酪氨酸酶

酪氨酸酶（共10篇）

酪氨酸酶 篇1

奥扎格雷 (ozagrel) 是一种新型抗血小板聚集药, 药理研究表明, 奥扎格雷能强力抑制TXA2合成酶的活性, 从而抑制血小板聚集, 同时提高前列环素PGI2的浓度, 扩张血管, 增加血流量, 有效抑制脑血栓的形成, 使已形成的血栓靠血液平衡关系的打破而被自行溶解, 达到治疗脑梗塞之功效。该文研究了奥扎格雷对蘑菇酪氨酸酶的抑制动力学。该研究结果为进一步的设计高效酪氨酸酶抑制剂奠定理论基础, 并为奥扎格雷及其衍生物作为食品防腐剂、果蔬保鲜剂以及美白化妆品的添加剂阐明了它们作用的酶学机理, 为新型高效酪氨酸酶抑制剂的开发提供了新的分子模板。

1 实验方法

1.1 酪氨酸酶活力测定

酪氨酸酶单酚酶活力测定:1.5mmol/LL-酪氨酸为底物, 在p H6.8的磷酸盐缓冲液中, 30℃恒温10分钟, 加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酶溶液, 在475nm波长下测定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力测定:1.0mmol/LL-DOPA为底物, 在p H 6.8的磷酸盐缓冲液中, 30℃恒温10分钟, 加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酪氨酸酶溶液, 在475nm波长下测定吸光度OD值。

2 结果与讨论

2.1 奥扎格雷对酪氨酸酶单酚酶的影响

如图1所示, 奥扎格雷具有抑制蘑菇酪氨酸酶单酚酶酶活。测定不同浓度的奥扎格雷浓度对酪氨酸酶单酚酶作用的进程曲线, 曲线1-5分别表示奥扎格雷在测酶活体系中的浓度为0、10、20、30和40mol/L。图1结果表明, 奥扎格雷能延长酶反应的延滞时间 (曲线的直线部分交于X轴的值) , 并随着奥扎格雷浓度的增大而延长。在相同反应时间下, 反应体系的吸光度值随着奥扎格雷浓度的增大而下降, 说明奥扎格雷对酪氨酸酶的单酚酶活性有抑制作用。延滞期过后, 酶催化体系逐渐达到了稳态 (曲线的直线部分) 。相对抑制率达到50%的奥扎格雷浓度 (IC50) 为1.35mmol/L。

2.2 奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的影响

以L-DOPA为底物测定酪氨酸酶二酚酶酶活, 反应进程曲线如图2 (曲线0-5) 。在测活条件体系中, 加入酶液后, 反应迅速进入稳态, 产物与时间呈线性递增, 直线部分为酶催化底物反应级数为一级反应, 随着时间的延长, 酶受到奥扎格雷的抑制, 导致酶活下降, 从而反应级数逐渐的由一级反应转变为零级反应。在不同的奥扎格雷浓度条件下, 随着奥扎格雷浓度的增加, 一级反应区域 (曲线直线部分) 的斜率逐渐减小, 即奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶酶活的抑制程度增大。

2.3 催化机理

在氧气存在条件下, 酪氨酸酶的基本功能有两个:作为单酚酶羟基化单酚生成邻二酚 (图3) ;作为双酚酶氧化邻二酚生成醌 (图4) 。该酶具有包含两个铜离子位点的活性中心, 并与不同数目的氧原子配位结合具有三种不同状态, 分别为氧化态Eoxy, 还原态Emet和脱氧态Edeoxy。氧化态Eoxy兼具单酚酶和二酚酶的活性;还原态Emet具有二酚酶的活性, 不具有单酚酶活性, 但是和单酚底物具有亲和作用, 所以还原态Emet是延滞效应产生的原因;脱氧态Edeoxy的作用是只能结合氧。所以, 酪氨酸酶催化单酚类底物都是从Eoxy开始, Emet和Edeoxy均不与单酚类底物反应, Eoxy和Emet两者都可以催化多酚类底物。

奥扎格雷能够延长单酚酶的延滞时间, 降低单酚酶和二酚酶的稳态速率, 说明奥扎格雷能够可逆的抑制酪氨酸酶并阻止多巴色素的生成, 进而能够遏制黑色素的生成。并且, 对于二酚酶体系而言, 奥扎格雷不仅能和还原态酶Emet和氧化态酶Eoxy结合分别形成对应的酶-抑制剂复合物Emet I和Eoxy I, 而且还能和酶-底物复合物Emet I和Eoxy I分别形成对应的酶-底物-抑制剂复合物Emet SI和Eoxy SI。同时, 根据奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的混合型抑制机理, 这一过程可表示为: (如图5所示)

其中E (Emet, Edeoxy和Eoxy) 、D、I和P分别表示酶的三种形态、底物L-DOPA、奥扎格雷和产物, EI、ES和ESI分别表示酶-抑制剂复合物、酶-底物复合物和酶-底物-抑制剂复合物。从酪氨酸酶角度分析, 该酶存在两个结合位点, 一个可与底物结合, 另一个与抑制剂结合。当底物与酶结合过程中, 酶的天然构象会发生一些形变, 在这个变化过程中, 酶的疏水性的“口袋”会变大。然后, 酶和底物结合后, 会形成一个新的疏水性的“口袋”, 抑制剂奥扎格雷会嵌入这个“口袋”形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。可以推断出, 酶和底物-抑制剂复合物ES容易形成并且结合力更强。而比较竞争性和反竞争性的强弱, 则可通过单酚酶的测试来旁证, 在单酚酶测活体系中, 延滞现象很容易被观察到。延滞期过后, 反应体系才达到稳态。反推之, 若奥扎格雷只与游离酶起作用, 那样不仅降低稳态反应速率而且延长延滞时间;若奥扎格雷只与酶-底物复合物ES起作用, 奥扎格雷仅降低稳态反应速率, 而且不会延长延滞时间, 但是奥扎格雷不仅降低了稳态反应速率, 而且延长了延滞时间, 则说明竞争性抑制效应要强于反竞争性抑制效应。

摘要：奥扎格雷不仅能抑制酪氨酸酶单酚酶的活性, 而且能够抑制酪氨酸酶二酚酶的活性。对单酚酶的抑制作用主要表现为抑制酶活, 并且使得酶催化反应的延滞时间有明显的延长, 而对二酚酶的抑制作用, 主要表现为抑制二酚酶酶活。同时, 讨论了酚氧化酶的催化氧化的机理:酶和底物结合后, 会形成一个新的疏水性的“口袋”, 抑制剂奥扎格雷会嵌入这个“口袋”, 形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。

关键词：酪氨酸酶,奥扎格雷,单酚酶,二酚酶,抑制机理

参考文献

[1]臧荣春, 夏凤毅.微生物动力学模型[M].北京:化学工业出版社, 2004.

[2]A.G.Marangoni (著) , 赵裕蓉, 张鹏 (译) .酶催化动力学—方法与应用[M].北京:化学工业出版社, 2007.

