L-丙氨酸（共10篇）
L-丙氨酸 篇1
酪氨酸是维持细胞生长必备的氨基酸之一,而丙酪二肽作为一种新型培养基的组成成分,其合成方法多为酶促合肽[1,2,3],虽然反应效率较高,但由于酶的专一性和成本较高,不利于工业化。本文设计用甲醇保护的L-酪氨酸和氯甲酸苄酯保护的丙氨酸反应生成带保护基团的二肽,再通过碱解和加氢脱去保护基团,合成路线见图1,该方法反应条件温和,原材料价格低廉,具有一定的工业化价值。
1 试验部分
1.1 试验试剂与仪器
试剂:L-丙氨酸和L-酪氨酸,1-羟基苯并三氮唑(HOBt),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐(EDC-HCl),纯净水为饮用水,其余试剂均为市售工业试剂。
仪器:LC-10ATVP液相色谱仪测定,TENSOR27 型傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片),LC-MS-2010EV质谱仪,Avanceav 500 型核磁共振仪(CDCl3溶剂,TMS内标)。
1.2 实验步骤
1.2.1 酪氨酸甲酯盐酸盐2 的制备
向1L体系中加入甲醇600m L,冰盐浴降温至T< 0℃,缓慢滴加氯化亚砜31.6g,控温T < 0℃反应,滴毕,向体系加入L-酪氨酸40g,继续搅拌,撤去冰盐浴,缓慢加热至回流2h,降温至T < 50℃,减压浓缩得黄色粗品82g;甲醇/ 甲基叔丁基醚重结晶,得白色固体42g,收率82%,LC纯度99%。
1.2.2 Cbz保护丙氨酸3 的制备
向2L体系中加入L-丙氨酸89.0g,12% 氢氧化钠溶液900m L,冰盐浴降温至体系T < 0℃,缓慢滴加氯甲酸苄酯340g,滴毕自然升温至室温反应,不断补充氢氧化钠溶液,保持体系p H ≈ 12 反应,至p H无变化,缓慢加入18% 盐酸溶液至p H ≈ 8,加入乙酸乙酯洗涤水相至澄清,继续缓慢加入18% 盐酸溶液至体系p H < 1,乙酸乙酯1200m L提取水相,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩得白色粗品300g;乙酸乙酯/ 石油醚重结晶得白色固体182g,收率81%,LC纯度94%,ESI-MS(m/z): (222,M--H)。
1.2.3 Cbz保护丙氨酰酪氨酸甲酯4 的制备
向1L体系中加入酪氨酸甲酯盐酸盐39.3g,Cbz保护丙氨酸45.0g, HOBt 32.4g,四氢呋喃750m L,冰盐浴降温至体系T < -5℃,缓慢滴加三乙胺20.2g,滴毕,控温T < 0 ℃ 继续搅拌30min,加入EDCl45.8g控温T < 0℃反应,继续搅拌30min,撤去冰盐浴,自然升温至室温反应,体系中少量固体不溶,继续搅拌16h,浓缩反应液得黄色粘稠固体80g,溶入乙酸乙酯800m L,分别用饱和碳酸氢钠溶液和0.5mol·L-1盐酸溶液分次洗涤,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩得浅黄色粗品70g;乙酸乙酯/ 石油醚重结晶得白色固体55g,收率80%,LC纯度96%,ESI-MS(m/z):(401,M++H)。
1.2.4 脱甲酯保护中间体5 的制备
向500m L体系中加入Cbz保护丙氨酰酪氨酸甲酯35g,甲醇350m L,加热至40℃溶清,冷却至室温,缓慢滴加2mol·L-1氢氧化钠溶液220m L,滴毕,继续搅拌1h,缓慢加入2mol·L-1盐酸溶液调节体系p H=8~9,浓缩除去甲醇,向剩余水液加入2mol·L-1盐酸溶液调节体系p H<1,乙酸乙酯萃取,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩得白色粘稠物35g,收率90%,LC纯度91 %,ESI-MS(m/z):(387,M++H)。
1.2.5 L-丙氨酰-L-酪氨酸1 的制备
向500m L体系中加入脱甲酯保护中间体522.0g,10% Pd/C 4.4g,甲醇和水的混合液920m L,通H2( 约0.1MPa) 反应2h,过滤除去Pd/C,滤液减压浓缩得白色粗品20g,甲醇和纯净水分别打浆30min,过滤,得白色固体17g,收率77%,LC纯度99%。
1.3 产品鉴定
产品为白色晶体粉末,红外图谱如图2 所示,与分子结构相符;ESI-MS(m/z):(253,M++H);1NMR(D2O,500MHz),δ:7.1(d,2H);6.8(d,2H);4.4(m,1H);4.0(q,1H);3.1(dd,1H);2.9(dd,1H);1.5(d,3H)。
2 结论
本文所用氨基酸保护基材料低廉,合肽采用EDCl-HOBt体系,后处理纯化方法简单且收率较高;加氢脱保护时用甲醇/ 水混合体系替代原有的单一溶剂体系,有效避免反应过程中产物析出附着Pd/C催化剂导致其失活,优化后的反应体系加氢时间仅为2h(常温20~30℃反应),反应完毕经简单后处理纯度即可达LC > 99%。该合肽方法条件温和,具有一定的工业化意义。
L-丙氨酸 篇2
离子交换法从发酵液中提取L-亮氨酸
用离子交换法提取发酵液中的L-亮氨酸,比较了不同型号的强酸性阳离子树脂对L-亮氨酸的`静态吸附量和吸附动力学,其中以WA-2型树脂对L-亮氨酸吸附量最大、吸附速度快,适于L-亮氨酸的提取.测定了WA-2型树脂对L-亮氨酸的吸附等温线,并回归得到Freundlich方程.考察了固定床操作工艺条件,结果表明:发酵液经预处理后,以1BV/h流速上柱吸附,上柱量为2BV;再用0.3mol/L的氨水洗脱,速度为1BV/h,洗脱效果较好,L-亮氨酸回收率达到95.7%.提取过程中WA-2型树脂不会受到不可逆的污染,也没有机械损坏,其使用寿命不受影响.
