酪氨酸酶抑制剂论文

酪氨酸酶抑制剂论文（精选6篇）

酪氨酸酶抑制剂论文 篇1

奥扎格雷 (ozagrel) 是一种新型抗血小板聚集药, 药理研究表明, 奥扎格雷能强力抑制TXA2合成酶的活性, 从而抑制血小板聚集, 同时提高前列环素PGI2的浓度, 扩张血管, 增加血流量, 有效抑制脑血栓的形成, 使已形成的血栓靠血液平衡关系的打破而被自行溶解, 达到治疗脑梗塞之功效。该文研究了奥扎格雷对蘑菇酪氨酸酶的抑制动力学。该研究结果为进一步的设计高效酪氨酸酶抑制剂奠定理论基础, 并为奥扎格雷及其衍生物作为食品防腐剂、果蔬保鲜剂以及美白化妆品的添加剂阐明了它们作用的酶学机理, 为新型高效酪氨酸酶抑制剂的开发提供了新的分子模板。

1 实验方法

1.1 酪氨酸酶活力测定

酪氨酸酶单酚酶活力测定:1.5mmol/LL-酪氨酸为底物, 在p H6.8的磷酸盐缓冲液中, 30℃恒温10分钟, 加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酶溶液, 在475nm波长下测定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力测定:1.0mmol/LL-DOPA为底物, 在p H 6.8的磷酸盐缓冲液中, 30℃恒温10分钟, 加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酪氨酸酶溶液, 在475nm波长下测定吸光度OD值。

2 结果与讨论

2.1 奥扎格雷对酪氨酸酶单酚酶的影响

如图1所示, 奥扎格雷具有抑制蘑菇酪氨酸酶单酚酶酶活。测定不同浓度的奥扎格雷浓度对酪氨酸酶单酚酶作用的进程曲线, 曲线1-5分别表示奥扎格雷在测酶活体系中的浓度为0、10、20、30和40mol/L。图1结果表明, 奥扎格雷能延长酶反应的延滞时间 (曲线的直线部分交于X轴的值) , 并随着奥扎格雷浓度的增大而延长。在相同反应时间下, 反应体系的吸光度值随着奥扎格雷浓度的增大而下降, 说明奥扎格雷对酪氨酸酶的单酚酶活性有抑制作用。延滞期过后, 酶催化体系逐渐达到了稳态 (曲线的直线部分) 。相对抑制率达到50%的奥扎格雷浓度 (IC50) 为1.35mmol/L。

2.2 奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的影响

以L-DOPA为底物测定酪氨酸酶二酚酶酶活, 反应进程曲线如图2 (曲线0-5) 。在测活条件体系中, 加入酶液后, 反应迅速进入稳态, 产物与时间呈线性递增, 直线部分为酶催化底物反应级数为一级反应, 随着时间的延长, 酶受到奥扎格雷的抑制, 导致酶活下降, 从而反应级数逐渐的由一级反应转变为零级反应。在不同的奥扎格雷浓度条件下, 随着奥扎格雷浓度的增加, 一级反应区域 (曲线直线部分) 的斜率逐渐减小, 即奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶酶活的抑制程度增大。

2.3 催化机理

在氧气存在条件下, 酪氨酸酶的基本功能有两个:作为单酚酶羟基化单酚生成邻二酚 (图3) ;作为双酚酶氧化邻二酚生成醌 (图4) 。该酶具有包含两个铜离子位点的活性中心, 并与不同数目的氧原子配位结合具有三种不同状态, 分别为氧化态Eoxy, 还原态Emet和脱氧态Edeoxy。氧化态Eoxy兼具单酚酶和二酚酶的活性;还原态Emet具有二酚酶的活性, 不具有单酚酶活性, 但是和单酚底物具有亲和作用, 所以还原态Emet是延滞效应产生的原因;脱氧态Edeoxy的作用是只能结合氧。所以, 酪氨酸酶催化单酚类底物都是从Eoxy开始, Emet和Edeoxy均不与单酚类底物反应, Eoxy和Emet两者都可以催化多酚类底物。

奥扎格雷能够延长单酚酶的延滞时间, 降低单酚酶和二酚酶的稳态速率, 说明奥扎格雷能够可逆的抑制酪氨酸酶并阻止多巴色素的生成, 进而能够遏制黑色素的生成。并且, 对于二酚酶体系而言, 奥扎格雷不仅能和还原态酶Emet和氧化态酶Eoxy结合分别形成对应的酶-抑制剂复合物Emet I和Eoxy I, 而且还能和酶-底物复合物Emet I和Eoxy I分别形成对应的酶-底物-抑制剂复合物Emet SI和Eoxy SI。同时, 根据奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的混合型抑制机理, 这一过程可表示为: (如图5所示)

其中E (Emet, Edeoxy和Eoxy) 、D、I和P分别表示酶的三种形态、底物L-DOPA、奥扎格雷和产物, EI、ES和ESI分别表示酶-抑制剂复合物、酶-底物复合物和酶-底物-抑制剂复合物。从酪氨酸酶角度分析, 该酶存在两个结合位点, 一个可与底物结合, 另一个与抑制剂结合。当底物与酶结合过程中, 酶的天然构象会发生一些形变, 在这个变化过程中, 酶的疏水性的“口袋”会变大。然后, 酶和底物结合后, 会形成一个新的疏水性的“口袋”, 抑制剂奥扎格雷会嵌入这个“口袋”形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。可以推断出, 酶和底物-抑制剂复合物ES容易形成并且结合力更强。而比较竞争性和反竞争性的强弱, 则可通过单酚酶的测试来旁证, 在单酚酶测活体系中, 延滞现象很容易被观察到。延滞期过后, 反应体系才达到稳态。反推之, 若奥扎格雷只与游离酶起作用, 那样不仅降低稳态反应速率而且延长延滞时间;若奥扎格雷只与酶-底物复合物ES起作用, 奥扎格雷仅降低稳态反应速率, 而且不会延长延滞时间, 但是奥扎格雷不仅降低了稳态反应速率, 而且延长了延滞时间, 则说明竞争性抑制效应要强于反竞争性抑制效应。

摘要：奥扎格雷不仅能抑制酪氨酸酶单酚酶的活性, 而且能够抑制酪氨酸酶二酚酶的活性。对单酚酶的抑制作用主要表现为抑制酶活, 并且使得酶催化反应的延滞时间有明显的延长, 而对二酚酶的抑制作用, 主要表现为抑制二酚酶酶活。同时, 讨论了酚氧化酶的催化氧化的机理:酶和底物结合后, 会形成一个新的疏水性的“口袋”, 抑制剂奥扎格雷会嵌入这个“口袋”, 形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。

关键词：酪氨酸酶,奥扎格雷,单酚酶,二酚酶,抑制机理

参考文献

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[2]A.G.Marangoni (著) , 赵裕蓉, 张鹏 (译) .酶催化动力学—方法与应用[M].北京:化学工业出版社, 2007.

