左旋精氨酸（精选9篇）
左旋精氨酸 篇1
近年来, 急性心肌梗死的发病率逐渐升高, 早期溶栓是治疗急性心肌梗死的最简便有效的方法, 可促进冠状动脉再通, 防止左室重构, 从而改善患者的心功能和预后, 降低近期和远期病死率。但冠脉再通后如何预防心肌再灌注性损伤是溶栓治疗后面临的问题。有研究报道, 溶栓治疗联合左旋精氨酸能够有效降低心肌缺血的再灌注损伤, 改善患者的预后[1]。我科室2015年6-8月采用尿激酶溶栓联合左旋精氨酸治疗急性心肌梗死, 效果满意, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组选取我科室2015年6-8月的70例急性心肌梗死患者, 其中男38例, 女32例;年龄45~75岁, 平均年龄 (56.6±12.5) 岁;发病至入院时间4~20h, 平均时间 (15.5±4.5) h。纳入标准: (1) 均符合AMI的诊断标准; (2) 均同意治疗方案, 自愿参与研究; (3) 年龄<75岁; (4) 服用硝酸甘油后症状改变不明显; (5) 均采用溶栓治疗。排除标准: (1) 溶栓治疗期间死亡的病例; (2) 溶栓禁忌证; (3) 严重的肝肾功能不全; (4) 严重的高血压; (5) 脑部病变; (6) 存在原发或继发性痴呆、出血性疾病; (7) 药物过敏史。将其随机分为观察组35例和对照组35例, 两组的一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 治疗方法
所有患者入院后卧床休息, 给予心电监护、镇静、β-受体阻滞剂、利尿剂、吸氧治疗, 将血压控制在160/100mmHg (1mmHg=0.133kPa) 。对照组采用尿激酶溶栓治疗, 将150万U的尿激酶+生理盐水100ml, 充分融合后进行静脉滴注, 30~60min滴完, 结合患者的病情及体重调整用药。观察组在对照组的基础上静脉滴注左旋精氨酸, 于尿激酶治疗后进行, 剂量为200mg/kg, 1次/d。两组均于溶栓后12h, 每隔12h给予1mg/kg的低分子肝素, 1次/d。
1.3 观察指标
比较两组的治疗效果、治疗过程中的血管再通率 (30min、1h、2h、4h) 、治疗后1个月的心血管事件以及左室射血分数 (LVEF) 。
1.4 疗效评价显效:症状、体征、心电图、实验室指标恢复正常, 未出现不良反应;有效:实验室指标、心电图基本正常, 症状、体征基本得到控制;无效:未达到以上标准。总有效=显效+有效。血管再通率:参照相关文献的4条诊断标准[2]。LVEF采用超声心动图检测。
1.5 统计学处理
采用SPSS17.0数据统计软件, 组间比较t检验或χ2检验, 检验水准α=0.05, P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者的治疗效果比较
观察组的总效率为91.4%, 高于对照组的77.1%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
2.2 两组患者的血管再通率比较
观察组治疗后30min、1h、2h时的血管再通率与对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。观察组治疗4h时的血管再通率高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
2.3 两组患者治疗1个月后的心血管时间及心功能比较
观察组治疗1个月后的心血管事件少于对照组, 左室射血分数大于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表3。
3 讨论
急性心肌梗死 (AMI) 由冠状动脉粥样硬化引起血栓形成, 临床表现为剧烈的胸骨后疼痛、心律失常以及心力衰竭等[3], 严重威胁患者的生命安全, 及时、准确的治疗是挽救患者生命、改善预后的关键。溶栓治疗是心肌梗死最简单有效的治疗方法, 主要是通过激活纤溶酶原使之成为纤溶酶, 从而溶解血块, 使闭塞的冠脉再通, 缺血的心肌得到再灌注, 血管快速重建, 进而挽救濒死的心肌[4], 改善患者的心功能。尿激酶是从人尿中分离的一种酶, 为急性心肌梗死溶栓治疗常用的药物, 其可直接激活人体内无活性的纤溶酶原变为有活性的纤溶酶, 水解纤维蛋白, 进而促进血栓溶解, 而且不良反应少。但急性心肌梗死的患者经过尿激酶溶栓治疗冠脉再通后, 短期内容易出现心律失常、再次心梗等并发症。心肌缺血再灌注可能是造成这一现象的主要原因。左旋精氨酸能够在NOS的作用下生成NO, 可提高心肌的抗氧化能力, 保护心肌细胞膜, 还能扩张局部血管, 改善冠脉血流, 发挥抗心肌损伤的效果[5]。本文采用尿激酶联合左旋精氨酸治疗急性心肌梗死的疗效高, 而且治疗4h的再通率高, 1个月后的心血管事件少, 心功能恢复好, 均有统计学意义。综上所述, 尿激酶溶栓联合左旋精氨酸治疗能够提高急性心梗患者的血管再通率, 减少心血管事件的发生。
摘要：目的:探讨尿激酶溶栓联合左旋精氨酸在急性心肌梗死患者中的治疗效果。方法:将70例急性心肌梗死患者随机分为观察组35例和对照组35例。对照组给予尿激酶溶栓, 观察组在对照组的基础上加用左旋精氨酸, 其他治疗措施两组基本一致。比较两组的治疗效果、血管再通率、1个月后的心血管事件及心功能。结果:观察组的总效率为91.4%, 高于对照组的77.1%, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 两组治疗后2h内的血管再通率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 但观察组治疗4h时的血管再通率高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。观察组治疗1个月后的心血管事件少于对照组, 左室射血分数大于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论:尿激酶溶栓联合左旋精氨酸治疗能够提高急性心梗患者的血管再通率, 减少心血管事件的发生。
关键词：尿激酶,溶栓,左旋精氨酸,急性心肌梗死,血管再通
参考文献
[1]何娟.尿激酶溶栓联合左旋精氨酸治疗急性心肌梗死的疗效分析〔J〕.黑龙江医学, 2013, 37 (7) :606-608.
[2]张海勋, 赵玉霞, 管仕春.尿激酶溶栓联合左旋精氨酸治疗急性ST段抬高型心肌梗死的临床作用〔J〕.中国医药导刊, 2015, 17 (5) :510-511.
[3]刘美玲.尿激酶联合左旋精氨酸治疗急性ST段抬高型心肌梗死的疗效及安全性观察〔J〕.心血管防治知识, 2014, 14 (8) :52.
[4]胡禄华.尿激酶联合左旋精氨酸治疗急性ST段抬高型心肌梗死的临床疗效观察〔J〕.实用心脑肺血管病杂志, 2014, 22 (12) :142-143.
[5]吴伟生.尿激酶联合左旋精氨酸治疗急性ST段抬高型心肌梗死的疗效观察〔J〕.中外医疗, 2012, 31 (1) :82-83.