作 者：刘辉 陈宁 LIU Hui CHEN Ning 作者单位：天津科技大学生物工程学院,天津,300457刊 名：离子交换与吸附 ISTIC PKU英文刊名：ION EXCHANGE AND ADSORPTION年，卷(期)：24(3)分类号：O647.3关键词：提取 L-亮氨酸 离子交换 吸附动力学
L-丙氨酸 篇3
关键词：L-精氨酸 溶氧 罐压 泡沫 聚醚类消泡剂
中图分类号：TS2；Q815 文献标识码：A 文章编号：文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
精氨酸属于人体半必须氨基酸，是合成蛋白质和肌酸的重要原料，具有多种生理功能，广泛应用于食品与医药行业等领域。目前的L-精氨酸多采用发酵法进行生产，雷剑芬利用黄色短杆菌生产L-精氨酸，产量达到了65g/L[1]，但与产酸过到119.7g/L[2] 的L-苏氨酸发酵相比，L-精氨酸发酵的产酸水平极相对较低，研究L-精氨酸配方与控制工艺等发酵条件，提高精氨酸发酵产酸水平具有重意义。
研究发现溶氧对于L-精氨酸发酵有重要影响[3]，通常既是营养因素，又是环境因素。许虹[4]等发供氧越高，L-精氨酸的生产量越大。泡沫的生成对精氨酸发酵有不利的影响，泡沫过多时容易冒顶跑料，造成染菌，泡沫过多还容易造成假溶氧，使L-精氨酸发酵供氧不足，导致菌体缺氧老化或死亡。因此控制和抑制L-精氨酸发酵过程的泡沫与提高发酵过程中的供氧水平相辅相成，同样重要。
1材料与方法
1.1 菌种
黄色短杆菌（Brevibacter ium flavum ）HXV305为广东环西生物科技股份有限公司技术中心菌种室保藏菌种。
1.2 培养基
1.2.1种子培养基（g/L）
葡萄糖30.0，磷酸二氢钾1.0，七水硫酸镁0.5，玉米浆干粉25.0，尿素1.0， VH 0.00005，VB1 0.00025，pH6.8～7.0；121℃灭菌20分钟。
1.2.2 发酵培养基（g/L）
葡萄糖100.0磷酸二氢钾1.5，七水硫酸镁0.6，VH0.0001，VB1 0.00025，硫酸铵40.0，玉米浆干粉30，pH7.0～7.2；121℃灭菌20分钟。
2 结果与讨论
2.1 溶氧对L精氨酸发酵的影响与控制
L-精氨酸发酵属于高耗氧发酵，溶氧不足时会严重抑制L-精氨酸的合成，导致生物细胞代谢转向所不需的化合物的合成，提高溶氧水平，对L-精氨酸发酵有利。影响溶氧的因素有通气量、机械搅拌转速、罐压等，再加大通气量与搅拌转速一方面会增加能源消耗，另一方面加大设备的损耗，增加生产成本，升高罐压是提高溶氧的有效途径。
合适的罐压，不仅可以提高溶氧，还可以保持罐内正压，防止染菌。不同罐压对L-精氨酸发酵的影响如图1所示，结果表明，0.08MPa是最适罐压，L-精氨酸产酸最高，达到了45.7g/L。随着罐压的升高，溶氧进一步提高，但产酸反而下降，這可能是因为罐压的提高，不仅提高了溶氧，也提高了CO2的溶解，CO2的过度溶解对菌体有毒害作用。
2.2 泡沫的生成与影响
L-精氨酸发酵培养基中的氮源比较中富，是重要的起泡物质，而且精氨酸通气量和搅拌转速比较大，加上菌体自身代谢旺盛，所以泡沫相对于其他的氨基酸发酵会比较多。泡沫过多，特别泡沫与发酵液界限明显的泡沫类型，会影响氧的传递速率，影响菌体对氧的摄取。另一方面，泡沫过多时，有时还会造成冒顶和跑料，增加染菌的机会。因此，抑制泡沫的生成对发酵有利。
控制和抑制泡沫生成的方式有很多，主要分为物理机械的方法和化学的方法两种。物理方法主要有超声波、机械搅拌、旋风分离等方法，化学的方法主要采用添加消泡剂的方式进行消泡。目前采用的消泡剂有天然油脂，聚醚类消泡剂，硅酮类消泡剂等。实验采用聚醚类消泡剂研究添加消泡剂后泡沫的三种状态对发酵的影响，结果如图2所示。从图中可以看出，添加消泡剂后，使泡沫完全消除，发酵产酸最高，达到48.88g/L。
3 结语
通过提高罐压，可以有效提高发酵液中的溶氧，在0.08MPa的压力下，对发酵的效果最好，产酸达到45.7g/L，在此条件下，再通过添加聚醚类消泡剂使发酵的液泡沫完全消除，并始抑制泡沫的生成，对发酵最有利，产酸达到了48.88g/L。
参考文献
[1] 雷剑芬.黄色短杆菌生产L-精氨酸发酵条件研究[J].发酵科技通讯，2009，38（3）：12-14.
[2] 冯志彬，程显好 等.正交旋转组合优化L-苏氨酸发酵的氮源[J].中国酿造，2009，209（8）：137-139.
[3] Takashi Utagawa.Arginine metabolism：enzymology，nutrition，and clinical significance.American Society for Nutriional Sciences，2004，134：2854-2857.
[4] 许虹，窦文芳 等.不同供氧水平对L-精氨酸分批发酵的影响[J].化工学报，2008，59（9）：2295-2301.