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酪氨酸酶抑制剂论文 篇2

滥用保健品和补品也能使丙氨酸氨基转移酶增高。

像酒精中毒，农药中毒，铅、汞等重金属中毒，各种急慢性中毒都能使丙氨酸氨基转移酶增高。

心理压力大，怀孕，劳累，运动，情绪恶化，内分泌失调，心.肝.脑供血不足等生理性因素增高都能使丙氨酸氨基转移酶增。

精神病药物(氯丙嗪等)，抗结核药物(利福平等)，消炎抗菌药物避孕药还有一些中药都能使丙氨酸氨基转移酶增高。

在劳累后，运动后，喝酒后，情绪激动后采血化验，都能造成丙氨酸氨基转移酶增高。所以患者在采血检验ALT时一定避开这些时间。 血清丙氨酸氨基转移酶增高的原因是多方面的，单项丙氨酸氨基转移酶指标增高，不能认为就是肝炎，必须结合其它各项检验指标来综合症断。

主要危害：

1.导致肝细胞不断损伤，使病情恶化。

2.导致肝脏代谢能力下降。肝脏代谢能力下降时，肝脏便要超负荷运作，不利于肝脏的恢复，甚至加剧肝脏损伤。

酪氨酸酶抑制剂论文 篇3

【摘 要】 目的：探讨清香木内生菌对酪氨酸酶活性的影响。方法：对新鲜清香木的茎和根部位进行内生真菌的分离，经显微鉴定菌株分别为木霉属、镰孢属和假丝酵母属，然后将菌株的发酵液用多孔酶标板法进行酪氨酸酶抑制活性的检测。结果：茎皮部的PZ-6-2对酪氨酸酶活性抑制作用最强，PZ-4次之；根皮部的QZ-1抑制活性也较强。结论：清香木内生菌对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用。

【关键词】 清香木；内生真菌；酪氨酸；酪氨酸酶抑制剂

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0018-01

Abstract：Objective To discuss the effect of endophytes from Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch on tyrosinase activity.Methods The endophytic fungi isolated from stems and roots of fresh Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch were belong to trichoderma， fusarium and candida through microscopic identification respectively， and next the inhibitory effect of strain fermented liquid on tyrosinase was determined.Result The PZ-6-2 from stem bark and QZ-1 from root bark had a stronger inhibitory effect on tyrosinase，and the effect of PZ-4 is weak.Conclusion The Endophytic fungi from Pistacia weinmannifolia J.Poisson ex Franch had a certain inhibitory effect on tyrosinase activity.

Keywords：Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch； Endophytic fungi； Tyrosine； Tyrosinase inhibitors

植物内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内且不引起植物明显病害的微生物[1]。研究表明，某些药用植物的内生菌可以产生与寄主相似的作用。清香木（Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch），别名香叶树、清香树等，为漆树科黄连木属植物，主要分布于云南中部、北部及四川南部等地。临床以叶及树皮入药，具有消炎解毒、收敛止泻的功效，并在美白和收缩毛孔方面有一定活性。酪氨酸酶又称多酚氧化酶（EC.1.14.18.1），广泛存在于微生物、动植物及人体中，是生物体合成黑色素等色素的限速酶[2]，与人的衰老、昆虫的伤口愈合与发育、果蔬的褐变有密切关系。近年来，酪氨酸酶一直受到国内外的关注，其研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域。本实验以清香木内生菌作为研究对象，以Kubo和Masuda的酪氨酸抑制模型[3-4]对代谢产物进行筛选。

1 仪器与材料

1.1 仪器 KHB ST-360酶标仪（上海科华）；Lambda 35紫外分光光度计（Perkin Elmer）；气浴恒温摇床（Thermo）；DZF-6050真空干燥箱（上海星业）；显微镜（奥林巴斯）。

1.2 材料 样本采自楚雄医药高等专科学校校园植物园，经鉴定为漆树科黄连木属植物Pistacia weinmannifolia J. Poisson ex Franch。

2 方法

2.1 内生真菌的分离鉴定

2.1.1 培养基的配制 平板和发酵用培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，加入1 L蒸馏水中，搅拌均匀备用。斜面培养基：用高氏1号（可溶性淀粉20 g， KNO3 1.0 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，纯化琼脂粉16 g，加入蒸馏水1 L，调整pH至7.4）。

2.1.2 内生真菌的培养分离 取新鲜清香木的茎和根，用自来水将表面冲洗干净，稍干后切成适宜长度的小段，在75 %乙醇中浸泡3～5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。然后用无菌刀片将组织表皮削去。分别取韧皮部、木质部并切成5 mm×5 mm×1 mm的小块贴放于分离培养基上，置25～28 ℃恒温箱中培养3～7 d，待培养基上各植物组织周围长出菌丝后，采用尖端菌丝挑取法对所分离的内生真菌进行纯化，即得内生真菌。

2.1.3 内生真菌的鉴定 参考文献[3]采用插片培养和点植法对分离获得的清香木内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定，结果见表1。经鉴定，来源于清香木茎皮部的内生真菌为木霉属（PZ-6-2）和镰孢属真菌（PZ-4），来源于根皮部的为的假丝酵母属真菌（QZ-1）

