还原酶抑制剂

还原酶抑制剂（共7篇）

还原酶抑制剂 篇1

1 材料

1.1 试剂和仪器

DMEM细胞培养液、小牛血清、胰蛋白酶购自Hyclone公司, MTT购自Sigma公司, β-拉帕醌购自Selleck公司;Bcl-2、Bax一抗购自Cell Signaling公司。

1.2 细胞培养

T47D细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液内, 置于37℃培养箱中培养。细胞单层贴壁生长至70%~80%融合时, 以0.25%胰蛋白酶消化、传代。

1.3 实验分组

对照组;β-拉帕醌高 (8umol/L) 、中 (4umol/L) 、低 (2umol/L) 剂量组。

2 方法

2.1 细胞增殖抑制实验

取对数增殖期细胞接种于96孔培养板, 贴壁后给药, 分别培养24、48、72 h。加入预先配制的MTT液50u L, 37℃继续孵育4 h。加入150u L DMSO后, 在波长490 nm处测定各孔光吸收值 (A) , 按下列公式计算细胞增殖抑制率:

2.2 蛋白印迹法检测凋亡蛋白的表达

提取各组细胞蛋白, SDS-PAGE分离, 电转并5%脱脂奶粉封闭, 加入一抗4℃反应过夜;二抗室温反应60 min;ECL增强发光。以actin蛋白作内参照, 图像分析软件进行半定量分析。

2.3 统计学处理

用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 细胞的增殖抑制作用

MTT检测结果显示, β-拉帕醌分别作用T47D细胞24、48和72h后, 细胞增殖速度下降明显, 结果见表1。

3.2 凋亡相关蛋白的表达

蛋白印迹检测结果显示, 用药组细胞bcl-2表达明显下降, 而bax蛋白表达明显增加, 用药组bcl-2/bax比值明显降低, 见图2。

4 讨论

凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中, 与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系。因此, 诱导瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一个新热点。本实验中MTT结果显示β-拉帕醌对乳腺癌细胞T47D的增殖具有明显的抑制作用, 并具有量效关系。

凋亡的过程受到多基因调控。Bcl-2和Bax是一对凋亡相关调控基因, Bcl-2主要通过与其家族成员Bax形成二聚体而发挥作用, 当Bcl-2表达量较高时, Bcl-2和Bax形成异源二聚体而抑制凋亡;当Bax表达较高时, bax之间形成同源二聚体而促进凋亡。在本实验中, 用药组Bcl-2蛋白表达则明显减弱, Bax蛋白表达明显增强, Bcl-2/Bax比值明显降低, 说明β-拉帕醌可有效诱导乳腺癌细胞凋亡, 这可能是抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。

摘要：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。研究表明, 乳腺癌的增殖及耐药是导致患者死亡的主要原因。因此, 明确乳腺癌的发生发展机制, 寻找有效的治疗靶点是延长乳腺癌患者生存时间的关键。最近研究表明, 醌氧化还原酶在多种肿瘤中表达异常增高, 并与肿瘤的不良预后密切相关。本研究通过在乳腺癌细胞株T47D中给予醌氧化还原酶抑制剂β-拉帕醌, 观察其对乳腺癌细胞增殖作用的影响, 并探讨可能的分子机制。

关键词：乳腺癌,细胞,蛋白

参考文献

[1]石建伟, 唐智柳, 蔡美玉.2008~2012年我国女性乳腺癌流行状况的系统性综述.中国妇幼保健, 2014, 29:1622-1626.

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还原酶抑制剂 篇2

关键词：他汀类药物,调节血脂,销售金额,用药分析

随着生活水平的提高和生活方式的改变, 我国居民血脂异常的发生率也呈现逐渐升高的趋势。对患有心血管疾病的患者来说, 脂质代谢紊乱是一个危险的因素[1]。他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-Co A) 还原酶的抑制剂, 能够有效地减少肝脏内胆固醇的合成, 减慢动脉粥样硬化 (AS) 进程, 减少心血管事件的发生率, 是目前应用最广泛的调脂药物。除了能够显著降低胆固醇的作用外, 他汀类药物还被发现具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用, 对多种疾病的防治有益[2]。

目前, 我院常用于临床的他汀类药物包含以下几种:辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和氨氯地平阿托伐他汀。为了解本院他汀类药物的应用情况和发展趋势, 特收集2010~2014年云南省第一人民医院用药情况进行统计分析, 为临床合理用药及规范化管理提供参考依据, 现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究资料来源于医院信息管理系统 (HIS) , 提取2010~2014年他汀类药物的出库记录, 对药品通用名、商品名、规格、剂型、年出库量、年销售金额进行统计处理。

1.2 方法

1.2.1 调查方法。

采用金额排序法、DDDs排序法、B/A法进行统计分析。

1.2.2 指标分析。

(1) 药品的限定日剂量 (defined daily dose, DDD) , 参照第17版《新编药物学》、2015年版《中国人民共和国药典》及药品说明书中推荐的成人平均日剂量标准; (2) 药物用药频度 (DDDs) , DDDs值越大表明该药的使用频度越高, 临床对该药的选择性越大。药物的消耗量以同一品种不同规格相同厂家均折算成同一单位后求和计算; (3) 限定日费用 (defined daily dose consumption, DDDc) , DDDc数值越大, 表明患者的经济负担越重; (4) 同步性指标B/A, 序号比值可以反映出购药金额与用药人次是否同步, 比值接近1, 表明同步性好;比值<1, 表明药品价位较高, 用药频度相对较低;比值>1, 表明药品价位较低, 用药频度相对较高。

2 结果

2.1 他汀类药物DDD值及日用药金额

统计完成后, 发现我院各他汀类药物的日用药金额区间为[2.84, 14.31], 日均费用分布合理, 这给患者和临床医生增加了选择的机会。DDDc=药物的年销售金额/该药DDDs, 详见表1。

2.2 他汀类药物的销售情况

我院的他汀类药物品种比较稳定, 药物的应用情况具有明显的选择性。统计结果显示, 2010~2014年阿托伐他汀钙 (J) , 瑞舒伐他汀钙 (J) 的年消耗数量和销售金额均处于领先地位, 且销量在不断增加, 在他汀类药物应用中占有主导地位;氟伐他汀钠 (J) 年消耗量较大, 基本稳定在第三位, 但是在5年间, 其销量不断减小, 所占比例也在不断减小;普伐他汀钠销量和市场占有率均较小, 并且在2013年后逐年降低;瑞舒伐他汀钙、氨氯地平阿托伐他汀钙 (J) 从2013年应用开始增加, 并且增长较快。2014年他汀类药物各药的销售情况差距在进一步拉大, 药品选择性明显增强, 详见表2及图1。