收稿日期：2015-04-20
L-丙氨酸在配合物领域的应用 篇4
通过对大量专利文献的分析和总结, 发现L-丙氨酸除了现有的应用领域, 国内的研究机构近几年开始采用L-丙氨酸等氨基酸制备配合物, 提供了L-丙氨酸应用的新视角和新思路。
1 微量金属元素添加剂
以L-丙氨酸为配体的配合物可以在补充生物体所需微量元素的同时补充氨基酸, 提高了生物吸收率。
中国科学院兰州化物所合成了一种二价铁-L-丙氨酸配合物, 作为铁离子添加剂[1]。
中国科学院过程工程研究所提供一种α-氨基酸铬 (III) 配合物, 由三价铬离子与L-丙氨酸螯合而成[2]。
2 催化剂
齐齐哈尔大学研制出了一种以1, 5-环辛二烯和L-丙氨酸为双配体的铑催化剂, 在含有铑盐的乙醇、水溶液中加入1, 5-环辛二烯, 得到[Rh (cod) Cl]2催化剂, 再加入L-丙氨酸的氢氧化钠溶液, 得到新型铑催化剂, 用于催化取代乙炔的手性聚合, 能够提高取代乙烯的聚合转化率和立体选择性[3]。
香港理工大学制备出了一种铑催化剂 (图1) , 其中L1为吡啶羧酸或2-乙烯吡啶或4-乙烯吡啶与丁烯酮、丙烯酸甲酯或丙烯腈的共聚物, 配体L2为吡啶羧酸或氨基酸, M为Co、Cu、Ni或Fe, 这一催化剂是双活性物种的正负离子性催化剂, 用于羰基化合成乙酸、乙酐的反应[4]。
巴斯夫股份有限公司提供一种含铱的氨基酸配合物 (图2) , 用于催化醇的胺化反应, 使用该催化剂有利于在较低的温度下选择性生成仲胺或叔胺, 获得较高的产率, 且反应中不需要加入碱。图2中X为卤素, 氨基酸可以为L-或D-α-氨基酸, 具体可以为丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等[5]。
巴斯夫欧洲公司制备出了一种负载型含锡催化剂, 将包含硝酸锡与丙氨酸配位剂的溶液施加于载体上得到, 该催化剂用于催化气相合成胺[6]。
3 席夫碱配体配合物
丙氨酸等氨基酸与醛类化合物合成席夫碱配体, 再与金属盐螯合得到席夫碱金属配合物, 广泛用于催化剂、医药以及电致发光等领域。
广西民族大学制成了一种用于氧化松香的席夫碱金属催化剂, 以丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸为有机胺, 与水杨醛等醛类化合物反应制得席夫碱配体, 与锌盐、铜盐、锰盐、镍盐等过渡金属盐配位得到席夫碱金属配合物, 这一配合物催化效率高、制备成本低、松香转化率高[7]。
西北师范大学合成了一种高分子负载三元氨基酸席夫碱金属铜配合物催化剂 (图3) , 以氯甲基化聚苯乙烯、2, 4-二羟基苯甲醛、丙氨酸、1, 10-邻菲罗啉和乙酸铜为反应原料制备, 可用于催化氧化乙基苯、异丙苯, 具有高转化率和高选择性[8]。
北京师范大学提供一种镓席夫碱四元配合物 (图4) , 由丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等氨基酸与水杨醛反应得到的席夫碱配体Li, 与bipy、phen等含氮杂环碱配体Li’和镓盐络合得到, 此配合物具有抗肿瘤活性, 同时具有较好的热力学及动力学稳定性[9]。
4 结语
1999年国内L-丙氨酸的年产量仅几十吨, 目前, 我国已有多家企业具备万吨级L-丙氨酸的生产能力。作为L-丙氨酸的生产企业, 寻找到更为广阔的下游应用行业是十分必要的, 专利技术汇集了行业中最新颖、最先进、也最具有工业应用前景的技术和研究, 经分析和总结得到的上述应用, 为L-丙氨酸的上游生产企业提供了产品应用的新思路和新方向, 对于生产企业开拓下游企业具有一定的指导和借鉴作用。由于L-丙氨酸的应用涵盖了工业原料、食品、药品等领域, 对于产品不同的需求, 也进一步督促国内的原料企业生产出低能耗、高纯度的产品, 以适应市场的需求。
参考文献
[1]CN101735089A.
[2]CN102898338A.
[3]CN104324750A.
[4]CN1672791A.
[5]WO2014023549A1.
[6]CN103945935A.
[7]CN101077960A.
[8]CN101450324A.
L-丙氨酸 篇5
L-苏氨酸在糖及维生素C水溶液中的体积性质
用精密数字密度计和粘度计测定了 L-苏氨酸在不同质量分数的葡萄糖、蔗糖及维生素 C水溶液中的密度和粘度,计算了 L-苏氨酸的极限偏摩尔体积、迁移偏摩尔体积、理论水化数和粘度 B系数,讨论了溶剂组成变化对 L-苏氨酸迁移偏摩尔体积、粘度 B系数和理论水化数的影响.结果表明,随混合溶剂中共溶质含量的增加,迁移偏摩尔体积、粘度 B系数随之增加;而由于葡萄糖、蔗糖及维生素 C分子与 L-苏氨酸荷电中心的`直接相互作用,削弱了两性离子带电中心对周围水分子的电致收缩效应,造成了理论水化数随其含量的增加而减小.
作 者：赵长伟 马沛生 朱春英 赵树志 作者单位：天津大学化工学院,天津,300072刊 名：物理化学学报 ISTIC SCI PKU英文刊名：ACTA PHYSICO-CHIMICA SINICA年，卷(期)：200420(1)分类号：O642关键词：L-苏氨酸,葡萄糖,蔗糖,维生素 C,体积,粘度
L-酪氨酸纯化工艺的优化 篇6
1 实验材料与仪器设备
1.1 材料
盐酸、烧碱、液氨均为工业级;303糖用活性炭:江西新岗山活性炭厂;L-酪氨酸粗品(Ⅰ)自产或外购。
1.2 仪器设备
耐酸搪瓷反应罐:河南郑州工业搪瓷厂;板框压滤机:河北石家庄;真空泵:安徽。
2 实验方法
2.1 工艺路线
优化的L-酪氨酸生产工艺路线及参数,见图1。
2.2 试验方法
2.2.1 L-酪氨酸的纯化
将一定量的L-酪氨酸粗品(Ⅰ)溶于pH 11.5~12.0 的烧碱溶液中,将溶液加热至60~65℃,加入303糖用活性炭进行搅拌脱色60 min后过滤;滤液于55℃,用2.0~4.0 mol· L-1盐酸溶液缓慢中和至pH8.5~10.0后搅拌冷却至40℃以下过滤、水洗,得L-酪氨酸(Ⅱ)。滤液调pH6.0回收利用。
2.2.2 重结晶