2.2 酪氨酸酶活性的研究

2.2.1 检测样品的制备 按照“2.1配制”培养基，然后于超净工作台中将纯化后的菌种依次接种到装有灭菌液体培养基的试管中，标记后置入多孔泡沫板于摇床中28 ℃，160 r/min，5 d，发酵。

2.2.2 样品处理及检测 发酵后的液体于121 ℃，20 min灭活后，将上清液倾倒入7 ml的离心管中，12000 r/min离心5 min。取适量上清液至干净的试管中，标记后4℃保存。

对酪氨酸酶的抑制筛选参照Kubo和Masuda的方法并进行改进。反应在96孔细胞培养板中进行，共设4组，每组设3个复孔，分别为：Ⅰ.不含样品，但含酪氨酸酶的阴性对照，每孔加入180 μl磷酸盐缓冲液，20 μl 酶溶液。不含样品及酪氨酸酶的空白对照，每孔加入200 μl缓冲液。包含样品及酪氨酸酶，依次加入150 μl缓冲液，20 μl 酶溶液，30 μl样品。Ⅳ.含样品但不含酪氨酸酶的空白对照，每孔170 μl磷酸缓冲液，30 μl样品。然后将培养板在30 ℃下孵化5 min，并在每孔中加入100 μl酪氨酸酶溶液。30 ℃反应20 min后，于酶标仪中测量475 nm处的吸光度值。提取物对酪氨酸酶活性的抑制按公式计算：

抑制率=[（Ⅰ-Ⅱ）-（Ⅲ-Ⅳ）] / （Ⅰ-Ⅱ）×100 %

3 结果

3.1 对酪氨酸酶活性的抑制作用 通过参考Kubo的酪氨酸酶活性筛选模型，将分离得到的清香木内生真菌进行活性筛选，通过计算抑制率，进而作出筛选的标准。见表2。

4 讨论

通过分离清香木中内生真菌并进行活性筛选，建立了酪氨酸酶活性的筛选模型，筛选出活性较好的三株菌株。接下来将通过对此三株菌株的产物活性跟踪找到活性成分并进行分离鉴定，希望获得能够在食品保鲜、美白方面有益的产物。

参考文献

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[2]Kubo I，Kinst-Hori I.Flavonols from saffron flower：tyrosinase inhibitory activity and inhibition mechanism[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（10）：4121-4125.

[3]Kubo I，Kinst-Hori I，Chaudhuri S K，et al.Flavonols from Heterotheca inuloides：tyrosinase inhibitory activity and structural criteria[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry， 2000， 8（7）： l749-1755.

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[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

芦荟素对酪氨酸酶活性的抑制作用 篇4

酶在医药、食品、化工和环保等领域应用广泛。酪氨酸酶是一种以双铜离子为活性单元的氧化还原性酶, 在动物、植物体内广泛存在, 对黑色素细胞的合成具有调控作用, 是黑色素形成的限速酶[1]。

黑色素细胞是生物体内黑色素的合成主要场所, 在黑色素的合成过程中, 酪氨酸酶对整个黑色素的合成具有重要催化作用, 酪氨酸酶主要存在于黑色素细胞中。酪氨酸酶的活性升高, 则黑色素的形成增加;酪氨酸酶的活性降低, 则黑色素的生成减少, 因此, 酪氨酸酶活性的强弱与黑色素形成的多少存在正相关关系。临床上酶氨酶活性过强、或者过弱均会导致临床疾病的发生, 如黄褐斑、白化病、雀斑、白癜风等异性性色素性皮肤病[2]。国内外学者常利用抑制酪氨酸酶活性试验, 研究筛选治疗皮肤色素沉着症的药物[3]。该实验采用蘑菇酪氨酸多巴速率氧化法, 研究活性单体化合物芦荟素对酪氨酸酶的影响[4]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

L-多巴胺 (L-DOPA) , 蘑菇酪氨酸酶 (美国Sigma公司) ;芦荟素 (中国药品生物制品检定所) ;氢醌 (天津市巴斯夫化工有限公司) ;其他试剂均为市售分析纯。UV-1800紫外可见分光光度计 (日本岛津) ;AUY220电子分析天平 (日本岛津) 。

1.2 方法

采用pH6.8磷酸缓冲溶液, 将L-DOPA、芦荟素、氢醌分别配制成0.1%的溶液, 将蘑菇酪氨酸酶配制成100U/mL的溶液。取上述磷酸缓冲240μL, 加入0.1%L-DOPA反应液80μL, 蘑菇酪氨酸酶80μL混合均匀, 常温静置5 min, 于分光光度计上在400~600 nm扫描。可见在475 nm处有最大吸收峰。同法分别测定L-DOPA、蘑菇酪氨酸酶均未见有吸收。采用酪氨酸酶多巴速率氧化法, 在pH6.8磷酸缓冲液中, 用酪氨酸酶催化多巴变成多巴醌, 有肾上腺素红色, 利用分光光度计在475 nm处的特定吸收测定生成多巴醌时的吸收度:A=A (药+L-DOPA+酶) —A (药+酶) 。反应在96孔培养板中进行, 总反应体系为200μL测试药物40μL;100U m L-1的酪氨酸酶溶液40μL;0.1%的L-DOPA溶液40μL;pH6.8的磷酸缓冲液80μL。调零孔仅加pH6.8的磷酸缓冲液200μL;对照组不加测试药物, 以pH6.8的磷酸缓冲液40μL代替。加样完毕, 将96孔培养皿置于水温为37℃的水浴箱中孵育20 min后, 随即取出立即检测其吸光度, 记录每孔的对应A值。每次试验重复8次。然后计算得出酪氨酸酶的抑制率。酪氨酸抑制率 (%) = (A (药+L-DOPA+酶) —A (药+酶) ) /A (药+L-DOPA+酶) [5,6]。

