸,广泛分布于从微生物到哺乳动物的原核和真核生物体中[1]。有许多研究表明,GABA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质,它有许多生理功能,比如对血压的调节作用[2],对心血管系统的调节作用[3],还有研究显示一些基因受到GABA的抑制[4]。鉴于GA-BA的这些生理功能,其作为一种新型食品活性因子,在功能食品中的应用已成为研究热点,越来越多的富含GABA的产品被开发出来,包括糙米[5]、茶、麦麸[6]、大豆[7]、乳酸菌(LAB)发酵食品[8]等。

谷氨酸脱羧酶(Glutamate Decarboxylase,GAD)是唯一一种能够利用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅因子不可逆地催化L-谷氨酸(L-GLu)的α位脱羧反应生成重要的抑制性神经递质GABA的酶,因此提高GABA产量的关键是GAD,但有关其分离、纯化及特性研究很少。鉴于GABA的工业效益,GAD已经被高效表达在各种细菌用于提高GABA的产量。例如,在清酒乳杆菌B2-16(Lactobacillus sakei B2-16)中成功高效表达出胚芽乳酸菌ATCC14917谷氨酸脱羧酶基因,获得了1.35倍的GABA含量[9]。也有报道称敲除了GABA转氨酶基因的大肠杆菌菌株经过高效表达的谷氨酸脱羧酶以及谷氨酸的逆向转运由10 g/L的谷氨酸单钠(MSG)获得5.5 g/L的GABA产物[10]。GAD是一种依赖于PLP的脱羧酶,PLP对GAD的活性来说是必须的,同时也可通过增加谷氨酸浓度、Ca2+与钙调和蛋白(Ca M)的比例来增强GAD的活性,H+对GABA的积累有重要作用[11]。试验拟对PLP的影响进行初步的讨论研究。现已经合成的转基因酿酒酵母(S.cerevisiae)YSC4515-98811386可提高GABA的产量,为了解该酿酒酵母GAD的相关情况,本试验对转基因酿酒酵母进行了培养、诱导、谷氨酸脱氢酶的分离纯化及其活性的研究。

1 材料

1.1 菌种

酵母菌(S.cerevisiae,YSC4515-98811386,ORF Name为YOR120W),由日本爱媛大学生化学研究室-70℃超低温冷冻室提供。

酵母提取物及胰蛋白胨(3×YP)+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基,自制。

1.2 仪器

ProfiniaTM蛋白质纯化系统(Bio-Rad)、紫外分光光度计(岛津的UV-1800型)、离心机、细胞破碎仪、SDS-PAGE电泳仪,均由日本爱媛大学生物化研究室提供。

2 方法

2.1 菌种的活化及生长情况

将S.cerevisiae放入28℃普通培养基中激活培养24 h,然后将激活培养的酵母菌分别接种到3×YP+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基中培养,并分别测定5,10,19,24,29,34,42,47,52,66小时的OD600值,并绘制生长曲线值。

2.2 S.cerevisiae的收集

取1个培养基中的液体30 m L置于离心管中3 000 r/min离心5 min;吸取上清液,在沉淀中加入生理盐水再次离心(3 000 r/min,5 min),重复3次将酵母菌洗净,备用。

2.3 融合蛋白的纯化

将上步悬浊液粉碎10 min后沉淀离心,通过ProfiniaTM蛋白质全自动高速纯化,获得融合蛋白。

2.4 SDS-PAGE电泳

将分离出的产物即融合蛋白进行SDS-PAGE电泳,90 min TE ORIOLE荧光染色,将凝胶通过紫外线照射仪观察并拍照。

2.5 酶活力的测定

取2支离心管,向其中分别加入0.4 m L纯化水和0.4 m L PLP(10 mmol/L),各加入酵素液(纯化的蛋白质50μL+纯化水150μL)0.2 m L,于37℃培养10 min;再分别加入谷氨酸(10 mmol/L)-酒石酸钠(100 mmol/L)缓冲液(p H值为4.5[12])1.4 m L,于37℃反应0,0.5,1,2,3 h;分别取2.0 m L于离心管中,于4℃、15 000 r/min离心10 min;取上清液1.5 m L,用柠檬酸钠缓冲液(p H值为2.2)稀释10倍,过滤器过滤,置于600μL的氨基酸分析系统进行分析。

3 结果与分析

3.1 S.cerevisiae在不同培养基中的生长情况

S.cerevisiae分别在3×YP+6%棉子糖液体培养基和3×YP+6%半乳糖液体培养基中培养。其中在3×YP+6%棉子糖液体培养基中酵母菌的含量是最高的,所有培养基中的酵母菌在50小时左右都达到了一个生长的高峰,由此可知该种酵母菌最适培养基为3×YP+6%棉子糖液体培养基。见表1。