L-酪氨酸(Ⅱ)经盐酸溶液溶解,控制 pH 值为0. 5~1.0,将溶液加温至80℃,加入303糖用活性炭后搅拌脱色40 min,测定脱色液的透过率,当滤液的透过率(T)达到98.0%以上时过滤;控制滤液温度55℃,并用8~12%氨水溶液缓慢中和至pH2.5~3.0后搅拌冷却至40℃以下,过滤、收集沉淀并用水洗至无Cl- 后得L-酪氨酸精品。滤液回收利用。
以上所用盐酸均为:工业盐酸经过201树脂脱铁至(Fe)≤5×10-6。
3 结果与分析
3.1 按照试验方法2.2.1, 对L-酪氨酸粗品(Ⅰ)进行了两组对比试验。每组试验重复4次,共测出8个L-酪氨酸(Ⅱ) 比旋光度值。前4项(1#~4#)试验采用的是:在L-酪氨酸粗品(Ⅰ)的碱溶pH值、分解胱氨酸的温度、中和pH值保持不变的情况下,随着分解胱氨酸时间的延长,L-酪氨酸(Ⅱ)的比旋光度值逐步升高,趋向合格区域;后4项(5#~8#)试验是在碱溶pH值、分解温度、分解时间保持恒定的情况下,随着中和pH值的逐渐降低(pH10.0→pH9.0),比旋光度值逐步降低至合格区域。试验结果表明: 第8#的试验参数获得的纯化效果和收得率最佳,结果见表1。
3.2 根据表1的分析结果依照试验方法2.2.1-2.2.2,我们采用实验编号第8#的试验参数和工艺对不同来源的酪氨酸粗品(Ⅰ)进行了不同批次放大试验,取得了较好的效果。试验产品的主要质量指标均达到日本味之素(AJI92)和中国药典(CP2000)标准,结果见表2、表3。
4 结论与讨论
不同来源的L-酪氨酸粗品(Ⅰ)中含有大量的灰砂、铵盐、水分、胱氨酸及其它酸性氨基酸和中性氨基酸[4],其中铵盐、胱氨酸及其它酸性氨基酸和中性氨基酸在酪氨酸粗品(Ⅰ)中所占的质量份额为15%~30%不等,因此首先采取碱溶L-酪氨酸粗品(Ⅰ)的方法来去除胱氨酸及其它酸性氨基酸和中性氨基酸是十分有效的。因为酸性氨基酸和中性氨基酸的等电点在pI=2.7~6.0,当它们在pH9.0的碱性条件下时,形成带负电的可溶性物质,通过过滤方式来分离掉[5]。从表1可以看出,在该工艺条件的控制下,对于L-酪氨酸粗品(Ⅰ)中所含少量的胱氨酸,通过碱分解和对中和过程中pH值的控制起到了很好的效果。L-酪氨酸粗品(Ⅰ)的脱色采用的是重结晶用过的活性炭,进行回收利用,大大降低了酪氨酸的二次吸附及活性炭的用量。第二步重结晶时,活性炭用量的多少,直接影响产品的颜色及透过率(T) [6]。用量过多,成本增加,吸附酪氨酸量增高;用量过少,产品质量不能达标。根据以上试验结果表明:我们采用一步法分离纯化L-酪氨酸粗品(Ⅰ),使L-酪氨酸(Ⅱ)的比旋光度值达到标准范围(见表1),然后采取重结晶方式将脱色液透过率指标控制在T≥98%(见表2);通过对各技术参数的控制,在该工艺条件下,试验产品L-酪氨酸的主要质量指标均达到日本味之素(AJI92)和中国药典(CP2000)标准。工艺的简化、活性炭的回收利用以及滤液的循环使用,大大降低了生产成本,这为L-酪氨酸产品的应用与出口创汇打下了良好的基础。
参考文献
[1]郑达华.离心法分离毛发水解物L一酪氨酸[J].氨基酸杂志,1983,(4):3~7
[2]符浩勇,张春力.活性炭分离回收胱氨酸生产废弃物中的酪氨酸[J].氨基酸杂志,1992,14(1):21~29.
[3]郝静,张关永.正交试验优化精制酪氨酸的工艺条件[J].氨基酸和生物资源,2002,24(1):29~30
[4]刘娟,杨万政,张仲宇.由动物蹄壳中提取胱氨酸、酪氨酸[J].化学世界,1997,(9):483~485
[5]蔡平,付必如.胱氨酸粗制废液中胱、酪氨酸的回收与分离[J].氨基酸杂志,1990,(3):14
L-茶氨酸的性能及合成初探 篇7
茶氨酸是茶叶中的特有成分, 是茶叶中含量最多的氨基酸, L-茶氨酸又名谷氨酰乙胺, 英文名L-Theanine, 在高级绿茶新茶中含量丰富, 占干茶质量的1%-2%.其分子式为C7H14N2O3L-茶氨酸为白色晶体粉末, 熔点为214℃-215℃, 极易溶于水, 茶氨酸具有焦糖香和类似味精的鲜爽味, 能缓解苦涩味, 增加茶汤的香甜味, 还可以抑制其他食品的苦味和辣味, 达到改善食品风味的目的。
L-茶氨酸有以下作用和特点:
1.1 茶氨酸对中枢神经递质活性的影响。
研究发现茶氨酸可以明显促进脑中枢多巴胺 (dopamine) 释放, 提高脑内多巴胺生理活性。多巴胺是一种活化脑神经细胞的中枢神经递质, 其生理活性与人的感情状态密切相关。尽管目前人们对茶氨酸在大脑中枢神经系统的作用机制并不是十分清楚。但茶氨酸对精神和感情的影响无疑部分是来自对中枢神经递质多巴胺生理活性的作用。
1.2 茶氨酸的降压作用。
一般认为人体血压的调节是受中枢和末梢神经递质儿茶酚胺及5-羟色胺分泌量的影响。近年来的一些研究证明茶氨酸能有效的降低大鼠自发性高血压。Kimura等人认为茶氨酸的这一降压效果可能是来自对脑内中枢神经递质5-羟色胺分泌量的调节作用。茶氨酸显示出的降低高血压效果在一定程度上也可以被看作是一种安定作用。而这种安定作用则无疑会有助于身心疲劳的恢复。
1.3 茶氨酸对学习、记忆的影响。
木村等人报道过他们曾在Operanttest的研究中发现每天经口服用180mg茶氨酸的大鼠与对照组相比学习能力有一定的提高。另外, 在Avoidance test的研究中也确认了茶氨酸可以增强大鼠的记忆能力。
1.4 茶氨酸旷怡身心作用。
早在1975年, 木村等人曾报告过茶氨酸具有缓和咖啡因引起中枢过度兴奋作用。虽然, 茶叶中的咖啡因含量多于咖啡和可可, 但由于茶氨酸的存在使人们在饮茶时享受到一种咖啡和可可没有的旷怡身心的感觉。
1.5 茶氨酸是21世纪的安全的健康食品。
目前的保健食品市场上多数是为成人防病或改善作用的品种。像茶氨酸这种既不具有催眠, 又可以解消疲劳、降低血压和提高学习记忆能力的保健食品实为少见, 引人注目。
从茶叶中提取L-茶氨酸的生产成本很高, 无实际生产意义.目前, 国外报道的主要是化学合成、微生物发酵和植物细胞培养法生产L-茶氨酸, 国内在这方面的研究尚处于起步阶段。化学合成法具有价格低、成本低、益于工业化的优点。目前化学合成法是:先使谷氨酸脱水, 再与乙胺反应制得茶氨酸, 即谷氨酸-乙胺合成法。以下是对该方法的改进初探。