[3]Y.Shi, Q.-X.Chen, Q.Wang, K.-K.Song, L.Qiu.Inhibitory effects of cinnamic acid and its derivatives on the diphenolase activity of mushroom (Agaricusbisporus) tyrosinase[J].Food chemistry, 2005, 92 (4) :707-712.

酪氨酸酶 篇2

2.调节情绪，心情要愉快，在种种压力面前“不要生气”这样也有利于提高抗病能力。

3.适当锻炼，避免疲劳。练瑜伽，打坐，打太极拳，游泳等，有利于身体免疫力的提高。

4.要自觉戒酒，尽可能戒烟。乙肝病毒复制，又重叠酒精性肝病是慢性乙肝走向肝硬化，肝癌的促发条件，也是肝病患者病情加重，难治的原因。

丙氨酸氨基转移酶为什么会升高 篇3

我是一名糖尿病患者。我的血糖水平一直控制得很好。但最近的一次体检结果显示，我的丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平有了轻度的升高。当时，医生怀疑我得了肝炎，但经过多方面的检查却未能确诊。后来医生说我出现这种情况可能是服用降糖药拜唐平引起的。但是我停止服用该药后，我的丙氨酸氨基转移酶的水平并未恢复正常。请问，人的丙氨酸氨基转移酶为什么会升高，我该怎么办？

山西 秦佳慧

秦佳慧读者：

多年来，丙氨酸氨基转移酶一直是人们进行体检和对肝病进行筛查时的常规检查项目。在我国，在无症状的乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎患者中，丙氨酸氨基转移酶升高是一项较为常见的敏感指标。而在国外（如在美国），人们出现丙氨酸氨基转移酶水平异常，其最常见的原因则是患有非酒精性脂肪性肝病。人们使用某些药物时也会出现丙氨酸氨基转移酶水平异常。因此，人们在使用药物的过程中都应注意监测肝功能的变化。如果患者的丙氨酸氨基转移酶的水平升高了，则意味着其可能存在药物性的肝脏损伤。不过，有些药物所致的丙氨酸氨基转移酶的改变往往是可逆的，如人们使用拜唐平、他汀类药物之后出现的丙氨酸氨基转移酶的改变是可以自然恢复的，并不需要停药。

近几年的研究还发现，一些非肝病因素也可以使人们的丙氨酸氨基转移酶发生改变，如男性患有高胆固醇血症、经常饮酒等，女性出现血糖升高、使用避孕药等以及人们的体质指数发生改变、患有高甘油三酯血症等因素都可以使丙氨酸氨基转移酶的水平升高。此外，丙氨酸氨基转移酶升高还与一些全身性疾病如肥胖、代谢综合征以及心血管疾病等密切相关。美国、韩国的科学家们所做的相关研究都发现，在丙氨酸氨基转移酶水平高于或等于100单位/升的人群中，由于患有心血管疾病而死亡的人数明显高于丙氨酸氨基转移酶低于20单位/升的人群。

一个人的丙氨酸氨基转移酶的水平是其健康状况的一种反映。如果已经出现了丙氨酸氨基转移酶水平升高的情况，那么无论是哪种原因引起的，都应该积极地查明原因，及时地予以纠正和进行治疗。

芦荟素对酪氨酸酶活性的抑制作用 篇4

酶在医药、食品、化工和环保等领域应用广泛。酪氨酸酶是一种以双铜离子为活性单元的氧化还原性酶, 在动物、植物体内广泛存在, 对黑色素细胞的合成具有调控作用, 是黑色素形成的限速酶[1]。

黑色素细胞是生物体内黑色素的合成主要场所, 在黑色素的合成过程中, 酪氨酸酶对整个黑色素的合成具有重要催化作用, 酪氨酸酶主要存在于黑色素细胞中。酪氨酸酶的活性升高, 则黑色素的形成增加;酪氨酸酶的活性降低, 则黑色素的生成减少, 因此, 酪氨酸酶活性的强弱与黑色素形成的多少存在正相关关系。临床上酶氨酶活性过强、或者过弱均会导致临床疾病的发生, 如黄褐斑、白化病、雀斑、白癜风等异性性色素性皮肤病[2]。国内外学者常利用抑制酪氨酸酶活性试验, 研究筛选治疗皮肤色素沉着症的药物[3]。该实验采用蘑菇酪氨酸多巴速率氧化法, 研究活性单体化合物芦荟素对酪氨酸酶的影响[4]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

L-多巴胺 (L-DOPA) , 蘑菇酪氨酸酶 (美国Sigma公司) ;芦荟素 (中国药品生物制品检定所) ;氢醌 (天津市巴斯夫化工有限公司) ;其他试剂均为市售分析纯。UV-1800紫外可见分光光度计 (日本岛津) ;AUY220电子分析天平 (日本岛津) 。

1.2 方法

采用pH6.8磷酸缓冲溶液, 将L-DOPA、芦荟素、氢醌分别配制成0.1%的溶液, 将蘑菇酪氨酸酶配制成100U/mL的溶液。取上述磷酸缓冲240μL, 加入0.1%L-DOPA反应液80μL, 蘑菇酪氨酸酶80μL混合均匀, 常温静置5 min, 于分光光度计上在400~600 nm扫描。可见在475 nm处有最大吸收峰。同法分别测定L-DOPA、蘑菇酪氨酸酶均未见有吸收。采用酪氨酸酶多巴速率氧化法, 在pH6.8磷酸缓冲液中, 用酪氨酸酶催化多巴变成多巴醌, 有肾上腺素红色, 利用分光光度计在475 nm处的特定吸收测定生成多巴醌时的吸收度:A=A (药+L-DOPA+酶) —A (药+酶) 。反应在96孔培养板中进行, 总反应体系为200μL测试药物40μL;100U m L-1的酪氨酸酶溶液40μL;0.1%的L-DOPA溶液40μL;pH6.8的磷酸缓冲液80μL。调零孔仅加pH6.8的磷酸缓冲液200μL;对照组不加测试药物, 以pH6.8的磷酸缓冲液40μL代替。加样完毕, 将96孔培养皿置于水温为37℃的水浴箱中孵育20 min后, 随即取出立即检测其吸光度, 记录每孔的对应A值。每次试验重复8次。然后计算得出酪氨酸酶的抑制率。酪氨酸抑制率 (%) = (A (药+L-DOPA+酶) —A (药+酶) ) /A (药+L-DOPA+酶) [5,6]。

2 结果

对酪氨酸酶活性的影响0.01%浓度的芦荟素和氢醌都对酪氨酸酶有不同程度的抑制作用, 其中氢醌的抑制作用稍强于芦荟素。结果见表1。进一步研究发现芦荟珍珠胶囊在高浓度 (2 mmol/L) , 中浓度 (1mmol/L) 时对酪氨酸酶活性的影响, 与氢醌 (0.5 mmol/L) 相比, 前者抑制率高于氢醌 (0.5 mmol/L) (P<0.05) 而后者抑制率与氢醌 (0.5 mmol/L) 相当 (P>0.05) 。并将芦荟素和氢醌的浓度从2~0.5作4种浓度倍比稀释, 反应其对酪氨酸酶的抑制作用的强弱大致呈剂量依赖关系, 如图1所示。

