蛋氨酸合成酶（精选9篇）
蛋氨酸合成酶 篇1
摘要：本实验考察了物料比、反应温度和时间对天冬氨酸合成的影响。该实验采用正交实验,以产率为指标优化实验,得到最佳实验条件为:顺丁烯二酸:氨=1:5,反应温度150℃,反应时间5h,产率73.4%。该实验为工业化合成天冬氨酸奠定了一定的基础。
关键词：天冬氨酸,合成,正交设计实验
前言
天冬氨酸又称氨基丁二酸,是一种常见的、重要的氨基酸。其左旋体L-天冬氨酸广泛用作氨解毒剂,肝机能促进剂和疲劳恢复剂等医药品,也用于各种清凉饮料添加剂的生产,还可作为生化试剂,培养基和有机合成中间体[1]。工业上主要采用生化方法生产L-天冬氨酸:在酶作用下,将富马酸与氨加成生产天冬氨酸。文献报道[2],采用化学法主要生成外消旋体,但一直未发现有效的拆分方法。近年来,人们发现将天冬氨酸聚合生成的聚天冬氨酸可以用作分散剂、阻垢剂、缓蚀剂、洗涤助剂等。同传统商品相比,聚天冬氨酸的效用好,而且具有极高的生物降解性,属于绿色化学品[3,4,5]。因此,开发高效的化学合成法是大规模生产聚天冬氨酸的关键[6]。
本文以顺丁烯二酸和氨水为主要原料合成了天冬氨酸,对物料比、反应温度以及反应时间进行了研究,并提出了切实可行的优化方案。
1 天冬氨酸的合成方法
国外文献报道的制备方法主要有两种。一是由顺丁烯二酸、氨气等为原料,分别以二氧六环、二甲苯为溶剂进行一系列反应,最后催化加氢合成天冬氨酸;第二种方法是以丙二酸二乙酯、醋酸、亚硝酸钠为原料进行一系列反应来合成[3]。这两种方法工艺流程均特别长,大规模工业化生产有一定的困难。
2 实验
2.1 试剂与仪器
试剂:顺丁烯二酸;氨水;盐酸。
仪器:不锈钢反应釜;电子分析天平;pH计;烘箱。
2.2 天冬氨酸的合成
将顺丁烯二酸和氨水按一定的比例加入到不锈钢反应釜中,把反应釜放进设置一定温度的烘箱中反应一定的时间,冷却后排出氨气,调节pH,析出固体,过滤,干燥,得到天冬氨酸。
选取对合成效率影响较大的几个因素:物料比、反应温度和时间分别进行单因素试验。
根据单因素试验,对以上因素分别取2水平,并制定因素水平表,如表2-1所示。
3 结果与讨论
3.1 物料比对天冬氨酸合成的影响
在相同的温度下,分别采用不同的物料比进行反应,相同的时间后处理,称量所得的天冬氨酸。不同的物料比对产率的影响结果如图3-1所示。
由图3-1可以看出,在物料比1:3~1:5的范围内,产率随氨水用量的增大而迅速增大。当固液比达到1:5后产率增加缓慢。因此,从成本方面考虑,最适物料比为l:5。
3.2 反应温度对天冬氨酸合成的影响
分别在不同的温度110℃、130℃、150℃、170℃下,采用相同的物料比进行反应,相同的时间后处理,称量所得的天冬氨酸。不同的反应温度对产率的影响结果如图3-2所示:
由图3-2可以看出,从110℃~150℃,随温度升高,产率迅速升高,当温度达到150℃时产率增加缓慢。因此,最适温度为150℃。
3.3 反应时间对天冬氨酸合成的影响
在相同的温度下,采用相同的物料比分别反应3h、4 h、5 h、6 h后处理,称量所得的天冬氨酸。不同的反应时间对产率的影响结果如图3-3所示。
由图3-3可以看出,5小时之前,天冬氨酸的产率随反应时间的延长而迅速增加,5小时之后产率增加缓慢。因此,单因素实验的最佳反应时间为5小时。
3.4 优化实验
根据表2-1,选取L4(23)正交试验表进行试验。以产率Y作为综合评价指标,实验安排及分析结果见表3-1。
通过对表3-1产率试验结果的分析,影响最大的因素是a,即物料比对产率的影响作用最大。因素作用主次为:物料比>温度>时间,优化方案为a2b2c2,即选择物料比为1:5,反应温度为150℃,连续反应5 h后,可得到最多的天冬氨酸。
经过验证试验,即在最优合成条件下产率为73.4%。
由于物料比对合成天冬氨酸的影响最大,反应时间影响比较小。因此,在实际生产过程中,可根据实际情况适当的减少反应时间,以达到降低生产成本,提高经济效益的目的。
4 结论
本合成工艺采用顺丁烯二酸和氨水为原料合成了天冬氨酸。最佳工艺条件为顺丁烯二酸与氨水物质的量比为1:5,反应温度150℃,反应时间5 h,产品总产率达到了73.4%。
该合成工艺简单,易操作,生产成本低,基本无环境污染,适宜于工业化生产。
参考文献
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[6]马江权,冷一欣,周宏斌等.DL-天冬氨酸合成工艺研究[J].江苏石油化工学院学报,2000:8-11.
蛋氨酸合成酶 篇2
熔融法合成甘氨酸锌配合物及表征
以甘氨酸和乙酸锌为原料,采用熔融法合成了甘氨酸锌配合物,其合成的最佳工艺条件为:原料摩尔比n甘氨酸:n乙酸锌=2:1,在刚好熔融状态下,即反应温度大约在125℃左右,反应时间0.5h.所得产品的.产率达99%.并通过元素分析,红外光谱,X-射线粉末衍射,差热-热重等实验手段对该配合物的结构和成份进行了表征,确定其主要组成为Zn(NH2CH2COO)2.
作 者：张大飞 照日格图 乌云 萨嘎拉 嘎日迪 ZHANG Da-fei ZHAORI Getu WU Yun SA Gala GA Ri-di 作者单位：张大飞,ZHANG Da-fei(内蒙古集宁师范高等专科学校化学系,内蒙古,集宁,01)照日格图,乌云,萨嘎拉,嘎日迪,ZHAORI Getu,WU Yun,SA Gala,GA Ri-di(内蒙古师范大学化学与环境科学学院,内蒙古,呼和浩特,010022)
刊 名：化学世界 PKU英文刊名：CHEMICAL WORLD 年，卷(期)： 46(9) 分类号：O623.6 TQ225 关键词：甘氨酸锌配合物 熔融法合成 表征蛋氨酸合成酶 篇3
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是生物体内的一种重要活性中间体,参与转甲基等生化反应[1],对肝病、抑郁症等疾病具有显著治疗作用,在欧美等地已经作为药品或保健品上市。目前SAM的生产方法主要为微生物发酵法[2],具有周期长、纯化复杂等缺点,而体外酶促法则相对周期短、成本较低,具有良好的工业化前景。北京双鹭药业有限公司构建了能够高效组成型表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌,并以此为基础探索固定化酶体外酶促法制备S-腺苷甲硫氨酸的相关工艺。
本研究选取五种常用于固定化的树脂载体对SAM合成酶进行了固定化研究,从中筛选了一种固定化效果较好的载体进行固定化工艺优化,同时还考察了制备所得固定化酶的性质,为工业化大规模生产SAM提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
大肠杆菌工程菌(E.coli)JM109(pBV220-SAMS)由双鹭药业股份有限公司构建,经诱导表达、硫酸铵盐分级盐析获得浓缩粗酶液;实验所用的树脂均由南开和成科技有限公司(原南开大学化工厂)提供,具有不同的功能基。
1.1.2 试剂
牛血清白蛋白标准品,购自北京索莱宝科技有限公司;腺苷甲硫氨酸标准品,购自Sigma;甲醛为国产色谱纯,其他所用试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器
高效液相色谱仪(岛津10-AV plus);台式高速离心机(苏州威尔TGL-16);恒温气浴摇床(常州科迈ZD-85型);紫外可见分光光度计(岛津UV-2450);水平摇床(北京六一WD-9405B型)。
1.2 方法
每组实验各水平平行进行3次,取3次结果的平均值为该水平的结果。
1.2.1 固定化载体的选择
树脂的预处理:季铵型和伯胺型树脂载体均以热水溶胀洗杂,0.5mol/L HCl和0.5mol/L NaOH交替处理2个循环,水洗至中性,保存于缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH=7.0)中备用;环氧型树脂载体以乙醇溶胀洗杂,平衡后保存于缓冲液中。
吸附法:取一定量处理过的树脂,滤纸吸干水分,加入酶液及缓冲液,保温振荡;倾出上清并测定上清蛋白含量,所得固定化酶用缓冲液洗3～4次。
交联法:伯胺基型树脂除了可直接吸附固定化酶外,还可先用蛋白交联剂活化,再与酶分子交联。向处理好的树脂中加入4倍体积2%戊二醛,室温振荡过夜,水洗4～5遍至基本无戊二醛残留,缓冲液平衡4h,加入酶液及缓冲液,保温振荡;倾出上清,缓冲液洗3～4次。