2. L-茶氨酸合称实验
2.1 试剂和仪器。
L-谷氨酸, 乙胺, 丙酮, 三苯基氯甲烷, 氯化亚砜, 无水乙醇, 无水甲醇, 乙酸, 浓硫酸, 浓盐酸等水浴锅, 冰箱, 搅拌器, 三口烧瓶, 抽滤器, 布氏漏斗等。
2.2 实验流程。
2.3 反应机理。
(1) 方法一.酯化反应在酸催化下进行, 由于氨基对相邻羧基的作用以及它的空间位阻效应, 酯化反应主要发生在离氨基较远的羧基上, 对氨基保护是L-茶氨酸的难点, 本实验采用三本甲基来保护氨基, 而且它能在较温和条件下以固态物质被脱除本实验用36%的乙酸溶液来除去三苯甲基。
(2) 方法二.L-谷氨酸用乙醇酯化较为困难, 此方法改为用氯化亚砜使L-谷氨酸酰化, 酰化后L-谷氨酸更容易与乙胺发生反应, 然后再用三苯基氯甲烷保护氨基。
2.4 实验步骤
方法一:
(1) 在250ml三口烧瓶中加入40ml无水乙醇和7.35g谷氨酸, 加入几滴浓硫酸, 放在水浴中温度控制50℃在电动搅拌的情况下反应4h, 得到浅黄色溶液。
(2) 冷却至室温, 抽滤得到L-谷氨酸-乙基酯的盐酸盐约5g。
(3) 用50ml甲醇溶解上步产物后, 先用氢氧化钠, 再用碳酸钠溶液调节至中性, 抽滤得5.05g产物:产率为57.7%。
(4) 将上步产物加热完全溶解在50ml丙酮中, 假如7.5g三苯基氯甲烷, 在50℃水浴中加热搅拌反应3h, 溶液分三层, 上层浅黄色, 中层为绿色, 下层是白色沉淀。
(5) 冷却后, 溶液为浅绿色, 生成大量晶状白色沉淀, 抽滤得产物。
(6) 加入30ml60%-70%的乙胺, 在50℃搅拌下, 反应3h, 使溶液均一, 再在水浴中加热10min, 除去过量的乙胺, 残留物为:n-三苯基-L-谷氨酸-r-乙酰胺。
(7) 冷却后, 加入30ml36%的乙酸, 在水浴中加热至沸腾, 并保持5min, 脱去三苯甲基, 再加入20ml水, 抽滤得到黄色溶液。
(8) 上步溶液蒸出溶剂, 在溶液中加入10ml无水乙醇, 24h后, 析出白色沉淀, 抽滤得到最终产物。
方法二:
(1) 在250ml三口瓶中加入2.94gL-谷氨酸, 40ml丙酮, 4m氯化亚砜, ph=1。
(2) 水浴蒸馏用碳酸钠溶液调节ph=7, 再减压蒸馏约15min得到黄色溶液。
(3) 加入40ml吡啶加热使上步产物完全溶于吡啶中, 加入4.5g三苯氯甲烷, 温度控制在40℃在装有冷却回流装置的三口烧瓶中搅拌反应12h, 反应后溶液呈淡黄色, 透明。
(4) 蒸馏出部分溶剂, 向其中加入60%~70%的乙胺15ml, 在室温下反应12h, 溶液呈淡黄色。
(5) 将溶液转移至烧杯中, 加入36%的乙酸30ml, 在水浴中加热至100℃保持5min。
(6) 冷却后抽滤, 得到淡黄色滤液。
(7) 在滤液中加15ml无水乙醇, 放置24h结晶, 得到少许产物。
3. 实验结果与检测
3.1 定性检测。
量取本品的水溶液 (1+1000) 5ml, 加入茚三酮溶液 (1+1000) 1ml, 加热8min, 显紫色.
3.2 液相色谱分析。
以异硫氰酸苯酯作衍生剂, 醋酸钠缓冲液与以氰梯洗脱, C18柱分离, 紫外243nm检测
色谱条件:Hypersil ODS柱 (water) ,
检测波长243nm,
柱温25C.
流动相:A:H2O;B:0.14mol/L醋酸钠, 0.5mol/L三乙胺, 以冰醋酸调节pH为6.4;C:乙氰;A:B:C=18:54:28.1
流速:1ml/min.
衍生剂:乙醇:水:TEA:PITC=0.35ml:0.05ml:0.05ml:0.05ml, 定溶于50ml水从茶氨酸标样和样品的高效液相色谱图的对比可以看出, 样品中生成了茶氨酸。
4. 实验结论
4.1
本实验在采用文献上的化学方法合成L-茶氨酸的基础上, 在催化剂选择, 反应时间, 反应条件等方面进行了改进和研究, 实验得到了目的产物, 但重复性不好。
4.2
本实验易溶于水的产物较多, 应在干燥的环境下进行.但由于实验条件的限制, 没能达到要求, 如:酸催化通入干燥的效果更好, 乙胺用99.5%的较好, 因此, 使L-茶氨酸的收率受到限制, 产率不高。
4.3
L-缬氨酸高产菌株的选育研究 篇8
L-缬氨酸属于支链氨基酸,是人体所需的八种必需氨基酸之一,在医药、食品等方面有广泛的应用[1]。医药上L-缬氨酸常被用来制造复合氨基酸输液和氨基酸注射液,高纯度的L-缬氨酸可被用来合成抗高血压药—缬沙坦和一种抗肿瘤药物[2]。食品中L-缬氨酸常用于风味剂、营养增强剂,如BCAA速溶粉等[3]。
近年来,低能离子束在微生物诱变育种方面的应用日趋广泛,并取得了良好的效果[4,5]。离子注入时的质量、电荷、能量等参数可以按需要进行设定,不仅使诱变具有相应的可控性和方向性,还可使诱变产生的效应比单一辐射更加丰富[6,7]。鉴于离子束诱变的独特性,通过与南京工业大学开展合作,利用N+注入设备对L-缬氨酸生产菌进行诱变,开辟了缬氨酸菌种诱变的新途径,国内还未见相关报道。经过多轮诱变后筛选得到一株稳定突变菌株,使菌株发酵能力有了明显提高,再次证明离子注入诱变在微生物育种方面的优势。
1 材料与方法
1.1 菌种
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum),本公司菌种。
1.2 培养基(%)
平板筛选培养基:葡萄糖0.5,蛋白胨1.0,酵母膏0.5,氯化钠0.3,琼脂1.8。
筛选发酵培养基:葡萄糖15.0,硫酸铵4.0,玉米浆4.0,磷酸二氢钾0.1,七水硫酸镁0.05,碳酸钙3.0。
1.3 低能N+注入与样品处理
用无菌水洗脱斜面制备成菌悬液,取一定体积涂布于空白培养皿上,风干后进行离子注入。使用能量20keV、N+剂量25×1013~200×1013cm-2进行注入,结束后用无菌水洗脱,涂布筛选平板培养基[8]。
1.4 快速筛选方法
将单菌落扩培后,接一环于装有20mL发酵培养基的三角瓶中,振荡培养96h后测定L-缬氨酸含量。
1.5 突变率的计算
