酶抑制快速检测法（精选5篇）
酶抑制快速检测法 篇1
食品安全是民生工程, 关系国计民生的头等大事。农产品安全是食品安全工作中的重中之重, 也是未来社会的发展趋势。农产品质量安全是人民群众生存的基本要求, 因此, 农产品质量安全有保障, 人民群众的身体健康和生命安全才有保障。目前, 各级政府和各级农业行政主管部门对蔬菜生产与流通环节中的监管措施和频次在不断强化。这就需要我们开发出用时少、成本低, 易操作的快速检测方法应用于蔬菜生产基地、蔬菜批发市场等地。而传统的检测技术使用大型仪器设备, 由于其检测时间长、成本高、对检测人员专业性要求高等不利因素而无法马上对有问题的农产品进行应急处理。
1 实验原理
酶抑制率法是在一定条件下, 有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酶的活性, 造成神经传导介质乙酰胆碱的积累, 影响正常传导, 使昆虫中毒致死, 根据这一昆虫毒理学原理, 用在对农药残留的快速检测中。如果蔬菜的提取液中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量较低, 酶的活性就不被抑制, 反之, 如果蔬菜的提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药, 酶的活性就被抑制, 从而导致加入底物后颜色发生不同程度的变化, 用农药残留快速检测仪测定吸光值随时间的变化, 计算出抑制率, 便可判断出蔬菜中含有机磷或氨基甲酸类酯农药的残留情况。
2 实验设备
1) RP420农药残留快速检测仪 (北京瑞利谱创仪器技术有限公司) ;
2) 电子天平 (精确到0.1g, 常熟双杰测试仪器厂) ;
3) 电热恒温培养箱 (5℃~40℃, 湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司) ;
3 实验试剂
3.1 pH8磷酸缓冲液;
3.2 显色剂:二硫代二硝基苯甲酸[DTNB) 和碳酸氢钠;
3.3 底物:硫代乙酰胆碱, 用缓冲液溶解;
3.4 丁酰胆碱酯酶:用缓冲液溶解, △A值控制在0.3以上;
4 实验方法和分析步骤
1) 样品处理:选取有代表性的样品, 擦掉表面泥土, 并剪成1cm见方的小碎片。称取2g (非叶菜类称取4g) , 加入20ml缓冲液, 震荡1~2min, 静置3~5min待用, 称为样品浸提液;
2) 上机实验:包括空白实验和样品实验。空白试验是于小试管内加入50ul酶, 50ul显色剂, 3ml pH8磷酸缓冲液, 于37~38℃下的恒温培养箱中放置15min后再分别加入50ul底物, 摇匀后立即倒入比色皿中上机测定;样品实验与空白实验步骤一样, 加入的试剂也一样, 只不过把pH8磷酸缓冲液换成样品浸提液。上机测定3min, 根据直接显示的抑制率即可得出是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药。
5 实验结果判断
实验结果按以下公式计算:
其中:△Ac为对照组3min后与3min前吸光度之差;
△As为样品3min后与3min前吸光度之差。
抑制率≥70%时, 蔬菜中含有某种或某几种有机磷或氨基甲酸酯类农药残毒, 此时样品要做3次以上重复检测, 且重现性应大于80%判定为不合格。
酶抑制率法快速测定有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的技术快速、简便、经济, 适用范围广, 适合在蔬菜生产与蔬菜流通环节中的行政监管和自我监督, 可以广泛应用我国各大中城市蔬菜批发市场, 用以加强对城市蔬菜质量安全的监督和管理。五年来, 沈阳市农业检测中心应用这种快速检测技术于沈阳五大蔬菜批发市场、各大超市和农贸市场, 保证检测合格蔬菜流入市场, 保障人民群众的菜篮子安全。
摘要：介绍了采用酶抑制率法快速测定有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的技术, 酶抑制率法即分光光度法, 是根据在一定条件下, 有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的正常功能有抑制作用, 其抑制率与农药的浓度呈正相关, 进而通过抑制率来判断蔬菜中是否含有有机磷及氨基甲酸酯类农药的存在。因其快速、简便、经济等特点, 应用范围涵盖较广, 保证有问题的蔬菜及时的排除。