注:L-多巴、芦荟素、氢醌为0.1%的溶液;酷氨酸酶为100 UmL-1。

3 讨论

从色素增多性皮肤病的发病机理来看, 自然界凡是对酪氨酸酶具有抑制作用的物质, 如氢醌、维生素E、维生素C、硫辛酸、曲酸等, 理论上均可作为临床祛斑剂的选择对象, 临床使用中发现氢醌霜、果酸类制剂因其刺激性大且使用过量后具有一定的细胞毒性已经逐渐被淘汰;维生素C、曲酸易氧化, 保质期短。而芦荟素在酪氨酸酶活性抑制的方面的有效性及安全性等方面均比较理想[7,8,9]。该研究表明:芦荟素对酪氨酸酶有较好的抑制作用, 并且芦荟素对酪氨酸酶活性的抑制作用呈现出良好的量-效关系, 芦荟素浓度在0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L时对酪氨酸酶的抑制作用逐渐增强, 其抑制率随剂量的增加而升高。在整个观察过程中, 无细胞毒性、皮肤刺激性及过敏反应等不良反应的发生, 临床使用安全性, 皮肤依从性良好。因此, 芦荟素或含有芦荟素的相关产品可以作为治疗色素增多性疾病, 如黄褐斑, 妊娠斑等的选择药物。

参考文献

[1]闫军.酪氨酸酶抑制剂及对黑素生物合成的影响[J].国外医学皮肤性病学分册, 2003, 29 (4) :250-253.

[2]姜洪芳, 刘本海, 刘晓棠, 等.薰衣草精油对酪氨酸酶活性影响的研究[J].中国野生植物资源, 2010, 29 (5) :29-32.

[3]李娜.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].食品工业科技, 2010, 07:406-409.

[4]闫军.咖啡酸、阿魏酸和香草酸对酪氨酸酶活性的影响[J].中国临床药理学与治疗学, 2004, 9 (3) :337-339.

[5]谭城.芦荟素、肉桂酸、苦参碱对酪氨酸酶的抑制作用[J].中华皮肤科杂志, 2002, 35 (2) :134-136.

[6]苗明三.白癜康复丸对酪氨酸酶活性的影响[J].中华实用中西医杂志, 2004, 4 (17) :2212, 2213.

[7]袁敏芳.黄褐斑的中医药治疗现状[J].浙江中医杂志, 2102, 47 (2) :149-151.

[8]林淑平.鲜芦荟的临床新用[J].四川中医, 2002, 20 (2) :21.

酪氨酸酶 篇5

柑橘果皮褐变严重影响果实的.商品价值和耐贮性.以奉节脐橙(Citrus sinensis Osbeck)果实为材料,通过采后常温、涂蜡、低温、机械损伤等处理研究了果实果皮褐变率、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及PAL基因在果皮褐变过程中表达水平的变化.结果表明,涂蜡、损伤处理均极显著地提高果实的果皮褐变率,而低温贮藏可显著降低其发生率;贮藏期间各处理的PAL活性均呈上升趋势,损伤处理PAL活性显著高于对照.果实发生褐变或受到机械损伤后,PAL2、PAL6基因的表达均比对照明显增强.结果首次表明脐橙果实PAL活性变化以及PAL2基因的表达与果皮褐变具有非常密切的关系.

作 者：李正国 高雪 樊晶 杨迎伍 李道高 Angelos K.Kanellis LI Zheng-Guo GAO Xue FAN Jing YANG Ying-Wu LI Dao-Gao Angelos K.Kanellis  作者单位：李正国,高雪,樊晶,杨迎伍,LI Zheng-Guo,GAO Xue,FAN Jing,YANG Ying-Wu(重庆大学基因工程研究中心,重庆大学生物工程学院,重庆,400044)

李道高,LI Dao-Gao(西南大学园艺园林学院,重庆,400716)

植物苯丙氨酸解氨酶研究进展 篇6

1 PAL的存在和分布

1961年Koukal和Conn首次在绿色植物大麦幼苗中发现了PAL, 并进行了分离纯化[3]。随着研究的深入, 该酶已被固定化, 用于工业化生产苯丙氨酸。至今, PAL已在所有绿色植物中发现, 在真菌、细菌、藻类中也有存在。不同植物中PAL活性不同, 在同一株植物的不同组织部位, PAL活性也不同。一般越嫩的部位PAL活性越高, 如杨树的幼叶、顶芽、幼茎中PAL活性最高, 而老茎和成熟叶中PAL则较低[4]。

在细胞水平上, 植物PAL主要分布在表皮下的细胞和维管组织细胞中;在亚细胞水平上, PAL定位于细胞质和一些细胞器上, 如叶绿体、白色体、线粒体、过氧化酶体、乙醛酸体等。Nakushima等进行了PAL的亚细胞定位, 发现细胞间质部分PAL活性最高, 电子显微镜观察显示, PAL分散在细胞的基质中, 定位在高尔基体囊泡和次生壁加厚层中[5]。

2 PAL的基本特性

PAL是一种胞内诱导酶, 酶蛋白是一种含有4个相同亚单位的寡聚体, 氨基酸组成随不同来源而异, 如水稻PAL氨基酸组成中酸性氨基酸成分低于小麦、玉米和马铃薯, 而中性及碱性氨基酸成分则高于后三者[6]。在酶活性部位具有脱氢丙氨酰基的亲电中心。酶蛋白分子量一般在220~330KDa, 但不同来源稍有差异, 如马铃薯PAL分子量为330KDa, 玉米为306KDa, 小麦和水稻PAL分子量分别为280KDa和230KDa[1]。不同来源的PAL最适pH值在8.0~9.5。如甘薯PAL最适p H值为8.5~9.5, 水稻为9.2, 小麦为8.8, 与其氨基酸组成相一致[7]。

该酶的动力学曲线不符合米氏方程, 不规则, 具有别构酶的特征。大多数PAL的米氏常数 (Km) 在0.3×10-4~1.5×10-2mmo L/L, 水稻PAL的Km为5.94×10-4mmo L/L;而小麦PAL的Km有2个, 分别为0.625×10-4mmo L/L和3.1×10-4mmo L/L[1,6]。

3 PAL对植物生理代谢的意义

植物的代谢分为初级代谢和次级代谢。植物的次级代谢有多条途径, 苯丙烷类代谢途径是其中很重要的一条。苯丙烷类途径生成的黄酮、异黄酮、生物碱等次生代谢产物在植物的生长发育过程中起着重要的作用, 所以PAL对植物的生理意义非常重大 (见图1) 。

3.1 在木质化中的作用

在植物的木质化组织中含有较高的PAL活性。Nakashima等用分离的百日草叶肉细胞研究了苯丙烷类代谢酶类与木质素、管状分子形成和细胞分化的关系, 发现在百日草细胞分化过程中, 木质素的合成及管状分子形成与PAL活性的增加成正相关, 细胞溶质中的PAL活性在木质化之前迅速上升, 微粒体和细胞壁的PAL活性在木质化期间快速增加[5]。