2.3 他汀类药物的DDDs及其排序

DDDs与药物的销量具有相关性, 其变化情况与药物的销售情况相似。DDDs=某药年消耗总量/该药DDD值 (表3) 。

2.4 他汀类药物的同步性分析

我院他汀类药物的排序的比值基本接近1, 同步性较好, 说明药物使用较为经济合理。B/A=药品使用金额排序/药品DDDs排序, 详见表4。

2.5 进口与国产他汀类药物使用情况

我院2010~2014年他汀类药物的销售中, 进口药物占主要比重。详见图2及表5。

3讨论

3.1他汀类药物销售情况

我院应用他汀类药物数量呈逐年上升的趋势, 年平均增长率为20%, 其中2011年增长率最高, 为30%。总体来说, 增长速度较为平稳, 说明目前本地高血脂症、心血管疾病的发病率仍有上升, 另一方面, 随着生活质量的提高, 人们更加关注自身的健康问题, 倾向于通过药物治疗来改善高血脂症, 预防心血管事件的发生。

从进口药与国产药的销售情况来看, 我院国产他汀类药物应用较少, 且销售量逐年降低, 与之相反, 进口药的应用增加, 且占有比重较高。进口他汀类药物的价格较国产高, 但从药物质量管控、安全性、使用疗效等方面来说, 进口药物相比之下更有优势。目前人们生活收入增加, 生活水平提高, 实际应用中更注重疗效的医生在患者没有经济压力的情况下也会推荐使用进口药品。

3.2各他汀类药物的特点分析

他汀类药物的降脂作用为:主要降低总胆固醇 (TC) 和低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 水平, 兼有降低甘油三酯 (TG) , 以及不同程度地提高高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 水平。在相同剂量下, 降低LDL-C的作用强弱为:瑞舒伐他汀>阿托伐他汀>辛伐他汀>普伐他汀>氟伐他汀[3]。

阿托伐他汀是一种新合成的他汀类降脂药物, 其显著的优点是半衰期长、调脂作用强, 可在较短时间内降低心血管事件发生率。主要通过CYP3A4酶系代谢, 而临床上通过CYP3A4酶系代谢的药物较多。此外CYP3A4酶抑制剂 (大环内酯类抗生素、环孢素、钙拮抗剂等) 和CYP3A4诱导剂 (苯巴比妥、利福平、地塞米松等) 均可能对阿托伐他汀的作用产生影响, 引起不良反应[4]。因此在临床使用过程中, 应重视药物之间的相互作用、适当剂量的使用及个体差异性。同时, 由于是亲脂性药物, 主要通过肝脏代谢, 因此对肝脏损害的风险增加。相对的, 因其通过肾脏排泄仅2%, 而适用于肾功能减退的患者。阿托伐他汀以其作用时间长, 降脂效果显著, 在我院应用较多, 临床医生倾向于该药作为首选方案。

瑞舒伐他汀的突出优势在于其降低LDL-C的性能———能以较小的剂量达到更低的LDL-C水平。生物利用度为20%, 相比阿托伐他汀较高。由于是亲水性他汀类药物, 仅部分经CYP2C9代谢, 大部分以原形排出 (90%) [5]。因此可以避免CYP4503A4介导的药物相互作用, 理论上更适于合并多种疾病接受多种药物治疗的患者。瑞舒伐他汀不仅降脂效果好, 研究显示长期使用还能够逆转动脉粥样硬化、促进粥样斑块消退、降低心血管事件的发生率和死亡率[6], 是目前最具潜力的他汀类药物。在我院他汀类药物的应用中也占有重要比重, 用药量逐年增长。

辛伐他汀作为霉菌代谢物中提取物洛伐他汀的结构改造产物[7], 药品价格便宜, 有较好的成本优势;亲水性的普伐他汀不通过CYP4503A4代谢, 与其他药物的相互作用较少。这两种药在我院他汀类药物的应用中所占比例较小, 原因主要是无明显优势, 被阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等取代。

氟伐他汀主要通过CYP2C9代谢, 且不是P-糖蛋白底物, 与其他药物相互作用较少, 并发症发生率低[3], 因其安全性优于其他他汀类药物而被称作“温柔的他汀”。5年中该药销售金额、DDDs均呈下降趋势, 虽然氟伐他汀疗效不及其他他汀类调脂药, 但不良反应发生率低、药品价位低是其优势所在, 仍会占有一定的销售份额。

氨氯地平阿托伐他汀是临床上首个用于治疗高血压合并高胆固醇的心血管系统复方制剂, 氨氯地平降血压, 阿托伐他汀降血脂, 较单独使用, 二者联用协同作用更强, 主要适用于高血压合并高血脂的老年患者[8]。该药日均费用较高, DDC为14.31, 可能受价格影响, 也可能与医师的用药习惯有关, 目前其应用不多, 预计其未来市场较乐观, 占有率将继续稳步上升。

通过以上调查研究发现, 我院他汀类药物品种使用及价格分布基本合理, 给患者和临床医师增加了选择的机会。就统计结果来看, 2010~2014年他汀类药物的销售金额和使用频次以进口阿托伐他汀钙、瑞舒伐他汀钙为主, DDDc相对较高;疗效好、价格低的国产瑞舒伐他汀得到医师和患者的肯定, 销售额在不断上升, 具有良好的发展趋势。临床医生应根据病人的具体情况及各类药物的不同特点, 合理选择药物, 以保证患者用药的安全、合理、有效。

参考文献

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[7]陈新谦, 金有豫, 汤光.新编药物学[M].第17版.北京:人民卫生出版社, 2011:420.