2 结果

对酪氨酸酶活性的影响0.01%浓度的芦荟素和氢醌都对酪氨酸酶有不同程度的抑制作用, 其中氢醌的抑制作用稍强于芦荟素。结果见表1。进一步研究发现芦荟珍珠胶囊在高浓度 (2 mmol/L) , 中浓度 (1mmol/L) 时对酪氨酸酶活性的影响, 与氢醌 (0.5 mmol/L) 相比, 前者抑制率高于氢醌 (0.5 mmol/L) (P<0.05) 而后者抑制率与氢醌 (0.5 mmol/L) 相当 (P>0.05) 。并将芦荟素和氢醌的浓度从2~0.5作4种浓度倍比稀释, 反应其对酪氨酸酶的抑制作用的强弱大致呈剂量依赖关系, 如图1所示。

注:L-多巴、芦荟素、氢醌为0.1%的溶液;酷氨酸酶为100 UmL-1。

3 讨论

从色素增多性皮肤病的发病机理来看, 自然界凡是对酪氨酸酶具有抑制作用的物质, 如氢醌、维生素E、维生素C、硫辛酸、曲酸等, 理论上均可作为临床祛斑剂的选择对象, 临床使用中发现氢醌霜、果酸类制剂因其刺激性大且使用过量后具有一定的细胞毒性已经逐渐被淘汰;维生素C、曲酸易氧化, 保质期短。而芦荟素在酪氨酸酶活性抑制的方面的有效性及安全性等方面均比较理想[7,8,9]。该研究表明:芦荟素对酪氨酸酶有较好的抑制作用, 并且芦荟素对酪氨酸酶活性的抑制作用呈现出良好的量-效关系, 芦荟素浓度在0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L时对酪氨酸酶的抑制作用逐渐增强, 其抑制率随剂量的增加而升高。在整个观察过程中, 无细胞毒性、皮肤刺激性及过敏反应等不良反应的发生, 临床使用安全性, 皮肤依从性良好。因此, 芦荟素或含有芦荟素的相关产品可以作为治疗色素增多性疾病, 如黄褐斑, 妊娠斑等的选择药物。

参考文献

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酪氨酸酶抑制剂论文 篇5

1 14-3-3蛋白的概况

1967年Moore和Perez进行牛脑神经元蛋白电泳时发现了一组可溶性同源/异源二聚体蛋白[3],根据纤维素膜柱层析(DEAE)的片段数目和淀粉凝胶电泳的迁移位置将这一蛋白家族命名为14-3-3。 该蛋白是在真核细胞中普遍存在的、高度保守的酸性蛋白家族,分子量在28~33 k D之间。 14-3-3蛋白家族在氨基酸序列上是高度保守的,如非洲爪蟾与人类14-3- 3蛋白在氨基酸序列上就有84%的同源性[4]。 14-3-3蛋白具有广泛的组织特异性,在脑、肺、肝脏、心脏等几乎所有的组织中均有分布。 在淋巴组织,尤其是胸腺和脾脏中表达最高[5]。 哺乳动物有7种亚型(β、γ、 ε、ζ、η、σ、τ),其中一种亚型即14-3-3β,又称蛋白激酶C抑制蛋白1 (protein kinase C inhibitor protein 1),是14-3-3蛋白家族的主要成员,含量最高。

2 14-3-3β蛋白与糖代谢

2.1 14-3-3β蛋白与糖酵解

Haruhiko等[6]研究指出,在小鼠的肝细胞中,碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrates response el- ement binding protein,CHREBP)的N-末端区域(125- 135残基) 通过与14-3-3蛋白相互作用调节其亚细胞定位,14-3-3蛋白通过与此区域的 α 螺旋结合,保留CHREBP在胞浆中,并且14-3-3蛋白与CHREBP的结合与输入蛋白 α 具有竞争作用,所以,14-3-3蛋白是通过影响CHREBP进入胞核来控制其作用的发挥。 其中,14-3-3β 蛋白是与CHREBP结合的最主要的内源性14-3-3蛋白亚型[7]。

2.2 14-3-3β 蛋白与糖异生

胰高血糖素受体(glucagon receptor,GCGR)是一个具有7个跨膜序列的G蛋白偶联受体。 GCGR主要的生物学作用是与其内源性配体胰高血糖素结合后通过PKA-c AMP途径和Gq-PLC/Ca两种途径发挥作用[8,9],在肝脏中主要是通过PKA-c AMP途径。 研究发现[10], 低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR),14-3-3β 蛋白和TMED三个辅助蛋白与GCGR相互作用,在胰高血糖素的刺激下,三个辅助蛋白通过调节c AMP来调节糖异生。 LDLR和TMED2通过增加c AMP的累积, 增加了胰高血糖素刺激葡萄糖的生成, 而14-3-3β 蛋白抑制了血糖的生成。 并且,LDLR和TMED2刺激了糖异生关键酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)基因的表达,14-3-3β 蛋白抑制其表达。 14- 3-3β 蛋白通过以上两种方式调节糖异生。 这些新的研究提供了一个通过拮抗胰高血糖素来降血糖治疗糖尿病患者的新研究视野。

3 14-3-3β 蛋白与脂肪的合成代谢

14-3-3β 蛋白和14-3-3γ 蛋白是PPARγ 的转录调节分子,通过竞争性地与PPARγ 的Ser273位点磷酸化来调节糖脂代谢。 在Park等[11]的细胞实验中提出,14-3-3β 蛋白和14-3-3γ 蛋白通过调节PPAR的靶基因固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)和脂肪酸易位酶(FAT)/CD36来影响肝脏的脂肪合成。 14-3- 3β 蛋白增加了PPARγ 的转录活性和靶基因表达水平,从而增加脂肪合成及运输。 相反,14-3-3γ 蛋白降低了PPARγ 的转录活性和靶基因表达水平, 在有高浓度的游离脂肪酸时抑制脂肪形成。

Yang等[12]的研究指出, 在脂肪细胞中,seipin蛋白在胞质中通过其N和C末端与14-3-3β 蛋白结合,在脂肪生成时,14-3-3β 蛋白的表达上调,不需要影响关键的脂肪合成转录因子(PPARγ、C/EBPα、C/ EBPβ、C/EBPσ 和Srebp1c),14 -3 -3β 蛋白的缺失就能引起脂肪生成的减少。 在脂肪细胞的发育过程中, 丝切蛋白-1(cofilin-1)调节了大量的肌动蛋白细胞骨架的形成。 在胰岛素刺激下,14-3-3β 蛋白与cofilin-1存在相互作用, 在脂肪生成时调节了cofilin-1的定位。 所以,在seipin蛋白招募cofilin-1改造肌动蛋白细胞骨架调节脂肪生成的过程中,14-3-3β 蛋白的作用是不能低估的。

