精氨酸及其研究

精氨酸及其研究（精选5篇）

精氨酸及其研究 篇1

L-精氨酸是一种半必需氨基酸, 其与瓜氨酸和鸟氨酸共同参与尿素循环, 同时也是内源性一氧化氮 (NO) 合成的一个前体。该反应由NO合酶催化, 同时生成L-瓜氨酸。

L-精氨酸能有效地降低正常人及高血压患者的血压[1], 而瓜氨酸在代谢上和精氨酸密切相关, 但目前对瓜氨酸和高血压关系的研究还很少。本实验旨在对精氨酸和瓜氨酸的降血压作用进行比较, 并探讨其降压机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组雄性SD大鼠30只, 体重200～220 g, 购自山西医科大学实验动物中心。

所有大鼠随机分为2组, 一组为精氨酸组, 一组为瓜氨酸组。2组大鼠在实验前测量血压, 血压测定采用尾套法, 连续测3次, 取平均值。

1.2 高血压模型制备

所有大鼠使用左旋硝基精氨酸 (L-NNA) , 每日腹腔注射15 mg/kg, 分2次注射, 连续注射7 d, 并在第7天测量血压。造模后2组大鼠血压较造模前均明显升高, 2组均造模成功。造模后2组大鼠血压无明显差异, 见表1.

1.3 实验方法

造模成功后, 继续维持原剂量使用L-NNA.测定2组大鼠实验前的血浆内皮素 (ET) 和一氧化氮 (NO) 含量。ET测定采用放射免疫法, 试剂盒购自中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所;NO测定采用硝酸还原酶法, 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。上述各指标测定均按试剂盒说明书严格执行。

精氨酸组使用L-精氨酸灌胃0.3 g/kg, 每日1次;瓜氨酸组使用L-瓜氨酸灌胃0.3 g/kg, 每日1次。2组喂养6周后, 测量血压和血浆ET与NO含量。

1.4 统计学方法

数据以均数±标准差表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验前后2组大鼠血压比较

见表2.

2.2 实验前后血浆ET和NO含量比较见表3、表4.

3讨论

Rector等认为, 连续6周口服L-精氨酸将明显增加心力衰竭患者运动时的肢体血流和动脉弹性, 同时血浆内皮素水平也明显降低[2]。另一项研究表明, 心力衰竭患者在连续4周使用L-精氨酸后, 桡动脉舒张增加了8.8%[3].

从本次实验结果来看, 精氨酸对高血压大鼠有降压作用, 同时可以降低血浆ET含量, 并升高血浆NO含量。

研究证明高血压存在不同程度的内皮细胞功能障碍[4], 而血浆ET和NO含量和内皮细胞功能密切相关。因此精氨酸可能是通过抑制ET的生成并促进NO的生成, 影响血管的舒张程度, 从而发挥降血压的作用。

L-瓜氨酸可以通过转变为L-精氨酸来发挥降血压作用。从实验结果来看, 同样剂量的L-瓜氨酸和L-精氨酸相比, L-瓜氨酸降血压作用更强。

L-瓜氨酸可在内皮细胞、肾细胞等细胞中转变为L-精氨酸, 由于L-瓜氨酸无需经肠肝代谢, 因此口服L-瓜氨酸比口服L-精氨酸本身更能增加L-精氨酸的血液浓度。由于L-瓜氨酸不是精氨酸酶的底物, 因此它不会诱导该酶的表达, 也不会激活该酶的活性。当给予L-瓜氨酸 (3.8 g/m2体表面积) 4 h后, L-精氨酸的最大浓度可以增加227%, 而使用同样剂量的L-精氨酸仅能增加90%[5].因此L-瓜氨酸可以比同样剂量的L-精氨酸发挥更强的降压作用。

虽然通过本实验来看, 精氨酸可能通过改善血管内皮功能来发挥降压作用, 但其如何改善血管内皮功能以及是否有其他机制, 还有待于今后的进一步研究。同时瓜氨酸的降血压作用是否有独立于精氨酸以外的机制, 也有待于进一步的研究。

摘要：目的 对照分析精氨酸和瓜氨酸对大鼠血压影响的差异。方法 雄性SD大鼠30只, 制备高血压模型后, 随机分为2组, 分别使用L-精氨酸和L-瓜氨酸治疗。比较实验前后大鼠的血压与血浆内皮素 (ET) 和一氧化氮 (NO) 含量。结果 2组大鼠实验后的血压与血浆ET和NO含量有显著差异, 瓜氨酸组血压和血浆ET含量下降较明显, 而血浆NO含量上升较明显。结论 精氨酸可能是通过改善内皮功能来发挥降压作用, 而瓜氨酸比精氨酸降压作用更强。

关键词：精氨酸,瓜氨酸,血压,血浆ET和NO含量

参考文献

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精氨酸及其研究 篇2

[关键词] 复发性口腔溃疡；精氨酸酶；一氧化氮；ELISA

[中图分类号] R781.5   [文献标识码] B   [文章编号] 2095-0616（2012）02-71-02

Expression of arginase and the level of severity of ulcers in the peripheral blood of ROU patients and their correlation

WANG Dong1  SUN Jijun2  LI Yanjun1  

1.Binzhou Medical University,Binzhou 256603,China;2.Department of Oral Medicine,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603,China

[Abstract] Objective To investigate the level of arginase in the peripheral blood of ROU patients and the mechanism of recurrent oral ulcers. Methods The peripheral blood was obtioned from patients and controls,ELISA was used to detect the level of Arginase. Results The patients with ROU were signifiantly higher than the healthy control group(P＜0.05),and arginase was correlated positively with the level of severity of ulcers. Conclusion The expression of arginase in the peripheral blood of ROU patients plays an important role in the development of ROU.