芳香化酶抑制剂与骨质疏松症 篇3

芳香化酶是类固醇激素代谢过程中的一种关键酶, 它能将雄激素的A环芳香化, 脱去19位的C原子, 并将1位的羰基转化为羟基, 催化雄烯二酮和睾酮等雄激素转化为雌酮和雌二醇。绝经后妇女体内的雌激素主要是靠外周脂肪组织和肾上腺的芳香化酶将雄激素转化而成。雌激素可以维持骨量和降低骨折发生的风险 [1,2], 但乳腺局部的雌激素增高将增加乳腺癌的发病概率。有研究表明2/3的乳腺肿瘤组织具有芳香化酶活性并在局部生成雌激素[3], 刺激乳腺癌细胞的增殖, 致使乳腺癌组织生长[4]。芳香化酶抑制剂 (aromatase inhibitors, AIs) 可通过抑制外周组织芳香化酶活性以降低循环血中的雌激素水平, 还可直接阻断乳腺肿瘤局部的雌激素产生。但有研究指出, AIs可使绝经前妇女的卵巢体积增大甚至产生卵巢囊肿, 是由于AIs减弱了雌激素对垂体的负反馈而使促性腺激素的分泌增加所致 [5]。所以AIs更多地被用于治疗绝经后妇女的乳腺癌。

根据酶结合位点和对芳香化酶作用的不同, AIs分为2类, 甾体类 (底物位点结合类型Ⅰ) 和非甾体类 (血红素结合类型Ⅱ) 。甾体类AIs是雄烯二酮的类似物, 可与芳香化酶分子上的类固醇结合位点不可逆性结合;非甾体类AIs不具有类雄激素的结构, 与血红素呈可逆性结合[6]。

据给药途径和药效的不同, 目前有三代的AIs (表1) 。第三代的AIs因药物毒性小、用药方便, 逐渐取代了前2代用于乳腺癌的辅助治疗[3]。其中, 非甾体类的阿那曲唑 (anastrozole) 和来曲唑 (letrozole) 以及甾体类的依西美坦 (exemestane) , 都可作为他莫昔芬后的二线用药, 治疗雌激素受体阳性的转移性乳腺癌。由于使用AIs后会使绝经后妇女的低血雌激素水平再行降低, 甚至降低80%～90%, 而且AIs作为辅助用药治疗早期乳腺癌疗程一般至少2～5年, 其对骨骼势必带来不利影响。

2 AIs对于健康妇女骨骼的影响

绝经是妇女骨质疏松的危险因素之一, 而骨质疏松会导致骨强度下降, 骨折风险增加。绝经后患乳腺癌的妇女更是骨质疏松的高危人群, 因为对于乳腺癌的很多治疗都会增加骨质疏松的患病风险, 如化疗、卵巢摘除和AIs的使用。

在妇女绝经后, 循环血中依然有较少的雌激素是通过外周组织经芳香化酶的作用将雄激素转化而来, 如肌肉、皮肤和脂肪组织[7,7]。AIs的使用可使骨转换水平升高, 几项对于健康绝经后妇女的研究都观察到了相似的结果[2,8,9], 但不同种类的AIs对骨转换指标的作用有一定差别, 不排除与相对较短的持续时间 (≤6月) 和较少的研究样本量等有关。

最近, 一个开放、随机、多中心的药效学研究比较了3种AIs。102名健康绝经后妇女的志愿者被随机地给予阿那曲唑 (1 mg/d) 、来曲唑 (2.5 mg/d) 或是依西美坦 (25 mg/d) , 持续24周。24周后观察到3种药物均使骨转换指标增加, 但三者之间无显著的统计学差异[10]。

这些研究结果喻示, 甾体类和非甾体类AIs均会导致绝经后妇女骨转换增加。将其用于治疗乳腺癌可能会加速骨量丢失并增加骨折发生率。

3 AIs用于乳腺癌治疗时对骨骼的影响

目前公布的关于AIs辅助性治疗绝经后妇女乳腺癌的大型临床研究主要有以下几个 (表2, 3) :阿那曲唑和他莫昔芬单独或联合用药 (arimidex or tamoxifen alone or in combination) 的ATAC研究[11];澳大利亚乳腺癌和结直肠癌研究组 (Austrian breast and colorectal cancer study group) 的ABCSG-8研究[12];阿那曲唑和他莫昔芬 (Arimidex-Nolvadex 95) 的ARNO研究[12];加拿大临床试验研究组 (Canada clinical trials group) 的 MA-17 研究[13];乳腺癌国际研究组 (breast international group) 的BIG 1-98 研究[14];国际依西美坦研究组 (intergroup exemestane study) 的IES研究[15]。

在ATAC, ARNO/ABCSG-8, BIG 1-98以及MA-17 研究中都观察到, 与对照组相比, 非甾体类AIs (阿那曲唑或来曲唑) 的治疗使受试者骨密度 (BMD) 降低, 骨折发生率明显增加或有增加的趋势, 新诊断的骨质疏松症也更多。其中ATAC的亚组随访研究显示, 在使用阿那曲唑1 mg治疗12月时, 骨转换的生化指标就有改变, 其中反映骨吸收的尿 Ⅰ 型胶原交联氨基末端肽 (NTX) 增加了16.0%, 反映骨形成的骨特异性碱性磷酸酶 (BSP) 增加了22.5%。这也证实了阿那曲唑降低BMD是由于增加了骨转换。

使用甾体类AIs (依西美坦) 的IES研究结果显示, 依西美坦后续治疗组的骨折更频繁, 尽管与他莫昔芬连续治疗组相比并无统计学差异 (3.1%比2.3%, P>0.05) , 而且依西美坦后续治疗组比他莫昔芬持续治疗组新诊断的骨质疏松症也更多。最近发表的关于IES骨骼评估亚组的研究[16]发现在6月的时候, 依西美坦组脊柱的骨量丢失就明显高于他莫昔芬组 (2.67%比0.24%, P<0.01) , 到了12月2组的BMD分别降低了3.17%和0.19% (P<0.01) , 髋部的BMD也有类似的结果。尽管依西美坦具有类雄激素结构和可能的促男性化作用, 但其对乳腺癌病人的骨骼并没有保护效应。

需要指出的是, 在对AIs 作为辅助治疗的效果进行观察时, 大部分的研究都采用了他莫昔芬作为对照。他莫昔芬为非固醇类雌激素受体调节剂, 其结构与雌激素相似[17], 常用于治疗雌激素受体阳性的乳腺癌, 已有研究显示该药对骨骼具有保护作用。在一个历经7年的大规模乳腺癌一级预防的随访研究中指出, 他莫昔芬可以将脊柱、髋部和桡骨远端的骨折发生率降低32%[18]。因此, AIs对于骨量丢失和骨折发生率的影响, 也可能由于使用了他莫昔芬作为对照而变得明显了。同样的, 在序列研究或交叉设计研究中, 使用他莫昔芬后接着使用AIs, 前者的撤药反应可能也会影响骨量丢失和骨折发生率。

4 使用AIs引起骨量丢失的治疗

已经有大量临床试验证实AIs的使用会引起BMD的降低和骨折危险性增加。美国临床肿瘤学会 (American society of clinical oncology, ASCO) [19]已经发表了关于监测和治疗乳腺癌妇女骨量减少的指南, 指南中提到, 有骨质疏松高风险的乳腺癌病人需要定期进行BMD的检查。对于长期使用AIs而引起骨量丢失的病人, 可以采取以下几个方面的措施:

4.1 建立一套良好的生活方式 如规律锻炼, 增加户外活动, 预防跌倒等。

4.2 每日补充足够的元素钙和维生素D ASCO的指南推荐不管是具有高或低的骨质疏松危险的乳腺癌妇女, 都需要补充足量的钙和维生素D。

4.3 使用双膦酸盐 双膦酸盐是一种抑制骨吸收的药物, 可以抑制破骨细胞的活性, 减少骨量丢失。对于绝经后妇女的骨质疏松是一种疗效肯定的药物。对于因癌症治疗而引起的骨质疏松, 有许多研究都显示了其对于保持骨量和防治骨质疏松方面的有效性。而针对那些肿瘤治疗引起的快速的骨丢失, 静脉注射的双膦酸盐比口服的耐受性和依从性更好, 如唑来膦酸 (zoledronic) 。已有的研究结果显示, 静脉使用唑来膦酸可以预防AIs引起的骨量丢失, 并且可使脊柱和全髋的BMD增加, 骨转换指标降低[20,21]。但关于最佳的用药剂量, 目前还没有确定。

5 总结

还原酶抑制剂 篇4

1 可逆复合抑制剂抑制率方程式的推导

1.1 两种竞争性抑制剂复合作用

酶可逆竞争性抑制剂的结构与底物相似, 与底物竞争酶的活性中心, 由米氏方程$\nu =\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m+[S]}$较容易推导出单一竞争性抑制剂作用的速度方程为:$\nu =\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m(1+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A})+[S]}$。其抑制率为[2]:

$i=1-\frac{\nu }{Vm}=1-\frac{\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m(1+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A})+[S]}}{\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m+[S]}}=\frac{{\rm K}m\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}}$ (1)

(1) 式显示竞争性抑制剂的抑制率取决于抑制剂和底物的相对浓度。文中所用符号:Vm为最大反应速度, Km为米氏常数, KA、KB、KI为抑制剂的解离常数, [S]为底物浓度, [A]、[B]、[I]为抑制剂浓度, i为抑制率。

由King-Altman法推导出两种竞争性抑制剂A、B的混合作用的速度方程为[3]:

$\nu =\frac{Vm[S]}{{\rm K}m(1+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[B]}{{\rm K}{}_B})+[S]}$

复合抑制率:

$\begin{array}{l}i=1-\frac{\nu }{Vm}=1-\frac{\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m(1+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[B]}{{\rm K}{}_B})+[S]}}{\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m+[S]}}\\ =\frac{{\rm K}m\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[B]}{{\rm K}{}_B}}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m(\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[B]}{{\rm K}{}_B})}(2)\\ =\frac{{\rm K}m\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}}{({\rm K}m+[S]+{\rm K}m\frac{[A]}{{\rm K}{}_A})+{\rm K}m\cdot \frac{[B]}{{\rm K}{}_B}}\\ +\frac{{\rm K}m\frac{[B]}{{\rm K}{}_B}}{({\rm K}m+[S]+{\rm K}m\frac{[B]}{{\rm K}{}_B})+{\rm K}m\cdot \frac{[A]}{{\rm K}{}_A}}(3)\end{array}$

1.2 两种非竞争性抑制剂复合作用

非竞争性抑制剂与酶活性中心外的部位结合。单一非竞争性抑制剂作用的动力学速度方程为:

$\nu =\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m(1+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}})+[S]\cdot (1+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}})}$

其抑制率为[2]:$i=\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}+[{\rm I}]}$ (4)

(4) 式显示抑制率与底物浓度无关, 只与抑制剂浓度有关。由King-Altman法推导出两种竞争性抑制剂I1、I2复合作用的动力学速度方程为[3]:

$\nu =\frac{Vm[S]}{{\rm K}m(1+\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}+\frac{[{\rm I}{}_1][{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}})+[S](1+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}+\frac{[{\rm I}{}_1][{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}})}$

复合抑制率:

$\begin{array}{l}i=1-\frac{\nu }{Vm}=\frac{({\rm K}m+[S])(\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}})+[S]\cdot \frac{[{\rm I}{}_1][{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}{({\rm K}m+[S])(1+\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}})+[S]\cdot \frac{[{\rm I}{}_1][{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}\\ =\frac{\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}+\frac{[S]}{{\rm K}m+[S]}\cdot \frac{[{\rm I}{}_1][{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}{(1+\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}})+\frac{[S]}{{\rm K}m+[S]}\cdot \frac{[{\rm I}{}_1][{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}(5)\end{array}$

若两种非竞争抑制剂作用于同一位置, 抑制剂之间存在竞争关系, 则无$\frac{[{\rm I}{}_1][{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}$项, 则 (5) 式简化为:

$\begin{array}{l}i=\frac{\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}}{1+\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}+\frac{\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}{1+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}\\ =\frac{[{\rm I}{}_1]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}+[{\rm I}{}_1]+[{\rm I}{}_2]\cdot \frac{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}}+\frac{[{\rm I}{}_2]}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}+[{\rm I}{}_2]+[{\rm I}{}_1]\cdot \frac{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_2}}{{\rm K}{}_{{\rm I}{}_1}}}(6)\end{array}$

1.3 一种竞争性抑制剂A和一种非竞争性抑制剂I复合作用

由King-Altman法推导出一竞争抑制剂A和一非竞争性抑制剂I复合的动力学速度方程为[3]:

$\nu =\frac{Vm[S]}{{\rm K}m(1+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}}+\frac{[A][{\rm I}]}{{\rm K}{}_A{\rm K}{}_{{\rm I}}})+[S](1+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}})}}$

复合抑制率为:

$\begin{array}{l}i=1-\frac{\nu }{Vm}=1-\frac{\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m(1+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}}+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}\cdot \frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}}}}{+[S](1+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}})\frac{Vm\cdot [S]}{{\rm K}m+[S]}}\\ =\frac{{\rm K}m\cdot \frac{[A]}{{\rm K}{}_A}}{(1+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}})\cdot ([S]+{\rm K}m(1+\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}))}+\frac{[{\rm I}]}{{\rm K}{}_{{\rm I}}+[{\rm I}]}(7)\end{array}$