酶的固定化率及表观酶活回收率计算公式为:
固定化率=(游离酶蛋白总量-固定化后上清蛋白总量)/游离酶蛋白总量
表观酶活回收率=固定化酶总酶活/游离酶总酶活
固定化载体的选择:在加酶量7.8U/g树脂,缓冲液50mmol/L Tris-HCl(pH=8),时间15h, 室温(25℃)的条件下进行。
1.2.2 酶的活力测定
酶促反应底物浓度参照文献[3],反应溶液终体积10ml,37℃条件下反应2h,加入0.5ml 2mol/L硫酸终止反应。
高效液相色谱条件根据美国药典[4]改进:流动相为pH 2.8,0.01mol/L甲酸铵溶液,临用前与甲醇4:1(V/V)混合。色谱柱为C18反相柱,进样量20μl。以不同浓度SAM标准品作标准曲线,通过外标法计算得出样品中SAM的含量。
SAM合成酶酶活的定义:37℃条件下,每1h生成1μmol SAM,其酶活为1U。
固定化酶的活力:底物浓度同游离酶,滤纸吸干水分后精密称取1g固定化酶,加入10ml底物,反应在恒温摇床中进行,转速150r/min。
1.2.3 蛋白含量的测定
采用Bradford MM法[5],以牛血清白蛋白作标准品。
1.2.4 固定化条件的优化
固定化的原始条件与1.2.2中相同。其他条件不变,分别考察加酶量、吸附时间、缓冲液pH和温度的改变对固定化效果的影响,根据单因素实验的结果,优化固定化条件。
1.2.5 酶的性质
酶促反应的底物溶液浓度、反应时间及终止方法同1.2.3。
最适pH:将酶置于不同pH的缓冲液中进行酶促反应,缓冲液为100mmol/L Tris-HCl,用稀NaOH或HCl调至所需pH。
最适温度:将酶置于恒温气浴摇床中进行酶促反应,分别设定不同的温度。
热稳定性及储藏稳定性:固定化酶经60℃热水处理一定时间后测定酶活,分析其热稳定性;固定化酶储藏于4℃冰箱中,每隔一段时间取出部分,测定酶活,分析储藏稳定性。
操作稳定性:连续反应10批次,每批次反应结束后取上清测定产物含量,倾去剩余反应液(不加入硫酸终止反应),缓冲液洗4～5次后滤纸吸干,加入新底物进行下一批次的反应。
2 结果与分析
2.1 固定化载体的选择
不同树脂及固定化方法所得固定化酶的固定化率、表观酶活及回收率如表2所示。
从表观酶活及回收率来看,ESQ-1和ESR-2(吸附法)较为理想。其中二者的固定化率差异显著(P<0.05),而酶活回收率差异不显著(P>0.1)。ESR-2固定化率及回收率都较为理想,因此选择这种树脂进行固定化条件优化。
2.2 固定化条件的优化
2.2.1 加酶量
其他条件同初始,不同加酶量条件下,固定化率及表观酶活回收率结果如图1。
从结果看,随着加入酶量的增加,表观酶活增大,回收率及固定化率均下降,说明随着溶液中酶量的增多,酶的吸附量也增大,但吸附效率降低,且吸附过量酶影响酶促反应进行,利用率降低。本实验中,为保证酶的利用率,加酶量选择4U/g。
2.2.2 吸附时间
加酶量4U/g,其他条件同初始,不同的吸附时间进行固定化,结果如图2。
结果表明,吸附反应发生较快,酶在离子交换树脂上容易吸附。随着吸附时间增加,固定化率和回收率有一定升高随后达到最大,说明吸附过程仍在进行并逐渐饱和;吸附时间过长时,固定化率继续上升,说明吸附过程仍在进行,但表观酶活下降,可能是由于吸附过量酶影响了酶促反应的进行,因此吸附时间在10h左右为宜。
2.2.3 缓冲液pH
加酶量4U/g,其他条件同初始,不同pH缓冲液中进行固定化的结果如图3。
由结果可知,在pH8.0时,树脂对酶的吸附效果最好,所得固定化酶酶活最高;pH8.5时固定化率最高,说明在此pH条件下游离酶中蛋白容易吸附,但酶活不是最高,可能是由于吸附了一定量杂蛋白所致,因此吸附pH选择8.0。
2.2.4 温度
加酶量4U/g,其他条件同初始,在不同温度条件下进行固定化,结果如图4。
固定化率随着温度升高而增加,可能是由于温度升高使分子运动加快从而促进吸附反应,但温度过高时则所得固定化酶表观酶活下降,可能是由于酶在温度较高的条件下易失活,因此吸附温度选择15℃。
2.3 固定化酶的性质
2.3.1 最适pH
分别将固定化酶和游离酶至于不同pH缓冲液中进行酶促反应,测定产物含量并计算酶活,结果如图5。
固定化酶与游离酶最适pH均为8.5,在树脂上的吸附过程并未改变酶的最适pH。这一结果与文献报道[6]基本一致。
2.3.2 最适温度
将固定化酶和游离酶置于不同温度水浴中进行酶促反应,测定产物含量并计算酶活,结果如图6。
从结果可以看出,固定化后酶的最适温度略有上升,从29℃上升为35℃。田林奇[6]等人对重组大肠杆菌SAM合成酶的性质研究表明,较短时间酶促反应过程中,酶的最适温度为50℃,但长时间酶促反应中较低温度使酶更加稳定,酶的最适温度是温度对酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果。固定化过程可能降低了酶的失活速率,因此最适反应温度略有升高。
2.3.3 热稳定性及储藏稳定性
固定化酶经60℃保温1h,2h,3h后,剩余酶活下降为原来的95.03%、87.37%、78.04%,在4℃冰箱内保存7d,14d,25d后,剩余酶活分别为91.36%、82.11%、75.73%,结果表明固定化酶在较高温度和较长时间的储存后仍能保留大部分酶活,具有良好的热稳定性和储藏稳定性。
2.3.4 操作稳定性
固定化酶连续反应,各批次相对酶活如图7所示。
随着反应批次的增加,固定化酶的酶活逐渐下降,反应5批次后,酶活仍为初始酶活的91.14%,反应10批次后酶活下降较多,为初始酶活的77.92%。
2.4 结果分析
SAM合成酶的固定化载体筛选实验表明,弱碱性伯胺基阴离子交换树脂ESR-2具有较好的固定化率和酶活回收率,以ESR-2为载体进行固定化工艺优化,在加酶量4U/g、pH8.0、15℃条件下吸附10h,所得固定化酶酶活为2.1U/g,表观酶活回收率达到51.6%。增加加酶量可进一步提高固定化酶的表观酶活,但酶活回收率会下降较多,造成游离酶的浪费,应用中可根据实际情况增加或减少加酶量。固定化酶最适温度为35℃,最适pH为8.5,热稳定性、储藏稳定性和操作稳定性均较好,适于在工业化生产中应用。
3 讨论
现阶段SAM生产均采用发酵法,相关研究也较多,Hui Hu等人[7,8]通过DNA改组技术构建了重组Pichia pastoris 并进行了发酵过程中L-甲硫氨酸的补料优化,SAM产率可达0.18±0.01 g·L-1·h-1;Na Shao等人[9]通过紫外-γ射线联合诱变选育和培养基优化的方式实现了SAM和谷胱甘肽在Candida utilis中的联合生产。相对于体外酶促法,发酵法仍具有难以避免的生产周期长,生产效率较低等缺点。固定化酶制备SAM的报道较少,Yunxing Luo等人[10]在Pichia pastoris中构建了含有His-tag的重组SAM合成酶,并用镍离子亲和琼脂糖凝胶一步法获得固定化SAM合成酶,采用的固定化材料价格较高,不适于工业生产中的推广使用。牛卫宁等人[11]采用海藻酸钙凝胶固定化重组Escherichia coli.细胞催化制备SAM,5批反应后酶活保留率为 91%,与酶促法相比具有无须进行酶的纯化、步骤相对简单的优点,但所用的固定化凝胶材料机械强度较差。树脂载体价廉易得,机械强度高、稳定性好,利用树脂载体制得的固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶具有良好的工业化应用前景,相关酶促及产品纯化工艺目前正在进一步研究中。
参考文献
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蛋氨酸合成酶 篇4
合成了[Cu(ctl)phen]NO_2・H_2O固体配合物,phen为1,10-邻菲咯啉;ctl为瓜氨酸(L-Citrulline),通过元素分析、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)测定对配合物的配位行为进行了表征;电子吸收光谱、粘度测定研究表明在pH=7.2的`缓冲溶液中,配合物与小牛胸腺DNA(Calf thymus DNA,ctDNA)发生部分插入作用.