[Key words] Recurrent oral ulcer;Arginase;NO;ELISA

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer，ROU）是一种以复发性、周期性、自限性为特点的口腔黏膜灼痛性溃疡[1]，多发生于口腔非角化黏膜，患病率居口腔黏膜病首位，其病因与遗传、免疫、环境等因素密切相关。虽然对于该病的发病机制和治疗已经进行了很多研究，但病因及致病机制至今尚未明确。本实验通过观察健康者及口腔溃疡患者外周血中精氨酸酶（Arg）水平的变化，探讨精氨酸酶在ROU发生发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

滨州医学院附属医院口腔内科门诊根据复发性口腔溃疡诊断标准诊断为ROU的患者30例作为实验组，其中男14例，女 16例；年龄 19～56岁；另从体检人群中选择口腔黏膜健康者10名作为对照组，其中男 4例，女6例；年龄25～53岁，所有研究对象均知情同意。实验组外周血样本均在发病期采集，同时采集健康人外周血样本。ROU患者的纳入标准：（1）在过去6个月内，每个月至少发病1次，发病时期没有接受任何系统性治疗。（2）具有“黄、红、凹、痛”的临床特点。（3）周期性、复发性和自限性。（4）无全身疾病，女性无妊娠，没有任何系统性疾病或者炎症性疾病，在过去2个月内没有服用任何免疫药物，均为非吸烟者。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器

Human Arginase ELISA Kit （BG公司），酶标分析仪（深圳雷社生命学股份有限公司），电热恒温培养箱（山东潍坊精鹰医疗器械有限公司），移液管（eppendorf，德国），超低温离心机（eppendorf，德国）。

1.3 样本采集和处理

实验组与对照组均于清晨空腹采肘静脉血2 mL，离心 （4℃，3 000 r/min，10 min），分离血浆，-20℃冰箱保存。

用注射针头蘸取龙胆紫在实验组患者溃疡上下左右四限处刺入黏膜，标记溃疡部位和测量溃疡直径大小，并询问患者月发作次数，统计自行愈合时间和间歇期。

1.4 ROU患者外周血精氨酸酶的测定

取上述冻存样本按照Human Arginase Elisa试剂盒要求，按照标准品的次序分别加入100 μL标准品溶液，空白微孔中各加入100μL的样品，空白孔加入100μL蒸馏水，37℃孵育1 h，洗板后加入显色剂，10 min后终止反应，全自动酶标仪450 nm处进行检测。

1.5 统计学处理

用 SPSS 11.5统计软件进行统计分析，实验组与对照组比较采用单因素方差分析，实验组血浆Arg水平与口腔溃疡严重程度的关系采用直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组患者临床指标分析

2.2 两组患者外周血中Arg水平的比较

本实验ELISA检测发现ROU患者精氨酸酶含量的表达均高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01），精氨酸酶在ROU中的表达均高于健康对照组（P＜0.01），且重型和中型的含量高于轻型，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

注：与正常对照组比较， *P＜0.01

2.3 ROU患者溃疡严重度与外周血Arg含量的相关性分析

本实验发现 ROU患者溃疡严重度与外周血Arg含量的表达呈正相关（r=0.99，P＜0.05）。见图1。

图1  ROU的严重程度与Arg含量的相关性分析

3 讨论

精氨酸酶是广泛存在于机体的以精氨酸为底物的一种双核含锰金属酶，参与体内多种生理过程， 它既可由机体通过外源性的食物摄入，也可通过内源性途径自身合成。精氨酸酶与口腔很多疾病有着密切的关系，有学者对牙周炎患者唾液中的精氨酸酶活性进行检测，发现牙周炎患者唾液中精氨酸酶的活性明显高于健康人[2]，但关于精氨酸酶在ROU患者外周血中的表达至今还尚未见报道。

Arg的催化底物是L-精氨酸，而一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）也能够催化L－精氨酸生成NO，NO本身具有抗菌、抗炎活性，可以阻止血小板的凝集，调节血管平滑肌的反应，也可以增强口腔内一些组织的血管传导性，此外，NO能够调节或调整机体的免疫功能，对于维持口腔内正常菌群与宿主的共生关系及增强口腔和消化道抵抗病原微生物的能力均起到重要的作用[3]，Arg与NOS竞争同一底物，从而抑制一氧化氮产生。本实验研究结果显示，ROU患者精氨酸酶含量表达均高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.01），Arg含量的升高，使得NO生成减少，黏膜组织的细菌易感性升高，血管通透性增高，炎症渗出物增加，从而加重了牙龈组织的炎症。

本研究发现溃疡患者血浆中的Arg含量升高，而且重型和中型的含量均高于轻型，差异具有统计学意义（P＜0.01），同时，溃疡患者血浆中Arg的含量与溃疡的严重程度呈正相关（r=0.99，P＜0.05）。ROU患者外周血中Arg含量的增多，导致尿素循环中的代谢产物鸟氨酸含量增加，鸟氨酸作为多胺的前体，可促进细菌大量的生长繁殖[4]，加速了溃疡疾病的进程。Arg作为机体新陈代谢的一种十分关键的酶，在ROU疾病的发生发展中发挥了重要作用，为进一步探索ROU的发病机制与酶的关系提供了重要依据，期待有进一步的研究为ROU的治疗提供理论依据。

[参考文献]

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[3] 袁晓琴，孙莲芬.一氧化氮及其合酶在口腔疾病中的作用研究进展[J].新医学，2008，39（11）：756-757.