关键词：酶抑制率法,快速检测,蔬菜,有机磷及氨基甲酸酯类,农药残留量,乙酰胆碱酯酶,分光光度法
酶抑制快速检测法 篇2
关键词：农药残留 气相色谱法 酶抑制率法
中图分类号：S481.8 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
目前，蔬菜农药残留监控中，使用最普遍的是酶抑制率法与气相色谱法， 依据其检测结果对农产品的质量进行评判和市场执法。酶抑制率法由于仪器便宜又轻便、检测过程简单、省时省力成本低，所以在大田和市场管理等需要迅速得到初步结果的场合得到广泛使用。但酶抑制率法仅能用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的初筛检测，局限性比较大。气相色谱法具有选择性高、分离效能好、灵敏度高、分析速度快等优点，是目前农药残留量检测最常用的定性定量方法。这里对酶抑制率法和气相色谱法的检测结果进行对比，探究在本实验室中酶抑制率法的准确性。
1 材料与方法
1.1材料和设备
蔬菜样品：油菜类、白菜类、菜心类、豆类、茄果类、葱和玉米等8类共100个样品，均从绿色蔬菜基地随机抽取。
安捷伦气相色谱仪7890A自动进样器，色谱柱：DB-17，DB-5MS；
农药快速检测仪SPR88（深圳安鑫宝）。
1.2方法
（1）酶抑制率法：参照标准GB/T 5009.199-2003[1]，抑制率大于或等于50% 判定为不合格，抑制率小于50% 判断为合格。（2）气相色谱法：参照标准NY/T 761-2008[2]。标的物：甲胺磷、甲拌磷、甲基对硫磷、氧化乐果、对硫磷、毒死蜱、百菌清、乐果、三唑酮、甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯及氰戊菊酯。样品用酶抑制法测试后，再用气相色谱仪进行定性定量检测，以DB-17和DB-5MS双柱确认。按无公害蔬菜安全要求[3] 进行产品合格判定， 以上13项标的物农药全部合格判定样品“合格”，其中一项标的物不合格判定样品“不合格”。
2 结果
蔬菜样品检验的结果表明：通过两种方法检验都被判定为合格的有88个，同时判定为不合格的有2个，两种方法得出的结论重复率为90%。结果不一致的共有10个样品，其中酶抑制率法判定为合格而气相色谱法判定为不合格的样品有7个，酶抑制率法判定不合格而气相色谱法检测出为合格的样品3个，具体结果见表1。
表1：
3 讨论
（1）从两组方法的检测结果来看，在这100个样品中，酶抑制率法的合格率为95%，气相色谱法检测的合格率为91%。气相色谱法比酶抑制率法合格率要低4%，其主要原因有以下3点：1）酶抑制率法对某些有机磷农药的响应值低。如小白菜用酶抑制率法检测是合格的，但用气相色谱法检测出来毒死蜱的浓度为7.32 mg/kg， 超标了7.3倍。在本次对比实验中，毒死蜱超标3个，酶抑制率法均未检出，说明酶抑制率法对毒死蜱的响应值相当低。2）酶抑制率法对菊酯类农药不敏感。表1中，多个蔬菜样品用气相法验出是菊酯类农药超标而用酶抑制率法验出的结果均是合格的。3）酶抑制率法对百菌清的检验结果不稳定。表1中小白菜和菜心1的百菌清残留量都大概在4.0mg/kg，但酶抑制率法判断的结果却相反。
（2）酶抑制率法判定为“不合格”的样品一共有5个，其中3个被气相色谱法判定为“合格”，出错率达到60%，说明酶抑制率法的误判几率较大。所以用酶抑制率法对样品作出“不合格”判定前， 一定要注意假阳性问题。气相色谱法的影响因素较少，干扰物质可以通过净化和分析条件的优化来排除，疑似样品可以通过双柱和质谱来确认，所以结果可信。
（3）酶抑制率法由酶水解显色反应和仪器光度分析共同作用，影响酶水解及影响光度分析的因素都会对结果造成重大影响，所以假阳性几率会比较高。酶活性、环境温度、PH值、酶及底物的浓度、反应时间等都会直接影响酶水解结果。另外，蔬菜基质对酶的干扰作用也值得注意，如葱、蒜、萝卜等含有刺激性硫化物的样品对酶有较强的抑制作用，极易造成假阳性。对光度分析有影响的因素也较多，如样品提取液颜色、澄清度等等，表1中的玉米可能是因为淀粉类物质浸出使提取液浑浊，造成假阳性。同时，样品和提取液的量、提取时间、取样部位也影响着酶抑制率法的准确性。
参考文献
[1] GB /T5009 1 199 - 2003 1蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测酶抑制率法[S]1.