通过发酵瓶实验对比诱变菌株和原始株的产酸能力。经平行实验发现,摇瓶间产酸差异小于4%。因此,产酸比原始株高4%以上的视为正突变株,低4%以下的为负突变株。正、负突变率是指正突变株、负突变株分别占全部被考察菌株的比率。
1.6 发酵培养基与培养条件优化
通过摇瓶发酵实验考察不同浓度的葡萄糖、玉米浆对发酵能力及糖酸转化率的影响,并确定最佳浓度。
通过摇瓶发酵实验考察不同摇瓶装量、不同发酵温度对发酵能力及糖酸转化率的影响,并确定最佳条件。
1.7 50L罐发酵研究
在50L发酵罐上对葡萄糖、OD562、发酵能力曲线进行研究。
1.8 分析方法
菌体浓度测定:取菌液用稀盐酸稀释25~100倍,在562nm处测定吸光值。
葡萄糖的测定:采用SBA—40生物传感分析仪测定。
L-缬氨酸测定:纸层析———分光光度计定量法[9]和液相色谱法测定[10]。
2 结果与分析
2.1 存活率曲线
统计不同N+离子辐照剂量下菌落成活的数量,以0剂量菌落个数为100%绘制存活率曲线,见图1。
由图1可知,随着N+离子注入剂量的增加,存活率曲线呈“马鞍型”,即先减小后增大再减小,这是离子注入诱变所特有的诱变效应的重要表现[11]。虞龙等[12]对产生的原因进行了分析:低剂量时离子只对细胞表面进行损伤,因而存活率较高;随着剂量的增加,细胞表面损伤严重,细胞内部产生的自由基、软射线等使存活率急剧下降[13];下降到一定程度时,细胞某种修复机制被激活,使得存活率有所回升;当剂量继续增大时,损伤已无法修复,存活率再次下降。
2.2 不同剂量下正负突变率
从图2可以看出,125×1013cm-2为N+最佳处理剂量。在此处理剂量下,总突变率和正突变率较高,均高于负突变率,说明在该剂量下进行诱变不仅突变株多,而且正突变株多于负突变株,对筛选工作有利。多次筛选后得到1株高产菌株,L-缬氨酸发酵能力达到38.0g·L-1,提高幅度为18.01%。
2.3 发酵培养基优化
2.3.1 葡萄糖对发酵的影响
在发酵培养基中采用10%、12%、14%、16%四种浓度的葡萄糖,分别进行摇瓶发酵,结果见表1。
从表中可以看出,随着葡萄糖浓度的增加,L-缬氨酸的发酵能力逐步提高,糖酸转化率先上升、后下降。综合考虑,摇瓶中葡萄糖最佳浓度为14%。
2.3.2 玉米浆对发酵的影响
缬氨酸发酵中常用玉米浆作为氮源,其成分比较复杂,含多种氨基酸、糖、生物素、无机盐等,不仅促进菌体生长,而且为菌体代谢提供必要的营养成分。在发酵培养基中分别添加2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的玉米浆,考察其对发酵的影响,结果见表2。
从表中可知,当玉米浆浓度为3.5%时,L-缬氨酸的发酵能力最强。作为唯一的有机氮源,玉米浆浓度低时,生长繁殖受到限制,OD值偏小,对产酸不利;玉米浆浓度过高时,OD值偏高导致消耗更多的营养物质,且杂质氨基酸也偏多。
2.4 发酵培养条件优化
2.4.1 装液量对发酵的影响
250mL三角瓶中分别装入10、15、30、45 mL培养基,接种发酵后测定L-缬氨酸的含量,结果见表3。
装液量的多少对菌体发酵的溶氧有影响。装液量偏小,水分蒸发会使发酵液粘度增大,对溶氧不利;装液量偏大,菌体在生长代谢中得不到足够的氧气,易生成有机酸。从表中可以看出,本实验最适装液量为15mL。
2.4.2 温度对发酵的影响
温度对酶活性有重要影响,本实验测定了不同温度对L-缬氨酸发酵的影响,见表4。
从上表可以看出,L-缬氨酸的最适发酵温度为32℃。在此温度下,菌体生长速度适宜,产酸水平高;温度太低,菌体生长速度慢,消耗葡萄糖速率低;温度太高,酶活力低,易导致发酵异常。
2.5 50L罐发酵曲线
利用50L发酵罐开展高产菌株的发酵实验,相关曲线如图3所示。
从图3可以看出,50L罐的发酵过程可以分为3个阶段:0~24h为发酵前期,OD562增长比较迅速,葡萄糖下降明显,但基本不产缬氨酸;24~56h为发酵中期,OD562继续增加,但速率变慢,此阶段对葡萄糖的浓度进行控制,缬氨酸生成的速度很快;56~70h为发酵后期,OD562增速明显放慢,到发酵结束时葡萄糖浓度基本为0,缬氨酸的产量可达70g·L-1以上。
3 结论
本研究采用N+注入对产L-缬氨酸的工业菌株进行诱变选育,并对产生的生物学效应进行初步研究。经多轮诱变选育后得到一个稳定突变株。与原始株相比,摇瓶发酵产L-缬氨酸的能力达到38.0g·L-1,提高幅度为18.01%。进一步对摇瓶中葡萄糖、玉米浆的浓度及发酵培养条件进行优化,优化后参数如下:葡萄糖14.0%,硫酸铵4.0%,玉米浆3.5%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸镁0.05%,碳酸钙3.0%;摇瓶装量为15 mL,发酵温度为32℃。在此条件下,摇瓶中产L-缬氨酸能力达40.6g·L-1。50L发酵罐的实验表明,L-缬氨酸的发酵能力可达70g·L-1左右。
L-异亮氨酸产生菌的选育 篇9
L-异亮氨酸产酸水平的高低主要受支路代谢及反馈调节的控制, 因此选育营养缺陷型和抗结构类似物突变菌株能有效地提高异亮氨酸的产量[3,5]。由L-异亮氨酸生物合成途径可知, 筛选赖氨酸缺陷型菌株可解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制作用, 使代谢更加流畅的通向异亮氨酸合成。另外选育S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸 (AEC) 和α-AB的抗性突变菌, 可遗传性的解除菌体的自身反馈抑制作用。本研究以黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum) BF420为出发菌株, 拟通过紫外线、亚硝基胍 (NTG) 复合诱变等技术, 筛选L-异亮氨酸高产突变株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原始菌种
黄色短杆菌BF420, 为实验室保藏菌株。
1.1.2 培养基
(1) 完全培养基
葡萄糖5g·L-1, 蛋白胨10g·L-1, 牛肉膏10g·L-1, 酵母浸粉3g·L-1, 氯化钠5g·L-1, 琼脂18~20g·L-1, pH 7.0。