左旋精氨酸 篇2
关键词：L-精氨酸 陶瓷膜过滤 微生物发酵液 菌体去除率 膜通量
中图分类号：TQ921 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00
L-精氨酸是一种具有胍基的人和动物的半必须碱性氨基酸，也是生物体尿素循环中的一种重要中间代谢物。L-精氨酸在医药工业上具有广泛的用途。它是复方氨基酸输液的主要成分之一，也被广泛用于氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能的促进剂，对病毒性肝炎疗效显著，同时对肠道溃疡、血栓形成、神经衰弱和男性无精等症状都有一定的治疗效果【2】。
微生物发酵液中往往存在着大量的菌体、杂蛋白和胶体颗粒等物质，这些物质的存在使产物收率和结晶质量下降。因此，在分离前必须先将其除去。目前膜分离技术以其在常温下操作无相态变化、分离精度高、选择性强、污染小等优点，逐步取代絮凝法、离心法成为分离提取发酵液中产物的主要方法[ 3 ，4 ]。
无机陶瓷膜因其构成基质主要为氧化锆、氧化铝等无机材料及其特殊的结构特征而具有如下的优点：耐高温，适用于处理高温、高粘度流体；机械强度高，具有良好的耐磨、耐冲刷性能，可以高压反冲使膜再生；化学稳定性好、耐酸碱、抗微生物降解；使用寿命长，一般可用 3～5 年，甚至8～10年。这些优点与有机高分子膜相比较，使它在许多方面有着潜在的应用优势，成为苛刻条件下精密过滤分离的重要新技术。现已广泛应用于食品工业、生物工程、环境工程、化学工业、石油化工、冶金工业等领域。无机陶瓷膜分离技术在我国氨基酸发酵行业具有普遍的适用性。其中孔径为 0.2 μm 的微滤膜可用于除去药液中的微粒、胶团等悬浮物，而孔径为0.1、0.05 μm及更小的超滤膜则可用于不同分子量成分的分级处理[5]。
1 材料与方法
1.1 材料
陶瓷管式膜分离中试设备（某国外品牌，膜面积5㎡，广东环西生物科技股份有限公司氨基酸提取车间提供）；722紫外可见光分光光度计（上海凤凰光学科仪有限公司）；FE20/EL20型pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；L-精氨酸发酵液（广东环西生物科技股份有限公司氨基酸发酵车间提供）。
1.2 分析测定
1.2.1 可溶性蛋白测定
将样品溶液在280 nm波长下测定其吸光度，蛋白含量（mg/ mL ） = A280×校正因子[3]。
1.2.2 L-精氨酸测定方法
L-精氨酸的测定采用α-萘酚（甲萘酚）和双乙酰混合液作为显色剂的坂口改良法[6]。
1.3 操作方法
通用陶瓷膜过滤法。将发酵液装入设备工作罐内，在一定的操作方法下，测定滤液的杂蛋白去除率及精氨酸收率。
2 结果与分析
2.1 料液温度对陶瓷膜过滤的影响
粘度是反映了液体粘性的大小，膜的渗透量随粘度的减小而增大，而粘度随温度的升高时减小的，所以提高温度可以获得较大的膜通量[7]。在一定的进出膜压力和料液温度下，进行陶瓷膜过滤。实验温度对陶瓷膜膜通量的影响。结果如图1所示
图1料液温度对膜通量的影响
从图1可以看出，膜通量随温度升高而变大。但考虑到运行成本，选择60℃为适宜的过滤温度，此温度下膜通量可达230L/h。
2.2 料液进出膜压力对陶瓷膜过滤的影响
在一定的料液pH值和料液温度下，进行陶瓷膜过滤。实验进出膜压力对陶瓷膜通量的影响。结果如表1所示。
从表1可以看出，L-精氨酸收率及蛋白质的去除率与进出膜压以及压差的变化不大，但是膜通量的影响效果较大，当压力及压差很低时，膜通量下降幅度较大，就会导致过滤时间的增加，间接的影响过滤效率使其降低，影响整个陶瓷膜工序的过滤效果。为了减少能耗保护膜部件，选择的压力为：进膜压力5.0Mpa，出膜压力2.0Mpa。
2.3 料液对陶瓷膜过滤的影响
料液pH值能通过改变溶质表面的电荷来改变溶质在溶液中的分散情况，对膜过滤过程产生影响。在一定的pH条件下可发生沉降现象[3] 。
发酵液用盐酸调不同pH值，进行陶瓷膜过滤。在一定的进出膜压力和料液温度下，对蛋白去除率、产品回收率以及膜通量进行了实验，结果见表2。
通过表2可看出发酵液调pH4.0～4.5能有效地去除杂质蛋白，并易发生沉降现象产生易于在膜前通过粗滤滤除，能有效防止膜污染。在编号3的操作方法下，菌体蛋白质去除率85.33%、精氨酸收率95.03%，膜通量220L/h。
3 结语
（1）选择料液温度60℃、进膜压力5.0Mpa、出膜压力2.0Mpa、料液pH值4.0作为操作参数，蛋白质去除率85.33%、膜通量220L/h。
（2）实验最高收率95.03%，主要原因为采用设备体积相对较大，导致发酵液过滤过程中不能够浓缩到终点，透析不完全。但伴随着后期规模化生产不断放大，该收率将会有较明显的提高。
参考文献
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[7]刘昌盛，傅金祥，李慧.陶瓷膜微滤的影响因素及膜污染再生探讨[J].辽宁化工，2010，01：55-57+60.
收稿日期：2015-03-25
作者简介：陈悦群（1984—）男，广东揭阳人，本科学历，食品生物助理工程师，主要从事运用发酵技术生产氨基酸产品及功能性食品研究等。
左旋精氨酸 篇3
关键词：急性ST段抬高型心肌梗死,尿激酶溶栓,左旋精氨酸,联合用药
急性ST段抬高型心肌梗死 (STEMI) 发病率随社会经济发展而增加, 致残率和致死率均较高[1]。本研究将60 例行尿激酶 (UK) + 左旋精氨酸 (L-Arg) 治疗的STEMI患者与60 例仅给予UK治疗的患者进行比较, 以期为日后临床用药提供参考, 现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料回顾性分析2012 年1 月—2014 年12 月我院收治的120 例STEMI患者的临床资料, 按照治疗方法的不同分成观察组和对照组各60 例。观察组男31 例, 女29 例, 年龄35 岁~72 岁, 平均年龄 (53.50±0.29) 岁, 病程1 h~6 h, 平均 (3.48±0.12) h;对照组男32 例, 女28 例, 年龄36 岁~74 岁, 平均年龄 (54.01±1.28) 岁, 病程1 h~6 h, 平均 (3.51±0.14) h。2 组患者基线资料无明显差异 (P>0.05) , 具可比性。
1.2 方法全部患者均给予检测血、尿常规和出血凝血时间, 行吸氧、止痛等常规治疗, 控制血压≤160/100 mm Hg。对照组:静脉滴注150 万U的UK (大连贝尔药业有限公司, 国药准字21020807, 规格10 万U) +100 m L的0.9%生理盐水, 于30 min内滴完, 可据患者实际病情予以利尿剂、他汀类药物等。观察组在此基础上加用200 mg/kg的L-Arg (重庆药友制药有限责任公司, 国药准字H50020901, 规格20 m L/5 g) , 1 次/d, 连用3 d;溶栓12 h后予以1 mg/kg低分子肝素钠 (深圳市天道医药有限公司, 国药准字H20056846, 规格0.2 m L/20 mg) , 1 次/12h。
1.3 观察指标统计2 组患者心肌肌钙蛋白T (c Tn T) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 水平;全部患者均随访1 个月, 统计不良反应发生情况[2]。