3.2 GAD的分离纯化结果

以ProfiniaTM低压液相色谱纯化后可知,在3×YP+6%半乳糖液体培养基的酵母菌基因表达产物较3×YP+6%棉子糖液体培养基的显著,见图1、图2。

3.3 棉子糖与半乳糖诱导表达GAD的结果

由棉子糖诱导的S.cerevisiae没有纯化到GAD,见图3。由半乳糖诱导的S.cerevisiae得到GAD,经SDS-PAGE凝胶电泳检测可知分子质量为67 ku,见图4。

3.4 PLP对S.cerevisiae GAD活性的影响

经过600μL的氨基酸分析系统自动分析,表示出L-Glu与GABA含量变化关系来间接反映PLP对S.cerevisiae GAD活性的影响,说明PLP对GAD活性有一定的活化作用,见图5、图6。

A.棉子糖培养原液;B.Wash-1;C.Wash-2;D.纯化物。

A.半乳糖培养原液;B.Wash-1;C.Wash-2;D.纯化物。

4 讨论

试验对S.cerevisiae GAD的纯化以及酶学性质进行了初步的研究,通过反复清洗、离心,利用ProfiniaTM蛋白质纯化系统从酿酒酵母细胞中有效纯化到GAD。结果表明,3×YP+6%半乳糖培养基能够诱导重组酵母表达产生GAD的目的基因。通过SDS-PAGE检测其GAD分子质量为67 ku,该数值相对于GAD氨基酸分子序列的标准值(65.897 ku)偏大,可能是其中存有其他蛋白质导致。GAD是一种依赖于吡哆醛的脱羧酶,PLP对GAD的活性来说是必须的,图5和图6显示了额外的添加PLP对酿酒酵母S.cerevisiae GAD活性的影响,结果表明,PLP对GAD的活性有一定的促进作用,原因可能是S.cerevisiae GAD与辅酶PLP紧密整合形成相对于更加完整的GAD,进而增加其活性[13]。本试验结果为进一步研究酿酒酵母YSC4515-98811386 GAD的构象、酶学性质以及与PLP的相互作用机制打下基础。

M.标准物;1.培养液;2.粗制的GAD;3.纯净水对照;4.纯化的GAD。

M.标准物;1.酵素液;2.培养液;3.粗制的GAD;4.纯净水对照;5.纯化的GAD。

摘要：为了了解酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)谷氨酸脱羧酶(GAD)的情况,分别用酵母提取物及胰蛋白胨(3×YP)+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基进行诱导培养,粉碎破碎酵母,采用ProfiniaTM蛋白质纯化系统纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子质量,同时研究了磷酸吡哆醛(PLP)对酿酒酵母谷氨酸脱羧酶(S.cerevisiae GAD)活性的影响。结果表明:转基因酿酒酵母在28℃振动培养47 h,3×YP+6%棉子糖培养基OD600值为7.4,3×YP+6%半乳糖培养基OD600值为6.8。棉子糖诱导的酿酒酵母没有表达目的基因,没有纯化到GAD;相反,半乳糖诱导的酿酒酵母表达了目的基因,纯化到了GAD,其分子质量为67 ku。PLP对GAD的活化作用较显著。

关键词：酿酒酵母(S.cerevisiae),谷氨酸脱羧酶(GAD),纯化,γ-氨基丁酸,酶活力,磷酸吡哆醛(PLP)

谷氨酸脱羧酶 篇2

关键词：γ-氨基丁酸,谷氨酸脱羧酶,屎肠球菌,鉴定

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸。GABA在中枢神经系统是一种主要的抑制性神经递质,具有安神抗抑郁、调节激素分泌、改善脂质代谢和降血压等重要的生理功能[1],近年来GABA 在食品中的研究和应用受到广泛关注。

GABA的生物合成主要是利用微生物的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)催化L-谷氨酸发生α-脱羧生成GABA。乳酸菌是人和动物肠道正常菌群,广泛用于发酵食品的生产,是对人体安全的食品微生物。寻找具有高谷氨酸脱羧酶活力的优良乳酸菌株,利用其生物合成食品级GABA或开发富含GABA的食品及保健品,具有良好的应用前景。已有文献报道乳球菌属(Lactococcus)[2,3]、链球菌属(Streptococcus)[4]和乳杆菌属(Lactobacillus)[5,6,7,8]等属的一些乳酸菌具有合成GABA的能力,但尚未见有屎肠球菌(Enterococcus faecium)产GABA的报道。本文从发酵食品中筛选和鉴定了一株产GABA的屎肠球菌(Enterococcus faecium),并报道了其GAD粗酶的酶学性质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

腌制橄榄菜、豆豉和生牛奶均购自潮州市菜市场,自然发酵泡菜为自制。

1.1.2 试剂

γ-氨基丁酸(minimum 99.0%)为Sigma产品;色谱纯试剂为美国Tedia 和 Honeywell International INC 公司产品; DNA纯化试剂盒为购自天为生物技术公司,其他试剂为分析纯。