作 者： 作者单位： 刊 名：光谱实验室 PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF SPECTROSCOPY LABORATORY 年，卷(期)：2009 26(6) 分类号：O657.32 关键词：铜配合物 1,10-邻菲咯啉 L-瓜氨酸 小牛胸腺DNA Copper (Ⅱ) Complex 1,10-Phenanthroline L-Citrulline ctDNA★ 由过渡金属配合物修饰的硅钨多金属氧酸盐的合成与晶体结构
★ 铅(Ⅱ)-氨基多羧酸配合物的合成与结构研究
★ 羧基氧桥连La(Ⅲ)四核配合物[C48H60La4O35]的合成和晶体结
★ 双二茂铁-钯配合物的合成,结构和电化学
★ 侧链含偶氮基的聚硅氧烷类液晶高分子及其离聚物的合成与表征
★ 电感耦合等离子体原子发射光谱法测定镍硅铜中镍和铜
★ 铝配合物的电合成及低温制备α-Al2O3纳米棒状晶须
★ [Cu(C8H6NO2)2(H2O)2]n的水热合成和晶体结构
★ 三维超分子化合物[Zn(H2O)6] (C16H8O8)的合成、晶体结构
谷氨酸衍生物合成研究进展 篇5
1 N-脂肪酰基谷氨酸盐
N-脂肪酰基谷氨酸盐目前主要的商品有月桂酰基谷氨酸钠(钾)、椰油酰基谷氨酸钠(钾),它们对皮肤极为柔和,无致敏性,泡沫适当,洗涤力强,对硬水具有出色的适应性,易生物降解,适用于固体状、液体状、膏状、粉末状等各种型态的商品,是肥皂、洗涤剂、洗面奶、剃胡膏、洗发精、沐浴乳、牙膏和起泡剂等产品的优质原料。20世纪70年代日本的Mashiro Takcara 和R Yoshida 等[15~17]对N-脂肪酰基谷氨酸表面活性剂进行了研究,又由日本味之素公司的吉田良之助等人将其商品化,如今美国的Degussa Corp. Fine chemicals和 Reseach Organics Inc.)、德国的Gesellschft mit Beschrankter Haftung Co. Ltd、日本的Degussa Japan Co. Ltd.、中国的上海经纬化工有限公司和南京中狮化学品有限公司均有产品上市。2003年美国的Dow Chemical Company 投产了一条N-脂肪酰基谷氨酸盐的生产线。国内在谷氨酸类表面活性剂的应用、开发和生产方面与国外还存一定的差距,但国内对该产品的需求日益增大。
20世纪90年代初徐宝财[14]、王亨权和王闻多等[15]对此类化合物的合成和应用进行了研究。1998年陈寅生等[16]进行了此类化合物的合成与性能测试,2003年韦异和朱海洋等对该化合物在日用化学品中的应用作了研究。研究的结果表明,该化合物具有优良的表面活性,无毒、无刺激,易生物降解,可与阴、阳、非和两性离子表面活性剂混用,去污洗涤性好,易于增黏,防锈等。2006年蒋海珍等[17]将油酸酰氯和谷氨酸在碱性溶液中反应得到N-油酰基谷氨酸, 用四球摩擦磨损试验机考察了N-油酰基谷氨酸三乙醇胺盐在水溶液中的摩擦磨损性能,结果表明, 当N-油酰基谷氨酸三乙醇胺添加量为0.25%时, 其水溶液表现出较好的抗磨和减摩特性;当添加剂的添加量为2.00%时,N-油酰基谷氨酸三乙醇胺盐的防锈性较好,同时还具有一定的抗菌能力。2007年祝阳和蒋立建[18]对油酰谷氨酸的合成工艺条件进行了详细的研究,得出了最佳的反应条件。同年孙霞等[19~20]分别制备了N-月桂基谷氨酸和N-油酰基谷氨酸,采用设计的生物降解试验方法考察了产物作为润滑油添加剂对HVB 50 矿物基础油生物降解性能的影响,并对产物促进润滑油生物降解的机理进行了分析。结果表明,该添加剂能够明显改善润滑油的生物降解性能。
采用谷氨酸为原料制备N-脂肪酰基谷氨酸盐的方法主要有以下几种:
方法1:Thomnas. H.等[21]早在20世纪 60 年代就已提出脂肪酸酐与谷氨酸盐进行酰化反应,制备N-脂肪酰基谷氨酸盐。该法不需催化和控制水量,采用石油醚、苯等溶剂提纯产品,但此法谷氨酸过量,成本高,产物的提纯困难。此法至今未见用于大规模工业生产。
方法2:肖顿-鲍曼(Schotten -Banmann)缩合反应方法[22~24]。它是由脂肪酰氯和谷氨酸在碱性水溶液或其它有机溶剂中制得 N-酰基谷氨酸盐,然后经无机酸酸化分离得 N-脂肪酰基谷氨酸粗品,再加碱中和而成为较纯的N-酰基谷氨酸盐,其中脂肪酰氯可以氯化亚砜或三氯化磷与脂肪酸为原料制备,收率可达95%。
方法3:乌布赖.R.P.等[25]在专利中提出了用脂肪酸和谷氨酸碱金属盐在高温(170~190 ℃)及N2保护下,可直接得到N-脂肪酰基谷氨酸钠,按1∶1摩尔比反应,产率仅有50%~55%,加入过量的谷氨酸转化率能得到提高,过量的谷氨酸成本高,分离难度大。
方法4:徐宝财等以脂肪酸甲酯代替酰氯作酰化剂与谷氨酸钠反应制得N-脂肪酰基谷氨酸,收率33%,该法原料价廉,对设备要求低,流程简单。
2 聚γ-谷氨酸及其酯
谷氨酸类聚合物主要包括聚γ-谷氨酸、聚谷氨酸-γ-苄酯、聚谷氨酸-γ-甲酯、聚谷氨酸-天冬氨酸共聚物、聚谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇共聚物。聚γ-谷氨酸是一类可生物降解的高分子化合物,具有低毒、生物相容性好、可生物降解、吸水性好、水溶性好、容易被机体吸收和代谢等优点,广泛应用于制造合成纤维、皮革、食品包装膜、提包、家具、皮衣、鞋[27]、种子包衣、苗木移栽和无土栽培[28]等领域。通过对其改性,还可得到比一般天然纤维和化学纤维性能更优的材料[29~31]。
聚γ-谷氨酸最早是由匈牙利学者在20世纪60年代采用传统的多肽合成法制备得到的,但是这种方法的合成路线长,副产物多,收率低,因此这种方法不具备工业应用价值[32]。2001年Fumio Sanda等[33]又对化学合成法作了进一步改进。到目前为止,聚γ-谷氨酸大多仍采用生物法合成[34~35],化学合成法因其产率低还需进一步研究。2002年张静夏等以L-谷氨酸单体为原料,经γ-羧基和氯乙醇成酯反应,再与三光气反应制备L-氯乙醇基谷氨酸酯的N-羧酸酐,由三乙胺引发聚合得聚-L-氯乙基谷氨酸酯。2004年吴秋华和张国林[36]以L-谷氨酸和苯甲醇为原料,制备了L-谷氨酸-苄酯;再将其与三光气反应制备了N-羧基-L-谷氨酸-苄酯-环内酸酐;用乙醇胺为引发剂经聚合得到了聚L-谷氨酸-苄酯。2006年曹田等[37]以谷氨酸为原料,采用三乙胺为催化剂,制备了黏均分子量在70000~350000的高分子聚γ-谷氨酸。张玉玲等[38]以谷氨酸为共聚单体,与天冬氨酸进行固相热缩聚合,制得了天冬氨酸-谷氨酸共聚物,该工艺与天冬氨酸单体聚合工艺相比,不仅降低了反应温度,缩短反应时间,而且没有产物与溶剂的分离过程,减少了环境污染。李贺敏等[39]以二甘醇缩水甘油醚和聚乙二醇(PEG) 缩水甘油醚作为交联剂对聚谷氨酸进行改性制备吸水树脂,吸水率最大可达2200 g·g-1。章苏宁和张健[40]以L-谷氨酸、苯甲醇、三光气和聚乙二醇为原料合成了黏均分子量在20000~110000的聚(L-谷氨酸-γ-苯甲酯)-聚乙二醇接枝共聚物,接枝率达43.86%。