1.4 统计学方法计量资料以±s表示, 采用t检验, 计数资料采用 χ2检验, P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.12 组患者血浆指标比较2 组患者治疗24 h后c Tn T、LDH、CK-MB、SOD水平均高于治疗前, 且观察组治疗后各指标值优于对照组, 差异均具统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:t、P为2 组组内比较检验值;t1、P1为2 组治疗后比较检验值。
2.2 2 组不良反应比较观察组出血、心绞痛、心肌梗死和死亡发生率均低于对照组, 且心绞痛和心肌梗死发生率比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
3 讨论
STEMI发病机制与冠状动脉粥样硬化斑块破裂, 血小板聚集后形成血栓, 最终导致冠状动脉阻塞相关, 因而促使冠脉再通、恢复心肌灌注是治疗该病的关键所在[3]。临床研究指出, CK-MB是诊断STEMI的特异性指标, 本次研究数据显示, 2组治疗24 h后的c Tn T、LDH、CK-MB、SOD水平均比治疗前更高, 由此可知:STEMI患者存在缺血再灌注问题。分析其原因主要与心肌缺血再灌注损伤过程较为复杂密切相关:心肌代谢改变、微血管和氧自由基损伤等易造成细胞功能紊乱, 影响细胞膜的通透性和完整性, 使得细胞中的大分子物质如c Tn T、LDH、CK-MB释放后进入血液而引起含量变化[4]。研究中观察组各指标升幅小于对照组, 可见UK联合L-Arg在治疗稳定型STEMI患者心肌细胞膜方面的效果优于单一使用UK。考虑原因可能在于:UK能够直接作用于人体内源性纤维蛋白溶解系统, 通过使纤溶酶原裂解成纤溶酶后降解纤维蛋白凝块, 发挥溶栓作用;增强血管二磷酸腺苷 (ADP) 酶活性, 抑制血小板聚集而阻断血栓形成。L-Arg是由NO合成的特异性化学前体, 能够增加患者冠状动脉血流量, 降低内皮细胞表面黏附分子表达, 减少中性粒细胞趋化。两种药物联合使用有助于进一步加强改善STEMI患者的血流情况[5]。另外根据本次研究结果, 对全部患者随访1 个月后, 发现患者可能会发生出血、心绞痛、心肌梗死、死亡等不良事件, 但观察组心绞痛和心肌梗死的发生率分别为5.00%, 1.67%, 明显比对照组的20.00%, 16.67%更少, 提示STEMI应用UK与L-Arg联合治疗有助于降低患者不良反应概率。推测其主要是因为L-Arg可以增加患者血浆中的一氧化氮 (NO) 水平, 进而有利于减轻患者因心肌梗死引起的心肌缺血再灌注损伤。
综上所述, 急性ST段抬高型心肌梗死应用尿激酶溶栓联合左旋精氨酸治疗, 不仅能够稳定心肌细胞、提高血管再通率, 而且可以有效减少心绞痛等不良反应, 具临床推广价值。
参考文献
[1]任利辉, 叶慧明, 曹世长, 等.急性ST段抬高型心肌梗死与非ST段抬高型急性冠脉综合征患者PCI后的长期病死率比较[J].中国老年学杂志, 2013, 33 (19) :4673-4675.
[2]孙万峰, 王大杰, 张国培, 等.次全量尿激酶溶栓联合急诊PCI治疗急性ST段抬高型心肌梗死的临床研究[J].中国医师杂志, 2013, 10 (15) :1360-1362.
[3]李艳玲, 李敏, 江慧琳, 等.急性ST段抬高型心肌梗死患者预后的危险因素分析[J].广东医学, 2014, 24 (35) :3817-3820.
[4]戴青原, 郭涛, 刘中梅, 等.血清内脏脂肪素浓度变化与急性ST段抬高型心肌梗死的关系[J].中国全科医学, 2014, 28 (17) :3341-3345.
左旋精氨酸 篇4
摘 要：以鸡胸肉中提取的肌球蛋白为研究对象，考察不同添加量（0～0.09%）L-精氨酸对肌球蛋白凝胶的硬度、保水性和微结构等凝胶特性以及肌球蛋白溶液热特性的影响。结果表明：L-精氨酸可显著提高肌球蛋白凝胶的保水性（P<0.05），降低凝胶硬度（P<0.05）。扫描电镜显示空白组样品呈现大小不均的孔洞与颗粒状聚集物共存的凝胶结构，而添加0.03%～0.05% L-精氨酸的样品呈现相对致密的凝胶结构。L-精氨酸添加量达到0.03%以上时，肌球蛋白的第1个变性温度TM1显著降低；L-精氨酸添加量达到0.04%以上时，肌球蛋白的第2个变性温度TM2显著降低（P<0.05）。
关键词：肌球蛋白；L-精氨酸；保水性；硬度；微观结构；热特性
保水性和质构是肉制品的重要品质特性，对肉制品的产率与口感有十分重要的影响[1]。钠盐的使用是目前提高肉制品保水性和质构的重要手段之一。在肉制品加工过程中，氯化钠能够改善产品的风味、嫩度和多汁性等品质特性，有利于产品的保藏[2]。但是，摄入过量钠盐可诱发高血压[3]，增加中风及心脑血管的发病几率[4]；降低肉制品钠盐的使用量，将降低产品风味、口感，缩短产品货架期。因此，研发钠盐替代物显得尤为重要。
研究表明，添加精氨酸可提高猪肉肠的保水性、硬度、咀嚼性、弹性以及其他感官性能，提高猪肉糜蛋白的变性温度，有利于光滑、致密、均匀凝胶的形成[5]，在肉制品加工中具有潜在的应用前景。
盐溶蛋白是肌肉中的重要蛋白成分，参与肉凝胶的形成过程，对肉制品的保水性和质构特性产生重要影响[6]。研究精氨酸对盐溶蛋白凝胶形成的影响有利于揭示精氨酸对肉制品保水性和质构特性的影响机制。然而，迄今为止，国内外关于外源性氨基酸对盐溶蛋白热凝胶的影响研究很少[7]；精氨酸对肌球蛋白热诱导凝胶的影响尚未见报导。本研究以鸡胸肉中提取的肌球蛋白为研究对象，考察不同添加量（0～0.09%）L-精氨酸对肌球蛋白凝胶的硬度、保水和微结构等凝胶特性以及肌球蛋白溶液热特性的影响，以探讨L-精氨酸对肉制品保水性和质构特性影响的机制，为低钠肉制品研发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡胸肉购于合肥市家乐福超市。
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氯化钾、无水乙醇、丙酮、戊二醛、甲醛等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BC/BD-241冰柜 青岛Haier集团公司；ML104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SCX-8/2A绞肉机 上海双碟厨具有限公司；DS-1组织捣碎机 上海越磁电子科技有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；CT14RD冷冻离心机 上海天美生化仪器设备有限公司；8S-1磁力搅拌器 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；752N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TA-XT Plus硬度仪 英国Stable Micro System公司；JSM6490LV扫描电子显微镜 日本JEOL公司。
1.3 方法
1.3.1 肌球蛋白的提取