3.2 在植物色素形成过程中的作用

花色素是植物花朵、果实和叶片颜色的重要组成部分, 花色素等的合成可由苯丙烷类产物反香豆酰Co A经过类黄酮途径生成, 该过程与PAL密切相关。如苋红素是中央种子目植物所特有的色素, 当用白光、蓝光或红光照射尾穗苋黄化苗后, 发现PAL活性均有不同程度地上升, 并有苋红素的积累[8]。有人通过调节PAL合成基因的表达, 有效地改变了矮牵牛、烟草和菊花的花色[9]。因此, 利用分子生物学技术有可能改变苹果等果树果实的色泽。

3.3 在植物根瘤形成中的作用

苯丙烷类代谢产物经类黄酮途径可产生黄酮类化合物, 这些化合物对根瘤菌有趋化作用, 有些类黄酮化合物还可作为根瘤菌结瘤基因的诱导物质[10]。这些黄酮类物质的含量与PAL活性存在着密切的关系, 在根瘤菌的形成过程中常伴随着PAL活性逐渐增强。

4 PAL在植物抗逆境中的作用

研究发现, 许多植物在遭受寒冷、机械损伤、微生物侵染等逆境时, 植物的防卫系统特别是苯丙烷类代谢被激活, PAL活性迅速上升。如柑橘果实受机械损伤后, 果皮中PAL的活性明显高于对照, 且pal2、pal6基因的表达比对照明显增强[11]。因此, PAL活性可作为植物抗逆境能力的一个生理指标。

4.1 PAL在植物抗病中的作用

PAL活性与植物抗病性密切相关, 其活性可作为衡量植物抗病性的生化指标之一。植物感染病原菌后PAL活性明显升高, 并表现出规律性的变化, 即在侵染的最初几小时, 酶活性上升滞缓, 随后急剧上升, 酶活高峰一般出现在侵染后的12~48h, 之后迅速下降。受病原物侵染后, 不同抗性的品种 (系) 间PAL活性有明显差异, 抗病品系诱导产生的PAL活性远高于感病品系, 且PAL活性越大, 品种 (系) 抗病性越强。如张淑珍等在对疫霉根腐病菌毒素胁迫下不同大豆抗感品种PAL活性的研究中发现, 抗病大豆品种的根、茎和叶中PAL活性在病程的大部分阶段都高于对照[12]。PAL参与植物抗病的机制和作用主要有如下几点。

4.1.1 参与植保素的合成。

植保素是参与植物防御反应的重要生理活性物质之一, 主要包括酚类植保素 (绿原酸、香豆素和儿茶酚等) 、异黄酮类植保素 (豌豆素、菜豆素、大豆素、苜蓿黄素等) 和萜烯类植保素, 它们能直接防止病原物的生长发育和侵染。其中, 前两类都是苯丙烷类代谢的直接或间接产物, 其生成量与PAL活性成正相关[1]。当用PAL抑制剂L-2-氨氧基-3-苯丙酸和α-氨氧基-乙酸处理植物幼苗, 植物体内植保素合成和累积受到抑制[13]。

4.1.2 参与木质素的合成。

木质素可加强细胞壁, 增加组织木质化程度, 形成病原菌入侵的机械屏障, 木质素的合成也来自苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸。PAL是这条途径的第一个也是最重要的酶。研究表明, 在植物-病原物互作中, PAL参与木质素合成和累积。如棉花受枯萎病菌侵染后, 随着PAL活性提高, 出现木质素的积累。PAL受抑制, 木质素合成亦受到抑制[14];不同抗病性的杉木接种炭疽菌后, PAL比活力均上升, 且抗病性强的杉木PAL比活力比抗病性弱的杉木高[15]。

4.1.3 参与酚类物质的合成。

酚类化合物也是苯丙烷类代谢产物。PAL活性增高与酚类物质的合成亦有一致性。如感染灰霉病的黄瓜组织中, 伴随PAL活性升高, 总酚积累[16];在用多糖组分处理后, 提高红豆杉中酚类物质和可溶性蛋白含量的同时, 过氧化物酶和PAL的活性也被激活[17]。

4.2 PAL与植物抗虫性的关系

关于PAL参与植物抗虫方面的研究报道较少, 但关于苯丙烷类代谢途径与植物抗虫性的报道已有很多, 主要集中在这一代谢途径的产物 (木质素、植保素) 与植物抗虫性的关系方面。木质素的积累, 可使细胞壁加厚, 成为食草类动物取食的机械障碍, 而植保素对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用, 这些化合物的生成与PAL含量存在着间接的关系。许多试验证明, PAL活性高低与植物的抗虫性有很大关系, 如吴龙火等在研究5种山羊草对禾谷缢管蚜取食的诱导性抗性机理时发现, PAL酶活提高率与蚜虫取食诱导有关[18]。而且食草类动物的取食也可诱导PAL活性升高[19]。

5 植物PAL基因的表达与调控

5.1 植物PAL基因的克隆

完整的Rhodotorula toroloides PAL基因序列已有报道 (Genebank/M18261) 。1987年, Anson等从R.toruloides中克隆出了PAL基因, 测得了其核苷酸全长序列, 发现R.toruloides PAL基因有6个内含子, 结构基因上游有一段富含C+T的序列, 这与脉孢菌 (Neurospora) 和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 中的某些基因具有相似性, 而在S.cerevisiae中这段富含C+T序列在一些高表达基因的转录中具有重要的作用[20]。这提示PAL基因中这段富含C+T序列对表达的意义, 有利于PAL基因工程菌的构建。同时, Anson归纳出了编码R.toruloides PAL基因的密码子的使用频率[20]。这对从c DNA (DNA) 中扩增PAL基因时设计PCR引物具有重要的参考价值。迄今为止, 对植物PAL基因的研究最多, 已有多种植物的PAL基因序列已经测定并公布在Gene Bank中。

5.2 植物PAL基因的表达调控

对苯丙烷类代谢途径的调控包括酶的内部调节和外界因子调控两个方面。它们的表达受发育和环境信号的调节, 具有严格的组织时间特异性[1]。

5.2.1 植物体内对PAL酶的内部调节。

PAL酶活性随植物发育过程的推进而不断变化。一般PAL酶活性最初较低或没有, 后上升到一个高峰后下降, 达到高峰的时间不同植物有所不同, 如水稻9d、小麦7d、胡萝卜60h。植物体内有一种内源性抑制物质 (PAL-inhibitor, PAL-I) 参与PAL活性的调节。从去胚乳的水稻黄化苗中提取并部分纯化了PAL-I, 它是非透析的蛋白质, 大部分活性可被蛋白酶破坏, 具有热稳定性。动力学实验表明, PAL-I对PAL的抑制是竞争性的。水稻PAL-I不仅能抑制水稻PAL, 还能抑制从小麦、玉米、马铃薯中提取的PAL, 但不能抑制水稻中提取的其他酶类, 如多酚氧化酶[21]。研究还发现, 单子叶植物幼苗胚乳中普遍存在PAL内源抑制物质的调节因子 (PAL-inhibitorregulator, PAL-IR) , 去胚乳后, 内源抑制物质增加, 幼苗中PAL活性下降。目前认为胚乳对幼苗PAL活性的调节作用在禾本科植物中具有普遍意义, 而双子叶植物子叶对PAL的调节作用不具有普遍性, 要比单子叶植物的胚乳复杂的多[1,21]。