1.1.3 仪器

MJ Research公司PTC-100TM PCR仪;Agilent 1100 Series高效液相色谱(XDB-C18柱,15cm×4.6mm,5μm);SIGMA2-16离心机;宁波新芝UY92-2D超声波细胞粉碎机。

1.1.4 培养基[9]

MRS、M17培养基、SL培养基、番茄汁培养基、脱脂牛乳培养基、LB培养基。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离

取橄榄菜、生牛奶、豆豉和泡菜(固体样品预先破碎,菌较少样品预先用适当培养基富集),于无菌生理盐水10倍梯度稀释。取合适稀释度的稀释液1mL分别注入无菌培养皿中,以无菌操作倾倒入已加入1% CaCO3熔化的MRS琼脂培养基(预冷至50℃以下),摇匀,待培养基凝固后,倒置于32℃培养箱中培养48h。挑取周围有CaCO3的溶解圈的菌落,于MRS平板上划线纯化。取纯化后菌落,涂片革兰氏染色,镜检,保留革兰氏阳性的菌株,于脱脂牛乳培养基保藏。

1.2.2 产GAD乳酸菌的筛选

取待筛选的菌株于MRS液体培养基活化18~24h。分别吸取1ml经活化的菌液至100ml MRS培养中,于32℃培养24h。将培养物在4℃于8 000r/min离心15min收集菌体,再用0.9%(W/V)的生理盐水洗涤2次。在1g湿菌体中加入1g/100mL L-谷氨酸钠(溶于0.2mol/L pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液中) 10mL,混匀,于40℃转化1h,离心取上清液,得转化液。

采用纸层析法对转化液定性分析,用10mmol/L GABA标准溶液和1%谷氨酸钠溶液作对照,展程15~18cm。展开剂组成为:正丁醇∶冰醋酸∶水=12∶3∶5(V:V:V),在配好的展开剂中加入0.4%(W/V)的茚三酮。展开后于90℃下显色10min。具有与GABA标样迁移率一致的斑点的待测样品,定性为具有产GABA活性的菌株。参照文献[10]采用高效液相色谱法对转化液中的GABA进行定量分析。

1.2.3 形态培养特征及生理生化特征实验

形态、培养及基本生理特征实验参照文献[9,11]。生化特征实验采用法国梅里埃vitek 32微生物自动鉴定系统鉴定。

1.2.4 16S rDNA序列比对及系统发育分析

PCR引物设计:正向引物为16SF:5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′,反向引物为16SR:5′-CTACG GCTAC CTTGT TACGA-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

16S rDNA的扩增参照文献[12,13],用DNA纯化试剂盒将PCR产物纯化,由上海生工公司测序。将16S rDNA序列与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中的核苷酸序列进行同源性分析,利用BioEdit7.0.0 软件的Clustal W程序进行多重比对,然后利用Clustal X1.8软件采用Neighbour-joining方法以E.coli O157∶H7为外群(outgroup)构建系统发育树,并进行bootstrap分析,重复次数为1 000次。

1.2.5 粗GAD制备

将湿菌体3g悬浮到30mL pH 5.0的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中,内含0.01mmol/L 5′-磷酸吡哆醛(PLP),1mmol/L二硫苏糖醇,冰浴中超声波破碎(400W,工作5s, 间隔15s,全程90min),4℃放置过夜,4℃离心收集上清液(8 000g, 20min),作为GAD粗酶液。

1.2.6 GAD活力测定

GAD酶反应体系总体积400μL,其中GAD粗酶液100μL,L-Glu溶液(pH 4.5, 40mmol/L,含0.02mmol/L PLP)100μL,pH 4.5的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液200μL。混合后于40℃反应4h,加入4倍体积预冷的-20℃无水乙醇终止反应,然后参照文献[10]采用高效液相色谱法测定GABA。在测定条件下1h生成1μmol GABA所需酶量定义为1个酶活力单位(U)。以相对酶活(%)比较不同处理的GAD活力大小。每组实验重复5次。

2 结果

2.1 生物合成GABA乳酸菌的分离筛选

从发酵食品中分离到124株革兰氏阳性、接触酶阴性菌株,初步确定为乳酸菌。待测乳酸菌经菌体细胞转化Glu,转化液纸层析定性检测,有8株菌转化液样与GABA标准有相同的迁移率,说明这些菌株产GABA。定量测定转化液中GABA的含量,结果(图1)表明,在8株产GABA菌株中,HS3转化液中GABA含量最高。35℃、pH4.5 转化1h,转化液中GABA达2.596±0.048 g/L。