(2) 基本培养基
蔗糖30g·L-1, 尿素2g·L-1, 醋酸铵3g·L-1, KH2PO4·3H2O 1.5g·L-1, K2HPO4·3H2O3g·L-1, MgSO4·7H2O 0.4g·L-1, FeSO4·7H2O0.01g·L-1, MnSO4·H2O 0.01g·L-1, VH 2mg·L-1, VB13mg·L-1, 琼脂20g·L-1, pH 7.0。
(3) 无氮培养基
葡萄糖5g·L-1, 柠檬酸钠1g·L-1, KH2PO4·3H2O 1.5g·L-1, K2HPO4·3H20 3g·L-1, FeSO4·7H2O 0.01g·L-1, MgSO4·7H2O 0.5g·L-1, MnSO4·H2O 0.01g·L-1, VH 0.14 mg·L-1, VB1l mg·L-1, pH 7.0~7.2。
(4) 二氮培养基
葡萄糖5g·L-1, 硫酸铵5g·L-1, 柠檬酸钠1g·L-1, KH2PO4·3H2O 1.5g·L-1, K2HPO4·3H2O3g·L-1, FeSO4·7H2O 0.01g·L-1, MgSO4·7H2O 0.5g·L-1, MnSO4·H2O 0.01g·L-1, VH 0.14mg·L-1, VB11mg·L-1, pH 7.0~7.2。
(5) 抗结构类似物培养基
完全培养基+AEC、完全培养基+α-AB
(6) 发酵培养基
葡萄糖150 g·L-1, 玉米浆28 g·L-1, (NH4) 2SO428g·L-1, MgSO4·7H2O 0.5g·L-1, KH2PO40.5g·L-1, pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 诱变方法
以黄色短杆菌BF420为出发菌株, 按常规诱变育种进行诱变处理[6,7]。
1.2.2 筛选方法
(1) 营养缺陷型菌株的检出与鉴定
将上述经紫外线和亚硝基胍诱变处理的菌体用完全培养基悬浮, 30℃振荡培养过夜。将培养液离心洗涤, 用无氮培养基冲悬, 再转移到含50"g·mL-1青霉素的二氮培养基中, 以淘汰野生型 (青霉素能抑制细胞壁肽聚糖的连接, 阻止细胞壁的合成, 从而杀死野生型细胞, 使营养缺陷型细胞因不能正常生长而保留下) 。将处理后的诱变菌悬液稀释至一定的浓度, 涂布于完全培养基, 于恒温培养箱30℃培养, 待长出菌落, 用灭菌的牙签挑取单菌落, 一一对应接种于完全培养基平板和基本培养基平板。在完全培养基平板上生长, 而基本培养基平板上对应位置不长的菌株, 则为营养缺陷型菌株。
氨基酸营养缺陷型的筛选采用滤纸片法, 具体过程参见文献[7]。
(2) 抗结构类似物菌株的筛选
将筛选到的营养缺陷型菌株, 接种于含一定量α-AB及AEC的抗性培养基中, 30℃培养, 若长出菌则为抗结构类似物α-AB及AEC的菌株。
(3) 发酵筛选
将筛选到的突变菌株在斜面培养基上活化后, 接种于发酵培养基, 30℃振荡培养。将出发菌株进行同步发酵, 作为对照。用纸层析-色斑洗脱比色法[8]和HPLC法[9]测量产酸量:先用纸层析法目测挑选L-异亮氨酸处斑点比出发株大, 颜色深的菌株, 进一步摇瓶复筛, 用色斑洗脱比色法定量分析, 最后经HPLC法进一步测定。
1.2.3 突变株遗传稳定性测定
将上述筛选到的突变株传代5次, 测定其缺陷类型、抗性特征, 并通过纸层析-色斑洗脱比色法测定异亮氨酸产量, 确定突变株的遗传稳定性。
2 结果
2.1 赖氨酸缺陷型菌株的选育
从原始菌株BF420出发, 采用紫外线和NTG复合诱变处理, 经完全培养基、基本培养基及氨基酸补充基本培养基, 共获得87株营养缺陷型菌株, 经滤纸片法鉴定发现12株为氨基酸缺陷型菌株, 将12株突变株进行摇瓶发酵初筛, 发现其中一株赖氨酸缺陷型菌株35号, 从纸层析图上可初步看出其产L-异亮氨酸较出发菌株高 (见图1) 。从L-异亮氨酸的合成途径和代谢调节机制可知, 选育Lys营养缺陷型菌株, 有利于切断分支代谢, 使代谢流向L-异亮氨酸合成方向。
赖氨酸缺陷型菌株BF35的鉴定见图2, 从图中可知, 在基本培养基上补充氨基酸, 只有在加有赖氨酸的滤纸片周围长出了菌, 说明该菌株为赖氨酸缺陷型。
BF35发酵液经测定后产酸量为5.3g·L-1, 比原始菌株提高了51%。可见切断Lys的代谢支路可以提高L-异亮氨酸的产量。
注:图中1、2、3、4滤纸片上添加的氨基酸分别为亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸
2.2 抗结构类似物菌株的筛选
2.2.1 AEC抗性菌株的筛选
AEC为Lys的结构类似物, 筛选抗AEC的菌株能有效地解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制作用。将BF35活化, 接种于含有一定浓度的AEC抗性培养基中, 培养10d。最后筛选到一株产酸量高的AEC抗性突变株BF359, 经测定异亮氨酸含量为5.9g·L-1 (表1) , 比原始菌株BF420提高了69%, 比BF35提高了11%。
2.2.2 α-AB抗性菌株的筛选
苏氨酸脱氨酶是L-异亮氨酸合成途径中的关键酶, 异亮氨酸对其有反馈抑制作用[10]。选育抗α-AB的抗性突变菌, 可解除异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的反馈抑制作用, 从而提高异亮氨酸的产量。将BF359活化后接种于含有一定浓度α-AB的抗性培养基中, 最后筛选到一株产酸量有进一步提高的抗性突变菌BF3510, 经测定产酸量为6.4g·L-1 (表1) , 比原始菌提高83%。
2.3 遗传稳定性测试
将筛选到的突变株BF3510连续传代, 测定每代的产酸量, 同时检测F1代与F5代的缺陷型及抗性情况, 测定其遗传稳定性。结果如表2。
注:表中产酸量为三个平行样的平均值;“-”表示未检测
菌株连续转接5代, 对每代的产酸量进行分析, t检验结果为|t|=1.91
3 讨论
L-丙氨酸 篇10