肌球蛋白提取：参照Chen等[8]的方法，将鸡胸肉剔除可见脂肪和结缔组织，切碎后取约150 g，在0～4 ℃条件下提取肌球蛋白。肌球蛋白溶液浓度的测定参照Zhou等[9]的方法，利用0.6 mol/L氯化钾磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5），将蛋白质质量浓度调整至20 mg/mL，待用。
1.3.2 肌球蛋白-精氨酸混合溶液的制备
参照史可夫等[10]的方法，分别向50 g 20 mg/mL肌球蛋白溶液中加入L-精氨酸，使L-精氨酸质量分数分别达到0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%。在0～4 ℃条件下缓慢搅拌30 min，至完全溶解，在冰箱中（约4 ℃）静置过夜（约12 h），形成肌球蛋白-精氨酸混合溶液待用。
1.3.3 肌球蛋白-精氨酸混合凝胶的制备
参照史可夫等[10]的方法，将处理后的肌球蛋白-精氨酸混合凝胶样品倒入小烧杯（27 mm×35 mm），放在20 ℃水浴锅中，以2 ℃/min的升温速率加热至80 ℃，并恒温处理30 min，取出小烧杯放入冰水浴中冷却10 min，放入冰箱中过夜（约12 h），待测。
1.3.4 凝胶保水性的测定
参照Qin等[11]的方法。取约10 g肌球蛋白-精氨酸凝胶在1 000 g/min下离心10 min，重复检测3 组。
1.3.5 凝胶硬度的测定
参照Zhou等[9]的方法。采用TA-XT Plus质构仪，设定GMIA程序测定肌球蛋白-精氨酸混合凝胶的硬度。参数设定：探头选用P/0.5，测试前速率1.50 mm/s，测试中速率1.00 mm/s，测试后速率1.00 mm/s，穿刺距离4 mm，触发力5 g。检测重复3 次。
1.3.6 扫描电子显微镜的测试
参照Qin等[11]的方法。将肌球蛋白-精氨酸凝胶样品放置在4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）中浸泡固定2 h，在凝胶样品固定变硬后，将样品均匀地切成10 mm×10 mm×2 mm的薄片；采用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2）漂洗5～10 次；用不同体积分数的乙醇（30%、40%、60%、80%和100%）溶液脱水，每次浸泡10 min，在通风厨中用冷风除去易挥发的有机溶剂；在真空冷冻干燥机中干燥15 h；喷金，观察。
1.3.7 肌球蛋白热特性的检测
参照陈星[12]的方法并稍加改动。称取10～15 mg蛋白样品，密封于铝坩埚中，放入设备中，并同时以空的铝坩埚作为对照。起始温度为20 ℃，并在此温度下平衡5 min，再以2 ℃/min升至80 ℃，收集其热相变温度T及相变焓值△H。实验重复3 次。
1.4 数据处理
结果以平均值±标准差的形式表示，采用Excel 2007进行数据处理，以Origin 8.0进行绘图，方差分析中的显著性检验采用IBM SPSS 19.0软件进行分析，当P<0.05时视为显著。
2 结果与分析
2.1 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶保水性的影响
样品1～6. L-精氨酸添加量分别为0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。下同。
由图1可知，与空白组相比，添加精氨酸
（L型，下同）能够很明显地提高肌球蛋白凝胶的保水性
（P<0.05）。这一现象与将精氨酸、赖氨酸分别添加到猪肉香肠中能显著提高其保水性的研究结果相似[7，13]。李俊[7]、Zhou[13]等推测由于精氨酸为碱性氨基酸，加入精氨酸可以改变猪肉香肠的pH值，使其偏离等电点，进而改变其保水性。已有研究[14]指出：调整牛肉的pH值可以提高其产率，进一步支持他们的观点。Guo等[15]研究发现精氨酸能够增加猪肉肌球蛋白的溶解性，表明精氨酸能够增强肌球蛋白的水合作用，进一步说明添加精氨酸能够增加蛋白凝胶的保水性。另一方面，Qin等[11]研究结果表明随着精氨酸添加量的增加，鸡盐溶性蛋白凝胶的保水性也随之增加；该研究指出随着精氨酸添加量的增加，盐溶性蛋白的微观组织结构发生改变是可能导致上述结果的又一重要原因。另外，精氨酸添加量为0.03%与0.01%、0.05%与0.03%以及0.07%与0.05%的蛋白凝胶的保水性差异不显著（P>0.05），这可能是由于精氨酸添加量的变化不足以明显改变蛋白溶液的pH值，或添加精氨酸所导致的pH值的改变不足以显著提高其保水性。虽然差别不显著，但是仍然可以发现，随着精氨酸的增加，肌球蛋白凝胶的保水性呈逐渐升高的趋势，意味着精氨酸的添加有利于改善肉制品的产率及多汁性。
2.2 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶硬度的影响
由图2可知，相对于空白组，添加了精氨酸的肌球蛋白混合凝胶的硬度显著降低（P<0.05）；并且，肌球蛋白凝胶的硬度随着精氨酸添加量的增加而显著降低（P<0.05）。Ma等[16]研究表明，在超高压条件下添加卡拉胶和CaCl2到盐溶蛋白体系后，其凝胶硬度也出现显著性降低（P<0.05）。有学者[17-18]指出肌球蛋白凝胶的质构可以通过高静压等不同技术处理或外源性成分的添加来实现；经上述处理，肌球蛋白得以展开并暴露出更多的带电基团，这种变化可能与其凝胶硬度相关。另外，有学者指出pH值的变化也对肉蛋白凝胶的硬度产生影响[19]，并指出最优的pH值约为6.0。精氨酸的等电点为10.8[20]，可以推测精氨酸的添加能够显著改变肌球蛋白体系的pH值，导致凝胶硬度的降低。但精氨酸影响肌球蛋白凝胶的硬度的机制尚不清楚，有待进一步的探究。然而，Zhou等[5]发现添加精氨酸能够明显增加猪肉肠的硬度（P<0.05），这与目前的研究结果相反，可能由于猪肉蛋白与鸡肌球蛋白的凝胶性质有很大差异。Qin等[11]研究也指出鸡盐溶蛋白凝胶的硬度随精氨酸添加量的增加而显著提高。除了肌球蛋白，盐溶性蛋白中还含有肌动蛋白、肌动球蛋白[21]，这些成分的存在对肌球蛋白凝胶特性有重要的影响[22]，可能是导致Qin等[11]的结果与本结果不同的原因。
2.3 不同添加量L-精氨酸对肌球蛋白凝胶微观结构的影响
A～F. L-精氨酸添加量分别为0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。
由图3可知，空白组的肌球蛋白凝胶由大小不均一的无规则的空洞和不规则的团状聚集物共同组成。
Qin[11]、Sun[23]等研究表明，未添加精氨酸的肌盐溶蛋白加热也形成相对粗糙的凝胶。当精氨酸的加入量达到0.03%和0.05%时，可以明显观察到肌球蛋白凝胶较为平整，且团状聚集物呈现减少的现象。随着添加量增加到0.07%和0.09%时，可以看到肌球蛋白凝胶三维网状结构中分布着较为均匀的孔洞。Sun等[23]认为，蛋白凝胶的保水性与其孔径呈负相关，添加精氨酸导致凝胶结构的变化可能与其保水性的变化密切相关。另外，多孔的凝胶结构与其硬度降低也可能有关。
2.4 不同添加量精氨酸对肌球蛋白凝胶热特性的影响
由图4及表1可知，空白组的差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）呈现出2 个特征峰，分别位于52.81 ℃和66.95 ℃，这与Ma等[16]的研究结果基本一致。有研究[23-24]报道，位于52.81 ℃特征峰为肌球蛋白头部变性所致，而位于66.95 ℃特征峰为肌球蛋白尾部变性所致。相较于空白组，精氨酸的添加量达到0.03%以上时，第1个峰对应的温度显著降低