2.2 菌株HS3的鉴定

2.2.1 形态特征

菌株HS3在MRS平板上生长24h,菌落直径1~2mm,菌落白色,表面光滑隆起、呈圆形、菌落边缘整齐。革兰氏染色观察,细胞呈卵圆形,大多数呈对排列或短链排列,极少见呈长链,革兰氏阳性,无芽孢,菌体直径约为1μm。

2.2.2 菌株HS3培养及生理生化特征

参照文献[9,11]进行培养及生理特征实验,生化特征由vitek 32鉴定系统鉴定,结果如表1所示,各项特征符合文献[9,11]关于Enterococcus的描述,初步鉴定菌株HS3属于肠球菌属(Enterococcus)。

2.2.3 16SrDNA序列比对及系统发育分析

以菌株HS3的总DNA为模版,利用细菌16S rDNA通用引物16SF和16SR进行PCR扩增,经电泳分析,扩增产物大小在1.5kb左右。经上海生工生物工程技术服务有限公司测序,菌株HS3的16S rDNA序列为1 427 kb,已在GenBank中登记,[NCBI]登记号为FJ851687。将菌株HS3的16S rDNA序列与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中报道的16S rDNA核苷酸序列进行比对,菌株HS3与Enterococcus faecium(EU717962)的16S rDNA序列相似度达99%,可以鉴定菌株HS3为Enterococcus faecium。

注Note:+,表示阳性Positive;-,表示阴性Negative。

根据菌株HS3的形态特征、生理生化特征以及其16S rDNA核苷酸序列的比对结果,选择E. coli O157:H7为外源,以接触酶阴性、革兰氏阳性、菌体呈成对或链状排列的各个属模式种和部分报道产GABA的细菌与菌株HS3以16S rDNA核苷酸序列为基础构建系统发育树(图3)。从图3可见,菌株HS3与Enterococcus faecium(EU717962)位于同一簇群,亲缘关系最近,在1000次bootstrap分析中完全支持该分枝,有很高的稳定性。因此进一步证实菌株HS3为Enterococcus faecium。

分枝节点数值表示1000次bootstrap分析所支持次数;线段(0.01)表示0.01序列差异的分枝长度。Eachnumberonabranchindicatesthebootstrapconfidencevalues(1000replicates).Thescalebarindicates 0.01substitutionspernucleotideposition.

根据上述16SrDNA序列比对及系统发育分析,结合形态特征、培养及生理生化特征,对照文献[9,11]鉴定菌株HS3为屎肠球菌Enterococcus faecium。

2.3 菌株HS3 GAD粗酶的性质

2.3.1 温度对菌株HS3 GAD酶活的影响

在不同温度下测定GAD酶活力,结果(图4)显示菌株HS3 GAD酶活力随温度的变化波动较大。GAD酶最适反应温度为40℃,酶相对活力在35℃和40℃之间的差别不大。当温度超过40℃时酶活迅速下降,60℃时酶活力残余仅为25.91%。将GAD酶液在不同温度保温4h,再于40℃测定酶活力,结果表明菌株HS3 GAD的热稳定较好,50℃以下处理酶活力损失不大,50℃以上处理酶活损失严重,70℃时GAD完全失活。

◇温度对菌株HS3粗GAD酶活的影响;◆温度对菌株HS3粗GAD稳定性的影响。◇EffectsoftemperatureonthereactiveactivityofthecrudeGAD from StrainHS3;◆EffectsoftemperatureonthestabilityofcrudeGAD from StrainHS3.

2.3.2 pH对菌株HS3 GAD酶活的影响

在不同pH值(3.5~6.5)的缓冲体系中测定酶活力,菌株HS3 GAD酶最适pH值为4.5,在pH4.0~5.0范围内,酶的相对活力都在90%以上,pH高于5.0时酶活力呈现出较为显著的下降趋势,当pH为5.5,相对酶活力仅为14.15%。GAD在不同pH条件下40℃处理4h后测定酶活力,pH3.5~6.0范围内,酶活力相对稳定,pH高于6.5,酶活下降较快。说明菌株HS3 GAD酶可耐受的pH值范围较宽。

◇pH对菌株HS3粗GAD反应活性的影响;◆pH对菌株HS3粗GAD稳定性的影响。◇EffectsofpH onthereactiveactivityofthecrudeGADfrom StrainHS3;◆EffectsofpH onthestabilityofcrudeGAD from StrainHS3.