总之,14-3-3β 蛋白在脂代谢的调节中起着重要的作用。 因此,可以通过研发作用于14-3-3β 蛋白的药物来治疗脂代谢紊乱性疾病,这些新的研究结果为脂代谢紊乱疾病的治疗提供了新思路。

4 14-3-3β 蛋白与临床疾病

4.1 14-3-3β 蛋白与神经系统疾病

研究发现[13], 在不进行抗精神病治疗的情况下, 与空白对照组相比,精神分裂症(schizophrenia,SZ)患者14-3-3β 蛋白和14-3-3ζ 蛋白的免疫反应性有所增加, 但是在进行抗精神病干预后,14-3-3β 蛋白免疫反应性有明显变化。 研究表明了抗精神病的治疗能下调14-3-3β 蛋白的表达水平。 进一步的分析表明, 14-3-3β 蛋白和14-3-3ζ 蛋白对于SZ具有特异性, 但是与自杀行为无关。

又有报道提出[14],在对近亲交配的两种鼠系抗抑郁反应的研究中发现, 在进行选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI) 治疗时,14-3-3β 蛋白的表达上调。

最近的研究表明[15],14-3-3β 蛋白与朊病毒蛋白质的中央疏水区氨基酸的106~126位点和138位点氨基端氨基酸存在相互作用。 这种相互作用表明14- 3-3β 蛋白参与了朊病毒所致疾病的发生与克雅氏病相关。

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种进行性神经退行性疾病,是老年人群中最常见引起老年痴呆的原因[16,17]。 最新研究表明[18],14-3-3β 蛋白与其他的一些蛋白共同作用改变AD患者脉络丛细胞中线粒体的功能并参与细胞凋亡的调控,从而发挥重要的生理学功能。

ADAM家族是一类具有去整合域和金属蛋白酶域的跨膜蛋白,广泛参与各种重要的生理过程, 如精卵结合、神经系统发育、成肌细胞融合以及炎性反应等。 ADAM22在脑部高度表达, 基因剔除小鼠则出现严重的共济失调。 研究表明[19],用酵母双杂合系统筛选到14-3-3β 与ADAM22相互作用并具有专一性。 ADAM22胞内部分系列缺失实验表明,C端第864~ 892氨基酸残基是14-3-3β 的结合基序,在神经功能和发育中起重要作用。

4.2 14-3-3β 蛋白与生殖系统疾病

研究发现[20],14-3-3β 蛋白在人类、 鼠类睾丸组织中的不同细胞都有表达,包括支持细胞、睾丸间质细胞、血管内皮细胞等。 在睾丸组织中,14-3-3β 蛋白与波形蛋白相互作用,通过阻止磷酸化波形蛋白的脱磷酸化来稳定已延长的波形蛋白细丝。 因此,14-3- 3β 蛋白在正常精子的形成中是很有必要的。 14-3-3β 蛋白的功能障碍会引起男性不育。

此研究[20]又提出,在生殖细胞瘤的肿瘤细胞中能检测到14-3-3β 蛋白强烈的免疫反应性, 在胞核和胞浆中都存在,胞核中含量更高。 此现象在支持细胞中也可观察到。 在精原细胞瘤中,14-3-3β 蛋白主要存在于恶性转化细胞的胞核中。

与正常的睾丸组织比较,14-3-3β 蛋白在恶性转化细胞中的表达明显提高。 吕德官等[21]的研究发现, 14-3-3β 蛋白参与了癌症的发生、增殖、转移以及耐药的调节。 并且也有证据表明,在星形胶质细胞瘤、肺癌、卡波肉瘤中,14-3-3β 蛋白的表达都会上调[22,23,24]。 有研究提出[25],14-3-3β m RNA在CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌中表达明显上调,而在慢性宫颈炎、CINⅠ的表达比较差异无统计学意义。 14-3-3β 在宫颈癌中高表达,从慢性宫颈炎→CIN→宫颈癌的过程中,14-3-3β 发挥了一定的作用,且其表达水平越高,宫颈病变程度也越高,越预后不良。 故14-3-3β 表达水平变化对宫颈癌的防治和高危患者的早期诊治具有非常重要的意义, 有利于临床指导宫颈癌的早期诊断和治疗。 又有研究报道[26],小鼠卵母细胞生发泡(GV)期卵母细胞中在m RNA水平上只有14-3-3β 和14-3-3ε 亚型存在, 但14-3-3εm RNA水平显著高于14-3-3β。 Tseng等[27]利用凝胶电泳和MALDI-TOF-TOF实验方法发现胃癌SC-M1细胞中14-3-3β 蛋白大量表达, 与对照组相比,14-3-3β 蛋白在胃癌组织和血清中的表达水平显著上升,与淋巴结转移数目、肿瘤大小和患者存活率关系紧密。 Liu等[28]证实14-3-3β 蛋白大量表达会明显促进肝肿瘤细胞的生长。 其研究显示, 14-3-3β 蛋白和integrinβ1共同大量表达会加强瘤细胞的迁移能力,增大细胞黏附性,加速瘤细胞的发展, 缩短恶性肝肿瘤患者的存活期。 这些都说明了14-3-3β 蛋白潜在的致癌性,与肿瘤的诱导及恶化紧密相关,应该引起高度重视,深入研究14-3-3β 蛋白与肿瘤的关系将为肿瘤诊疗提供新的思路。

4.3 14-3-3β 蛋白与内分泌系统疾病

Zhang等[29]的研究发现通过曼-惠特尼U检验去分别检测在低、 高骨密度组的不同蛋白表达水平,在绝经后妇女的低骨密度组发现了14-3-3β 蛋白的表达下调。

5总结与展望

14-3-3β 蛋白通过蛋白质组学途径被确认与许多蛋白质相关联,在分子靶向治疗上可作为一个有用的标志物[30]。 这些在T2DM中新确认的蛋白质能够为肝细胞脂肪变性的病理生理学研究及胰岛素抵抗提供新的视野。