（P<0.05），表明添加精氨酸之后肌球蛋白头部的转变温度朝较低的温度方向移动、稳定性呈现降低的趋势。精氨酸的添加量达到0.04%以上时，第2个峰对应的温度显著降低（P<0.05），表明添加精氨酸之后肌球蛋白尾部的变性温度降低、稳定性下降。Qin等[11]发现精氨酸添加到鸡胸盐溶蛋白中导致盐溶蛋白对应的第1个峰消失，而第2个峰对应的温度降低。Ma等[16]研究也表明，同时向猪盐溶蛋白中加入0.2% CaCl2和0.6%卡拉胶的混合物，可以显著降低肌球蛋白尾部的变性温度，同时肌球蛋白头部的转变峰消失。这些研究报导与本研究结果基本类似。Ma等[16]指出加入的Ca2+可能激活了内源性谷氨酰胺酶，同时卡拉胶可能与蛋白质间产生静电作用，两者共同作用于盐溶蛋白，导致上述结果。
3 结 论
添加精氨酸能够提高肌球蛋白凝胶的保水性，降低硬度（P<0.05）。同时，添加0.03%和0.05%精氨酸的样品呈现结构均匀致密的凝胶网状，显著改变肌球蛋白凝胶的微观结构。精氨酸的添加量达到0.03%以上显著降低肌球蛋白头部变性温度，添加量达0.04%以上显著降低尾部变性温度（P<0.05）。本研究表明，精氨酸的添加改变了肌球蛋白溶液的热特性及肌球蛋白凝胶的微观结构，可能导致最终肌球蛋白凝胶保水性的提高、硬度的降低。
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左旋精氨酸 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2009年6月至2010年12月86例符合溶栓治疗的急性ST段抬高型心肌梗死患者, 按照单双顺位随机分为2组, 观察组43例患者采用尿激酶溶栓联合左旋精氨酸 (L-Arg) 治疗, 其中男27例, 女15例;年龄47~72岁, 平均年龄57.5岁;对照组43例患者采用常规溶栓治疗, 其中男25例, 女17例;年龄46~72岁, 平均年龄57岁;所有患者发病距入院时间为6~68h, 2组在性别、年龄、各基础疾病方面差异不明显, 无统计学意义P>0.05。
1.2 诊断标准
所有患者入院前临床表现均为缺血性胸痛等, 胸痛时间在30min以上, 含服硝酸甘油症状无缓解、心电图显示至少2个邻近的肢体导联上s T段抬高>0.1m V, 相邻的胸前导联上S1段抬高>0.2m V, 并经心肌酶谱定量和肌钙蛋白定量确诊为急性ST段抬高型心肌梗死。
1.3 治疗方法
1.3.1 对照组治疗方法
患者入院后立即给予心电监护、休息、吸氧、镇静、止痛。30min内给予0.9%氯化钠溶液100m L+尿激酶150万U, 于30min内输注完;同时根据患者情况给予β受体阻滞剂、他汀类药物、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂 (ACEI) 等药物。
1.3.2 观察组治疗方法
在对照组基础上连续3d给予左旋精氨酸200mg/kg, 每天1次, 溶栓12h后给予低分子肝素钠1mg/kg, 1次/12h。
1.4 观察指标
观察2组患者治疗48h及1个月后心绞痛、再梗死、死亡等。
1.5 统计学方法
数据采用SPSS 13.0统计学处理, 进行χ2检验, 以P<0.05有统计学意义。
2 结果 (表1)
从表12种方法治疗48h及1个月后心血管不良事件发生情况显示, 观察组无死亡病例发生, 对照组死亡4例, 且心肌梗死与心绞痛发生率明显高于观察组, 2组间比较差异明显, 具有统计学意义P<0.05。
3 讨论
研究表明, 许多急性ST段抬高型心肌梗死患者经冠状动脉溶栓再通后, 恢复并不理想, 容易在短期出现较多的并发症, 如再次心肌梗死, 心绞痛等[3]。心肌缺血后再灌注损伤的形成是一个多步骤、多因素的复杂过程, 其发病机制包括微血管损伤、氧自由基损伤、钙超载、心肌代谢改变等。溶栓治疗后心肌缺血再灌注可能是造成这一现象的主要原因。上述因素引起细胞膜完整性和通透性改变,
NO的生理作用是下调心肌细胞、增加冠状动脉血流量、减少中性粒细胞的黏附、趋化, 防止中性粒细胞介导的损伤[4]。左旋精氨酸是N0合成的特异化学前体, 血管内皮细胞通过NO合酶使左旋精氨酸生成L-瓜氨酸和N0。本研究对2组患者治疗结果显示, 观察组患者使用尿激酶溶栓联合左旋精氨酸治疗后48h与1个月后随访情况显示, 观察组患者的梗死后心绞痛、再发心肌梗死、及死亡发生率明显少于常规溶栓组, 原因可能是由于左旋精氨酸能降低心肌缺血再灌注损伤所致。从2组患者的治疗情况显示, 对照组治疗后心血管不良事件的发生率与患者死亡率明显高于观察组, 提示尿激酶溶栓联合左旋精氨酸对减少急性ST段抬高型心肌梗死后并发症的发生具有明显效果。
参考文献
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左旋精氨酸 篇6
关键词：尿激酶,左旋精氨酸,心肌梗死
急性心肌梗死(AMI)的主要致病原因在于患者体内的冠状动脉的闭塞[1],从而引起血流的中断,引起血液供应不足,导致了部分的心肌产生较长时间的缺血供应而发生的一种局部坏死的现象。而本研究中的ST段抬高型心肌梗死(MI)疾病是由于患者体内的斑块破裂,导致了基质胶原的暴露,让凝血酶等粘附与血小板上,从而形成了血栓,引起冠状动脉闭塞,这便形成了ST段抬高型MI[2~4]。据相关研究发现,常规溶栓能够有效让患者血液再通,阻止冠状动脉闭塞。本文主要采用尿激酶溶栓加左旋精氨酸联合治疗急性ST段抬高型MI。
1 资料与方法
1.1 诊断标准
对急性ST段抬高型MI的临床诊治标准主要有以下几点要求[5]。(1)患者有胸痛感觉,且胸痛的时间一般持续在三四十分钟左右;(2)让患者服用硝酸甘油来观察症状是否消失,但并没有消失,通过心电图发现至少含有≥2个的邻近肢体的ST段抬高在0.1mv以上,胸前ST段抬高在0.2mv以上;(3)通过对患者的体内酶的含量判断,即肌钙蛋白和心肌酶谱,确定为急性ST段抬高型MI。
1.2 研究对象
主要研究对象为在2011年3月~2012年3月就诊于我院的患者,患者经过诊断标准确诊为急性ST段抬高型MI患者的有76例。患者中,男性为40例,女性患者为36例。年龄39~79岁,平均年龄51.2岁。主要的症状有经常性胸痛,且反复发作。病程在3~9年,平均病程5.3年。这些患者在性别、年龄、病理特征上所具有的差异不具有可比性,P>0.05。
1.3 研究方法
将76例患者随机分为两组,分别为尿激酶组38例和常规组38例。尿激酶组采用尿激酶溶栓加上左旋精氨酸治疗,常规组只采用常规的溶栓来治疗。采用尿激酶溶栓(南京南大药业,批号H32023290),采用左旋精氨酸(上海华兰化学,批号:74-79-3)。
尿激酶组的患者,入院后首先进行各项常规的检查,包括心电图、尿液、心肌酶、血压等的检查[6]。其次让患者处于平静的状态,在对患者治疗时的各项生理检测都要齐备。在治疗时,首先让尿激酶溶栓混合0.9%的氯化钠溶液,其中尿激酶取150万U,加入到氯化钠溶液中混合制成1000ml的溶液,让患者静脉滴注该溶液。滴注完后,采用左旋精氨酸治疗,用量为每天1次,每次200mg,使用该种治疗方法连续治疗10天。
常规组的患者,在入院前的各项检查与尿激酶组的患者相同,所不同的是在治疗过程中将尿激酶组的尿激酶溶栓换做常规的溶栓来治疗。治疗时间与尿激酶组相同,也要密切关注患者在治疗过程中的各项生理特征的变化。