2.3.3 金属离子对菌株HS3 GAD酶活的影响

在酶反应体系中分别加入5mmol/L和50mmol/L不同种类的金属离子测定酶活力,如图5所示,金属离子对GAD酶活影响较大。当金属离子浓度为5mmol/L时,Ca2+、Ba2+和Zn2+对GAD有明显激活作用,Mg2+、K+和Na+的影响不大,Co2+和Mn2+使酶活稍有下降,Hg2+、Cu2+、Pb2+、Fe2+和Fe3+对酶活有强烈的抑制。当金属离子浓度为50mmol/L时,Mg2+和Ca2+有激活作用,Ba2+对酶活的影响不大,Zn2+、Co2+、Mn2+、K+和Na+对酶活有不同程度的抑制作用,Hg2+、Cu2+、Pb2+、Fe2+和Fe3+使GAD几乎完全失活。以上结果表明,Ca2+在两个实验浓度对GAD酶活都有激活作用,酶活分别提高了37.41%和17.43%,Ba2+和Zn2+在低浓度对酶激活较好,Mg2+在高浓度有激活作用。

3 讨论

乳酸菌GAD 最适作用温度与最适生长温度较为接近,屎肠球菌HS3的GAD最适温度为40℃,符合其生长温度条件[5,6,7,8]。细菌GAD的最适pH一般在3.5~5.5之间[14],而已报道的乳酸菌GAD最适pH在4.0~5.0[5,6,7,8,15],菌株HS3 GAD最适pH4.5与文献报道的一致。与乳杆菌属(Lactobacillus)[6,7]和乳球菌属(Lactococcus)[15] 的乳酸菌GAD相比,屎肠球菌HS3 GAD在较宽的pH范围(3.5~5.0)内酶活维持稳定,并且其GAD可耐受的pH值范围也较宽。细菌细胞内的GAD酶系统是细菌对酸性环境的应激反应,维持体内pH稳态的机制之一[16]。当菌体处于酸性环境时,细菌通过GAD酶的脱羧反应消耗体内的H+,从而维持体内pH稳定。肠球菌(Enterococcus)有较强的抗逆性,对酸性环境有较强的耐受能力,这可能是菌株HS3 GAD在较宽的酸性pH范围(3.5~5.0)内维持高活力的原因。

谷氨酸脱羧酶 篇3

尸胺是赖氨酸脱羧的产物, 已有技术可以将尸胺精炼后和己二酸共聚合成为具有实用性的尼龙56[2]。现今尼龙生产主要是以石油中提炼出的己二胺及己二酸为原料。目前面临石油价格猛涨以及今后将面临的石油枯竭, 寻找新的己二胺替代物迫在眉睫。尸胺是很好的己二胺替代品, 可以通过微生物合成, 有可再生能力, 具有很好的应用前景。此外, 尸胺可以作为第二信使调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育, 外源施加尸胺可以改善坐果和促进果实发育[3,4,5]。尸胺可以利用微生物细胞内的赖氨酸脱羧酶使L-赖氨酸脱羧而获得。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

蜂房哈夫尼菌 (Hafnia alvei AS 1.1009) , 北京微生物研究所提供。

1.1.2 仪器

SKW-3型微量呼吸检压仪 (瓦勃氏呼吸仪) 。

1.1.3 培养基

种子培养基 (%) 蛋白胨1, 牛肉浸膏0.5, NaCl 0.5, 玉米浆 0.5, pH7.2。

优化前发酵培养基 (%) :蛋白胨1, 牛肉浸膏0.5, NaCl 0.5, 维生素B6 0.5, L-赖氨酸0.5, pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶培养

自斜面取1环菌接入装有30mL种子培养基的三角瓶中, 35℃、170r/min震荡培养12h。以5%的接种量接入250mL三角瓶装有30mL发酵培养基中, 菌体生长阶段:35℃, 旋转式摇床170r/min振荡培养11h;诱导阶段:将pH调至5.5, 35℃静置培养7h。

1.2.2 赖氨酸脱羧酶活力测定:

采用瓦勃氏呼吸仪测定脱羧产生的CO2的方法。

含L-赖氨酸转化液的配制:1g L-赖氨酸溶解于0.2mol/L pH5.0乙酸-乙酸钠缓冲液100 mL中, 然后滴加数滴吐温-80, 供转化反应用。

酶活力测定:取1mL发酵液, 离心10min (5 000×g) , 用0.2mol/L pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液重悬, 取0.5mL加入反应瓶侧臂中, 保温震荡后与底物混合进行反应, 1h后读取测压管读数。以脱羧所形成的CO2来表示酶的活力, 即一个酶活力单位定义为:在反应温度为37℃时, 在pH 5.0的0.2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液体系中1h转化1μmol L-赖氨酸为CO2的酶量。

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式中:ΔV=ΔV2×K2-Δh1×K1, h1-对照瓶初读数, mm液柱;h2-样品瓶初读数, mm液柱;K1-对照反应瓶常数, μL/mm液柱;K2-样品反应瓶常数, μL/mm液柱;k-被测菌液稀释倍数;T为转化反应时间 (h) (将转化时间选定为1 h) 。以下每次试验重复3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 碳源对产酶的影响