综上所述,近几年来,众多研究者对14-3-3β 蛋白的数千种体内外试验都能够证实其与糖脂代谢及多种疾病存在着一定的联系。 随着新技术、新方法的出现,目前14-3-3β 蛋白在临床疾病的发生、发展等方面的研究已经取得了巨大进展,但它们之间的具体机制尚需进一步明确。 相信通过对14-3-3β 蛋白的研究可以更好地了解细胞的各种信号转导途径以及它们之间的相互作用,从而更好地阐明细胞的各种生命活动,为疾病治疗提供更多的理论基础。 这方面的工作将会是目前和今后相当一段时期的热点,深入认识14-3-3β 蛋白有望为疾病的早发现、 早诊断和早治疗开辟新的途径。

摘要：酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(14-3-3蛋白)家族是高度保守的可溶性酸性蛋白质。14-3-3蛋白调节着许多重要细胞生命活动,如新陈代谢、细胞周期、细胞生长发育、细胞的存活和凋亡以及基因转录,该蛋白家族异常与疾病的发生密切相关。其中14-3-3β蛋白是重要的亚型之一,引起了相关学者的关注。14-3-3β蛋白已成为一些疾病的临床诊断指标,其作为疾病治疗的靶点也在研究之中。本文主要简述了14-3-3β蛋白在糖脂代谢中发挥的作用及该蛋白与临床疾病的关系。

植物苯丙氨酸解氨酶研究进展 篇6

1 PAL的存在和分布

1961年Koukal和Conn首次在绿色植物大麦幼苗中发现了PAL, 并进行了分离纯化[3]。随着研究的深入, 该酶已被固定化, 用于工业化生产苯丙氨酸。至今, PAL已在所有绿色植物中发现, 在真菌、细菌、藻类中也有存在。不同植物中PAL活性不同, 在同一株植物的不同组织部位, PAL活性也不同。一般越嫩的部位PAL活性越高, 如杨树的幼叶、顶芽、幼茎中PAL活性最高, 而老茎和成熟叶中PAL则较低[4]。

在细胞水平上, 植物PAL主要分布在表皮下的细胞和维管组织细胞中;在亚细胞水平上, PAL定位于细胞质和一些细胞器上, 如叶绿体、白色体、线粒体、过氧化酶体、乙醛酸体等。Nakushima等进行了PAL的亚细胞定位, 发现细胞间质部分PAL活性最高, 电子显微镜观察显示, PAL分散在细胞的基质中, 定位在高尔基体囊泡和次生壁加厚层中[5]。

2 PAL的基本特性

PAL是一种胞内诱导酶, 酶蛋白是一种含有4个相同亚单位的寡聚体, 氨基酸组成随不同来源而异, 如水稻PAL氨基酸组成中酸性氨基酸成分低于小麦、玉米和马铃薯, 而中性及碱性氨基酸成分则高于后三者[6]。在酶活性部位具有脱氢丙氨酰基的亲电中心。酶蛋白分子量一般在220~330KDa, 但不同来源稍有差异, 如马铃薯PAL分子量为330KDa, 玉米为306KDa, 小麦和水稻PAL分子量分别为280KDa和230KDa[1]。不同来源的PAL最适pH值在8.0~9.5。如甘薯PAL最适p H值为8.5~9.5, 水稻为9.2, 小麦为8.8, 与其氨基酸组成相一致[7]。

该酶的动力学曲线不符合米氏方程, 不规则, 具有别构酶的特征。大多数PAL的米氏常数 (Km) 在0.3×10-4~1.5×10-2mmo L/L, 水稻PAL的Km为5.94×10-4mmo L/L;而小麦PAL的Km有2个, 分别为0.625×10-4mmo L/L和3.1×10-4mmo L/L[1,6]。

3 PAL对植物生理代谢的意义

植物的代谢分为初级代谢和次级代谢。植物的次级代谢有多条途径, 苯丙烷类代谢途径是其中很重要的一条。苯丙烷类途径生成的黄酮、异黄酮、生物碱等次生代谢产物在植物的生长发育过程中起着重要的作用, 所以PAL对植物的生理意义非常重大 (见图1) 。

3.1 在木质化中的作用

在植物的木质化组织中含有较高的PAL活性。Nakashima等用分离的百日草叶肉细胞研究了苯丙烷类代谢酶类与木质素、管状分子形成和细胞分化的关系, 发现在百日草细胞分化过程中, 木质素的合成及管状分子形成与PAL活性的增加成正相关, 细胞溶质中的PAL活性在木质化之前迅速上升, 微粒体和细胞壁的PAL活性在木质化期间快速增加[5]。

3.2 在植物色素形成过程中的作用

花色素是植物花朵、果实和叶片颜色的重要组成部分, 花色素等的合成可由苯丙烷类产物反香豆酰Co A经过类黄酮途径生成, 该过程与PAL密切相关。如苋红素是中央种子目植物所特有的色素, 当用白光、蓝光或红光照射尾穗苋黄化苗后, 发现PAL活性均有不同程度地上升, 并有苋红素的积累[8]。有人通过调节PAL合成基因的表达, 有效地改变了矮牵牛、烟草和菊花的花色[9]。因此, 利用分子生物学技术有可能改变苹果等果树果实的色泽。

3.3 在植物根瘤形成中的作用

苯丙烷类代谢产物经类黄酮途径可产生黄酮类化合物, 这些化合物对根瘤菌有趋化作用, 有些类黄酮化合物还可作为根瘤菌结瘤基因的诱导物质[10]。这些黄酮类物质的含量与PAL活性存在着密切的关系, 在根瘤菌的形成过程中常伴随着PAL活性逐渐增强。