在治疗的过程中,观察两组患者的心电图、消化道情况、黏膜等,同时做好记录。根据不同患者的病情,来决定是否采取检查胸片,做CT检查等。每隔一段时间,记录下患者的血液再通情况,对患者的各种酶含量进行统计,记录下不良反应发生的几率。
1.4 血管再通标准
由于对患者的MI的治疗效果的判断标准之一为血管的再通情况,故本研究需要研究血管的再通情况,这就需要有一个血管再通的标准[7]。该项标准主要有:(1)患者的胸痛感觉在滴注尿激酶溶栓和氯化钠溶液后的3h后,症状缓解或者疼痛感逐渐消失;(2)通过心电图的检查发现,入院前的ST段在溶栓和氯化钠溶液吸收后的3h内迅速下降,且下降到原来的一半或以上;(3)若以上两项都满足,且通过检查酶含量发现,血清酶的含量提前到15h以内,则可判断为血管的再通。
1.5 观察指标
在治疗过程中,对患者的血管再通情况进行统计,对患者的乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、肌钙蛋白、肌酸激酶含量进行统计,对患者在治疗过程中发生的各项不良反应情况进行记录统计[8]。
1.6 统计学方法
通过专业的统计软件SPSS15.0对数据进行分析,进行t检验。若分析的结果中,P<0.05,则表示该组的差异性具有统计学意义,若P<0.01,则该组的差异具有显著性意义。
2 结果
2.1 患者的血管再通情况比较
在治疗结束后的各个不同时间段,依据血管再通的诊断标准判断患者的血管再通例数。这些时间段分别为1h、2h、3h、4h,统计的结果如表1所示。从表1中可以看出,两组患者的血管再通情况相当,由于P>0.05,故可以认为两种方法在对于患者的血管再通的治疗效果相当。
2.2 患者体内各种酶含量统计
对患者的乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、肌钙蛋白、肌酸激酶含量进行统计,统计结果如表2所示。从表2中可以看出,尿激酶组患者的各项酶含量指标明显要由于常规组患者体内的酶含量。且P<0.05,故该项差异具有统计学意义。
2.3 患者发生不良反应统计
通过对患者的不良反应情况统计,主要的不良反应有出血、低血压、过敏反应三种。该研究的统计结果如表3所示。从表3中看出,尿激酶组的不良反应率低于常规组,P<0.05。
3 讨论
早期的AMI的发生缘由是由于患者的冠状动脉的闭塞,致使流通的血流发生中断,所导致的后果便是部分的心肌由于严重的缺血发生坏死,严重的后果会导致患者休克或死亡[8~10]。根据相关的研究,发现对于ST段抬高型MI的有效方法即是及时地恢复患者的动脉血流[11,12]。本研究中就是采用尿激酶溶栓加上左旋精氨酸来让患者的血流再通,让部分坏死的心肌有血流供应。但是单纯的溶栓治疗会引起较多的并发症,会发生心律失常、MI等。所以,采用左旋精氨酸联合的方法,它的作用是让血浆中的NO浓度升高,提高超氧化物歧化酶的活性,对心肌细胞膜具有很好的保护作用。
左旋精氨酸 篇7
1 实验材料
1.1 主要试剂与仪器
L-精氨酸(L-Arginine,纯度>99%),美国Sigma公司;低分子肝素(平均相对分子质量4500 Da,抗Xa效价105 U/mg),杭州九源基因工程有限公司);戊巴比妥钠(纯度>99%),美国Sigma公司;电子天平,德国赛多利斯天平有限公司;磁力搅拌器,上海司东仪器有限公司。
1.2 动物
健康SD雄性大鼠,体重(200±20)g,由中国药科大学实验动物中心提供。
2 实验方法
2.1 LMWH-精氨酸溶液的制备
按照表1的处方,将不同比例的LMWH与精氨酸溶解在10.0 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中即得。
2.2 大鼠十二指肠给药的血液凝固实验
取健康雄性SD大鼠(200±20)g30只,正常饮食1周;随机分为5组(n=6),试验前禁食12 h,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg),在鼠板上固定后沿腹中线剖开腹腔,皮下注射组(Sc.组)皮下注射LMWH水溶液(LMWH 20 U/kg);对照组(Control组)十二指肠处注入LMWH水溶液(LMWH 200 U/kg);试验组在十二指肠处分别给予表1中A(A组)、B(B组)、C(C组)处方(LMWH 200 U/kg),缝合伤口,给药后于0、0.5、1、2、4、6、 8 h在大鼠眼底静脉丛取血,弃去第1滴,滴3滴于载玻片两端,计时,用干燥针头挑动,当挑出第1根血纤蛋白丝时,停止计时,取3滴的平均值即为各取血时间的血液凝固时间。以用药后各时期与用药前(0 h)血液凝固时间的差值计算血液凝固时间延长百分率[7],绘制血液凝固时间延长百分率和时间的关系曲线,采用梯形面积法计算LMWH血液凝固时间延长百分率——时间曲线下的面积(AUC)。LMWH十二指肠给药的药效学相对生物利用度计算方法如下式:
undefined
式中,PA为LMWH十二指肠给药相对于皮下注射LMWH的相对生物利用度;AUCoral和AUCs.c.分别为十二指肠给药和皮下注射LMWH的血液凝固时间延长百分率——时间曲线下面积;DOSEoral和DOSEs.c.分别为十二指肠给药和皮下注射的LMWH剂量。
2.3 大鼠在体肠袢法给药的血液凝固实验
取健康雄性SD大鼠(200±20)g 18只,正常饮食1周;随机分为3组(n=6),考察表1中C处方在体肠袢法给药的抗凝血效果。大鼠实验前禁食12 h,用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg),在鼠板上固定后沿腹中线剖开腹腔,小肠分为3段:自幽门以下2 cm处向下取10 cm为十二指肠段,幽门以下15 cm向下取10 cm为空肠段,盲肠上端2 cm向上取10 cm为回肠段,各肠段两端结扎。肠袢中给药(LMWH 200 U/kg),缝合伤口,给药后于0、0.5、1、2、4、6、8 h在大鼠眼底静脉丛取血。血液凝固时间测定、血液凝固时间延长百分率计算、血液凝固时间延长百分率——时间曲线下的面积(AUC)计算同2.2项。
2.4 统计学处理
数据统计分析为SPSS 17.0软件,本研究计量资料以undefined表示,用药后各时期血液凝固时间延长百分率与0 h的比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 大鼠十二指肠给药血液凝固实验
大鼠十二指肠给药血液凝固实验的结果如图1和表2所示。给药后0.5、1、2、4、6、8 h,A、B、C组与0 h相比,大鼠血液凝固时间显著延长(P<0.05),对照组大鼠血液凝固时间延长百分率虽有增大的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。A、B、C组的AUC和PA显著高于对照组(P<0.05)。A、B、C组之间比较,AUC和PA随着精氨酸与LMWH摩尔比从10 ∶1、20 ∶1提高到30 ∶1时,有依次增加的趋势(P<0.05)。
百分率
3.2 大鼠在体肠袢法给药的血液凝固实验