碳源是培养基的主要成分之一, 是合成菌体成分的原料, 也是微生物获取能量的主要来源。试验中考察了以上述培养基为基础, 分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉等四种不同碳源, 各碳源添加浓度均为2%, 考察各碳源对产赖氨酸脱羧酶的影响, 结果见图1。从图1可知, 以葡萄糖为碳源时的酶活力最高, 达到35.96U/mL。

2.1.2 葡萄糖浓度对产酶的影响

由试验确定的葡萄糖为最佳碳源后, 在浓度为1.0%～4.0%之间调整葡萄糖浓度, 其它培养条件不变, 并测定酶活, 结果如图2所示。由图2可以看出, 葡萄糖浓度为2%时酶活达到最高, 继续提高糖浓度, 菌体产酶能力迅速下降, 表明高浓度的葡萄糖, 可能会因渗透压过高, 不利于菌体的生长及产酶。

2.1.3 不同氮源对产酶的影响

氮源主要用来构成菌体细胞物质和代谢产物。试验中考察了在上述优化好的碳源基础上将1%的蛋白胨和0.5%的牛肉膏替换成分别加入1.5%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、 (NH4) 2SO4、NH4NO3等六种不同氮源对菌体产酶的影响, 结果如图3所示。由图3可以看出, 采用1.5%的酵母膏为氮源时的酶活力最高达76.42U/mL, (NH4) 2SO4、NH4NO3等无机氮源发酵时, 酶活力较低, 这表明大多数迅速利用的无机氮源对菌体产酶存在氮分解代谢物阻遏作用。

2.1.4 不同酵母膏浓度对产酶的影响

酵母膏中含有丰富的氨基酸和生长因子, 因而是一种良好的氮源。本试验对不同浓度的酵母膏进行考察, 结果如图4所示。由图4可知, 采用2%酵母膏浓度时, 酶活力最高, 为92.7U/mL, 浓度大于2%时, 菌体产酶能力缓慢下降。

2.1.5 MgSO4浓度对产酶的影响

Mg2+为许多酶的激活剂, 考察了不同浓度MgSO4对酶活的影响, 结果如图5所示, 由图5可以看出, 当硫酸镁的浓度为0.03%时酶活最高, 达到126.45U/mL, 当浓度达到0.1%时酶活降低, 证明高浓度的Mg2+对酶活起抑制作用。

2.1.6 KH2PO4浓度对产酶的影响

磷酸盐除用于维持pH和渗透压外, 也是重要的能量传递者, 同时磷还可以改变菌体的能荷状态。因此试验中考察了不同浓度的KH2PO4对酶活的影响, 结果见图6。由图6可以看出, 当其浓度为0.01%时酶活力最高138.34U/mL。KH2PO4浓度过高会阻遏酶的生成, 表现出酶活力降低。

2.1.7 NaCl浓度对产酶的影响

NaCl对维持菌体渗透压起着重要作用, 考察不同浓度NaCl对酶活的影响, 结果如图7所示, 由图7可以看出, 当NaCl浓度为0.3%时酶活最高为146.12U/mL。

2.1.8 VB6加入量对酶活的影响

培养基中添加不同浓度的VB6, 考察其对酶活的影响, 结果如图8所示。由图8可以看出, 维生素B6对酶活的影响显著, 在VB6为0.1%时酶活最高, 可达到160.62U/mL。这是因为磷酸吡哆醛 (VB6) 是L-赖氨酸脱羧酶的辅酶, 对脱羧反应有很强的促进作用。不添加VB6时也有酶活, 是由于天然培养基成分中本来就含有一定量的VB6, 超过1%时酶活略有下降。

2.1.9 生长因子——玉米浆浓度对产酶的影响

玉米浆中通常含有一定量的生物素, 而加适量的生物素对细胞膜通透性有一定的影响。试验中考察了不同玉米浆浓度对产酶的影响, 结果如图9所示。由图9可知, 当玉米浆浓度小于4%时, 随着培养基中玉米浆浓度的提高, 菌体的脱羧酶活力逐步提高。玉米浆浓度为4%时, 酶活力可达180.85U/mL, 增加玉米浆浓度, 菌体产酶下降。其原因在于高浓度的玉米浆对脱羧酶的产生存在氮分解代谢物阻遏。

2.2 Plackett-Burman试验设计筛选对酶活影响显著的因素

选用N=12的Plackett-Burman试验, 对赖氨酸脱羧酶产酶培养基中的8个因素进行考察。每个因子取高 (1) 低 (-1) 两个水平, 各参数及其水和平方差分析结果见表1。由表1可知, 产酶培养基显著影响 (置信度大于96%) 的因素有酵母膏、玉米浆和葡萄糖。其中三个因素对酶活都呈正效应。这三个因素对产酶的影响可用方程:Y1=164.2608+0.299167X1+9.4175X2+8.015833X3-0.1225X4+4.089167X5-2.145833X6+0.495833X7-2.805833X8表示。该方程的决定系数R2为99.28%, 表明该回归方程拟合良好。