2 讨 论

(1) 、 (4) 式显示, 竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂单独作用时, 若底物浓度一定, 以抑制率对抑制剂浓度作图, 均为过原点的双曲线。两种竞争性抑制剂复合时, 底物浓度一定, (2) 式以抑制率i对[A]、[B]双变量作三维图, 图形为曲面形式。当[A]=0或[B]=0时, 抑制率对抑制剂浓度作图分别为i-[B]和i-[A]面上的一条双曲线;若A、B的比例一定, 可令[B]=n[A], 则式 (2) 可简化为$i=\frac{{\rm K}m(\frac{1}{{\rm K}{}_A}+\frac{n}{{\rm K}{}_B})[A]}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m(\frac{1}{{\rm K}{}_A}+\frac{n}{{\rm K}{}_B})[A]}$, 仍是过原点的一条双曲线的形式。

两种抑制剂按一定比例复合作用时, 不考虑相互间发生化学反应对各自有效浓度的影响, 抑制剂间的相互作用可分为简单相加、相互拮抗和相互协同三种效应, 可通过实验确定[4,5]。复合抑制剂对酶活性抑制的简单相加效应并不能理解为两种抑制剂独立作用时抑制率的数学加和。从形式上看, 三种复合抑制剂混合推导的复合抑制率公式 (3) 、 (6) 、 (7) 有一定特点, 公式可分为两项式的相加, 每项主要表现为各自单一抑制剂独立作用的抑制率形式, 但有另一抑制剂的因素加参入, 并不是各自抑制率的简单相加。可以用下面的例子形象地说明, 当某种竞争性抑制剂的浓度为[C]时, 相应的抑制率为$i=\frac{{\rm K}m\cdot [C]}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m\cdot [C]}$, 若将两次浓度分别为[C]的此抑制剂混合, 这时的复合抑制率并不等于$2i=\frac{2{\rm K}m\cdot [C]}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m[C]}$, 而是$\frac{2{\rm K}m\cdot [C]}{{\rm K}m+[S]+2{\rm K}m\cdot [C]}$;

若这两种竞争性抑制剂分别为A和B, 其复合的相加效应的抑制率等于$\frac{{\rm K}m\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[B]}{{\rm K}{}_B}}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m(\frac{[A]}{{\rm K}{}_A}+\frac{[B]}{{\rm K}{}_B})}$, 而非

$\begin{array}{l}\frac{{\rm K}m\cdot \frac{[A]}{{\rm K}{}_A}}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m\cdot \frac{[A]}{{\rm K}{}_A}}+\\ \frac{{\rm K}m\frac{[B]}{{\rm K}{}_B}}{{\rm K}m+[S]+{\rm K}m\cdot \frac{[B]}{{\rm K}{}_B}}\end{array}$

。换而言之, 两种竞争性抑制剂复合作用的相加效应的抑制率变化趋势应符合公式 (3) 的描述。A、B若为两种非竞争性抑制剂, 则相加效应的抑制率符合式 (5) ;A、B为一竞争性和一非竞争性抑制剂复合, 相加效应的抑制率符合式 (7) 。

事实上复合后抑制作用时并不都表现为相加效应, 由于各抑制剂可能通过与酶的结合而发生相互作用, 往往表现为协同效应或拮抗效应, 具体属于何种效应可由实验结果来评价。

摘要：从可逆抑制剂复合作用的酶反应动力学方程, 推导出两种竞争性抑制剂、两种非竞争性抑制剂、一种竞争性和一种非竞争性抑制剂的复合作用对酶活性的抑制率计算方式, 并对复合抑制作用的特点进行了分析。

关键词：酶,复合抑制剂,抑制率,计算方法

参考文献

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[3]孙凤祥, 赵冸梅, 任维栋.激活剂与不同类型抑制剂同时存在对血管紧张素转化酶催化反应影响的探讨[J].数理医药学杂志, 2003, 16 (2) :157-159.

[4]刘瑾.等高线图解分析法:评价药物相互作用的方法[J].国外医学药学分册, 2006, 33 (6) :459-461.

脲酶抑制剂在奶牛养殖中的应用 篇5

1 乙酰氧肟酸 (AHA) 型脲酶抑制剂

从20世纪70年代开始, 人们对乙酰氧肟酸 (AHA) 型脲酶抑制剂的研究逐渐增多;但其作为饲料添加剂的使用才是近几年的事。中国农业科学院畜牧所王加启博士首次在国内合成了纯度在80%以上的AHA, 并在全国范围内推广和应用, 取得了明显效果。但在国外对AHA在生产中应用的效果仍存在着很大争议, 至今没有批准作为饲料添加剂使用。

国内自王加启在实验室条件下成功地合成了AHA以来, AHA在反刍动物上的应用效果研究日益增多。周建民[3]用脲酶抑制剂作为奶牛日粮添加剂, 结果表明:与对照组比较, 添加20 mg/kg组产奶量增加11.6%;添加25 mg/kg组效果最佳, 产奶量提高16.7%, 瘤胃内的氨浓度降低56.8%, 粗蛋白质用于合成菌体蛋白质的利用效率提高16.7%;添加30 mg/kg组产奶量提高10.5%。

黄根新等[4]应用以脲酶抑制剂为核心的预混料饲喂奶牛, 结果表明:脲酶抑制剂预混料对单产7 000~7 500 kg的奶牛有增产作用, 产奶量增幅为每天每头1.0~2.1 kg, 投入产出比为1∶2.70;此外在热应激条件下, 试验组每头奶牛每天产奶量比对照组少下降1.53 kg。

王淑香等[5]报道:添加20, 25, 30 mg/kg AHA使奶牛产奶量分别提高11.6%、16.7%、10.5%;添加25 mg/kg时达到最佳产奶效果;当增加到30 mg/k时则不能进一步提高产奶量, 且有减少增产幅度的趋势。故25 mg/kg AHA对奶牛的增产效果最佳, 随着泌乳月份的增加对照组产奶量必然要下降。在不改变奶牛饲养管理方式和日粮配方的条件下, 每头奶牛1 d喂25 mg/kg脲酶抑制型添加剂的成本为0.70元, 能使每头奶牛增产3.6 kg, 按每千克1.40元计算奶价, 每头日增收入5.04元, 投入产出比为1∶7.2。

安正仑[6]在试验中将36头泌乳中期奶牛随机分成4组, 对照 (1) 组饲喂基础日粮, 试验 (2, 3, 4) 组分别在基础日粮 (干物质) 中添加20, 25, 30 mg/kg AHA, 试验期为30 d。结果表明:与对照组相比, 试验2, 3, 4组产奶量分别提高11.6%、16.7%、10.5%。故以25 mg/kg浓度添加AHA对奶牛的增产效果最佳。

2 苯磷酸二酰胺 (PPDA)