3 谷氨酸酯
谷氨酸烷基酯类化合物目前还未有大规模的工业化产品,其低碳谷氨酸烷基酯主要用作药物,可治疗骨质疏松症[41]、艾滋病人的腹泻。高碳链的谷氨酸烷基酯主要用作表面活性剂,具有低毒、低刺激、良好的抗菌和抗静电性、生物降解性好等优点,可用于化妆品、洗涤剂、食品、医药、农药等领域[42~43]。 也可作合成聚γ-谷氨酸酯的单体,用作水处理剂,具有缓蚀和防结垢的性能,同时还能作为合成可降解塑料的原料。谷氨酸烷基酯的合成在我国的报道还不多。孙建军[44]和邓斌等人分别以谷氨酸和月桂醇为原料, 用固体超强酸ZrO2-SO42-和SnCl4·H2O/C为催化剂合成谷氨酸月桂醇酯表面活性剂,月桂醇转化率分别达96%和97.9%。
4 焦谷氨酸盐及其酯
焦谷氨酸(钠)又称吡咯烷酮羧酸(钠),最早仅作为一种生化试剂,主要用于外消旋化合物的拆分和某些氧化酶的抑制剂等[45~48]。近10年来,有几十篇文献说明其应用在化妆品、食品、药品、织物、油墨和管道清洗等领域中[49]。20世纪70年代初,日本人开始了对焦谷氨酸的合成研究。由谷氨酸脱去一分子的水可生成焦谷氨酸,焦谷氨酸的钠、钾盐是皮肤的天然保湿因子,具有很好的保湿性,并兼具美白、去皱功能,其锌盐具有抗过敏性,可作为化妆品中的功能添加剂[50~55]。高碳链的焦谷氨酸酯可作为O/W型或W/O型的乳化体的乳化剂[56], 同时具有抑菌和促进渗透的功能[57~59],低碳链酯可作为手性拆分剂,用于药物的拆分[60],近年来越来越受到人们的关注。
1988年 Drauz K 和Krimmer H P等[61]发现L-谷氨酸钠(熔点195 ℃)在195~270 ℃条件下热分解可得L-焦谷氨酸钠,如在220 ℃下加热1 h得到澄清的熔融物,冷却后即得L-焦谷氨酸钠, 转化率99%。将其水溶液通过离子交换树脂可得L-焦谷氨酸。11年后他们将谷氨酸钠热解产物用水重结晶得到含3个结晶水的菱柱状结晶。1993年冯大炎采用干法将L-谷氨酸直接加热熔融,并维持在150 ℃下分解生成焦谷氨酸酸,L-焦谷氨酸溶液经中和可得L-焦谷氨酸钠溶液。1994年贾艳梅以谷氨酸为原料,采用加入催化剂的方法,使谷氨酸在140 ℃、保温2~3 h的条件下制得焦谷氨酸,用氢氧化钠中和后得钠盐,转化率可达93.1%。1995年Ito H和 Shimzu K 等以谷氨酸为原料,经微生物产碱杆菌属(Alcaligenes)催化缩合得到焦谷氨酸,转化率达95%。1995年毛允萍和孙铠[62]用干法合成了焦谷氨酸钠,并将其与甘油、山梨醇和木糖醇等进行了保湿的对比试验,结果表明,焦谷氨酸钠的保湿性能明显优于常用的保湿剂,可用于护肤霜、牙膏、香波和香皂中,起保湿作用。1997年Nishimura A和Ozaki Y等[63]从各种产碱杆菌属和假单胞菌培养分离得到了5-氧(代)脯氨酸酶(焦谷氨酸酶),并证明它们对谷氨酸脱水环化和焦谷氨酸的开环水解具有双重的活性。同年林春绵[64]对L-谷氨酸热解进行了研究,结果表明,L-谷氨酸受热先分解为L-焦谷氨酸,继而生成吡咯,2个阶段没有足够的温度分界区,故以L-谷氨酸为原料干法热解制取L-焦谷氨酸是不合适的。1999年徐明仙和林春绵[65]以谷氨酸钠为原料分别采用干法和湿法合成了焦谷氨酸钠,并对2种方法的反应条件进行了探讨,结果表明,较佳的热解温度为190 ℃,时间为2 h,湿法热解时浓度以质量分数0.5%为宜,在此条件下热解转化率可达97.5%。2000年任君等以L-谷氨酸和甲醇、乙醇为原料,经先酯化再高温热环合的方式得L-焦谷氨酸甲、乙酯,将其作为手性诱导剂。2002年成志毅等用谷氨酸先环化制得焦谷氨酸再与油醇酯化合成了焦谷氨酸油醇酯,并将其作为渗透促进剂使替硝唑、咖啡因和醋酸可的松经皮渗透分别增大了41.8倍、9.1倍和2.9倍。2006年李群和赵昔慧[66]以L-谷氨酸为原料,采用干热法合成了焦谷氨酸钠,并将其应用于制备涤棉混纺织物中,吸湿性、透湿性、抗静电性均得到了显著提高。
采用谷氨酸为原料制备N-酰基谷氨酸盐的方法主要有以下3种:
(1)生物催化法。
以L-谷氨酸为原料,经微生物产碱杆菌属和假单胞菌的孢子催化发酵得L-焦谷氨酸。
(2)干法热解。
L-谷氨酸钠在195~270 ℃下缩合得L-焦谷氨酸钠,转化率可达99%。将其水溶液通过离子交换树脂可得L-焦谷氨酸,用水重结晶得到含3个结晶水的菱柱状结晶。
(3)湿法热解。
L-谷氨酸水溶液加热回流过夜,可得到焦谷氨酸溶液,转化率85%~86%,或以谷氨酸或其盐为原料在100~300 ℃和高于该温度下水的蒸汽压下反应,转化率在90%以上[67]。
5 其它谷氨酸衍生物
除了以上典型的谷氨酸衍生物外,2001年谢文磊[68]合成了松香酰谷氨酸作为表面活性剂,2002年刘国珍等[69]以谷氨酸和葡萄糖、蔗糖、木糖等进行Maillard反应,其产物作为烟草增香剂。2007年李和平[70]以L-谷氨酸和壳聚糖为原料,N ,N'-二环己基碳二亚胺为活化剂,合成了一种新的靶向型药物载体谷氨酰壳聚糖。
6 展望
谷氨酸螯合钙的合成条件研究 篇6
钙是人体含量最丰富的矿物质元素。钙元素嵌合在两个氨基酸中间后,它不会被人体的酸碱环境破坏,也不会受到食物中植酸、草酸的影响。但仍具有生物活性,在胃肠道内能完全溶解而不产生沉淀,能被肠道粘膜直接吸收,避免了体内结石,同时补充了氨基酸[3]。
实验的目的在于研究一种水溶性好、吸收率高的氨基酸螯合钙的合成条件。谷氨酸钙是钙离子与谷氨酸螯合形成的氨基酸螯合物。谷氨酸原料易得、成本相对较低,适于作为研究合成条件的反应底物。以谷氨酸和氢氧化钙为原料,采用化学合成的方法制备谷氨酸螯合钙,研究物料比、反应温度和反应时间对合成谷氨酸螯合钙的影响。然后,通过中心组合设计确定合成谷氨酸螯合钙的最佳工艺条件。
1 材料和方法
1.1 实验材料
99%谷氨酸钠 武汉亚太调味食品有限公司;钙指示剂;99.90～100.10%碳酸钙 基准试剂;氢氧化钙、氢氧化钠、三乙醇胺、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、盐酸 均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
T-114电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;UB-7型pH计,北京赛多利斯仪器系统有限公司;CL-3型恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司;SHZ-D(Ⅲ)A循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司;GZX-9030 MBE数显鼓风干燥箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;RE-52AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 谷氨酸钙的合成
两步法制备谷氨酸钙:将谷氨酸钠调pH值至等电点沉淀出谷氨酸。谷氨酸与氢氧化钙螯合反应生成谷氨酸钙和水,过滤去除杂质后即得纯净的谷氨酸钙。谷氨酸钙合成的反应如下式:
1.3.2谷氨酸的制备
用等电点沉淀法制取谷氨酸。将一定量的谷氨酸钠置于烧杯中,加适量蒸馏水,搅拌溶解。然后加入浓盐酸调节溶液的pH值约等于3左右(达到谷氨酸的等电点)。冷却至室温,将乳浊液真空抽滤。用蒸馏水洗涤沉淀后,再次真空抽滤。将沉淀在105℃下烘干2 h,得白色细粉状谷氨酸,贮存于聚乙烯瓶中待用。
1.3.3 谷氨酸钙合成的单因素试验
将谷氨酸和氢氧化钙按一定的比例混合在一个密闭的容器里进行反应制备谷氨酸钙。对反应物配比、反应温度进行单因素试验,分别观察反应结果。
1.3.4谷氨酸钙合成条件的优化
由单因素试验的结果确定合成反应的试验因素与水平。再对因素和编码水平进行中心组合设计[4,5]。对试验数据进行多项式回归分析,得到描述响应量和自变量关系的二次多项式。模型可描述为:
y = b0 + ∑bixi + ∑biixi2 + ∑bijxixj (1)
式中y为预测响应值(谷氨酸钙的反应收率),x是自变量的编码值,b0是截距,bi是线性系数,bii是平方系数,bij是交互作用系数。[6,7]
1.3.5 谷氨酸、柠檬酸和EDTA对钙离子螯合力的测定方法
螯合力是指螯合剂可螯合金属离子的能力[8]。用移液管移取一定体积0.04 mol·L-1 CaCO3标准溶液于250 mL锥形瓶中,加入50 mL蒸馏水,加1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节溶液pH大于13(约2 mL),并加少量钙指示剂。然后,分别用螯合剂0.2 mol·L-1谷氨酸、柠檬酸和EDTA滴定至酒红色变纯蓝色为终点,记下所消耗溶液的体积,再计算螯合剂的螯合力。重复做3次平行实验,计算其平均螯合力。
1 g螯合剂螯合Ca2+的量(以CaCO3计)按下式(2)计算,单位为mg·g-1。
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式中: V——CaCO3标准溶液的体积,mL; V'--滴定消耗螯合剂的体积,mL;
100.09——CaCO3的摩尔质量,g/mol;M——螯合剂的摩尔质量,g/mol。
2 结果与讨论
2.1 谷氨酸、柠檬酸和EDTA对钙离子螯合力的对比分析
3次重复测定取平均值。柠檬酸的螯合力为90.21、谷氨酸的螯合力为146.32、EDTA的螯合力为269.22。如图1所示,柠檬酸、谷氨酸和EDTA对钙离子的螯合力依次增大。EDTA的螯合力明显强于柠檬酸和谷氨酸,在溶液中,EDTA可以夺取柠檬酸钙和谷氨酸钙的钙离子。在滴定分析中,可以在少量钙指示剂存在的条件下,以EDTA标准溶液为滴定剂来检测谷氨酸钙样品中的钙含量以及谷氨酸钙的纯度。EDTA型强螯合剂常用于清理对生物体有害的阳离子。谷氨酸对钙离子的螯合力大于柠檬酸,说明谷氨酸钙在肠道中比柠檬酸钙更稳定。谷氨酸钙螯合物性质稳定,能完整地进入生物系统被吸收利用。柠檬酸钙在食品工业中作为营养强化剂。根据试验结果可以推测谷氨酸钙的补钙效果要好于柠檬酸钙。
2.2 反应物配比对反应的影响
为了充分了解谷氨酸钙的合成反应,在250 mL三口烧瓶中,放入100 mL蒸馏水,在搅拌的情况下,在恒定温度70℃的条件,观察当氢氧化钙和谷氨酸以一定比例参与反应,当反应结束后,考察溶液的最终pH值,以及在反应中、反应后烧瓶中的情况。实验结果见表1。
从表1中可以看出,当谷氨酸过量时,溶液的底部出现了较多的谷氨酸沉淀。当氢氧化钙过量时,由于部分细微颗粒氢氧化钙悬浮在溶液中,造成溶液浑浊;而部分大颗粒的氢氧化钙则形成沉淀。因而只有当参与反应的氢氧化钙和谷氨酸比例适当时,反应才能充分地进行,在反应中既没有过量的谷氨酸,也没有过量的氢氧化钙。此时,溶液澄清、透明。在只考虑反应物配比对反应的影响时,反应物氢氧化钙和谷氨酸物质的量之比在0.45～0.5之间是适宜的。
2.3 反应温度对反应的影响
在250 mL三口烧瓶中放入100 mL蒸馏水,在搅拌的情况下,以合适的次序,投放合适量的氢氧化钙和谷氨酸,观察反应温度对反应的影响。实验结果见表2。
从表2中可以得出,反应物氢氧化钙和谷氨酸在同比例的条件下,反应温度越高,反应的时间越短,所以适当提高温度是有利的。在不考虑反应物配比对反应的影响时,根据反应完全程度,反应的温度应控制在70～90℃之间为宜。
由于氢氧化钙和谷氨酸反应制备谷氨酸钙是络合放热反应,温度的提高,加快了谷氨酸的溶解,从而促进反应加快进行。谷氨酸钙的合成反应不需要很长时间。反应时间长,不会增加产率,只会增加能耗;但反应时间太短,不易控制。因而,反应时间控制在10～30 min之间就可以了。
2.4 三因子二次回归通用旋转组合设计
综上所述,谷氨酸钙合成的反应条件可以确定如下:反应物氢氧化钙和谷氨酸之比在0.45～0.5之间;反应温度控制在70～90 ℃之间;反应时间控制在10～30 min之间是适宜的。
为了确定最佳工艺条件,在前期实验基础上,选定了物料比n(氢氧化钙)∶n(谷氨酸)、反应温度和反应时间三个工艺条件进行三因子二次回归通用旋转组合设计。本次实验的自变量、正则变量和水平如表3。
按表4安排实验,再通过实际产量与理论产量的比值来计算收率。
x1=(X1-0.475)/0.025; x2=(X2-80)/10; x3=(X3-20)/10
对物料比、温度和时间进行多元回归分析,回归方程如下。其中y为谷氨酸钙的收率,x为各因子的正则值。
y=98.365+0.75x1+1.258x2+0.284x3-0.038x1x2-0.31x1x3+0.46x2x3-2.491x12-1.052x22-0.268x32
确定系数R2为0.9209,表明谷氨酸钙收率的92.09%可变性能通过此模型解释。方差分析的结果显示了模型是合适的。
对回归方程进行规划求解,在规范变量x1=0.0672、x2=0.8670、x3=1.2344时,收率达到最高点。由此可以确定当反应物料比为0.477、温度为89℃、反应时间为32 min时,谷氨酸钙的收率可达到最大值99.11%。
2.5 验证实验
在中心组合设计得出的最佳反应条件下进行三次重复的验证实验,谷氨酸钙的收率分别为98.70%、99.10%、98.45%,平均值为98.75%,接近理论预测值99.11%。因此,采用中心组合设计优化得到的反应条件参数准确可靠,具有实用价值。
3 结论
采用化学合成的方法制备谷氨酸钙,谷氨酸对钙离子的螯合力小于EDTA,但大于柠檬酸。研究物料比、反应温度和反应时间三因素对合成谷氨酸钙的影响,通过中心组合设计确定最佳工艺条件是:氢氧化钙与谷氨酸的物料比为0.477:1;反应温度为89℃;反应时间为32 min。在此条件下,谷氨酸钙的收率为98.75%。
参考文献
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蛋氨酸合成酶 篇7