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精氨酸及其研究 篇3

1 实验材料

1.1 主要试剂与仪器

L-精氨酸(L-Arginine,纯度>99%),美国Sigma公司;低分子肝素(平均相对分子质量4500 Da,抗Xa效价105 U/mg),杭州九源基因工程有限公司);戊巴比妥钠(纯度>99%),美国Sigma公司;电子天平,德国赛多利斯天平有限公司;磁力搅拌器,上海司东仪器有限公司。

1.2 动物

健康SD雄性大鼠,体重(200±20)g,由中国药科大学实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 LMWH-精氨酸溶液的制备

按照表1的处方,将不同比例的LMWH与精氨酸溶解在10.0 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中即得。

2.2 大鼠十二指肠给药的血液凝固实验

取健康雄性SD大鼠(200±20)g30只,正常饮食1周;随机分为5组(n=6),试验前禁食12 h,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg),在鼠板上固定后沿腹中线剖开腹腔,皮下注射组(Sc.组)皮下注射LMWH水溶液(LMWH 20 U/kg);对照组(Control组)十二指肠处注入LMWH水溶液(LMWH 200 U/kg);试验组在十二指肠处分别给予表1中A(A组)、B(B组)、C(C组)处方(LMWH 200 U/kg),缝合伤口,给药后于0、0.5、1、2、4、6、 8 h在大鼠眼底静脉丛取血,弃去第1滴,滴3滴于载玻片两端,计时,用干燥针头挑动,当挑出第1根血纤蛋白丝时,停止计时,取3滴的平均值即为各取血时间的血液凝固时间。以用药后各时期与用药前(0 h)血液凝固时间的差值计算血液凝固时间延长百分率[7],绘制血液凝固时间延长百分率和时间的关系曲线,采用梯形面积法计算LMWH血液凝固时间延长百分率——时间曲线下的面积(AUC)。LMWH十二指肠给药的药效学相对生物利用度计算方法如下式:

undefined

式中,PA为LMWH十二指肠给药相对于皮下注射LMWH的相对生物利用度;AUCoral和AUCs.c.分别为十二指肠给药和皮下注射LMWH的血液凝固时间延长百分率——时间曲线下面积;DOSEoral和DOSEs.c.分别为十二指肠给药和皮下注射的LMWH剂量。

2.3 大鼠在体肠袢法给药的血液凝固实验

取健康雄性SD大鼠(200±20)g 18只,正常饮食1周;随机分为3组(n=6),考察表1中C处方在体肠袢法给药的抗凝血效果。大鼠实验前禁食12 h,用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg),在鼠板上固定后沿腹中线剖开腹腔,小肠分为3段:自幽门以下2 cm处向下取10 cm为十二指肠段,幽门以下15 cm向下取10 cm为空肠段,盲肠上端2 cm向上取10 cm为回肠段,各肠段两端结扎。肠袢中给药(LMWH 200 U/kg),缝合伤口,给药后于0、0.5、1、2、4、6、8 h在大鼠眼底静脉丛取血。血液凝固时间测定、血液凝固时间延长百分率计算、血液凝固时间延长百分率——时间曲线下的面积(AUC)计算同2.2项。

2.4 统计学处理

数据统计分析为SPSS 17.0软件,本研究计量资料以undefined表示,用药后各时期血液凝固时间延长百分率与0 h的比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠十二指肠给药血液凝固实验

大鼠十二指肠给药血液凝固实验的结果如图1和表2所示。给药后0.5、1、2、4、6、8 h,A、B、C组与0 h相比,大鼠血液凝固时间显著延长(P<0.05),对照组大鼠血液凝固时间延长百分率虽有增大的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。A、B、C组的AUC和PA显著高于对照组(P<0.05)。A、B、C组之间比较,AUC和PA随着精氨酸与LMWH摩尔比从10 ∶1、20 ∶1提高到30 ∶1时,有依次增加的趋势(P<0.05)。

百分率

3.2 大鼠在体肠袢法给药的血液凝固实验

大鼠经体肠袢法给药的血液凝固实验的结果如图2和表3所示,给药后0.5、1、2、4、6、8 h,各组与0 h相比,大鼠血液凝固时间显著延长(P<0.05)。十二指肠组、空肠组、回肠组组间相比,AUC差异无统计学意义(P>0.05)。结果说明精氨酸在十二指肠、空肠、回肠部位均能显著促进低分子肝素的吸收,并且在3个部位的促吸收作用,差异无统计学意义(P>0.05)。