大鼠经体肠袢法给药的血液凝固实验的结果如图2和表3所示,给药后0.5、1、2、4、6、8 h,各组与0 h相比,大鼠血液凝固时间显著延长(P<0.05)。十二指肠组、空肠组、回肠组组间相比,AUC差异无统计学意义(P>0.05)。结果说明精氨酸在十二指肠、空肠、回肠部位均能显著促进低分子肝素的吸收,并且在3个部位的促吸收作用,差异无统计学意义(P>0.05)。
时间的百分率
4 讨论
低分子肝素为有效的抑制血栓形成的抗凝新药,它疗效显著,近年来广泛应用于临床,已取代肝素成为急性冠脉综合征的首选抗凝药物。目前,低分子肝素给药途径大多为皮下注射,但皮下注射不良反应较多,如皮下淤斑、皮下出血等,且患者使用不便[8]。为了方便给药、能够长期应用以及避免皮下注射出现的不良反应,我们以天然氨基酸中的L-精氨酸为LMWH的肠道促吸收剂,探讨其对LMWH的口服促吸收作用。
前期实验研究证明,穿膜肽六聚精氨酸(R6)能够与LMWH非共价键偶合,显著促进LMWH的口服吸收,其原因可能是R6的6个精氨酸残基上的阳离子基团与LMWH上的阴离子基团偶合,LMWH被R6携带透过肠道细胞膜而吸收[2]。考虑到穿膜肽的价格较高,应用于LMWH的口服给药将大幅度增加治疗成本,阳离子性的精氨酸同样能够与LMWH上的众多阴离子基团偶合,有可能促进LMWH的口服吸收,因此考察了精氨酸促进低分子肝素肠道吸收的效果。结果证明精氨酸能够显著促进LMWH的口服吸收,在精氨酸与LMWH的摩尔比达到30 ∶1时,以血液凝固时间延长百分率计算,LMWH口服的生物利用度甚至超过了10%。
预试验已经证明精氨酸不具有改变大鼠血液凝固时间的作用,因此本实验不再考察精氨酸对血液凝固时间的影响,仅证实精氨酸能够显著促进LMWH的口服吸收作用。精氨酸对低分子肝素的肠道促吸收作用,为开发安全有效、成本较低的低分子肝素口服制剂奠定了一定的实验基础,也希望为低分子肝素的肠道给药开辟一条新的途径。关于精氨酸对LMWH的口服促吸收作用目前还建立在实验动物的基础上,其确切机制尚需进一步研究。
摘要：目的 低分子肝素是一种有效的溶栓剂,目前只有注射剂用于临床,该实验研究精氨酸对低分子肝素口服吸收的促进作用。方法 以大鼠用药前后血液凝固时间的变化研究精氨酸的肠道促吸收作用。结果 精氨酸能够显著延长大鼠的凝血时间。在精氨酸与低分子肝素摩尔比为30∶1时,低分子肝素的药效学生物利用度达到11.7%。结论 精氨酸能够显著促进低分子肝素的肠道吸收。
关键词：精氨酸,低分子肝素,口服
参考文献
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精氨酸接枝改性壳聚糖的制备 篇8
我国的水资源非常丰富,虾蟹产量位于世界前列,而甲壳素正是虾、蟹外壳的主要有机成分[2]。除此之外,甲壳素还存在于软体动物(如扇贝),节肢动物(如昆虫),低等植物的菌类、藻类细胞,高等植物的细胞壁中等等[3]。壳聚糖除了来源丰富,可再生等优点以外,还具有抗菌性能,能抑制一些真菌、细菌和病毒的生长繁殖;生物官能性、相容性和安全性,可作为骨的替代物以及牙的填料;血液相容性,能促进伤口愈合,起到止血的效果等[4,5,6]。基于以上性质,壳聚糖及其衍生物已经日益引起各行各业的重视,被广泛应用于化妆品、环境保护、化工、农业、食品等领域,尤其是在医学方面的应用更是显著[7]。但是,由于壳聚糖具有分子量大,粘度大,在大多数溶剂中溶解性差,易降解以及紫外吸收较弱等缺点,对其应用也存在一定的局限,故要对壳聚糖进行改性[2]。
本实验重点介绍精氨酸接枝改性壳聚糖制备,在结合传统合成工艺的基础上,通过比较单独反应和混合反应,改变精氨酸的加入量,改变反应温度等条件,从而探索出最适宜精氨酸接枝改性壳聚糖的最佳条件。
1.1 国内外壳聚糖的应用现状
1.1.1 生物技术领域的应用[8,9]
(1)用于人造组织和器官;(2)具有免疫调节活性;(3)具有抗癌作用;(4)作为药物的缓释基质;(5)促进凝血和伤口愈合;(6)其他医学用途(胃壁保护膜等)。
1.1.2 食品方面[10,11,12]
(1)抗菌剂;(2)果蔬保鲜剂;(3)肉制品的抗氧剂;(4)果汁的澄清剂;(5)饮用水的净化剂;(6)食用包装膜。
1.1.3 化妆品行业[13,14,15]
壳聚糖是唯一的仿天然的阳离子高分子聚合物,它的成膜性和生物学活性拓宽了它的应用范围。应用最突出的领域当属化妆品领域,可用于合成护肤产品及护发产品等。
2 实验部分
2.1 实验药品与仪器
2.1.1 改性壳聚糖的制备所需试剂
L-精氨酸,上海康捷生物科技发展有限公司;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,上海晶纯试剂有限公司;N-羟基丁二酰亚胺,国药集团化学试剂有限公司;壳聚糖,国药集团化学试剂有限公司;冰乙酸,中国杭州化学试剂有限公司;聚乙二醇,国药集团化学试剂有限公司。
2.1.2 改性壳聚糖的制备所需仪器
电子天平,上海民桥紧密科学仪器有限公司;恒温磁力搅拌器,杭州仪表电机有限公司;集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司;傅立叶变换红外光谱仪,浙江精科计量仪器有限公司。
2.2 壳聚糖的改性机理
本实验是在活性酯EDC做催化剂的条件下,壳聚糖分子(CS)的中的氨基与L-精氨酸(Arg)的α-羧基脱水,两者发生键合作用,形成肽键。反应中EDC夺取精氨酸的α-羧基的羟基及壳聚糖氨基的氢,合成肽键,从而形成壳聚糖-精氨酸(CS-Arg)。
2.3 壳聚糖衍生物的制备
A:精氨酸用NHS进行活化,并加入15%mg/mL的EDC溶液,待用;B:另称取壳聚糖(80～95 KD)溶于1%醋酸溶液中,搅拌1天。将A、B混合,在搅拌器上反应2天,之后依次进行蒸馏水透析、18%PEG溶液浓缩处理;再用无水丙酮对浓缩液进行沉淀,摇匀,静置于4 ℃一夜。次日离心10 min;离心后,弃去上清液,用无水乙醇浸泡沉淀5 min;弃去乙醇溶液,将沉淀带离心管放入烘箱干燥,待收集。
3 结果与讨论
3.1 红外光谱分析
图1中,B为精氨酸的量与壳聚糖的量为1:1的制备样品;D为精氨酸的量与壳聚糖的量为1:1,并且把精氨酸处理后放置2天,再加入到壳聚糖溶液中进行实验的制备样品;F为精氨酸的量与壳聚糖的量为2:1的制备样品;H为精氨酸的量与壳聚糖的量为3:1的制备样品;J为纯壳聚糖。
从图1可知,天然壳聚糖(图1:J)伯氨弯曲振动特征吸收峰(1604 cm-1),在改性产物中均消失,相应仲氨弯曲振动特征吸收峰(1550 cm-1)在改性产物中有所增强(图1:B、F和H),初步说明壳聚糖精氨酸接枝成功。预活化处理2天制备样品(图1:D)仲氨弯曲振动特征吸收峰(1550 cm-1)增强不明显。由此说明,预活化处理2天作用不明显,精氨酸与壳聚糖比例1:1、2:1和3:1对接枝反应没有显著影响,1:1比例即可实现改性。