近年来,D-氨基酰化酶(D-Aminoacylase, 也叫 N-Acyl-D-amino acid amidohydrolase )的研究逐渐增多。D-氨基酸酰化酶可以直接水解乙酰-D-氨基酸而得到D-氨基酸,未水解的乙酰-L-氨基酸进行消旋处理成乙酰-D,L-氨基酸继续拆分。工艺路线如图所示。
这种方法工艺简单、收率较高、产品光学纯度高,具有很好的发展前景。本文进行了以D,L-苯丙氨酸为原料经D-氨基酰化酶制备D-苯丙氨酸的研究。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
D型氨基酰化酶(D-Aminoacylase, EC 3.5.1.81)购自日本天野酶制品株式会社,以乙酰-D,L-苯丙氨酸为底物时的酶活为1.0×107 U·g-1。D,L-苯丙氨酸购自安徽恒锐新科技有限公司,D061强酸性阳离子交换树脂购自天津市和成科技有限公司,其它试剂均为市售分析纯试剂。
WZZ-2B自动指示旋光仪、722N分光光度计、DWS-51钠度计、PHS-3B酸度计、WRS-2A熔点仪均为上海精密科学仪器有限公司产品。
1.2 乙酰-D,L-苯丙氨酸的制备
将40 g NaOH和165 g D,L-苯丙氨酸溶于400 mL去离子水中,在5℃下,边搅拌边滴加醋酸酐和4 mol·L-1 NaOH溶液使溶液的pH值保持在9.0～10.0之间,用茚三酮试剂检测无残留氨基酸后,用盐酸调pH值为2.0～2.5,低温静置得到乙酰-D,L-苯丙氨酸结晶。
1.3 乙酰-D,L-苯丙氨酸的酶法拆分
将D-氨基酰化酶溶解于0.2 mol·L-1醋酸钠溶液中,配制成1×107U·L-1 的酶液。准确配制0.5 mol·L-1乙酰-D,L-苯丙氨酸溶液(用氢氧化钠调pH8.0),预热到40℃后加入一定量的酶液,定时取样,样品迅速煮沸灭酶活,用纸层析法检测D-苯丙氨酸的含量。
1.4 D-苯丙氨酸的分离
拆分结束后,在拆分液中加入少量活性炭脱色,再用去离子水稀释1倍,加热到70℃后过H+型D061树脂柱(柱子的内径为2.5 cm,有效高度为30 cm,内装离子交换树脂150 mL,带恒温夹套,夹套温度为70℃,流速300 ml·h-1)。用0.2 mol·L-1氨水进行解析,收集含有D-苯丙氨酸的组分,真空浓缩至小体积,用醋酸调pH为5.0,低温静置析出D-苯丙氨酸结晶。
1.5 乙酰-L-苯丙氨酸的消旋
乙酰-L-苯丙氨酸和醋酸组成的混合溶液减压浓缩至小体积,用氢氧化钠调pH,继续减压浓缩直至温度达到150℃,加入一定量的醋酸酐,保温反应一段时间后,加入冷水进行冷却、稀释,用盐酸调pH2.0～2.5,低温静置得到乙酰-D,L-苯丙氨酸结晶。
2 结果和讨论
2.1 乙酰-D,L-苯丙氨酸的制备
乙酰-D,L-苯丙氨酸采用在碱性条件下进行酰化,实验发现所需的醋酸酐的量与氢氧化钠加入方式有很大的关系。实验采用两种方案,第一种方案为将一定量氢氧化钠和D,L-苯丙氨酸全部溶解于水中后再滴加醋酸酐;第二种方案为将D,L苯丙氨酸溶解后,同时滴加醋酸酐和4 mol·L-1的NaOH溶液,始终保持溶液pH9～10。实验发现第一种方案的原料的最优比例为:D,L苯丙氨酸︰氢氧化钠∶醋酸酐=1︰2.5︰1.3,第二种方案的最优比例为:1︰2.2︰1.1。第二种方案明显优于第一种方案。
2.2 拆分实验
给酶量对拆分过程有着重要的影响,给酶量大则反应所需的时间短,给酶量小则所需的时间长。实验考察了不同的给酶量对酶拆分过程的影响。从图1中可以看出,在不同的给酶量条件下,拆分率在反应的初始阶段均迅速增加,但随着时间的延长,拆分率增加的越来越慢。这是因为酶在溶液中容易失活,在反应的初始阶段,酶活较高,随着反应的进行酶活逐渐下降,同时由于底物浓度降低和产物浓度增高产生的抑制作用,24 h 后酶反应基本停止。从图1中可以看出,在给酶量为1×104U·L-1和2×104U·L-1时,最终的拆分率分别为55%和85%左右。当给酶量为3×104U·L-1和4×104U·L-1时,拆分率均可达95%以上,但二者所需要的时间不同。给酶量为3×104U·L-1时,达到95%的时间为24 h左右,而给酶量为4×104U·L-1时,达到95%所需的时间只有5 h左右。从经济上考虑,3×104U·L-1为合适的给酶量。
2.3 D-苯丙氨酸的分离
采用D061树脂进行了D-苯丙氨酸的分离研究,流出液的组成和pH如图2所示。酶拆分液中可与阳离子交换树脂进行离子交换的物质有D-苯丙氨酸和Na+,二者在D061树脂上发生竞争吸附,Na+不断置换已经交换在树脂上的D-苯丙氨酸,这样就在离子交换树脂柱中形成上层为Na+下层为D-苯丙氨酸的两个层带,流出液中先出现D-苯丙氨酸后出现Na+。用茚三酮显色和钠度计监控始点和终点,收集含有D-苯丙氨酸的组分(图中500 mL～1000 mL),这一组分重新上柱,用0.2 mol·L-1氨水进行解吸,解吸液真空浓缩,低温结晶。经过多次循环操作,计算出D-苯丙氨酸的收率为95.4%。D-苯丙氨酸重结晶并干燥后纯度为99.8%,熔点为283℃,旋光度为D20=+35.0(C=1,水)。
2.4 乙酰-L-苯丙氨酸的消旋
本文参考文献[8],采用乙酰-L-苯丙氨酸熔融状态下进行消旋,最佳实验参数为:温度为150℃,pH值为6.0,醋酸酐质量分数为5%,反应时间为30 min,反应结束后加入5倍体积冷水进行冷却、稀释,用盐酸调pH为2.0～2.5,冷却得到大量的乙酰-D,L-苯丙氨酸。采用此方法可以得到旋光度为0的乙酰-D,L-苯丙氨酸,收率为92.8%。
3 结论
在指定的条件下,3×104U·L-1的给酶量可以对0.5mol·L-1的乙酰-D,L-苯丙氨酸进行较彻底的拆分。酶拆分液通过阳离子交换树脂柱进行D-苯丙氨酸的分离,D-苯丙氨酸的收率为95.4%。过柱液真空浓缩至熔融,加入一定量的醋酸酐即可得到旋光度为0的乙酰-D,L-苯丙氨酸。采用D-氨基酰化酶拆分制备D-苯丙氨酸,工艺简单,收率较高,具有很好的工业应用价值。
参考文献
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