2.3 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman法筛选出的显著因子效应大小设计他们的步长, 进行最陡爬坡试验设计, 寻找最大产酶区。试验设计及结果如表2所示。由表2可知, 培养基最佳成分在0+2△和0+3△之间, 故以0+2△的条件作为响应面实验因素水平中心点。

2.4 Box-behnken设计统计分析结果

根据最陡爬坡试验确定的中心点, 进一步进行Box-Benhnken实验。其中在影响赖氨酸脱羧酶酶活的8个因素中, 酵母膏、玉米浆和葡萄糖对酶活的影响最为显著, 因此在Box-Benhnken实验中主要对三者的最佳添加量进行优化。

Box-Benhnken实验组和设计对影响赖氨酸脱羧酶酶活的关键因素进行15组试验, 来寻求上述三个因素的最佳添加量。实验因素水平及编码如表3所示, 试验设计及结果如表4所示。

利用Statistica软件, 对Box-behnken实验结果进行二次多项回归拟合, 获得酵母膏、玉米浆和葡萄糖浓度的多元二次回归方程:

Y=180.3633+10.06625X1+2.22875X2+3.9775X3-6.179157Xundefined-1.305X1X2-4.1875X1X3-5.329167Xundefined-5.5125X2X3-4.176667Xundefined

式中Y是赖氨酸脱羧酶的酶活 (U/mL) , X1、X2、X3分别为葡萄糖、酵母膏和玉米浆添加量。从该方程的方差分析表 (表略) 可知, 本试验所采用的模型高度显著, Radj2值为0.9165, 表明酶活的91.65%的变异分布在方程的9个因子中, 总变异中仅有8.35%不能由模型解释, R2值为97.02%, 表明酶活的预测值和实际值之间具有较好的拟合度。该模型可用于预测蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶酶活的实际情况。

将回归方程 (1) 分别对其自变量 (X1、X2、X3) 求一阶偏导并均令其为0, 即可得到一个三元一次方程组, 通过借此方程组得到比酶活的最大值和对应的极值点。极值点为X1=0.035, X2=0.4013, X3=-0.05515, 相当于三者的最适浓度分别为葡萄糖1.84%, 酵母膏2.20%, 玉米浆3.66%。

2.5 拟合优化的验证

在上述求得的最优条件下, 预测酶活的最高值, 验证试验的设计及结果见表5。由表5可知酶活的预测最高值为204.53U/mL。为了验证模型的准确性和有效性, 在预测最优条件下进行发酵试验, 得到酶活为203.14±0.2U/mL (试验重复3次, 3次试验结果分别为202.16U/mL、204.08U/mL、203.18U/mL, 进一步证明了该模型能准确预见实际发酵情况。

3 讨论

石油价格不断增长并在不久的将来可能面临枯竭, 这使许多原料依赖石油的化工生产必须寻找石油代替品。微生物具有培养方便, 快速繁殖, 可再生等诸多优点, 成为很多化工原料理想的“生产者”。作者以赖氨酸这种微生物代谢产物为原料, 利用微生物的赖氨酸脱羧酶将其转化成合尸胺。目前一些日本学者在从事此方面的研究, 并取得一定成果, 国内关于此方面研究极少, 此课题在实验室水平上初步探讨生产尸胺的方法, 为今后我国拥有自主知识产权的尸胺工业化生产技术奠定基础。酶活达到203.14U/mL, 比优化前的比酶活提高28.9倍。

参考文献

[1]David Gani.A structural and mechanistic comparison of pyridoxal 5’-phos-phate denpendent decarboxylase and transaminase enzymes[J].Biological Sci-ences, 1991, 1263 (332) :131-139.

[2]Nishi Kiyohiko, Endo Shuichi, Mori Yukiko, et al.Method for producingcadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon[P].EP:20040010711, 2004-12-01.

[3]陈学好, 于杰, 李伶利.高等植物开花结实的多胺研究进展[J].植物学报, 2003, 20 (1) :36-42.

[4]刘宽灿, 梁秋芬, 赵丽红, 等.多胺在植物生长发育过程中的生理作用[J].氨基酸和生物资源, 2005, 27 (1) :22-26.

[5]王晓云, 邹琦.多胺与植物衰老关系研究进展[J].植物学通报, 2002, 19 (1) :11-20.

[6]蒋丽丽, 吴晓燕, 刘毅, 等.赖氨酸脱羧酶发酵工艺及其酶学性质[J].精细化工, 2006, 23:1060-1067.