类似于金银纳米粒子等贵金属纳米粒子, 因具有特殊光学性质而引起人们关注, 并被广泛应用到生物标记、细胞成像[1]、癌症临床诊断和治疗[2]等各个领域。纳米粒子是20世纪80年代中期发展起来的一种尺寸处于原子簇和宏观物体交界过渡区域的一类特殊微粒[3]。由于纳米颗粒具有量子效应、表面效应、小尺寸效应[4]以及“宏观量子隧道效应”[5], 从而呈现出优良的光学性质[6]、电学性质和良好的生物相容性[2]等。目前, 合成银纳米粒子的方法有化学合成法[7,8]、种子培养法[9]、微乳液培养法[10]、辐射法[11]、超临界流体法[12]等, 但是这些方法都要用到大量有毒有机试剂和还原剂, 会对环境造成一定影响。另外, 物理方法需要先进设备和严格条件控制。一些作为模板分子的天然产物虽可用来合成银纳米粒子, 但是时间控制以及严格的合成条件也给合成带来了挑战。因此, 建立一种简单、快速及绿色的合成银纳米颗粒的方法令人期待。
半胱氨酸是广泛存在于生物系统内的一种具有还原性基团琉基 (-SH) 的氨基酸[13]。半胱氨酸在人体内具有重要作用, 它是通过二硫键支撑蛋白质的二级结构而与蛋白质分子作用, 从而具有许多包括新陈代谢等的生物功能[14]。传统的检测半胱氨酸的方法有高效液相色谱法、荧光光谱法[15]和电化学伏安法等。然而, 这些方法需要昂贵复杂的设备, 操作复杂、费时, 从而限制了其应用, 因此建立一种简单、快速、选择性好的方法来检测半胱氨酸具有重要意义。
综合上述考虑, 以木瓜蛋白酶为模板, 利用光催化法合成了光学性质稳定、生物相容性好的银纳米簇, 并根据纳米簇等离子共振吸收峰变化来检测半胱氨酸 (Cys) , 这是一种快速简单、绿色环保、低成本的新方法。首先, 在紫外灯光照的情况下光催化合成银纳米簇, 然后加入半胱氨酸, 银纳米簇在365 nm处会出现一个等离子共振吸收峰, 且在365n m处的吸光度变化与半胱氨酸的浓度有良好的关系, 在0.5μM~60μM有很好的线性范围, 最低检测限为0.5μM。此外, 选择性明显提高, 其他生物小分子, 包括氨基酸、葡萄糖、多巴胺等, 均对检测无干扰。基于上述现象, 最终建立了基于光催化合成银纳米簇紫外可见分光光度法对半胱氨酸的检测。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
银纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱是通过U V-2 5 5 0紫外-可见分光光度计 (日本, 岛津) 用10 mm×2 mm宽的石英比色皿测得;银纳米粒子的形态和大小使用JEM-2100高分辨率透射电子显微镜 (日本电子公司, 日本) 观测;制备Ag (Ⅰ) -木瓜蛋白酶化合物的搅拌器使用SZCL-2A数显智能控温磁力搅拌器 (巩义市予华仪器有限责任公司) ;紫外光照使用ZF-1型三用紫外分析仪 (上海骥辉科学分析仪器有限公司) 3 W灯进行光照实验;QL-901漩涡混合仪 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司) 用于溶液混匀;实验中缓冲溶液的p H是通过PHS-25型p H计 (上海雷磁仪器厂) 测定。
实验所使用的试剂木瓜蛋白酶 (国药试剂化学试剂有限公司) 、L-半胱氨酸 (国药集团化学试剂有限公司, 上海) 、储备液置于4℃冰箱避光保存、Ag NO3 (99.999 5%, Alfa Aesar) 、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、葡萄糖。其他化学试剂均为分析纯, 实验中所用的水为超纯水 (电阻率18.25 MΩ) 。
1.2 紫外光催化合成木瓜蛋白酶包裹的银纳米粒子
实验使用王水洗过的玻璃仪器, 在室温下移取0.3 m L, 50 mg/m L的木瓜蛋白酶溶液于10 m L圆底烧瓶中, 在均匀搅拌下快速加入新配制的2.4 m L 10 m M的Ag NO3溶液, 快速搅拌10 min后, 将该混合溶液转移到5 m L的石英比色皿里, 在365 nm紫外光照射30 min, 溶液颜色由无色变为浅棕黄色。然后将溶液转移到试剂瓶中, 在4℃的冰箱里储存备用。
1.3 半胱氨酸检测
紫外分光光度法检测半胱氨酸:首先, 将50μL的银纳米溶胶加入到1.5 m L的离心管中, 然后加入不同体积的半胱氨酸 (0.1 m M) 到反应体系中, 快速震荡30 s后, 紧接着加入 (20 m M, p H=5.6) B-R缓冲定容到1 000μL, 在漩涡仪上摇匀。实现用紫外分光光度法对半胱氨酸的检测。
2 结果与讨论
2.1 银纳米簇的表征
金属纳米粒子在紫外可见光区有吸收带或吸收区, 这是由等离子共振激发或者电子跃迁所形成的, 这是纳米粒子尺寸效应的表现, 在块体中是不存在的, 而且银纳米粒子的紫外吸收峰一般在415nm左右。因此观察银纳米粒子的光学现象非常有意义。合成的银纳米簇通过紫外吸收光谱和扫描电镜 (TEM) 来表征 (如图1) 。银纳米簇最大吸收波长在420 nm处。从TEM图中看出制备的银纳米簇的外观基本为球形, 粒度分布均匀, 颗粒粒径小, 粒径大部分小于5 nm。
2.2 半胱氨酸检测实验条件优化
本实验利用紫外光催化合成的银纳米簇是首次报道的, 实验中对银纳米簇检测半胱氨酸的检测条件进行优化, 主要优化了缓冲溶液和反应体系的p H值。
2.2.1 缓冲溶液的选择
为了得到稳定的紫外吸收值, 在相同银纳米簇里分别加入相同浓度不同种类的缓冲溶液, 然后再加入30μM的半胱氨酸, 反应后扫描反应体系的紫外吸收光谱, 对比365 nm处的吸收值。从实验结果可以看出 (如图2所示) , B-R缓冲条件下在365 nm处的紫外吸收增强得最多, 所以选择的缓冲溶液为B-R缓冲。
实验条件:银纳米簇 (通过木瓜蛋白酶估算) 1.112mg/m L, Ag+浓度:1.78 m M, 半胱氨酸:30μM, 缓冲溶液浓度:20 m M, p H=7.0, 反应时间:20 min, 反应温度:25℃。
2.2.2 p H值的优化
缓冲溶液的酸度对半胱氨酸检测的影响, 实验中在银纳米粒子和半胱氨酸浓度不变的情况下, 通过改变加入不同p H值的B-R缓冲溶液来控制反应体系的酸度。p H值的酸度范围是4~10, 实验结果如图3所示。随着p H值的增加, 365 nm处的吸收峰强度明显增强, 当反应的p H为8时, 365 nm处的紫外可见吸收值最强, 有利于对半胱氨酸的检测, 所以最终选择检测半胱氨酸时使用p H为9的B-R缓冲溶液。
实验条件:银纳米簇:8 mg/m L;半胱氨酸:30μM, 反应时间:20 min, 反应温度为25℃。
2.3 选择性实验
为了考察方法的选择性, 实验选用多种氨基酸、葡萄糖、多巴胺等进行了研究。结果如图4所示, 可以得出具有较强还原性的1.5 m M多巴胺 (DA) 和葡萄糖 (Glu) 与银纳米团簇反应后会引起体系吸光度增加很少, 这说明本方法有较好的选择性。
实验条件:银纳米簇:3.2 mg/m L, 半胱氨酸的浓度为30μM, 其他物质的浓度为1.5 m M, 反应时间为20 min。
2.4 光谱法对半胱氨酸的检测