[2] NY/T76 1-2004 1蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留检测方法[S]1.
[3] GB18406 1 1-1004 1农产品安全质量无公害蔬菜安全要求[S]1.
收稿日期：2015-04-21
酶抑制快速检测法 篇3
材料与方法
仪器与试剂
1仪器
全自动/高感度农药残留速测仪(台湾绿辉)、超声波清洗仪(上海睿祺电子设备有限公司)。
2试剂
农药残留检测试剂盒(台湾绿辉)、敌敌畏(佛山市大兴生物化工有限公司)。
实验器具中污染物的提取
本实验仅针对重复使用的实验器具。在做农药残留试验时,前处理用到镊子、剪刀、平底小试管,检测时用到反应盘(96孔),因此通过不同方法对这些器具进行清洗,再对农药残留情况进行检测。
1镊子、剪刀
取10个,每个用2 m L农药残留缓冲溶液反复冲洗,收集冲洗液,待测定。
2平底小试管
取10个,每个用2 m L农药残留缓冲溶液荡洗内壁,收集荡洗液,待测定。
3反应盘
取10个反应盘,每个用2 m L农药残留缓冲溶液反复冲洗反应孔,收集冲洗液,待测定。
实验器具清洗方法对农药残留祛除效果的考察
主要考察实验室常用的2种清洗方法。先取0.5 m L敌敌畏,加入5000 m L自来水,混匀。取镊子、剪刀、平底小试管和微孔板,浸泡10 min后取出,晾干,作为阳性实验器具。按以下方法清洗。
1方法1
取镊子、剪刀、平底小试管和反应盘各10个,先用自来水反复冲洗5次,然后置于5 000 m L自来水中,加入10 g洗衣粉,浸泡10 min,取出用毛刷刷洗(反应盘禁止刷洗),然后用自来水冲洗5次,再用蒸馏水冲洗3次,于40℃恒温干燥箱中烘干。按照1.2.1、1.2.2、1.2.3项下方法制备污染物提取液。
2方法2
取镊子、剪刀、平底小试管和反应盘各10个,先用自来水反复清洗5次,然后置于盛有4 000 m L蒸馏水的超声波清洗机中,加入8 g洗衣粉,超声清洗15 min,取出用自来水冲去泡沫,再次用蒸馏水重复超声清洗2次,每次5 min,于40℃恒温干燥箱中烘干。按照1.2.1、1.2.2、1.2.3项下方法制备污染物提取液(注意:反应盘应单独清洗)。
检测
1准备
试剂盒取出放置回温,按要求用蒸馏水配备缓冲液、酵素和混合剂待用。
2检测
按试剂盒方法进行检测:于反应盘内依次加入50μL样品待测液,50μL酵素,静置反应3 min,加入50μL混合液,同时用缓冲液代替样液作对照,于405 nm波长下读取结果。
结果
检测结果见表1、表2。可以看出,经方法1清洗后,大部分器具的农药残留抑制率(标准值50%)仍然较高,其中剪刀和反应盘检出了农药残留阳性,并且反应盘由于不能刷洗所以残留量较高。经方法2清洗后,无器具检出农药残留阳性,抑制率也较方法1降低,但清洗后的实验器具也仍有农药残留,说明清洗方法未能将农药残留彻底去除。
讨论
从试验结果来看,清洗不干净会使实验器具残留农药,由此产生的污染可对酶抑制率法检测农药残留试验产生干扰。首先,镊子、剪刀、平底小试管上残留的农药,在样品提取过程中,可将样品严重污染。其次,在样品检测过程中,反应盘上的有机磷农药经过累加后,可造成抑制率增大。因此,在做农药残留的检测时,实验样品就容易出现假阳性。
酶抑制快速检测法 篇4
1材料与方法
1.1 标本选择
本文资料根据我院2009年2月住院患者及健康体检人员血清标本90份。其中CK-MB活性高于总活性的30例患者血清、30例心肌梗死患者血清、30例健康体检者血清。30例患者CK-MB活性高于总活性患者中男性21例, 女性9例, 平均48±15岁 (6～80岁) 。30例心肌梗死患者血清中男19例, 女11例, 平均47±14岁 (6～78岁) ;对照血清标本30份, 均为本院健康体检者 (非孕) , 平均45±11岁 (20～76岁) 。三组病例的年龄、性别经统计学处理差别无统计学意义, 具有可比性。