时间的百分率

4 讨论

低分子肝素为有效的抑制血栓形成的抗凝新药,它疗效显著,近年来广泛应用于临床,已取代肝素成为急性冠脉综合征的首选抗凝药物。目前,低分子肝素给药途径大多为皮下注射,但皮下注射不良反应较多,如皮下淤斑、皮下出血等,且患者使用不便[8]。为了方便给药、能够长期应用以及避免皮下注射出现的不良反应,我们以天然氨基酸中的L-精氨酸为LMWH的肠道促吸收剂,探讨其对LMWH的口服促吸收作用。

前期实验研究证明,穿膜肽六聚精氨酸(R6)能够与LMWH非共价键偶合,显著促进LMWH的口服吸收,其原因可能是R6的6个精氨酸残基上的阳离子基团与LMWH上的阴离子基团偶合,LMWH被R6携带透过肠道细胞膜而吸收[2]。考虑到穿膜肽的价格较高,应用于LMWH的口服给药将大幅度增加治疗成本,阳离子性的精氨酸同样能够与LMWH上的众多阴离子基团偶合,有可能促进LMWH的口服吸收,因此考察了精氨酸促进低分子肝素肠道吸收的效果。结果证明精氨酸能够显著促进LMWH的口服吸收,在精氨酸与LMWH的摩尔比达到30 ∶1时,以血液凝固时间延长百分率计算,LMWH口服的生物利用度甚至超过了10%。

预试验已经证明精氨酸不具有改变大鼠血液凝固时间的作用,因此本实验不再考察精氨酸对血液凝固时间的影响,仅证实精氨酸能够显著促进LMWH的口服吸收作用。精氨酸对低分子肝素的肠道促吸收作用,为开发安全有效、成本较低的低分子肝素口服制剂奠定了一定的实验基础,也希望为低分子肝素的肠道给药开辟一条新的途径。关于精氨酸对LMWH的口服促吸收作用目前还建立在实验动物的基础上,其确切机制尚需进一步研究。

摘要：目的 低分子肝素是一种有效的溶栓剂,目前只有注射剂用于临床,该实验研究精氨酸对低分子肝素口服吸收的促进作用。方法 以大鼠用药前后血液凝固时间的变化研究精氨酸的肠道促吸收作用。结果 精氨酸能够显著延长大鼠的凝血时间。在精氨酸与低分子肝素摩尔比为30∶1时,低分子肝素的药效学生物利用度达到11.7%。结论 精氨酸能够显著促进低分子肝素的肠道吸收。

关键词：精氨酸,低分子肝素,口服

参考文献

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精氨酸及其研究 篇4

关键词：氧化苦参碱脂质体,肝纤维化,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸

氧化苦参碱(oxymatrine,OXY) 是从中药苦豆子中提取的成分,是苦参碱的氮-氧化物。既往研究表明,该药有抗炎、平喘、 保护心肌、调节免疫和抗肿瘤等作用。 近年的研究又表明氧化苦参碱有抗乙型肝炎和丙型肝炎病毒的作用, 并有抑制胶原活动度、防止肝纤维化的作用[1]。但因传统给药方式使药物全身分布, 局部血药浓度低, 致其难以进入肝实质细胞杀灭病毒,达不到很好的治疗效果。近年来,备受关注的脂质体是一种以磷脂等材料作为膜材而构成的具有封闭囊泡结构的药物载体,且其经静脉注射后,自然靶器官主要为肝脏,由此可提高局部血药浓度并减少全身不良反应。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arginine-Glycin-Aspartic acid,RGD)三肽序列对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)有特异性的靶向性的特点,但目前尚无RGD偶联OXYL对OXYL疗效影响的研究。本实验通过建立慢性肝损伤纤维化的大鼠研究模型,构建氧化苦参碱脂质体(oxymatrine liposomes,OXYL)及RGD-OXYL,评价RGD是否可增强OXYL对肝纤维化的治疗作用,并探索其对纤维化相关基因表达的影响,为非病毒性肝纤维化治疗中氧化苦参碱的机制研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

清洁级SD大鼠30只,重约200 g(第四军医大学实验动物中心),大豆卵磷脂(天津远航化学品有限公司),胆固醇(北京奥博星生物技术责任有限公司),甲醇(西安化学试剂厂),氯仿(西安化学试剂厂),98.9%氧化苦参碱(西安大河药业有限责任公司)。

1.2 制备OXYL(逆相蒸发法)

将大豆卵磷脂5.0 g,胆固醇2.5 g,溶于氯仿甲醇50 ml混合液中,70 ℃水浴挥干溶剂,加入油酸0.5 g,聚山梨酯2.5 g,搅拌融化。另将氧化苦参碱1.5 g,聚乙烯吡咯烷酮2.5 g溶于PH 7.4磷酸缓冲液中,水浴加热至70 ℃,再将两者混合,恒温搅拌,灌装,密封,超声乳化,所得乳剂在旋转蒸发仪上减压蒸除有机溶剂,然后再进行短时超声,即得乳白色脂质体混悬剂。

1.3 氧化苦参碱肝三肽序列对肝星状细胞靶向脂质体的制备

按RGD∶氧化苦参碱脂质体=10∶1摩尔比加入RGD,室温震荡过夜,得到RGD修饰的OXYL液RGD-OXYL,冰浴下旋涡震荡30分钟,通过凝胶柱(CL-4B),层析法除去未偶联的脂质体。