PAL酶除自然降解、钝化因子和调节因子外, 还受其末端产物的调节。酶抑制剂有许多种类, 如肉桂酸、ρ-香豆酸、α-氨氧基乙酸和一些氨基酸如组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等。不同来源的PAL对同一种类抑制剂的敏感性不同。如来源于大麦和红酵母的PAL对硫氢基类抑制剂敏感, 而来源于马铃薯、玉米、黑粉菌和链霉菌的则不敏感, 这种对酶活性的抑制同酶活性部位脱氢丙氨酰基的丧失和减少相伴随, 其机理可能是对脱氢丙氨酰残基的修饰[7]。

5.2.2 外界因子对PAL酶的调控。

PAL是一种诱导酶, 可受多种因素的诱导。低温、机械损伤、光 (白光、蓝光、红光、紫外光) 、病原菌感染、毒素处理、昆虫取食、矿质营养、悬浮细胞的稀释和外源植物激素等因素都可以在转录水平上诱导PAL基因的表达[22,23]。如用真菌诱导子接种欧芹叶细胞悬浮培养液, 接种后6~8h, PAL m RNA在大范围内高度表达, 且明显高于对照;约12h后, PAL m RNA收缩到坏死斑周围, 并在此区域内, PAL酶蛋白有所增加;接种25h, PAL m RNA表达基本恢复到原来水平, 而PAL酶蛋白在坏死斑周围被强烈地诱导合成[24]。

生长素 (IAA) 、激动素 (BAP) 和乙烯都可诱导植物PAL基因的表达, 剌激效应乙烯>IAA>BAP。还有研究表明, 赤霉素 (GA3) 也能诱导PAL活性的升高[1]。植物在生长发育过程中以及受病原菌及其诱导物和伤害等刺激时, PAL常伴随内源乙烯合成的增加而积累。如在西瓜果实发育中, PAL基因随着乙烯生物合成基因的表达而表达[25];马铃薯在用外源乙烯处理后, PAL m RNA的水平增加[26]。说明乙烯可能是植物PAL诱导表达的内源信号分子。各种诱导因子间还存在着互作关系, 如在切伤诱导甘薯块根切片PAL活性增高时, IAA、BAP和乙烯处理能使PAL的活性再增加, BAP的效应还可被照光而增强[7];在尾穗苋黄化苗PAL与苋红素积累的相关性研究中, 也观察到光对BAP的刺激作用有增效现象[8]。

5.3 调控机理

PAL是由一个多基因家族控制, 不同组织有多种PAL同工酶, 分别定位于不同的组织细胞, 控制不同的代谢途径[1,7]。研究表明, 植物PAL基因结构的普遍特点是由小的多基因家族组成, 在1组染色体中, 含有1至多个PAL基因, 并随不同植物而异, 基因内一般含有1个内含子。如菜豆基因组包含3个PAL基因, 即PAL1、PAL2、PAL3。它们都可在根部大量表达, 而花瓣中PAL2大量表达, PAL1表达量很少, PAL3不表达;这3个PAL基因都能被机械损伤诱导, 而PAL1和PAL2能被真菌细胞壁诱导因子所诱导。此外, 在机械损伤的细胞和木质部细胞都能检测到PAL2的活性[27]。这与其生理功能一致, 因为在木质部的正常发育过程中, 木质部的形成也是从PAL所催化的反应开始的。植物细胞受伤时用于填补伤口的物质的合成也需要PAL。

PAL多基因家族在表达上的差异是由于它们的启动子所包含的顺式作用元件不同而引起的。由顺式作用元件和相应的转录因子共同作用, 控制PAL基因在不同时间和组织中的表达。植物PAL基因启动子在转基因植物中的表达调控也说明了这一点。有人将菜豆 (PAL2、PAL3) 、拟南芥 (PAL1) 等植物PAL基因的启动子与β-葡萄糖醛酸糖苷酶 (β-Glucuronidase, GUS) 报告基因融合转移到马铃薯、烟草、拟南芥中, 通过检测报告基因活性, 来研究PAL启动子在转基因植物中的表达调控模式及表达的细胞和组织特异性。他们发现用亲和性的Pseudomonas solanacearum野生型菌株K60, 或不亲和性的无毒性突变株B1, 接种含有拟南芥PAL1-GUS基因融合物的转基因烟草植株, 迅速诱导了GUS基因的大量表达[28];将菜豆PAL2-GUS和PAL3-GUS转入拟南芥、马铃薯和烟草中, 其表达受环境刺激因子的诱导调控, 也受转基因植物发育阶段调控, 表现出不同的时空表达模式[28]。GUS表达的组织化学分析表明, 菜豆PAL基因启动子, 在转基因马铃薯和烟草的特定细胞———机械损伤的细胞中表达, 也可在发育中的木质部 (射线细胞) 和花器中表达[29]。这些结果表明, PAL基因启动子在转基因植物中的表达, 也受病原菌、转基因植物的发育阶段及其他环境因子的诱导调控。

6 结语

PAL是植物次生代谢中一种非常重要的酶类, 在植物的生长发育、抗病反应等过程中起着非常重要的作用。随着分子生物学的不断发展, 大量PAL基因的克隆、测序、结构特点分析及时空表达模式的研究, 将为在转基因植物中大量、持久表达PAL酶, 提高次生代谢产物的含量, 增强植物对病害的广谱持久抗性及其他农艺性状具有非常重要的作用。同时深入研究PAL基因启动子及相关转录因子, 不仅可以进一步阐明PAL基因的调控机理, 还能为增强作物抗病性、作物的遗传改良等研究开辟新的思路, 具有广阔的应用前景。

摘要：苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine ammonia-lyase, PAL, E.C4.3.1.5) 是催化苯丙烷代谢途径第一步反应的酶, 也是这个途径的关键酶和限速酶, 对植物具有非常重要的生理意义。综述了苯丙氨酸解氨酶的存在与分布、基本特性、生理代谢意义、抗病以及基因表达与调控等, 为PAL在植物抗病的应用上提供基础数据。

酪氨酸酶 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

紫草素购自英国FLUOROCHEM (分析纯) , 配制成1 mmol/L的贮存液, -80℃冰箱保存, 使用前稀释至工作浓度。8-MOP (甲氧沙林) 溶于二甲基亚砜, 配成10 ml。

8-MOP、中性酶、胰酶、二甲基亚砜 (DMSO) 、四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 均购自Sigma公司, 小牛血清购自杭州四季青公司;高通量多功能微板测试系统 (德国BMG) , 图像信号采集与分析系统 (德国LEICA公司) , 倒置显微镜, 无菌工作台等。