苯磷酸二酰胺 (PPDA) 是一种非常有效的土壤脲酶抑制剂, 在碱性条件下水解产生苯和磷酰胺, 后者对脲酶仍存在一定的抑制作用。PPDA分子结构中具有仲胺结构 (>N-H) , 可以提供活泼的氢, 使脲酶受到抑制。M.P.Bryant等[7]报道, PPDA对土壤脲酶的抑制作用只持续11 d, 说明这种脲酶抑制剂在土壤环境中的稳定性较差。E.R.Austin等[8]报道, PPDA在2~3 h迅速水解脱掉氨变成PPA, PPA在酸性条件下也不稳定, 最终降解为苯磷酸和氨。

PPDA对奶牛瘤胃发酵和血液生化指标的影响也有很多报道。J.Vogit等[9]将PPDA作为瘤胃脲酶抑制剂添加于奶牛日粮中, 结果在为期24周的试验中, 试验初期使用脲酶抑制剂可以使脲酶受到一定 (中等) 程度的抑制, 瘤胃氨浓度也随之降低;但由于瘤胃内环境突然变化, 使没有来得及适应的奶牛粗纤维消化率降低, 但1个月后, 这种影响不复存在。在整个试验期, 与对照组相比, 给奶牛每天喂给370, 740 mg PPDA产奶量没有多大变化, 血浆尿素氮、尿中尿素的排泄量也不受PPDA影响, 结论是使用PP-DA不能提高尿素氮利用率, 对奶牛的生产性能无改善作用。B.Piatkowski等以占尿素 (每100 kg体重饲喂给30 g) 0.5%或1.0%比例在奶牛日粮中添加PPDA, 结果在相同日粮组成下, 试验组和对照组在产奶量上没有显著差异。

3 Sarsaponin

Sarsaponin是一种生长在沙漠中的丝兰属植物 (Yucca) 中提取出来的天然产品。它有2种活性成分Sarsaponin和Smilagenin, 一个与氨结合, 另一个与硫化氢气体及其他有毒气体结合, 从而有效地减少畜禽粪便中这些有害气体向环境中排出。由奥特奇 (Alltech) 公司生产的除臭灵就是以Sarsaponin为主要成分。它具有提高厌氧微生物发酵能力的功效, 近几年广泛应用于反刍动物瘤胃营养调控, 在减少瘤胃中氨浓度过大方面, 与脲酶抑制剂有着相似的作用。美国DPI公司已开发出以Sarsaponin为主要成分的脲酶抑制剂产品 (Micro-aid) , 并广泛用作奶牛、肉牛、猪和肉仔鸡的非营养性添加剂。

在美国克罗拉多州、俄克拉荷马州和得克萨斯州的研究报告中显示, 使用饲料级脲酶抑制剂可以使瘤胃氨浓度降低22%, 使血清尿素氮 (BUN) 水平显著降低, 进而提高了早期泌乳奶牛的受胎率。大量研究证明, 奶牛生殖道黏液中尿素氮含量过高会导致不孕。尿素氮与奶牛的受胎率呈负相关, 使用商业化的脲酶抑制剂能够控制血清尿素氮水平, 以使奶牛繁殖率免受不良影响。J.Y.Kil等[10]用离体法测定了在培养液中添加0, 15, 30, 45 mg/d L Sarsaponin, 连续培养24 h后的氨产量, 结果随着Sarsaponin添加水平的提高, 氨浓度显著降低。

在奶牛体外瘤胃液试验中发现, 添加Yucca Sapanoin能显著降低甲烷产生量, 减少能量损失, 降低环境污染。通过对瘤胃气体生成量、菌体转化率、氨水平、原虫的评定, 得出Yucca Sapanoin可增加菌体生成量、减少气体 (CO2、CH4) 生成量、提高饲料转化率。

牛奶的产量和组成及泌乳期奶牛体重的变化也不受Sarsaponin的影响。体内和体外的试验结果并不完全一致。A.L.Goetsch等[11]在相同精粗比日粮条件下测定Sarsaponin对养分消化率和流通速度的影响, 结果在日粮中添加4 mg/kg Sarsaponin均可提高瘤胃有机物浓度、淀粉和氮消失率及流通速度, 同时增加这3种营养物质在全消化道的消化率, 但增加的幅度依精粗比的不同而有所不同。

F.R.Valdez等[12]研究表明, 在体外培养基质中添加0, 33, 55, 77 mg/kg Sarsaponin, 结果瘤胃细菌总数增加, 基质中酸性洗涤纤维消化率提高, 原虫数量减少。

4 氢醌 (hydroquinone, HQ)

氢醌 (hydroquinone, HQ) 是国内外普遍应用的土壤脲酶抑制剂, 是一种最简单的多元酚, 是难挥发物质, 具有相当大的蒸汽压。选用HQ作为瘤胃脲酶抑制剂的基本出发点是, 理论上进入动物体内微量HQ不应对瘤胃微生物和宿主动物产生毒害和积累, 对人类健康和环境不造成危害。HQ对奶牛瘤胃发酵、日增重、产奶量及相关血液指标等方面均有报道。李杰等[13]使用40 mg/kg HQ时, 结果绵羊瘤胃氨浓度降低45.50%~62.20%。张倩等[14]在豆饼型日粮条件下使用脲酶抑制剂, 结果奶牛日产奶量增加2.3~3.6 kg。左福元等[15]将泌乳量、胎次、泌乳月相近的18头中国荷斯坦奶牛分为3组, 1, 2, 3组分别饲喂精料补充料1, 2, 3, 其中精料补充料1含有11%豆饼, 精料补充料2, 3在等能等氮分别添加0.01%和0.02%HQ, 并用尿素取代精料补充料1中全部豆饼。结果表明:与对照组相比, 2, 3组奶牛泌乳量、乳脂率、血液尿素氮、日增重和增重校正标准乳均差异不显著, 平均日产奶量增加1.78~1.85 kg, 而且可节约蛋白质饲料资源;但2, 3组奶牛日增重和增重校正标准乳有提高的趋势。因此, 在奶牛饲养中适当应用HQ尿素对泌乳量无负效应, 而且可节约蛋白质饲料资源。

5 脲酶抑制剂应用的前景

在奶牛养殖中, 蛋白质是最短缺的一种营养物质, 据估计, 缺乏程度达40%左右。由于奶牛瘤胃代谢的特点, 不仅能利用饲料中的可降解蛋白质, 而且能利用非蛋白氮合成微生物蛋白质供机体利用。与天然蛋白质饲料相比, 尿素具有含氮量高、来源广泛、成本低的优点。对于瘤胃发育完全的奶牛, 只要适量使用尿素, 替代平衡日粮中可降解蛋白部分, 不会影响动物的生产性能, 并可大幅度降低饲料成本。