1.4 动物模型的制备及给药方法

雄性SD大鼠50只,体重约200 g,食用标准饲料,饮自来水。大鼠分成5组,正常对照组10只,其余4组均复制四氯化碳腹腔注射诱导肝纤维化模型。其中OXYL治疗组肌肉注射OXYL50 mg/kg,3次/周;RGD-OXYL治疗组肌肉注射RGD-OXYL 50 mg/kg,3次/周;正常对照组、肝纤维化模型组给予等量的生理盐水处理;RGD脂质体组肌肉注射RGD脂质体50 mg/kg,3次/周。

1.5 碱性磷酸酶检测

8周末用眶静脉取血方法获得各组大鼠血清,送检至中国人民解放军总医院生化科,检测碱性磷酸酶。

1.6 组织学检测

肝组织用10%福尔马林固定后,石蜡包埋。切片行HE染色观察肝损伤程度,行Masson染色检测细胞外基质沉积。在光镜下观察,随机选取5个视野测量面积密度(胶原纤维面积/ 肝组织面积×100%),取平均值,比较各组大鼠肝组织细胞外基质沉积差异。

1.7 测定肝组织中的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的mRNA表达

以“看家基因”硝酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GADPH)作为内参照。GADPH引物序列5′-ACC CCC CAA TGT ATC CGT TGT-3′和5′-TAC TCC TTG GAG GCC ATG TA-3′;MMP-2引物序列 5′-CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG-3′和5′-CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT-3′;TIMP-1引物序列 5′-ACA GCT TTC TGC AAC TCG-3′和5′-CTA TAG GTC TTT ACG AAG GCC-3′。用Image J软件测量并计算靶基因与看家基因的灰度比值。

1.8 统计学分析

统计学处理采用SPSS 16.0统计软件包,所有计量资料使用均数±标准差($\overline{x}\pm s$)表示。参数采用单因素方差(One-Way ANOVA)检验,非参数用Mann-Whitney U检验比较组间差异。P<0.05时,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGD可增强OXYL降低模型大鼠血清ALP水平的作用

8周末模型大鼠血清,检测各组ALP水平,结果发现肝与纤维化组相比,OXYL可显著降低血取清ALP(344.470±27.515 v.s. 550.691±43.797,P<0.05);与OXYL治疗组相比,RGD-OXYL治疗组血清ALP水平进一步降低(272.508±19.548 v.s. 344.470±27.515,P<0.05)。见图1。

control:正常对照组;CCl4 :肝纤维化组;RGD-OXYL:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-OXYL治疗组; OXYL: OXYL-治疗组;Lip:RGD脂质体组注:与正常对照组比较,aP<0.05;与OXYL治疗组比较,bP<0.05,n=10

2.2 RGD可显著增强OXYL改善四氯化碳诱导的肝损伤的作用

取8周末模型大鼠肝组织,HE染色观察肝脏损伤程度(图2)。肝纤维化模型组及RGD脂质体组病理组织学检查示肝细胞脂肪变性,以胞浆内出现大泡性脂滴为特征,细胞不同程度肿胀,大片溶解坏死的肝细胞及纤维增生处有炎性细胞浸润,肝组织内可见假小叶形成。与肝纤维化模型组相比,RGD-OXYL治疗组肝脏脂肪变和纤维化程度减轻,肝细胞脂肪变和坏死较轻,原先存在的假小叶由于肝细胞增殖而变大,但纤维隔变细。OXYL治疗组与RGD-OXYL治疗组比较可见肝细胞脂肪变较重,但与肝纤维化模型组相比纤维化程度减轻。

2.3 RGD可增强OXYL减少细胞外基质沉积面积的作用

取8周末模型大鼠肝组织,Masson染色观察细胞外基质沉积情况。正常大鼠肝组织纤维化分级全部为0级; 肝纤维化模型组(CCl4)和RGD脂质体组 (Lip)肝纤维化多为肝小叶结构破坏,汇管区有大量纤维组织增生(4期);治疗组:肝细胞排列紊乱,肝小叶结构尚完整,部分肝小叶结构有破坏,汇管区有中等量OXYL纤维组织增生(2,3期);RGD-OXYL治疗组:肝细胞排列规整,肝小叶结构完整,汇管区有少量纤维组织增生(1,2期)(图3)。与肝纤维化模型组(CCl4)相比,OXYL治疗组胶原面积密度显著减小(P<0.05),与OXYL治疗组相比,RGD-OXYL治疗组可进一步减小胶原面积密度(P<0.05)。见图3～4。

2.4 RGD可增强OXYL下调MMP-2的mRNA水平的作用

MMP-2,即明胶酶A,主要来源于活化的HSCs,在肝纤维化发生时表达上调,是纤维化进展的重要分子。因此分离各组大鼠HSCs,用半定量PCR比较各组大鼠HSCs中MMP-2的表达水平有无差异。结果发现,与肝纤维化模型组(CCl4)相比,OXYL治疗组MMP-2表达显著下调(P<0.05);与OXYL治疗组比较,RGD-OXYL治疗组MMP-2表达进一步下调(P<0.05)。见图5～6。