1.2 方法

1.2.1

人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系的建立参考文献[2]。

1.2.2 紫草素对人共培养细胞增殖的影响:

MTT法检测。

1.2.3 酪氨酸酶活性测定实验[3]

参考文献, 根据MTT实验结果选取3个浓度 (0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L) 的紫草素, 测定其对酪氨酸酶活性的影响。

1.2.4 黑素含量的测定[4]

参考文献, 测定0.25μmol/L、0.5μmol/L及1μmol/L的紫草素对黑素生成的影响。

1.3 统计学方法

全部数据采用SPSS统计软件进行两因素方差分析检验, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 行t检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对细胞增殖的影响

MTT实验结果显示紫草素浓度在 (0.25~1μmol/L) 对人表皮共培养细胞无生长抑制作用。

2.2紫草素对人表皮共培养体系中酪氨酸酶活性及黑素生成的影响

结果表明 (见表1) , 紫草素对于人表皮共培养体系中酪氨酸酶活性及黑素生成呈剂量依赖性激活作用, 紫草素组与对照组比较, 0.5μmol/L及1μmol/L紫草素对人表皮共培养体系中氨酸酶活性激活及黑素生成均差异具有统计学意义 (P<0.01) , 8-MOP为阳性对照, 1μmol/L紫草素作用优于8-MOP (P<0.01) 。

注:对照组相应值设为100%, 与对照组相比, aP<0.05, bP<0.01

3 讨论

中医中药的研究对于白癜风未来的治疗越来越重要, 作者系统研究了许多中药对于黑素生成的影响。紫草素不仅在黑素瘤细胞中可以剂量依赖地促进黑素生成, 本研究发现紫草素在模拟人体的共培养体系中同样具有促进黑素生成和酪氨酸酶活性的作用, 为进一步研究开发紫草素打下基础。

摘要：目的 探讨紫草素在人表皮共培养体系中对酪氨酸酶活性及黑素生成的影响。方法 在共培养体系中测定紫草素对酪氨酸酶活性和黑素生成的影响。结果 0.25μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L紫草素对于人表皮共培养细胞增殖无影响, 0.25μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L紫草素对于表皮共培养细胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有较强的剂量相关性激活作用, 0.5μmol/L及1μmol/L紫草素与对照组相比差异具有统计学意义 (P<0.01) 。结论 紫草素对于人表皮共培养体系中酪氨酸酶活性和黑素生成有一定促进作用。

关键词：紫草素,表皮共培养体系,酪氨酸酶,黑素生成

参考文献

[1]解士海, 黄荣云, 赵卫华, 等.紫草素对人黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响.临床合理用药杂志, 2010, 3 (9) :10-12.

[2]解士海, 陈志强, 马鹏程, 等.人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察.临床皮肤科杂志, 2006, 35 (5) :286-288.

酪氨酸酶 篇8

1 材料与方法

1.1 实验材料

谷氨酸脱氢酶由北京迈迪卡科技有限公司生产;NADH和α-酮戊二酸购于Sigma公司, Tris和NH4Cl是国产生化分析纯试剂;检测仪器是Olympus AU400全自动生化分析仪器和岛津2450紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 谷氨酸脱氢酶活力的测定

该法以α-酮戊二酸、铵离子及还原型辅酶I (NADH) 为底物, 在谷氨酸脱氢酶催化作用下, 转变为谷氨酸和氧化型辅酶I (NAD) , 利用NADH在340 nm处有吸收峰, 监测其反应速率 (-△A/min) , 计算谷氨酸脱氢酶的活力单位。反应混合液的p H为8.3, 含有0.1 mol/L的Tris-Cl、0.2 mol/L的氯化铵、0.01 mol/L的α-酮戊二酸和一定量的酶液。所有酶活测定, 如果未作特殊说明, 反应体系温度均为37℃。

1.2.2 谷氨酸脱氢酶米氏常数的测定

采用Linewaeaver―Burk作图法 (双倒数作图法) 对谷氨酸脱氢酶的米氏常数进行测定。所有酶活测定, 如果未作特殊说明, 反应体系温度均为37℃。

2 结果

2.1 谷氨酸脱氢酶p H稳定性的测定

将一定量的谷氨酸脱氢酶稀释至p H为4~12的缓冲液中, 25℃条件下放置20 h。其中, p H 4~6为醋酸缓冲液, p H 6~8范围为磷酸盐缓冲体系;p H 8~10为Tris-Cl缓冲体系, p H10~12为甘氨酸缓冲体系。然后37℃条件下测定残存谷氨酸脱氢酶的活力。实验表明该种谷氨酸脱氢酶具有p H作用范围广的优点, 在p H为5~10范围内稳定性较好, 酶残存活力在90%以上。见图1。

2.2 谷氨酸脱氢酶最适反应温度的测定

温度是影响酶作用的重要因素。酶反应的速度随温度的变化而变化。通常温度每增加10℃, 酶反应速度增加1~2倍。在一定条件下, 每种酶都有一个最适宜的作用温度, 在最适温度下酶的活力最高, 作用效果最好。为了测定谷氨酸脱氢酶的活力, 取一定量的谷氨酸脱氢酶稀释至p H为8.3的0.1mol/L的Tris-Cl缓冲液中, 然后在岛津2450紫外分光光度计上将反应温度分别调整至30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃条件, 试剂保温1 min, 然后加入稀释好的谷氨酸脱氢酶测定活力。实验表明该种谷氨酸脱氢酶的最适反应温度是45℃。见图2。

2.3 谷氨酸脱氢酶最适p H的测定

酶在一定的较狭的p H值范围内表现出最高活力, 这个p H值就是酶作用的最适p H值。高于或低于这一p H值, 酶的稳定性下降, 活性受到影响。为了测定谷氨酸脱氢酶的最适p H, 配制如下种类缓冲液:p H范围为6~7.5的0.1 M磷酸钾缓冲液;p H范围为6~7.5的0.1 M Tris-HCL缓冲液;p H范围为8.5~10.5的0.1 M甘氨酸缓冲液。以上3种缓冲液中含有0.1 mol/L的氯化铵、0.01 mol/L的α-酮戊二酸和7.5 mmol/L的NADH。取一定量的谷氨酸脱氢酶稀释至p H为8.3的0.1 mol/L的Tris-Cl缓冲液中。然后37℃条件下测定谷氨酸脱氢酶在不同p H条件下的活力。实验结果表明谷氨酸脱氢酶最适p H值是7.5, 实验结果见图3。

2.4 谷氨酸脱氢酶Km值的测定

米氏常数 (Km) 是酶的特征性常数, Km只与酶的种类、反应体系的p H和反应温度有关系, 而与酶的浓度和底物的浓度无关。酶的米氏常数越大, 说明需要的底物浓度越高, 所以酶的Km数值是反应酶性质优略的重要指标。笔者利用Lineweaver-Burk作图法对谷氨酸脱氢酶催化正反应的3个底物 (NN4、α-酮戊二酸、NADH) 的米氏常数 (3) , 根据直线在横轴上的截距 (1/Km) , 求得米氏常数Km。实验表明, 麦迪卡公司产谷氨酸脱氢酶的米氏常数与进口知名品牌相比相差不大, 见表1。