还原酶抑制剂 篇6

病例1:患者男, 59岁。因“反复头昏2年, 加重1周”, 拟诊为“高血压病”入院, 既往无痛风发作史。体检:血压180/100 mm Hg, 神志清楚, 心界不大, 心率70次/min, 主动脉第二心音亢进。查血肌酐106 μmol/L, 血尿酸534 μmol/L。诊断为“原发性高血压”。给予卡托普利片25 mg, 2次/d, 口服。服药1周后, 患者出现右足拇趾关节红肿, 剧痛, 夜间睡眠时加重。复查血尿酸526 μmol/L。给予秋水仙碱, 双氯芬酸钠等止痛治疗, 效果不佳。停用卡托普利后2 d, 肿痛消失。1周后换用蒙诺10 mg, 1次/d, 口服2 d再次出现右足拇趾关节疼痛。停用蒙诺, 更换三精司乐平后未再出现痛风发作。

病例2:患者男, 65岁。因“四肢肿痛2 d”而入院。患者有“高血压病”史10余年, 痛风病史5年。于发病前5 d服用“洛丁新10 mg”1次/d, 降压治疗。体检:血压150/90 mmHg, 四肢多关节可见痛风结节, 皮面红肿, 压痛。查血肌酐206 μmol/L, 尿素氮5.8 mmol/L, 血尿酸604 μmol/L。以秋水仙碱止痛效果不佳。停用洛丁新2 d后, 肿痛消退。再次应用洛丁新及换用蒙诺降压治疗, 均诱发痛风急性发作, 停药后好转。后换用“科素亚”未再出现疼痛。

2讨论

血管紧张素酶抑制剂 (ACEI) 是目前常用的降血压一线药物。尤其是合并冠心病, 轻度肾功能不全, 有明显的心肾保护作用, 痛风时常作为首选药物。ACEI诱发痛风发作目前少见报告。该组2例患者应用不同的ACEI类药物均诱发痛风发作, 停药后缓解, 可以肯定痛风与ACEI相关。依据病情发作血尿酸不升高, 甚至有下降趋势, 不似ACEI影响尿酸代谢作用。且应用血管紧张素Ⅱ拮抗剂无类似诱发作用。可能诱发因素为ACEI抑制激肽酶, 导致局部激肽类炎性介质升高, 导致痛风发作。ACEI作为目前痛风合并高血压病常用药物, 在临床用药过程中若出现痛风发作, 应考虑可能与ACEI有关, 应及时换用药物。

还原酶抑制剂 篇7

1 材料和方法

1.1 MTHFR特异性SiRNA真核表达载体PSiRNA-

MTHFR的构建及其在小鼠胚胎腭突MEPM(murine embryo palatal mesenchymal, MEPM)细胞中沉默效应的鉴定[10]

根据小鼠的MTHFR基因在GenBank (GenBank accession No. AK030192)中的cDNA序列设计SiRNA序列。使用BLAST(www.nebi. aim,nii.gov/BLAST/)排除SiRNA非特异性地抑制其他任何基因片段的可能,最后筛选出最佳的4条序列。根据LinSilenceTM试剂盒(Allele Biotechnology & Pharmaceutical公司)以半定量PCR筛选出最有效的一条SiRNA序列,构建到PSiRNA- neo质粒中(InvivoGin公司),经酶切、测序证实MTHFR基因沉默质粒构建成功,命名为PSiRNA- MTHFR。转染PSiRNA- MTHFR进入原代培养的MEPM细胞,转染48 h、5 d后,应用荧光实时定量PCR和Western blot从mRNA水平和蛋白水平检测其沉默效率。

1.2 将PSiRNA- MTHFR转染进原代培养的腭突MEPM细胞的最佳转染程序的筛选[11]

1.2.1 脂质体转染法

(1)转染前1 d,消化胰酶消化EPM细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%~95%。细胞铺板在2 ml含血清、不含抗生素的正常生长的培养基中。

(2)对于每孔细胞,使用250 μl无血清DMEM培养基稀释4.0 μg DNA(pEGFP- N1),轻轻混匀。

(3)使用前将Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)转染试剂轻轻混匀,用250 μl无血清DMEM培养基稀释10 μl Lipofectamine 2000转染试剂,轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后,在5 min内同稀释的DNA(pEGFP- N1)混合。

(4) 混合稀释的DNA(第二步)和稀释的Lipofectamine 2000(第三步)。室温放置20 min。

(5)(optional)将6 孔板中的旧营养液吸出,用无血清DMEM培养基清洗2 次。加入2 ml无血清DMEM配养基。

(6)直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。

(7)在37 ℃, 5% CO2中继续培养24~48 h。不去掉复合物或更换培养基。

(8)在细胞中加入复合物48 h后,荧光显微镜照相分析。

1.2.2 NucleofectorTM转染仪(Amaxa公司)转染法

(1)原代生长的EPM细胞密度为90%~95%时,消化胰酶消化细胞并计数,每个转染样本的细胞数达到1×106 个。CMF- PBS洗涤细胞1 次。

(2)弃去上清液,加入NucleofectorTM Kit V溶剂,使每个转染样本的终浓度为1×106 个细胞/100 μl。

(3)在15 min内将4 μg pEGFP- N1质粒DNA与100 μl细胞悬浮液混合。

(4)将混合液放入Amaxa certified cuvette中,避免混入气泡, 然后用瓶盖旋紧amaxa certified cuvette。

(5)将cuvette放入Amaxa NucleofectorTM转染仪的小孔中,根据EPM的细胞特性,以3 个样本分别选择A23、G16、U30程序进行转染。

(6)转染程序停止后,取出装有样本细胞的cuvette,用塑料吸管细心吸取每个样本转染后的细胞,分别移入6 孔板中的一个孔中。用500 μl 37 ℃预热的DMEM/F12带有10%FBS的完全培养基重悬细胞。