4 PAL在植物抗逆境中的作用

研究发现, 许多植物在遭受寒冷、机械损伤、微生物侵染等逆境时, 植物的防卫系统特别是苯丙烷类代谢被激活, PAL活性迅速上升。如柑橘果实受机械损伤后, 果皮中PAL的活性明显高于对照, 且pal2、pal6基因的表达比对照明显增强[11]。因此, PAL活性可作为植物抗逆境能力的一个生理指标。

4.1 PAL在植物抗病中的作用

PAL活性与植物抗病性密切相关, 其活性可作为衡量植物抗病性的生化指标之一。植物感染病原菌后PAL活性明显升高, 并表现出规律性的变化, 即在侵染的最初几小时, 酶活性上升滞缓, 随后急剧上升, 酶活高峰一般出现在侵染后的12~48h, 之后迅速下降。受病原物侵染后, 不同抗性的品种 (系) 间PAL活性有明显差异, 抗病品系诱导产生的PAL活性远高于感病品系, 且PAL活性越大, 品种 (系) 抗病性越强。如张淑珍等在对疫霉根腐病菌毒素胁迫下不同大豆抗感品种PAL活性的研究中发现, 抗病大豆品种的根、茎和叶中PAL活性在病程的大部分阶段都高于对照[12]。PAL参与植物抗病的机制和作用主要有如下几点。

4.1.1 参与植保素的合成。

植保素是参与植物防御反应的重要生理活性物质之一, 主要包括酚类植保素 (绿原酸、香豆素和儿茶酚等) 、异黄酮类植保素 (豌豆素、菜豆素、大豆素、苜蓿黄素等) 和萜烯类植保素, 它们能直接防止病原物的生长发育和侵染。其中, 前两类都是苯丙烷类代谢的直接或间接产物, 其生成量与PAL活性成正相关[1]。当用PAL抑制剂L-2-氨氧基-3-苯丙酸和α-氨氧基-乙酸处理植物幼苗, 植物体内植保素合成和累积受到抑制[13]。

4.1.2 参与木质素的合成。

木质素可加强细胞壁, 增加组织木质化程度, 形成病原菌入侵的机械屏障, 木质素的合成也来自苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸。PAL是这条途径的第一个也是最重要的酶。研究表明, 在植物-病原物互作中, PAL参与木质素合成和累积。如棉花受枯萎病菌侵染后, 随着PAL活性提高, 出现木质素的积累。PAL受抑制, 木质素合成亦受到抑制[14];不同抗病性的杉木接种炭疽菌后, PAL比活力均上升, 且抗病性强的杉木PAL比活力比抗病性弱的杉木高[15]。

4.1.3 参与酚类物质的合成。

酚类化合物也是苯丙烷类代谢产物。PAL活性增高与酚类物质的合成亦有一致性。如感染灰霉病的黄瓜组织中, 伴随PAL活性升高, 总酚积累[16];在用多糖组分处理后, 提高红豆杉中酚类物质和可溶性蛋白含量的同时, 过氧化物酶和PAL的活性也被激活[17]。

4.2 PAL与植物抗虫性的关系

关于PAL参与植物抗虫方面的研究报道较少, 但关于苯丙烷类代谢途径与植物抗虫性的报道已有很多, 主要集中在这一代谢途径的产物 (木质素、植保素) 与植物抗虫性的关系方面。木质素的积累, 可使细胞壁加厚, 成为食草类动物取食的机械障碍, 而植保素对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用, 这些化合物的生成与PAL含量存在着间接的关系。许多试验证明, PAL活性高低与植物的抗虫性有很大关系, 如吴龙火等在研究5种山羊草对禾谷缢管蚜取食的诱导性抗性机理时发现, PAL酶活提高率与蚜虫取食诱导有关[18]。而且食草类动物的取食也可诱导PAL活性升高[19]。

5 植物PAL基因的表达与调控

5.1 植物PAL基因的克隆

完整的Rhodotorula toroloides PAL基因序列已有报道 (Genebank/M18261) 。1987年, Anson等从R.toruloides中克隆出了PAL基因, 测得了其核苷酸全长序列, 发现R.toruloides PAL基因有6个内含子, 结构基因上游有一段富含C+T的序列, 这与脉孢菌 (Neurospora) 和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 中的某些基因具有相似性, 而在S.cerevisiae中这段富含C+T序列在一些高表达基因的转录中具有重要的作用[20]。这提示PAL基因中这段富含C+T序列对表达的意义, 有利于PAL基因工程菌的构建。同时, Anson归纳出了编码R.toruloides PAL基因的密码子的使用频率[20]。这对从c DNA (DNA) 中扩增PAL基因时设计PCR引物具有重要的参考价值。迄今为止, 对植物PAL基因的研究最多, 已有多种植物的PAL基因序列已经测定并公布在Gene Bank中。

5.2 植物PAL基因的表达调控

对苯丙烷类代谢途径的调控包括酶的内部调节和外界因子调控两个方面。它们的表达受发育和环境信号的调节, 具有严格的组织时间特异性[1]。

5.2.1 植物体内对PAL酶的内部调节。

PAL酶活性随植物发育过程的推进而不断变化。一般PAL酶活性最初较低或没有, 后上升到一个高峰后下降, 达到高峰的时间不同植物有所不同, 如水稻9d、小麦7d、胡萝卜60h。植物体内有一种内源性抑制物质 (PAL-inhibitor, PAL-I) 参与PAL活性的调节。从去胚乳的水稻黄化苗中提取并部分纯化了PAL-I, 它是非透析的蛋白质, 大部分活性可被蛋白酶破坏, 具有热稳定性。动力学实验表明, PAL-I对PAL的抑制是竞争性的。水稻PAL-I不仅能抑制水稻PAL, 还能抑制从小麦、玉米、马铃薯中提取的PAL, 但不能抑制水稻中提取的其他酶类, 如多酚氧化酶[21]。研究还发现, 单子叶植物幼苗胚乳中普遍存在PAL内源抑制物质的调节因子 (PAL-inhibitorregulator, PAL-IR) , 去胚乳后, 内源抑制物质增加, 幼苗中PAL活性下降。目前认为胚乳对幼苗PAL活性的调节作用在禾本科植物中具有普遍意义, 而双子叶植物子叶对PAL的调节作用不具有普遍性, 要比单子叶植物的胚乳复杂的多[1,21]。