3 讨论

诊断试剂原料用酶属于酶制剂行业的一个小分支, 与工业用酶不同, 生化诊断试剂用原料酶理化性质要求较高。一种好的诊断试剂原料酶应当具有条件是热稳定性好、p H稳定范围宽, Km数值较低。目前, 国内对诊断原料用酶研究较少, 对新的诊断用原料用酶的酶学性质研究更是相对滞后。所以对国产诊断用原料酶的酶学性质进行研究对正确使用酶法诊断试剂有指导意义。

该研究对麦迪卡公司生产的谷氨酸脱氢酶的酸碱耐受范围、热稳定性、最适温度、最适p H和Km进行了测定。该种谷氨酸p H耐受范围较宽, 在p H为5~10范围内保持较好的稳定性;热稳定性较好, 50℃加热20 min, 酶活保留87.5%;酶动力学研究表明该种谷氨酸脱氢酶3个底物的米氏常数分别为:NN4+是10.4×10-3mol/L;α-酮戊二酸是7.42×10-3mol/L;辅酶I (NADH) 是6.65×10-4mol/L。实验结果表明, 麦迪卡公司生产的谷氨酸脱氢酶酶学性质较好, 适合临床诊断试剂盒使用。

参考文献

[1]罗侃, 崔有民.诊断用酶的研究进展[J].西北国防医学杂志, 2000, 21 (1) :57-59.

[2]王燕, 宋香, 杨平平, 等.谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究[J].生物工程学报, 2003 (19) :725-729.

[3]张克旭, 刘永生.天津短杆菌T6-13谷氨酸脱氢酶的研究[J].微生物学报, 1991, 31 (4) :281-286.

[4]郭绍丽, 张连祥, 蔡忠, 等.谷氨酸脱氢酶液态试剂盒的制备与临床应用[J].中国中西医结合消化杂志, 2000, 9 (1) :46-47.

[5]郭建, 姜国湖, 王燕鸣.血清酶法钾、钠测定及其评价[J].中华医学检验杂志, 1998 (5) :32.

[6]杨艳玲.血氨检测有助于脑病、肝病的病因诊断[J].中国医刊, 2006, (3) :19-22.

酪氨酸酶 篇9

本文研究了双酶耦合法制备L-Orn HCl的工艺条件, 寻找精氨酸酶 (Arginase) 和尿酶 (Urease) 的催化合成L-Orn Hcl最佳工艺参数。对所制备的目标产物通过红外光谱 (IR) 、比旋光度测定进行结构表征, 并借助电位滴定仪进行含量分析。

1.1原料、试剂及仪器

L-Arg, Food grade, 宁波市镇海海德生化科技有限公司;纯化水, 通过二级反渗透系统制得;Mn SO4, AR, 上海化学试剂二厂;KBr, AR, 汕头市西陇化工厂;C2H5OH, AR, 溧阳光源工贸;CH3COCH3, AR, 溧阳光源工贸;市售黄豆、牛肝;

郑州杜甫仪器厂SHB-3循环水式多用真空泵、上海索光WZZ-2D自动旋光仪、天津拓普仪器TJ270-30 (A) 双光速红外分光光度计、常州国华电器HH-2数显恒温水浴锅、上海一恒HG-9123A电热鼓风干燥箱、梅特勒T50电位滴定仪。

1.2步骤

将L-Arg作为底物溶于纯化水中配成转化液, 并控制p H (8.5~10.0) 在此范围, 加入Arginase、Mn2+, 并放置恒温TA (33~42℃) 条件下反应TA (10~40h) 后;加入Urease, 并控制温度TB (36~40℃) 在此恒温反应TB (40~70min) , 再经酸化、脱色过滤、浓缩至有少量晶体析出, 加入乙醇进行回流、冷却结晶, 过滤收集析出的结晶, 或进一步重结晶提高产品纯度, 再经干燥后得成品。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 反应p H对产率的影响 (表1)

注:反应温度TA为38.5℃, 反应时间TA为15h, 反应温度TB为38.5℃, 反应时间TB为60min。

注:反应p H为9.3, 反应时间TA为15h, 反应温度TB为38.5℃, 反应时间TB为60min。

由表1可知, 9.3为该反应体系中酶的最适p H, p H过高或过低对酶的活性均受到一定的抑制作用, 从而影响酶的活性发挥。

2.1.2 反应温度TA对产率的影响 (表2)

由表2可知, 反应温度TA过低, 造成反应无法快速进行彻底, 反应温度较高的条件下, 反应比较完全, 但温度过高会导致副产物的增多, 从而影响产率, 温度为38.5℃时, 可获得较高收率。

2.1.3 反应时间TA对产率的影响 (表3)

由表3可知, 反应时间TA是决定反应是否完全的关键因素, 时间不足, 反应不能完全进行, 反应时间过长会造成能源浪费, 并且影响生产效率, 反应时间15h为最佳。

2.2 红外光谱分析 (图1)

图1中a谱线为医药级标准品L-Orn HCl的红外光谱, b谱线为使用纯化水重结晶得到的L-Orn HCl红外光谱, c谱线为未经重结晶得到的L-Orn HCl红外光谱。可见在1680-1550cm-1间较宽的中等强度吸收峰及在1250-1000cm-1间的弱峰均与标准品一致。

3 结论

采用双酶偶合法制备L-Orn HCl, 得到最佳的酶催化合成工艺条件为:将L-Arg作为底物溶于纯化水中配成10%的转化液, 控制p H9.3条件下, 加入Arginase、Mn2+, 并在38.5℃恒温条件下反应15h后;加入Urease, 恒温反应60min, 再经酸化、脱色过滤、浓缩至有少量晶体析出, 加入乙醇进行回流、冷却结晶, 过滤收集析出的结晶, 或进一步重结晶提高产品纯度, 再经干燥后得成品。在此条件下, L-Orn HCl的产率为83.5%, 熔点为245.2℃~245.6℃, 旋光度为23.9°~24.3° (C=4, 6N HCl) , 含量为99.7%。

注:反应p H为9.3, 反应温度TA为38.5℃, 反应温度TB为38.5℃, 反应时间TB为60min。

摘要：本研究以L-精氨酸为原料制备L-鸟氨酸盐酸盐, 通过设计正交实验, 讨论反应pH、温度、时间等因素对产率的影响, 确定各步反应中较佳的实验条件。得到双酶耦合法制备L-鸟氨酸盐酸盐的较佳工艺条件为:反应pH值9.3, 反应的温度为38.5℃, 反应时间15小时, 产率为83.5%。