1.2 仪器和试剂
仪器美国贝克曼CX7, 试剂为中生公司提供试剂盒, 游离血红蛋白按《全国临床检验操作规程》自配试剂。
1.3 方法
CK-MB速率法双试剂, 主波长340 mm, 副波长410 mm, 样品量10 μl, 试剂量A液200 μl, B液50 μl, 反应时间180 s, 终点读数为120 s, 温度37℃。游离血红蛋白按《临床检验操作规程》[1]操作。
2结果
三组病例检查结果见表1。
3讨论
CK由M和B两个亚单位组成, 组合成CK-BB, CK-MM, CK-MB三种同工酶, 在细胞线粒体内还有另一种同工酶, 称之为CK-Mt。CK-BB主要存在于脑、前列腺等器官, CK-MM主要存在于骨骼和心肌, CK-MB则主要存在于心肌, 正常人血液中大部分是CK-MM, 少量CK-MB, 而CK-BB极少。
在急性脑外伤、癫痫时BB明显增高, 恶性肿瘤 (如恶性组织细胞病) 因胚胎化细胞产生BB增加, 这些患者的血清在应用M亚基的抗体封闭法测定CK-MB活性时, 也可见所谓的“CK-MB”增高, 但实际是BB增高。CK-BB、巨CK、线粒体CK以及某些CK的变异体都不会被M亚基的抗体封闭, 这些均致CK-MB结果偏高。
免疫抑制法测定CK-MB活性的原理是, 通过抗CK-M抗体抑制M亚基的活性, 测定B亚基的活性, 正常血清中CK-BB含量极微[3], 用一般的方法检测不出, 故将结果乘以2便可大致代表CK-MB的活性。显然凡是可使CK-BB升高的疾病均可影响CK-MB的测定, 使其假性增高。
由于免疫抑制法测得CK-MB/CK>50%的患者血清CK总活性均<200 IU/L, 而电泳结果显示CK-MB含量并不高, CK-BB含量明显增高, 说明这些患者并无心肌损伤, 而是存在心外器官损伤。所以在CK总活性不高, 而免疫抑制法测得CK-MB明显增高时有必要对CK同工酶进行分析, 以判断CK-MB是否假性增高, 排除非心肌来源的可能[4]。
本试验在免疫抑制法测得CK-MB/CK>50%的标本中, 经CK同工酶电泳进一步分离后均出现CK-BB水平不同程度的升高, 同时在30份对照血清中未出现CK-BB含量增高。由于所选标本患者年龄均>6岁排除了胚胎期肝脏合成CK-BB增高的影响, 说明肿瘤患者血清中检出CK-BB的概率远大于正常人, 差别具有统计学意义 (P<0.01) , 符合肿瘤患者血清CK-BB升高可导致免疫抑制法测定CK-MB活性假性升高的说法。
摘要：目的 探讨肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 活性高于肌酸激酶 (CK) 总活性的原因。方法 免疫抑制法检测血清标本心肌型肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 、肌酸激酶 (CK) 活性, 计算二者比值。随机选取用免疫抑制法测定出现CK-MB活性高于总活性的30例患者血清、30例心肌梗死患者血清、30例健康体检者血清。对这三组标本同时用免疫抑制法测CK-MB、酶法测总CK;用电泳法分离各个组分, 由扫描仪对各条酶谱进行扫描。结果 CK-MB活性高于总活性的患者血清中在CK-MM、CK-MB中间多出一条区带, 为巨CK;或在CK-MM后面靠阴极端出现一条CK-MT区带。结论 对于CK-MB活性高于CK总活性的患者血清, 建议用其他方法进行复查, 避免假阳性对实验结果的影响。
关键词：免疫抑制法,血清肌酸激酶同工酶,肌酸激酶
参考文献
[1]潘柏中.美国临床生化科学关于冠心病时心肌标志物的应用建议.上海医学检验杂志, 2000, 15 (1) :5.