PAL酶除自然降解、钝化因子和调节因子外, 还受其末端产物的调节。酶抑制剂有许多种类, 如肉桂酸、ρ-香豆酸、α-氨氧基乙酸和一些氨基酸如组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等。不同来源的PAL对同一种类抑制剂的敏感性不同。如来源于大麦和红酵母的PAL对硫氢基类抑制剂敏感, 而来源于马铃薯、玉米、黑粉菌和链霉菌的则不敏感, 这种对酶活性的抑制同酶活性部位脱氢丙氨酰基的丧失和减少相伴随, 其机理可能是对脱氢丙氨酰残基的修饰[7]。

5.2.2 外界因子对PAL酶的调控。

PAL是一种诱导酶, 可受多种因素的诱导。低温、机械损伤、光 (白光、蓝光、红光、紫外光) 、病原菌感染、毒素处理、昆虫取食、矿质营养、悬浮细胞的稀释和外源植物激素等因素都可以在转录水平上诱导PAL基因的表达[22,23]。如用真菌诱导子接种欧芹叶细胞悬浮培养液, 接种后6~8h, PAL m RNA在大范围内高度表达, 且明显高于对照;约12h后, PAL m RNA收缩到坏死斑周围, 并在此区域内, PAL酶蛋白有所增加;接种25h, PAL m RNA表达基本恢复到原来水平, 而PAL酶蛋白在坏死斑周围被强烈地诱导合成[24]。

生长素 (IAA) 、激动素 (BAP) 和乙烯都可诱导植物PAL基因的表达, 剌激效应乙烯>IAA>BAP。还有研究表明, 赤霉素 (GA3) 也能诱导PAL活性的升高[1]。植物在生长发育过程中以及受病原菌及其诱导物和伤害等刺激时, PAL常伴随内源乙烯合成的增加而积累。如在西瓜果实发育中, PAL基因随着乙烯生物合成基因的表达而表达[25];马铃薯在用外源乙烯处理后, PAL m RNA的水平增加[26]。说明乙烯可能是植物PAL诱导表达的内源信号分子。各种诱导因子间还存在着互作关系, 如在切伤诱导甘薯块根切片PAL活性增高时, IAA、BAP和乙烯处理能使PAL的活性再增加, BAP的效应还可被照光而增强[7];在尾穗苋黄化苗PAL与苋红素积累的相关性研究中, 也观察到光对BAP的刺激作用有增效现象[8]。

5.3 调控机理

PAL是由一个多基因家族控制, 不同组织有多种PAL同工酶, 分别定位于不同的组织细胞, 控制不同的代谢途径[1,7]。研究表明, 植物PAL基因结构的普遍特点是由小的多基因家族组成, 在1组染色体中, 含有1至多个PAL基因, 并随不同植物而异, 基因内一般含有1个内含子。如菜豆基因组包含3个PAL基因, 即PAL1、PAL2、PAL3。它们都可在根部大量表达, 而花瓣中PAL2大量表达, PAL1表达量很少, PAL3不表达;这3个PAL基因都能被机械损伤诱导, 而PAL1和PAL2能被真菌细胞壁诱导因子所诱导。此外, 在机械损伤的细胞和木质部细胞都能检测到PAL2的活性[27]。这与其生理功能一致, 因为在木质部的正常发育过程中, 木质部的形成也是从PAL所催化的反应开始的。植物细胞受伤时用于填补伤口的物质的合成也需要PAL。

PAL多基因家族在表达上的差异是由于它们的启动子所包含的顺式作用元件不同而引起的。由顺式作用元件和相应的转录因子共同作用, 控制PAL基因在不同时间和组织中的表达。植物PAL基因启动子在转基因植物中的表达调控也说明了这一点。有人将菜豆 (PAL2、PAL3) 、拟南芥 (PAL1) 等植物PAL基因的启动子与β-葡萄糖醛酸糖苷酶 (β-Glucuronidase, GUS) 报告基因融合转移到马铃薯、烟草、拟南芥中, 通过检测报告基因活性, 来研究PAL启动子在转基因植物中的表达调控模式及表达的细胞和组织特异性。他们发现用亲和性的Pseudomonas solanacearum野生型菌株K60, 或不亲和性的无毒性突变株B1, 接种含有拟南芥PAL1-GUS基因融合物的转基因烟草植株, 迅速诱导了GUS基因的大量表达[28];将菜豆PAL2-GUS和PAL3-GUS转入拟南芥、马铃薯和烟草中, 其表达受环境刺激因子的诱导调控, 也受转基因植物发育阶段调控, 表现出不同的时空表达模式[28]。GUS表达的组织化学分析表明, 菜豆PAL基因启动子, 在转基因马铃薯和烟草的特定细胞———机械损伤的细胞中表达, 也可在发育中的木质部 (射线细胞) 和花器中表达[29]。这些结果表明, PAL基因启动子在转基因植物中的表达, 也受病原菌、转基因植物的发育阶段及其他环境因子的诱导调控。

6 结语

PAL是植物次生代谢中一种非常重要的酶类, 在植物的生长发育、抗病反应等过程中起着非常重要的作用。随着分子生物学的不断发展, 大量PAL基因的克隆、测序、结构特点分析及时空表达模式的研究, 将为在转基因植物中大量、持久表达PAL酶, 提高次生代谢产物的含量, 增强植物对病害的广谱持久抗性及其他农艺性状具有非常重要的作用。同时深入研究PAL基因启动子及相关转录因子, 不仅可以进一步阐明PAL基因的调控机理, 还能为增强作物抗病性、作物的遗传改良等研究开辟新的思路, 具有广阔的应用前景。

摘要：苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine ammonia-lyase, PAL, E.C4.3.1.5) 是催化苯丙烷代谢途径第一步反应的酶, 也是这个途径的关键酶和限速酶, 对植物具有非常重要的生理意义。综述了苯丙氨酸解氨酶的存在与分布、基本特性、生理代谢意义、抗病以及基因表达与调控等, 为PAL在植物抗病的应用上提供基础数据。