如图2所示精氨酸的量与壳聚糖的比值均为1:1,B、D、F、H、J分别为40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃下制备的样品,L为天然纯壳聚糖。图2中,在CS的红外谱图中:3456 cm-1的吸收峰对应着-NH和-OH的伸缩振动以及CS分子内和分子间的氢键作用,2923 cm-1的弱吸收峰是由于-CH-的伸缩振动,1641 cm-1,1600 cm-1和1328 cm-1分别对应是CS的v(C=O)酰基(酰胺Ⅰ)弯曲振动,δ(-NH2)(酰胺Ⅱ),v(C-H)+δ(N-H)(酰胺Ⅲ)的吸收峰,CS吡喃环上的C—O骨架伸缩振动带出现在1092～1033 cm-1,1155 cm-1处的吸收峰属于壳聚糖吡喃环上C-O-C的非对称伸缩振动;在CA的红外谱图中:仍然可以看出Arg的两个特征吸收峰,1645 cm-1和1421 cm-1,也可以看到CS吡喃环C-O骨架伸缩振动带出现在1092～1033 cm-1,同时1550 cm-1附近为氨基(-NH2)的N-H变形振动吸收峰,说明壳聚糖分子(CS)的中的氨基与L-精氨酸(Arg)的α-羧基脱水,两者发生键合作用,形成肽键,生成了仲胺。Arg取代度高的壳聚糖在1576 cm-1处的峰明显增强,表明自由氨基的量增多。这就证明Arg确实已经接到了CS的自由氨基上生成了酰胺键,取代较高的是在精氨酸的量与壳聚糖的量为1:1,反应温度在55 ℃的条件下得到的。
3.2 DSC分析
如图3所示A为精氨酸的量与壳聚糖比值为1:1,且把精氨酸预活化处理后放置2天,加入到壳聚糖中室温下制得样品;B为精氨酸的量与壳聚糖比值为1:1室温下制得样品;C为精氨酸的量与壳聚糖比值为2:1室温下制得样品;D为精氨酸的量与壳聚糖比值为3:1室温下制得样品。E、F、G、H和I为精氨酸的量与壳聚糖比值均为1:1,制备温度分别为40 ℃(E)、50 ℃(F)、55 ℃(G)、60 ℃(H)和65 ℃(I)下制备的样品。
由图3可见,C的反应产物有较高热稳定性,比未改性的壳聚糖稳定性还要高,达到了199 ℃,其他的几组也相应的出现了玻璃转变温度,说明精氨酸接影响了壳聚糖的热力学性能。
由图3可见,G,I有多处Tg,推测可能是聚合过程中生成精氨酸自聚寡肽侧链基团,在升温过程中寡肽与壳聚糖主链热力学性能差异导致多个玻璃化转变温度的出现。F,E,H都只有一个玻璃化转变温度,原因可能是该3种反应温度下,精氨酸自聚反应较少,反应产物结构较为均一所致。
4 结 论
左旋精氨酸 篇9
1实验材料
1.1 试药与试剂
精氨酸:白色粉末,规格:原料药,批号:09021004、09021005、09021006,由苏州东瑞制药有限公司提供。细菌内毒素工作标准品:批号:150601-200861,效价:150 EU·支,由中国药品生物制品检定所提供。鲎试剂:批号:0807260,灵敏度:0.125 EU/ml,由湛江博康海洋生物有限公司生产;批号:0903311,灵敏度:0.125 EU/ml,由湛江安度斯生物有限公司生产,试验前2批鲎试剂的灵敏度复核均符合规定。细菌内毒素检查用稀释剂II(调节供试品的碱性,以下简称稀释剂II):批号:0903160,规格:4 ml/支,内毒素含量小于0.003 EU/ml,由湛江安度斯生物有限公司提供。
1.2 仪器
ZH-2型自动漩涡混合器,由天津药典标准仪器厂生产;DC-3A型细菌内毒素检查干式恒温器,由南京三爱斯技术开发有限公司生产。
2方法与结果
2.1 精氨酸中细菌内毒素限值的计算
按《中国药典2005年版》[2]规定,细菌内毒素限值(L)由公式L=K/M计算。其中,K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,注射剂K值为5 EU/(kg·h) ;M为人每公斤体重每小时的最大给药剂量,精氨酸为原料药,根据其制剂盐酸精氨酸注射液临床使用最大剂量换算得到, M值为83 mg/(kg·h)。据此计算,精氨酸的L值为0.06 EU/mg,精氨酸是原料药,考虑之后还有一个制剂生产过程,所以慎重起见,我们最后确定精氨酸的L值为0.01 EU/mg。
2.2 精氨酸稀释度的确定
计算供试品最小有效稀释浓度的公式为C=λ/L(L值为0.01 EU/mg,λ为鲎试剂的标示灵敏度),当λ分别为0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.062 EU/ml、0.031 EU/ml时,则供试品的最小有效稀释浓度C应分别为50 mg/ml、25 mg/ml、 12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml。
注:“+”为凝固,“-”为未凝固 由表1可见,当供试品溶液浓度≤12.5 mg/ml时,对两个厂家的鲎试剂不产生干扰作用,也就是对λ=0.125 EU/ml以上灵敏度的鲎试剂无干扰。
2.3 干扰试验
2.3.1 干扰试验预实验
试验前验证供试品热原试验均符合规定。为排除供试品溶液对细菌内毒素检查的干扰,求出最高无干扰浓度,先进行干扰试验预实验。将3批精氨酸分别用稀释剂II配制成50 mg/ml、25 mg/ml、 12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml 5个不同浓度的供试品溶液(NPC),并配制此系列浓度中含2λ的供试品阳性液(PPC)。选择两个厂家的λ为0.125 EU/ml的鲎试剂,分别加入0.1 ml稀释剂II溶解,再分别加入0.1 ml不同浓度的NPC和PPC,混匀后,于37℃保温60 min,同时作阳性对照(PC)和阴性对照(NC),试验重复2管,结果见表1。
2.3.2 干扰确证试验
为进一步确证供试品溶液对λ为0.125 EU/ml的鲎试剂是否存在干扰作用,用稀释剂II和浓度为0.25 mg/ml的3个批号供试品溶液分别将细菌内毒素工作标准品配制成0.250、0.125、0.062、0.031 EU/ml4个浓度的系列内毒素标准溶液。再分别用两个厂家的λ为0.125 EU/ml的鲎试剂实验,同时做供试品溶液的对照,试验重复4管,结果见表2。
由表2可见,内毒素标准溶液的Es值在0.5～2.0λ(包括0.5λ和2λ)范围内,而供试品的Et值则在0.5～2.0 Es(包括0.5Es和2.0 Es)范围内,确证浓度为12.5 mg/ml的3个供试品溶液 对λ为0.125 EU/ml鲎试剂无干扰作用。
注:“+”为凝固,“-”为未凝固
2.4 精氨酸的细菌内毒素检查
取3个批号的精氨酸,分别用稀释剂II配制成浓度为12.5 mg/ml的供试品溶液,然后用两个厂家的λ为0.125 EU/ml鲎试剂进行细菌内毒素检查,并设供试品阳性(2λ)、PC及NC,结果见表3。
注:“+”为凝固,“-”为未凝固
由表3可见,3批精氨酸细菌内毒素检查均符合规定。
3讨论
本实验考察了精氨酸是否对鲎试剂与内毒素的凝聚反应有干扰作用,结果证明将精氨酸按《中国药典》2005年版(二部)附录Ⅺ E中细菌内毒素检查法试验,对鲎试剂与内毒素凝聚反应没有干扰,使用λ为0.125 EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查是可行的,确证了细菌内毒素检查法完全可以代替传统的兔热原法用于该制剂的质量控制。据此,提出精氨酸的细菌内毒素检查参考标准:取本品,以能够调节本品的pH值的缓冲液稀释,依照《中国药典》2005年版(二部)附录Ⅺ E检查,每1 mg精氨酸中含内毒素的量应小于0.01 EU。
摘要：目的 建立精氨酸的细菌内毒素检查法。方法 按照《中国药典》2005年版(二部)附录ⅪE中细菌内毒素检查法,使用两个厂家的鲎试剂对精氨酸进行干扰试验研究。结果 精氨酸对采用鲎试剂进行细菌内毒素检查无干扰作用。结论 精氨酸可以用细菌内毒素检查法(凝胶法)代替家兔热原检查法控制其产品质量。
关键词：精氨酸,细菌内毒素,鲎试剂,干扰试验
参考文献
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