2.5 RGD可增强OXYL下调TIMP-1的mRNA水平的作用

MMP-1是人类主要的间质性胶原酶,主要降解间质胶原。而TIMP-1与MMP-1结合后抑制其活性,阻止细胞外基质降解。TIMP-1亦来自于激活的HSCs,在肝纤维化发生时表达显著上调。因此分离各组大鼠HSCs,用半定量PCR比较各组大鼠HSCs中TIMP-1的表达水平有无差异。与肝纤维化模型组(CCl4)相比, OXYL治疗组TIMP-1表达显著下调(P<0.05);与OXYL治疗组比较,RGD-OXYL治疗组TIMP-1表达进一步下调(P<0.05)。见图7～8。

CCl4:肝纤维化模型组; OXYL:氧化苦参碱脂质体治疗组;RGD-OXYL:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-OXYL治疗组; Lip:RGD脂质体组

注: 与肝纤维化组(CCl4)比较,aP<0.05;与OXYL治疗组比较,bP<0.05,n=5

G:GAPDH;M:Marker;A:肝纤维化模型组(CCl4);B:RGD-OXYL治疗组;C:RGD脂质体组;D:OXYL治疗组

CCl4:肝纤维化组; RGD-OXYL:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-OXYL治疗组; OXYL: OXYL-治疗组;Lip:RGD脂质体组注: 与对照组比较,aP<0.05;与OXYL治疗组比较,bP<0.05,n=5

G:GAPDH;A:OXYL治疗组;B:RGD-OXYL治疗组;C:肝纤维化模型组(CCl4);D:RGD脂质体组;M:Marker

CCl4:肝纤维化组;RGD-OXYL:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-OXYL治疗组; OXYL:OXYL-治疗组;Lip:RGD脂质体组注: 与对照组比较,aP<0.05;与OXYL治疗组比较,bP<0.05,n=5

mRNA水平(TIMP-1/GAPDH比值)

3 讨论

各种慢性肝损伤均可发展至肝纤维化,目前认为肝纤维化是对创伤的一个修复过程,在此损伤修复的反应中,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)[2],肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)和细胞因子共同参与发挥了致纤维化的作用[3]。因此大量研究着眼于逆转肝纤维进展,其中氧化苦参碱(oxymatrine,OXY)具有广泛的研究和应用前景。

OXY是一种四环喹嗪啶类生物碱,对多种肝病的治疗,发现其对乙型肝炎[4],丙型肝炎,肝纤维化及肝癌都具有较好的疗效。然而用于临床的OXY剂型仍存在以下不足:(1)药物半衰期短,t1/2只有0.5小时,药物清除较快;(2)需要多次给药来维持血药浓度,给药剂量大,易导致毒副作用发生。脂质体可阻止蛋白酶分解被包裹的药物,具有延长药物作用时间、使药物用量减少、提高药物稳定性、降低药物毒副作用等特点,是比较理想的靶向药物载体,目前已被广泛应用于研究。

本研究成功构建了氧化苦参碱脂质体(OXYL),并用其治疗四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠,结果发现大鼠血清ALP水平、肝脏损伤程度及细胞外基质沉积均得到明显改善,且未出现毒副作用,证实该种剂型的氧化苦参碱可能成为临床有效的治疗肝纤维化的药物。但是,由于网状内皮系统可摄取脂质体,使得其靶向性降低,需要进一步研究可增加药物靶向性的剂型。

新型人工合成的RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arginine-Glycin-Aspartic acid,RGD)的短肽,是整合素与其配体结合的识别位点。由于细胞表面的整合素介导ECM与HSCs细胞膜受体结合,影响HSCs的生物学功能,RGD能够竞争性与整合素结合,不但减少ECM与HSCs粘附,还可作为HSCs的特异性配体[5]。本课题组建立了RGD偶联的OXYL,发现其改善大鼠血清ALP水平、肝脏损伤程度及细胞外基质沉积的功能较OXYL显著增强。

目前氧化苦参碱治疗肝纤维化的机制尚不明确,课题组从抑制细胞外基质沉积促进纤维化进展的角度,观察了相关基因表达。MMP-2[6],即明胶酶A,主要来源于活化的HSCs,可降解窦周基底膜中的Ⅳ型胶原支架,使得维持HSCs静态的基底膜遭到破坏,HSCs被激活,分泌间质性胶原,使得MMP-1表达增加,刺激MMP-2酶原的激活,从而上调MMP-2表达,造成恶性循环。TIMP-1[7]主要来源于活化的HSCs,在肝纤维化过程中,激活的HSCs分泌TIMP-1抑制胶原的降解[8]。Janssen AP等[9]发现,TIMP-1可显著促进纤维化发展。因此下调MMP-2和TIMP-1的表达可能是肝纤维化减轻的重要机制。本课题组的研究发现OXYL可显著下调模型大鼠肝脏HSCs中MMP-2和TIMP-1的表达,RGD-OXYL下调二者表达的功能更为显著。提示氧化苦参碱可能通过下调MMP-2和TIMP-1的方式减轻肝脏损伤、减少细胞外基质沉积,从而延缓肝纤维化的进展。