谷氨酸脱羧酶 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 底物

由蛋白胨0.5%、酵母膏0.3%、赖氨酸1%、0.2%BCP 5 ml构成、调p H值为p H 5.0~5.3、分装成0.5 ml/支, 115℃高压蒸汽灭菌10 min, 放冰箱中保存备用。

1.1.2 Vitamin B6水溶液

含0.1%Vitamin B6水溶液, 用0.2μm滤器过滤除菌备用。

1.1.3 实验菌株

肠道致病菌及条件致病菌115株, 其中标准菌株11株, 来自中国科学院微生物研究所, 其余104株从临床的腹泻便、食品、水及环境样品中分离, 均经过API 20E鉴定系统或按《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定。

1.1.4 质控菌株

阳性菌株-产气肠杆菌ATCC49701, 阴性菌株-阴沟肠杆菌CMCC43501。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

取18~24 h的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物, 用5.0 ml吸管吸取3~5 ml稀释液加入斜面试管内, 反复吹吸, 洗下菌苔, 将洗液制成1×109~5×109CFU/ml菌悬液。

1.2.2 接种与结果判定

将菌悬液加到0.5 ml底物中, 再加入1滴Vitamin B6水溶液, 混匀后, 上面滴加1层无菌液体石蜡, 约0.5 ml, 37℃培养1~2 h判定结果。底物由黄色变紫或深紫色为赖氨酸脱羧试验阳性, 底物仍为黄色或黄褐色为赖氨酸脱羧试验阴性。同时以常规法作对照, 用标准菌株质控。

2 结果

2.1 赖氨酸脱羧试验底物微量快速法的敏感性和符合性

赖氨酸脱羧试验是观察细菌脱羧酶将氨基酸的羧基脱出形成胺和二氧化碳, 从而使培养基变成碱性的能力。Vitamin B6是脱羧基的一种辅酶, 可加快氨基酸代谢。赖氨酸脱羧试验底物微量快速法应用Vitamin B6作为赖氨酸脱羧试验的辅酶以提升赖氨酸脱羧试验反应速度, 通过对肠杆菌科的埃希菌属、哈弗尼亚菌属、克雷伯菌属、沙门菌属、沙雷菌属、志贺菌属、变形杆菌属及肠杆菌属等8个菌属115株细菌进行该试验。同时以常规法作对照[2], 用标准菌株质控。赖氨酸脱羧试验底物微量快速法37℃培养1~2 h, 即可准确判断结果, 而常规法需培养24 h读结果, 因此, 快速法具有较高的敏感性, 并且与常规法24 h培养结果相一致, 符合率达到100%。结果见表1。

2.2 赖氨酸脱羧试验底物微量快速法的稳定性观察

将质控合格的底物和辅酶置4~8℃条件下保存。用质控菌株 (质控菌株:阳性菌株-产气肠杆菌ATCC49701, 阴性菌株-阴沟肠杆菌CMCC43501) 对新配置和保存的底物、辅酶进行质控, 每月质控1次, 连续作6次。结果显示, 在4~8℃条件下保存的底物、辅酶与新制备的底物、辅酶试验结果一致, 符合率达100%。因此, 认为该底物和辅酶在4~8℃条件下可保存6个月。

3 讨论

赖氨酸脱羧试验可用于鉴别菌属如爱德华菌属、沙门菌属、亚利桑那菌属与弗氏柠檬酸菌属;区别不产气、无动力的大肠埃希菌与志贺菌属;还用于鉴别菌种如产气肠杆菌、蜂房哈弗尼菌与阴沟肠杆菌以及成团肠杆菌;用于侵袭性大肠埃希菌和沙门菌属的初筛[3]。因此, 赖氨酸脱羧试验在鉴定肠杆菌科细菌中具有广泛的应用价值。笔者研究建立的赖氨酸脱羧试验底物微量快速法, 将待检菌悬液加到0.5 ml底物中, 再加入1滴辅酶, 混匀后, 滴加1层无菌液体石蜡, 37℃培养1~2 h即可快速准确的判定结果。该方法可缩短检测时限, 操作简捷, 成本低廉, 便于推广使用。

摘要：目的 探讨赖氨酸脱羧试验底物微量快速法的建立与应用。方法 采用赖氨酸脱羧试验底物微量快速法、常规方法对肠道致病菌及条件致病菌共115株进行赖氨酸脱羧试验的敏感性和符合性试验。结果 赖氨酸脱羧快速试验法37℃培养12 h, 即可准确判断结果, 而常规法需培养24 h读结果。因此, 快速法具有较高的敏感性, 并且与常规法24 h培养结果相一致, 符合率达到100%。结论 该方法可缩短检测时限, 操作简捷, 成本低廉, 便于推广使用。

关键词：赖氨酸脱羧酶,底物微量,快速,试验

参考文献

[1]王唐晋.现代临床检验学[M].第2版.北京:人民军医出版社, 2007:687-688.

[2]中华人民共和国卫生部.GB/T 4789-2008食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验[S].北京:人民卫生出版社, 2008.