[2]黄忠耀, 朱洪生, 赵函芳.缺血-再灌注心肌诱导型一氧化氮合酶基因表达及其活性的变化和卡托普利的影响.福建医科大学学报, 2006, 40 (3) :207-210.
[3]张秀明, 李健斋, 侯振江, 等.现代临床生化检验学.人民军医出版社, 2001:135-140.
酶抑制快速检测法 篇5
1资料与方法
资料来源于上海市血液管理办公室的常规管理数据,包括2010—2013年上海市ALT快速检测仪的配置与使用、血液报废、ALT快速检测设备配置费用等数据。分析了ALT快速检测项目开展前后的血液报废率和报废量, 并根据血液报废量的变化和每人份血液采集和检验成本的估计值(220元 / 人份),分析ALT快速检测项目开展的经济效益。
2结果
2.1ALT快速检测仪配置与使用
项目开展前,上海市共有6台ALT快速检测仪,年采血前ALT检测数为3.67万人次 ;2011年上海市推广了采血前的ALT快速检测,购置了78台ALT快速检测仪,年采血前ALT检测数上升至26.70万人次 ;至2013年11月, 上海市ALT快速检测仪配置数达160台,1—11月采血前ALT检测人数达37.25万人次,是2010年全年检测人次数的10.15倍(表1)。
2.2项目开展前后血液报废分析
2011年项目开展后,上海市因ALT不合格而报废的血液量明显降低(表2)。
注 :2013 年数据截止至2013年11月
注 :2013 年数据截止至2013年11月
2.3项目开展的经济效益
以2010年上海市各采供血机构的血液报废率估计, 上海市如果未开展采血前ALT快速检测项目,2011年、 2012年和2013年因ALT快速检验不合格造成的血液报废数较相应年份实际数减少血液报废数分别为9 698人份、 1.40万人份和1.55万人份。
此外,按每人份血液的采集和检验成本220元计算, 2011年、2012年和2013年上海市因ALT快速检测项目的开展而节约的血液采集经费分别为213.36万元、308.59万元和341.70万元,合计863.65万元。
2011—2013年154台ALT快速检测仪及相关耗材的购置费用共882.42万元,平均每台ALT快速检测仪及其基本试剂与耗材的购置费为5.73万元。2011—2013年因ALT快速检测仪的推广应用而节约的采血经费与购置费之比为0.98。若考虑ALT快速检测仪的使用寿命为5年, 则此比例将进一步增加(表3)。
3讨论
3.1ALT快速检测明显减少血液浪费
血液是一种特殊的宝贵资源。在运用现代科学技术也无法合成其替代品的今天,从健康的献血者身上采集血液是获得临床所需血液的唯一途径。如何保障采集血液的质量,减少血液报废,对减少献血者负担、减少血液浪费具有重要意义。调查显示,2010—2013年上海市ALT快速检测仪增加了26.67倍,ALT检测数增加10.15倍,血液报废率从7.13% 降低至1.96%,血液报废数减少1.93万人份(降低23.80%)。国内多个地区的相关调查结果均表明,ALT快速检测能够明显降低血液报废率[6,7,8,9]。因此, 采用ALT快速检测法对无偿献血志愿者进行初筛,能够更高效地采集血液,避免血液资源的浪费。
* :2013年数据截止至2013年11月 ; ** :以 2010 年上海市各采供血机构血液报废率估计项目不开 ; *** :当年度估计的血液报废数减去实际的血液报废数
3.2ALT快速检测有良好的经济效益