综上所述,本研究首次建立了氧化苦参碱脂质体和RGD偶联的氧化苦参碱脂质体,增强了药物延缓肝纤维化进展的作用,同时极大地降低了药物的毒副作用,可为临床采用氧化苦参碱治疗肝纤维化提供新的思路。此外,氧化苦参碱可能通过下调MMP-2和TIMP-1减少细胞外基质形成,延缓纤维化进展。但氧化苦参碱通过何种方式下调上述两种分子的表达,仍需进一步研究。

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精氨酸及其研究 篇5

关键词：心肌肥厚,L-精氨酸,一氧化氮

心肌肥大是高血压常见的并发症, 心力衰竭发生的结构基础, 也是心律失常等多种心血管疾病的独立危险因素。 一氧化氮 (NO) 是多种细胞均可以产生的自由基, 在全身各处广泛存在。 作为NO的前体L-精氨酸可通过拮抗氧自由基、 增加心肌组织能量代谢、增加冠脉血流量和抑制中性粒细胞聚集等对心血管系统发挥保护作用[1]。 本研究的主要目的是研究L-精氨酸干预对心肌肥大和细胞损伤的影响, 及NO和一氧化氮合酶 (NOS) 的变化, 以探讨L-精氨酸对心肌肥大的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性Wistar大鼠36 只, 体重 (200±20) g, 齐齐哈尔医学院动物中心提供。 平衡饮食一周后, 将大鼠随机分3 组, 每组各12 只:①对照组:给予0.9%氯化钠注射液[5 m L/ (kg·d) ] 皮下注射; ②模型组 (ISO组) :ISO皮下注射5 m L/ (kg·d) , 连续7 d;③L-精氨酸治疗组:ISO皮下注射5 m L/ (kg·d) 的同时给予L-精氨酸800 mg/ (kg·d) , 腹腔注射, 常规给水, 连续给药7 d[2,3]。

1.2 试剂与设备

L-精氨酸, 异丙肾上腺素 (ISO) 购于美国Sigma公司, Trizol和逆转录试剂盒购于Takala公司, Leica切片机, Leica显微镜, 电子天平;紫外-可见分光光度计 (岛津) , 乳酸脱氢酶 (LDH) 、丙二醛 (MDA) 、NO和NOS检测试剂盒购于南京建成生物公司。

1.3 样本采集

末次给药后次日, 称量大鼠体重 (BW) 后, 2%乌拉坦腹腔注射麻醉后, 取心脏组织, 称全心重 (HW) 和左室重 (LVW) , 立即投入液氮中保存。

1.4 胶原纤维染色

取心肌组织左室游离壁, 10%甲醛固定, 石蜡包埋, 常规HE和胶原纤维染色 (VG) 。 图像分析系统分析心肌间质胶原含量。

1.5 生化指标检测

剥离左侧颈总动脉, 取血。4℃, 3000 r/min离心后取上清。 用NO、NOS、MDA和LDH试剂盒测定血清中相应酶的活性或含量。 步骤完全按照试剂盒说明操作。

1.6 RT-PCR反应检测大鼠心肌组织ANP基因表达

RT-PCR按TRIzol试剂盒说明书抽提心肌组织总RNA, 紫外测定OD260/OD280的比值。 参照Takala公司说明书将RNA逆转录成c DNA, 以合成好的c DNA为模板进行PCR扩增反应。 ANP上游引物:5'-GGCTCCTTCTECATGACCAA-3';下游引物:5'-TGTTATCTTEGGTACCG-3';产物长度458 bp。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离, 并应用凝胶成像系统分析, 以目的片段ANP带的灰度与内参照 β-actin带的灰度之比表示ANP m RNA的表达水平。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0 对数据进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用t检验;重复测量的计量资料多组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏重量参数的变化

大鼠心肌重量参数即心重 (左室重) 与体重的比值可作为评价大鼠心肌肥大的指标。 ISO组与对照组比较, ISO诱导大鼠心肌重量参数增加显著, 心重/体重比值为 (3.89±0.25) mg/g, 左室重/体重比值为 (2.67±0.26) mg/g, 均明显高于对照组[心重/体重比值 (3.39±0.25) mg/g, 左室重/体重比值 (2.33±0.11) mg/g], 差异有统计学意义 (P < 0.01 或P < 0.05) 。 见图1。

L-精氨酸治疗组与ISO组比较, L- 精氨酸可抑制心肌重量参数, L-精氨酸治疗后, 心重/体重比值 (3.52±0.21) mg/g和左室重/体重比值 (2.39 ±0.23) mg/g均低于ISO组 (P < 0.05) 。

注:与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;与ISO组比较, #P<0.05;HW:心重;BW:体重;LVW:左室重

2.2 心肌组织ANP m RNA表达水平的变化

ISO组与对照组比较, ISO组心肌组织ANP基因的表达水平相对值 (1.5) 明显高于对照组 (1.0) , 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) ;L-精氨酸治疗组与ISO组比较, L- 精氨酸治疗组ANP基因表达水平相对值 (1.2) 低于ISO组, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 。见图2。