关键词：鸟氨酸盐酸盐,双酶耦合法,工艺改进,精氨酸

参考文献

酪氨酸酶 篇10

关键词：亚甲基四氢叶酸还原酶,甲硫氨酸合成酶还原酶,基因多态性

同型半胱氨酸(hom ocysteine,Hcy)水平升高与神经管缺陷[1]、唇腭裂[2]、先天性心脏病等[3]出生缺陷,以及复发性流产[4]、妊娠期高血压综合征等[5]孕期疾病密切相关。Hcy水平的升高主要是遗传因素和营养因素共同作用的结果。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenete trahydrofolate reductase,MTH FR)和甲硫氨酸合成还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是叶酸代谢通路中的关键酶,体内的Hcy在甲硫氨酸合成酶的催化下,以维生素B12为辅酶,接受5-甲基四氢叶酸提供的甲基生成甲硫氨酸。5-甲基四氢叶酸由MTHFR催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原而来,而维生素B12需要MTRR催化其甲基化维持辅酶的活性,使甲硫氨酸合成酶的催化反应正常进行。MTHFR和MTRR具有多种基因多态性,最常见的有MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G,这些基因多态性影响着其编码的酶的活性[6]、血清和红细胞叶酸浓度[7]以及血浆Hcy浓度[8]。基因多态性与叶酸、Hcy代谢以及以上多种疾病的关系是近年研究的热点,这些相关基因多态性存在地区[9]和民族[10]的分布差异,但尚未见云南地区的大样本分子流行病学研究报道。本文旨在分析云南省汉族女性的MTHFR和MTRR遗传特征,为出生缺陷的病因学研究以及基于遗传特征的临床干预方案研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性的Taqman-MGB探针信息见表1。探针和试剂均购自美国ABI公司。

1.2 仪器与设备

使用ABI 7900型荧光定量PCR仪进行基因分型。

1.3 实验方法

依据知情同意原则,选择2009年11月~2012年6月在云南省妇幼保健院进行孕前或孕期检查的汉族女性,纳入标准为同意进行口腔黏膜细胞采样并进行遗传检验的人群,排除DNA抽提不符合要求者,共获取有效样本297例,平均(27.5±4.0)岁。

采集受检者的口腔黏膜上皮细胞,利用柱式抽提试剂盒抽提样本DNA。采用Taqman-MGB技术检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的基因多态性。对3个位点分别进行荧光定量PCR反应,每个反应体系总体积10μL,包含浓度为20 ng/μL的DNA模板1μL,2×Taqman Universal Master Mix 5μL,20×Taqman-MGB探针0.5μL,去离子水3.5μL。反应条件为95℃10 min,随后进行20个循环的扩增(92℃15 s,60℃1 min),再进行30个循环的扩增(89℃15 s,60℃90 s)。反应结束后在ABI 7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光,利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。针对每种基因型各取5个样本进行DNA测序,验证结果的准确性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,组间比较采用R×Cχ2检验,以95%可信区间(CI)表示相对风险度,检验水准为α=0.05。

2 结果

MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因分型:样本荧光定量PCR反应结果见附图,利用分析软件确定各样本的不同基因型。针对每种基因型各取5个样本进行DNA测序,基因分型结果与荧光定量PCR方法结论一致。

基因型和等位基因频率:对检测到的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点分别进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验,均符合HardyWeinberg平衡,证明样本具有本区域群体代表性。云南省297例汉族女性的基因型及等位基因频率统计结果见表2、3。

云南省汉族女性MTHFR、MTRR基因多态性分布与已报道的其他地区的数据进行比较,贺宪民等[9]和劳海红等[10]之前报道了山东、河南、四川以及海南省汉族女性的MTHFR、MTRR基因多态性分布。研究以云南省得到的数据与这些地区的数据进行两两比较,结果见表2、3。

云南省汉族女性MTHFR 677TT纯合突变基因型频率高于海南省,低于山东省和河南省(均P<0.01),与四川省的差异没有统计学意义(P>0.05)。MTHFR 1298CC纯合突变基因型频率低于海南省和四川省(均P<0.05),与山东、河南的差异没有统计学意义(均P>0.05)。MTRR 66GG纯合突变基因型频率低于海南省(P<0.05),与山东、河南、四川的差异没有统计学意义(均P>0.05)。

等位基因频率比较结果类似(见表3)。云南省汉族女性的MTHFR 677T突变等位基因频率高于海南省,低于山东和河南省(均P<0.01),与四川省的差异无统计学意义(P>0.05)。MTHFR 1298C突变等位基因频率低于四川和海南省(均P<0.05),与山东和河南省的差异均无统计学意义(均P>0.05)。MTRR 66G突变等位基因频率低于海南省(P<0.01),与山东、河南和四川省的差异均无统计学意义(均P>0.05)。

注:χ2和P值以本研究结果为参照进行两两比较

3 讨论

出生缺陷是我国严重的公共卫生问题,更是影响经济发展和人民生活的社会问题。根据《国家人口发展战略研究报告》,全国每年约有20~30万肉眼可见先天畸形儿出生,加上出生后逐渐显现出来的缺陷,出生缺陷总数高达80~120万,约占每年出生人口总数的4%~6%。根据云南省近18年来的出生缺陷监测分析,围产儿出生缺陷发生率平均为103.16/万,多指(趾)、唇腭裂、神经管畸形、马蹄内翻足、肢体短缩畸形是高发的前5位畸形[11]。

目前出生缺陷的病因学研究表明,遗传因素不容忽视。与MTHFR 677CC基因型相比,TT基因型将造成编码氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸,导致MTHFR酶活性下降到正常的22%;另外,MTHFR677CT和1298AC存在协同作用,使MTHFR酶活性下降到正常的36%[12]。李智文等[13]的Meta分析表明,以CC基因型为参照,携带MTHFR 677TT、CT基因型的个体,子代发生神经管畸形的OR值分别为3.13和1.66。张亲凤等[14]根据MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的不同基因型组合将个体的叶酸利用能力分为不同风险等级,高度风险人群在正常孕产组和不良孕产组的构成分别为19.45%和31.07%(P<0.01),高度风险组与未发现风险组间的相对危险度RR值为2.265,表明因基因多态性导致的叶酸代谢障碍与不良孕产有着重要关系。

已有研究表明,不同地域人群的MTHFR和MTRR基因多态性分布存在差异,但尚未见针对云南省出生缺陷的大样本分子流行病学调查报道。本文分析了MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性在云南省汉族女性中的分布情况,并与已报道的其他地区的数据进行比较,结果显示不同的遗传分布特征。MTHFR 677T突变等位基因在山东、河南、云南、四川和海南地区的分布频率分别为63.6%、58.3%、36.8%、34.5%和26.2%,由北到南基本呈现递减趋势,有地域差异性。这在遗传因素上解释了我国神经管缺陷发病率北高南低的事实。当然南北方的饮食差异导致叶酸摄入水平的不同也是重要原因,而北方饮食习惯所致的膳食叶酸摄入不足(营养因素)在MTHFR、MTRR基因多态性(遗传因素)的作用下,更增加了神经管畸形、先天性心脏病、唇腭裂等出生缺陷的发病风险。遗传因素如何与营养因素、环境因素综合作用导致出生缺陷的发生,仍需深入研究。