在最佳实验条件下, 向银纳米簇溶液中加入不同浓度的半胱氨酸, 当半胱氨酸的浓度不断增加, 如图5 (a) 所示体系在365 nm处的紫外吸收峰逐渐增强, 且其吸光度值与半胱氨酸浓度具有良好的线性关系 (如图5 (b) 所示) , 线性回归方程为A/A0=0.970+0.137 C, R2=0.996 7, 检测下限为0.5μM。
2.5 加标回收实验
为了检验方法的可行性, 采用加标回收实验, 结果如表1所示。可以看出此方法用来检测半胱氨酸是可靠的。
3 结论
以木瓜蛋白酶为模板, 通过光催化法合成了光学性质稳定、生物相容性好的银纳米簇, 并根据纳米簇的等离子共振吸收峰变化来检测半胱氨酸 (Cys) , 这是一种快速简单、绿色环保、低成本的新方法。这种方法首先在紫外灯存在的情况下光催化合成银纳米簇, 然后加入半胱氨酸, 在365 nm处会出现一个等离子共振吸收峰, 且在365 nm处的吸光度变化与半胱氨酸的浓度有良好的线性关系, 在0.5μM~60.0μM有很好的线性范围, 最低检测限为0.5μM。该检测方法对半胱氨酸具有高选择性。基于此现象, 最终建立了基于光催化合成银纳米簇紫外可见分光光度法对半胱氨酸的检测。
摘要：以木瓜蛋白酶为模板, 通过光催化法合成了光学性质稳定、生物相容性好的银纳簇。研究发现, 将一定浓度的半胱氨酸加入银纳米簇和银离子的混合溶液后, 混合溶液在365 nm处会出现一个等离子共振吸收峰, 且与半胱氨酸的浓度有良好的线性关系。因此, 建立了半胱氨酸的紫外吸收光谱分析法, 实现了0.5μM60.0μM浓度范围内半胱氨酸的定量测定, 检出限达0.5μM。这种检测方法具有良好选择性, 常见的生物小分子均不会对检测造成影响。
蛋氨酸合成酶 篇8
赖氨酸是含有三个功能基团的亲水性分子,分子中的两个氨基可以引发丙交酯开环聚合生成双端羟基聚乳酸,从而在聚乳酸分子中引入赖氨酸。赖氨酸既可增强聚乳酸亲水性,同时又具有羧基功能团,为聚乳酸材料的进一步改性和修饰提供了可能。
本文研究了赖氨酸引发丙交酯开环聚合的方法,合成了含赖氨酸的双端羟基聚乳酸寡聚体,经1,6-六亚甲基二异氰酸酯(HDI)对寡聚体扩链,获得了赖氨酸改性的聚乳酸,并对寡聚体和扩链产物的性能和结构进行了表征。
1 实验部分
1.1 试剂和仪器
D,L-丙交酯,实验室自制,使用时用乙酸乙酯重结晶3-4次;辛酸亚锡(分析纯),SIGMA ALDRICH CHEMIE GMBH;1,4-二氧六环(分析纯),成都市科龙化工试剂厂,使用时用氢化钙脱水、蒸馏精制;L-赖氨酸(分析纯),日本协和,真空干燥;1,6-六亚甲基二异氰酸酯(分析纯),A Johnson Matthey Company,氢化钙处理;三氯甲烷(分析纯),重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂;氢化钙(分析纯),天津市光复精细化工研究所。
傅里叶变换红外光谱仪(IRAffinity-1),岛津公司;核磁共振波谱仪(Bruker Advanc500Hz),Bruker公司;乌氏粘度计(0.38mm),台州市椒江玻璃仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9023A),上海浦东荣丰科学仪器有限公司;静滴接触角测量仪(JY-82),北京哈科实验仪器厂;集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S),巩义市予华仪器有限公司。
1.2 双端羟基聚乳酸寡聚体(HO-PLA-Lys-PLA-OH)合成
取60 g丙交酯,45 m L二氧六环于玻璃耐压瓶中,再加入赖氨酸和辛酸亚锡的二氧六环溶液,反复通N2抽真空5次,恒温105℃,反应72 h。待反应结束后,旋转蒸发仪蒸发二氧六环,三氯甲烷溶解,蒸馏水洗涤、沉淀,经过滤得白色聚乳酸。40℃真空干燥,再次用三氯甲烷溶解,水洗、沉淀、过滤,真空干燥获得双端羟基聚乳酸寡聚体,置于干燥器中保存待用。
赖氨酸引发丙交酯开环聚合的反应见式(1):
1.3 双端羟基聚乳酸寡聚体(HO-PLA-Lys-PLA-OH)扩链
准确称取2 g的HO-PLA-Lys-PLA-OH,准确计量HDI、辛酸亚锡催化剂和4 m L二氧六环置于三颈瓶中,在N2保护气氛下,搅拌、加热反应3 h,冰浴冷却终止反应。用蒸馏水洗涤、沉淀、过滤,40℃真空干燥,再用三氯甲烷溶解,水洗、沉淀、过滤,真空干燥获得扩链产物,置于干燥器中保存待用。
扩链反应见式(2):
1.4 产物表征
1.4.1 核磁共振
CDCl3为溶剂,Bruker Advance500核磁共振波谱仪,在298.15 K条件下,测定双端羟基HO-PLA-Lys-PLA-OH的1H-NMR波谱。
1.4.2 红外光谱分析
用IRAffinity-1型傅里叶红外光谱仪对产物进行红外光谱分析,KBr压片法制样,波数400～4 000 cm-1,表征产物各基团的特征吸收峰。
1.4.3 粘度法测定分子量
准确称0.2～0.3 g的产物,三氯甲烷溶解,(30±0.5)℃定容至25 m L。用乌氏粘度计,在(30±0.5)℃测定聚合物的粘均分子量。
聚合物的粘均分子量采用方程式[9](3)计算:
式中:Mη为粘均分子量;[η]为特性粘度。
特性粘度采用“一点法”公式计算(公式4):
式中:ηr=t/t0为相对粘度;ηsp=(ηr-1)为增比粘度;c为聚合物浓度。
1.4.4 接触角的测定
将聚乳酸溶解于三氯甲烷,在载玻片上流延成膜,室温挥发三氯甲烷、真空干燥,除去膜中残留的三氯甲烷,将载玻片水平放在接触角分析仪平台上,用微量注射剂将二次蒸馏水滴在膜上,迅速测定接触角大小。测定范围:0°～180°。
2 结果与讨论
2.1 双端羟基聚乳酸寡聚体的表征
2.1.1 双端羟基聚乳酸寡聚体的核磁共振波谱
图1为双端羟基聚乳酸寡聚体的核磁共振波谱图,由图可见:寡聚体在δ=1.5的峰为链段中-CH3的H所引起;δ=5.2处的峰属于链段中-CH的H,两峰面积之比约为3:1,表明两种H数量比为3:1;δ=0.9处为两个三重峰,来源于赖氨酸分子中两个-CH2的H;δ=4.4处的峰,既可来源于近端羟基的-CH的H,也可源于赖氨酸中近NH2的-CH2的H;在δ=7.3的峰来源于RCONHR中的H,是分子中含有赖氨酸的直接证据。由寡聚体的1H-NMR谱图得出:赖氨酸引发了丙交酯开环聚合,其产物为含赖氨酸的双端羟基聚乳酸寡聚体HO-PLA-Lys-PLA-OH。
2.1.2 双端羟基聚乳酸寡聚体的红外光谱
图2为双端羟基聚乳酸寡聚体的红外光谱图,可以看出在3 516 cm-1位置出现-OH峰;在3 412 cm-1处为-NH峰;2 997cm-1为C-H伸缩振动峰;1 755 cm-1处出现宽强峰,来源于酯和酰亚胺中的C=O基。但是,羟基峰和氨基峰很弱,可能是由于寡聚体中,二者含量太少的缘故。结合寡聚体的核磁共振谱图,可以确认赖氨酸引发丙交酯聚合的产物为含有赖氨酸的双端羟基聚乳酸寡聚体HO-PLA-Lys-PLA-OH。
2.2 寡聚体的扩链产物
2.2.1 扩链剂用量的影响
在二氧六环溶剂中,以0.3wt%辛酸亚锡为催化剂,HDI为扩链剂,在70℃条件下,扩链反应3 h,用粘度法测定扩链产物的相对分子质量,结果如表1。