注:A:ANP基因表达电泳图;B:各组ANP基因水平相对值图;与对照组比较, **P<0.01;与ISO组比较, #P<0.05

2.3 心组织胶原含量的变化

心肌组织经Van Gieson染色后, 光镜下见心肌细胞呈橘黄色, 间质胶原纤维呈红色。 病理图像分析系统分析显示, ISO组与对照组比较, ISO组心肌组织间质胶原含量[ (35.24±4.78) %]明显高于对照组[ (7.02±2.13) %], 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) ;L-精氨酸治疗组与ISO组比较, 胶原含量[ (14.52±3.09) %]低于ISO组, 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) 。 见图3。

注:与对照组比较, **P<0.01;与ISO组比较, ##P<0.01

2.4 L- 精氨酸干预对心肌组织NO、NOS、MDA和LDH水平的影响

ISO组NO含量[ (20.96 ±5.06 ) μmol/L] 和NOS活性[ (16.58±3.12) U/m L]与对照组[NO含量 (36.72±5.32) μmol/L, NOS活性 (24.96±3.59) U/m L] 比较, 明显降低, 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) 。 见图4。

ISO组MDA含量[ (389.63±42.85) nmol/L]和LDH水平[ (3582.89±364.51) U/L] 与对照组[MDA含量 (240.72±26.63) nmol/L, LDH水平 (1328.62±206.35) U/L]比较显著增加, 差异有统计学意义 (P < 0.05 或P <0.01) 。 与ISO组比较, L - 精氨酸治疗组NO含量[ (34.15±6.12) μmol/L]和NOS水平[ (23.99±3.12) U/m L]均增加, 差异有统计学意义 (P < 0.01 或P < 0.05) , MDA水平[ (308.73±37.48) nmol/L] 和LDH水平[ (2065.35±347.46) U/L]均降低, 差异有统计学意义 (P < 0.05 或P < 0.01) 。 见图5。

注:与对照组比较, *P<0.05, *P<0.01;与组虽ISO组比较, #P<0.05, ##P<0.05;NO:一氧化氮;NOS:一氧化氮合酶

注:与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;与ISO组比较, #P<0.05, ##P<0.01

3 讨论

心肌肥大既是压力负荷增加时心肌组织代偿性增生的结果, 又是高血压、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的独立危险因素。 严重影响患者的预后, 并增加死亡率[4]。 因此, 探讨心肌肥大的发病机制, 寻找有效的防治措施, 具有重要的临床意义。

ISO通过激活 β - 肾上腺素受体诱导的心肌肥大, 被认为是研究心肌肥厚的重要模型[5]。 ISO皮下注射7 d后, 心脏重量参数明显增加, ANP基因表达增高, 同时心肌间质胶原增加, 这些均表明心肌肥大模型复制成功。 LDH是催化L-乳酸与丙酮酸之间可逆反应的脱氢酶。 广泛存在于心肌、肝、骨骼肌、肺等各种组织中。 当心肌细胞受到损伤时, LDH等心肌酶从胞浆中漏出, 测定血清和组织中LDH活性可反映心肌损伤程度, 并已成为反映心肌损伤程度的敏感指标被广泛采用。MDA对心肌的毒性损伤主要与氧自由基损伤、钙超载、细胞凋亡、ADM继发代谢产物等有关。 二者联合可反映心肌组织损伤程度。 实验结果显示, ISO诱导心肌肥大的同时, 增强了血清中LDH活性和MDA含量, 表明ISO诱导心肌肥大的同时, 引发心肌组织强烈的脂质过氧化反应, 产生大量的自由基, 严重损伤心肌组织。

近年, L-精氨酸对心肌疾病的作用研究开展较多, 有助于进一步解释心肌疾病的机制, 寻找新的治疗靶点。L-精氨酸在NOS的作用下, 生成NO和L-瓜氨酸, 即L-精氨酸—NO通路。 目前认为L-精氨酸—NO通路所产生的NO主要通过自分泌和 (或) 旁分泌的方式发挥其生理效应。目前研究表明, NO供体具有减轻缺血再灌注引起的心肌细胞损伤和减轻腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚的作用[6,7]。 本研究结果表明, L-精氨酸干预后明显降低心脏重量参数和ANP基因表达水平, 同时又减少心肌间质胶原含量, 对心肌肥大有明显的抑制作用。同时发现, 心肌肥大时, NOS活性和NO含量均降低, L-精氨酸干预后, 显著逆转了上述改变。 在生理情况下, 心肌中可以表达内皮型一氧化氮合酶 (e NOS) 和神经元型一氧化氮合酶 (n NOS) , 二者以精氨酸为底物生成NO, 参与心肌收缩的调整。不同亚型的NOS在心肌中的位置不同, 从而对心肌的收缩产生不同的影响[8,9]。 Ganzinelli等[10]研究表明NO弥散进入细胞核后, 影响c-fos, c-myc相关基因转录水平, 进而抑制心肌肥大。 与对照组比较, ISO增强了LDH活性和MDA含量。 L-Arg显著降低MDA含量和LDH活性。推测L-精氨酸通过促进NO的产生, 减少过氧亚硝酸阴离子 (ONOO-) 生成, 直接中和氧自由基, 消除氧自由基对心肌的损害, 并增强膜稳定, 从而减轻细胞损伤。

综上所述, L-精氨酸干预, 通过激活L-精氨酸—NO通路, 促进体内NO浓度增加, 可减轻心肌肥大和保护心肌细胞。 随着今后的深入研究, 将为L-精氨酸的临床应用提供广阔前景。

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