由表1可见,在反应温度、时间、催化剂用量一定的前提下,扩链产物的粘均分子量随着HDI和PLA的反应比增加而逐渐增加。当反应比为2时,所得产物的粘均分子量最大为19 359,其分子量是寡聚体的3.6倍;当反应比为2.5时,由于产物不溶于三氯甲烷和四氢呋喃而无法测定分子量。这是由于HDI的-NCO与PLA的端-OH进行反应,随着反应体系中-NCO基团的增加,与PLA端-OH反应的活性基团数目增加,扩链产物的分子量增加。当-NCO基团数目继续增加时,过量的-NCO可以与扩链产物的酰亚胺基进一步反应,发生交联形成体型高聚物,在NCO/OH为2.5时产物不溶于三氯甲烷和四氢呋喃。
2.2.2 反应温度对扩链反应的影响
表2列出了反应温度对扩链产物分子量的影响。由表中数据可知:当反应时间为3 h,反应比为2∶1,催化剂用量为0.3wt%,反应温度为70℃时,所得粘均分子量最高;而当在反应温度为80℃时,所得产物由于不溶于三氯甲烷和四氢呋喃,无法测定分子量。原因可能是:在70℃时,异氰酸与寡聚体的羟基反应速度快,而与酰亚胺和羧基反应速度慢,反应产物基本为线型高分子,所以反应体系中无凝胶出现并且产物可溶。相反,当温度升高至80℃时,虽然,异氰酸与寡聚体的羟基反应速度加快,但是,-NCO与扩链产物的酰亚胺以及分子中的羧基反应速度加快,很快发生分子交联形成凝胶,使扩链产物溶解性变差,同时凝胶的出现阻碍了分子链的延长,致使分子量不能大幅度提高(参照75℃部分生成凝胶的情况),该结果与文献[10]的结果一致。
2.2.3 亲水性
接触角是表征材料亲水性的重要指标之一。本文基于赖氨酸是含有羧基功能团的亲水性物质,因此考察了以赖氨酸引发丙交酯开环聚合制备的聚乳酸(PLA1)和实验室合成的以1,4-丁二醇引发丙交酯开环聚合制备的聚乳酸PLA-B(Mη=4920)的亲水性能;以及在采用相同的反应条件下,分别以不同用量的HDI对双端羟基聚乳酸寡聚体进行扩链,考察扩链前后产物的亲水性能。结果见图3和图4。
由图3和图4可知:赖氨酸引发丙交酯制备的聚乳酸寡聚体(PLA1)的接触角小于粘均分子量比较接近的PLA-B的接触角;扩链前的PLA1的接触角小于扩链后产物的接触角,而且随着扩链产物分子量的增加,接触角也逐渐增加。这是由于赖氨酸含有羧基功能基团,亲水性好,寡聚体分子链中引入了赖氨酸,其亲水性明显好于由1,4-丁二醇引发制备的PLA-B;由于扩链后产物分子量增加,虽然引入了亲水性的赖氨酸,但由于赖氨酸含量太低,赖氨酸分子链太短,所以扩链后产物分子量越大,聚乳酸的接触角越大,亲水性有所降低。
3 结论
(1)以含有羧基功能团的赖氨酸引发丙交酯开环聚合,制备了双端羟基聚乳酸寡聚体HO-PLA-Lys-PLA-OH,在聚乳酸分子链中引入了亲水性的赖氨酸。
(2)以HDI为扩链剂,对HO-PLA-Lys-PLA-OH进行扩链,得到高分子量的PLA的最佳工艺条件为:0.3wt%辛酸亚锡为催化剂,nNCO/nOH为2,70℃,反应3 h,扩链产物的粘均分子量最大,是扩链前的3.6倍。
(3)从接触角测定可知,赖氨酸的引入增加了聚乳酸的亲水性,其接触角为59°;扩链后产物分子量增加,接触角增加到76.8°。
摘要：以D,L-丙交酯为原料,辛酸亚锡为催化剂,赖氨酸为引发剂,丙交酯开环聚合制备双端羟基聚乳酸(HO-PLA-Lys-PLA-OH)寡聚体,经16,-六亚甲基二异氰酸酯(HDI)扩链获得赖氨酸改性的聚乳酸材料。用傅里叶红外光谱、核磁共振、接触角、粘度法等手段对赖氨酸改性聚乳酸结构和性能等进行了表征。结果表明:赖氨酸可以引发丙交酯聚合,产物为含赖氨酸的双端羟基聚乳酸寡聚体;扩链产物的粘均分子量是寡聚体的3.6倍,其接触角变大,亲水性降低。
关键词：聚乳酸改性,赖氨酸改性聚乳酸,生物可降解材料,扩链,医用材料
参考文献
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蛋氨酸合成酶 篇9
本试验是用邻苯二甲酰甘氨酸和半胱氨酸为起始物质, 先将邻苯二甲酰甘氨酸酰氯化然后和氨基酸缩合反应得到分子内给收电子体系1a在乙腈和水中发生光诱导单电子转移反应得到半胱氨酸环肽化合物2a反应路线如Scheme 2所示。
1 实验部分
1.1 仪器与药品。
70 e V Hitachi VG-7070质谱仪;Bruker 400MHz核磁共振仪 (TMS为内标) ;Hanvia 450 W中压汞灯为光源上海百申手提紫外灯;邻苯二甲酰甘酸、2-乙氧基-1-乙氧甲酰基-1, 2-二氢喹啉 (EEDQ) 、半胱氨酸等购自alfa Aesar公司.参加反应的溶剂均纯化。
1.2 邻苯二甲酰半胱氨酸1a的合成。
取2.05g (0.01mol) 邻苯二甲酰甘氨酸放入250ML单口瓶中, 加入新纯化的的干燥的苯作为溶剂, 零度搅拌30分钟, 分批次加入PCl52.01g (0.01mol) , 投毕, 待温度回至室温65℃冷凝回流搅拌。反应结束后TLC点板检测, 旋蒸除去溶剂, 可以得到白色的邻苯二甲酰甘氨酰氯白色固体, 反应产率达到98%。
取0.5g半胱氨酸加入到40ml水中, 加入Na HCO3, 使半胱氨酸完全溶解, 此反应在冰浴下进行。待溶液温度零度以后, 将1.84g酰氯溶于一四二氧六环中, 分批次滴入到上述溶液中, 滴加完毕后撤去冰浴, 室温下反应2.5小时。TLC监测。取2mol的盐酸讲反应液进行酸化, 调节PH-=2。讲反应液直接进行抽滤, 得到滤渣用蒸馏水多次淋洗, 倒掉水层。再用乙酸乙酯进行淋洗。得到白色的光反应底物1a.m.p.209.1~211.4℃;
1.3 邻苯二甲酰半胱氨酸环肽2a的合成。
取0.32g (0.001mol) 1溶解在乙腈和水的溶液中, 在加入1.0ml (0.001mol) 四丁基氢氧化铵, hv5h10min, 光反应底物1a完全转化为2a, 得到反应液经过旋蒸, 经过柱层析分离提纯得到2a。熔点173~174.氢谱碳谱如下:
2 结果与讨论
在溶液中发生光反应底物1a的羧基被中和成羧酸盐3.hv光致激发态的3*的氮原子上的一个电子与激发态的羰基发色团之间发生单电子转移 (SET) 反应, 生成分子内双离子自由基4, 4失去一个CO2分子生成了中间体自由基5, 自由基5迅速发生邻位电子转移生成端位自由基6, 6发生分子内偶合反应生成半胱氨酸环肽2a.光反应合成环肽方法操作简单容易, 有良好的区域选择性, 以极高的产率去生成最终化合物, 经过SET反应得到的环肽化合物不仅产率很高, 并且分离提纯容易, 只需要用柱层析分离得到即可。这是合成环肽的化学进程中又一重要的里程碑。
摘要：本文主要研究以邻苯二甲酰亚胺为电子受体, 以半胱氨酸肽链为电子给体的新型分子内给受电子体系化合物, 在甲醇溶液中的光反应, 发展了环肽类化合物的方法.化合物1a在甲醇溶液中经连续的光诱导单电子转移 (SET) 历程生成了半胱氨酸环肽化合物2a。所有新化合物的结构均经核磁共振谱、高分辨质谱所确定。
关键词：光反应,单电子转移 (SET) ,环肽,邻苯二甲酰亚胺
参考文献
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