(7)在37 ℃, 5% CO2中继续培养48 h,荧光显微镜照相分析。

1.3 不同浓度叶酸对RNA干扰MTHFR基因后细胞增殖的影响

叶酸(Sigma公司)以RMPI- 1640培养基溶解后配制成不同浓度:1、 5、 10、 20、 50、 100 μg/ml,并加入10%FBS配制成不同叶酸浓度的RMPI- 1640培养基。应用Amaxa核转仪及最佳转染程序转染PSiRNA- MTHFR到原代培养MEPM细胞后,离心,去除原10%FBS+DMEM/F12培养基,分别以不同叶酸浓度的RMPI- 1640培养基重悬细胞,以5×103 个细胞/孔接种到96孔板。按不同的叶酸浓度分为6 组,每组接种6 个复孔。以10%FBS+RMPI- 1640培养基替换原培养基培养的MEPM细胞作为空白对照组,以RNAi后的未补充叶酸的以10%FBS+RMPI- 1640培养的MEPM细胞为试验对照组,接种到96 孔板。继续培养3 d后应用MTT法检测各组细胞增殖。

1.4 补充叶酸对RNA干扰MTHFR基因后MEPM细胞细胞周期的影响

以10%FBS+RMPI- 1640培养基及含20 μg/ml叶酸的10%FBS+RMPI- 1640培养基培养的RNA干扰MTHFR基因后的MEPM细胞以2×105 个细胞/孔接种到6 孔板。培养3 d后,收集2 组细胞,PI(BD公司)染色,流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。

2 结 果

2.1 MTHFR特异性SiRNA真核表达载体PSiRNA- MTHFR的构建及其在MEPM细胞中沉默效应的鉴定

在转染后48 h及5 d,PSiRNA- MTHFR均能显著性地抑制MTHFR基因mRNA水平和蛋白水平的表达。48 h EPM细胞MTHFR mRNA表达抑制率约88.67%,蛋白表达抑制率约84.71%; 5 d时EPM细胞MTHFR mRNA表达抑制率约79.97%,蛋白抑制率约78.33%。结果说明MTHFR基因SiRNA表达载体RNAi效果是特异性的,可以用来进行后续试验。

2.2 Nucleofector核转染仪转染原代培养的腭突MEPM细胞最佳转染程序的筛选

证实应用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂转染pEGFP- N1质粒到EPM细胞的转染效率极低,48 h转染率不到15%。而应用Nucleofector核转染仪的A23、G16、U30程序转染pEGFP- N1质粒到EPM细胞,转染后48 h,A23程序转染率最低,约42%;G16程序次之,约60%;U30程序最高,转染效率约92%。经试验验证,Nucleofector核转染仪U30程序是原代培养EPM细胞的最佳转染质粒的程序。

2.3 不同浓度叶酸对RNA干扰MTHFR基因后细胞增殖的影响

加入不同浓度的叶酸,MTHFR基因沉默后的MEPM细胞增殖有不同程度的改善。除1 μg/ml的叶酸补充外,其它浓度的叶酸补充均可以使RNA干扰MTHFR基因的MEPM细胞的增殖情况明显改善;20 μg/ml叶酸对MTHFR基因干扰的拮抗作用最强,其促进细胞增殖水平接近正常细胞,高及低于20 μg/ml浓度的叶酸未能增强转染细胞的增殖。因此,体外实验证明,20 μg/ml叶酸可以逆反MTHFR基因表达下调对MEPM细胞的不良影响,使MTHFR基因表达下调的MEPM细胞增殖接近MTHFR基因功能正常的细胞增殖水平。各组之间细胞增殖MTT检测结果如图 1。

2.4 MTHFR基因沉默前、后MEPM细胞周期及RNA干扰MTHFR基因后补充叶酸的MEPM细胞细胞周期分析

流式细胞仪检测结果显示,与MTHFR基因功能正常的细胞相比,较多的MTHFR基因沉默后MEPM细胞阻滞在G0/G1期。与MTHFR基因功能正常的细胞G0/G1期细胞相比, MTHFR基因沉默后G0/G1期的MEPM细胞比例的差异有显著性(P<0.05)。而MTHFR基因沉默后MEPM细胞在加入20 μg/ml叶酸后, G0/G1期的MEPM细胞显著减少, S期细胞增加。与MTHFR基因功能正常的细胞相比,G0/G1期的MEPM细胞比例差异没有显著性(P>0.05)。而MTHFR基因沉默后MEPM细胞在加入20 μg/ml叶酸后,与MTHFR基因沉默后MEPM细胞未加入20 μg/ml叶酸的MEPM细胞相比,G0/G1期的MEPM细胞比例差异没有显著性(P>0.05)(流式细胞仪细胞周期检测见图 2)。

3 讨 论

对于功能基因的研究,反义RNA抑制及基因敲除等反向遗传学手段是最常用的方法[9,12,13]。但这2 种方法都存在着缺陷,特别是当用于胚胎研究时,如基因敲除能从根本上完全消除目标基因活性,但可能不适用于研究特定基因在特定胚胎发育阶段的功能,包括一些控制发育与细胞分裂的基因与拷贝基因。同时,由于反义RNA技术对内源性基因表达的抑制较弱,往往产生一些过渡性表型,误导我们对目标基因功能的判断。最近出现的RNA干扰技术[14,15],为从反向遗传学角度研究胚胎发育过程中未知基因的功能提供了新的方法和思路。并且RNAi作用比反义RNA技术更有效[16],比基因敲除更省时[17]。本实验利用RNA干扰技术研究了MTHFR基因沉默对小鼠胚胎腭突细胞生长的影响,以及补充叶酸拮抗MTHFR基因沉默抑制MEPM细胞生长的作用机制,证明此方法应用于胚胎发育过程中基因功能的研究是可行的。

MTHFR基因对胚胎发育具有重要的作用,本研究发现MTHFR基因表达下调后,小鼠胚胎腭突MEPM细胞增殖明显减慢;流式细胞仪检测实验组凋亡率明显高于对照组。细胞周期检测表明MTHFR基因下调能减少MEPM细胞进入S期和G2期的细胞比例,细胞不能通过G1/S限制点而被阻滞在G1期,促进了凋亡的发生。补充叶酸的生理剂量(0.8 mg)时,流行病学研究并未发现先天性唇腭裂的发病率降低[18,19]。1982 年,Tolarova研究证实孕期每天补充高剂量的叶酸(10 mg)可以减少先天性唇腭裂的发生率[20],而最近的研究认为叶酸预防先天性唇腭裂具有剂量依赖性, 只有在补充高药理浓度叶酸 (每天6 mg) 的情况下,才可以有效的减少唇腭裂的发生[21]。本实验细胞水平补充的叶酸 浓度均可以改 善MTHFR基因沉默后

A为实验组:MEPM细胞MTHFR基因沉默后补充20 μg/ml叶酸; B为实验对照组:MEPM细胞MTHFR基因沉默后未补充叶酸; C为对照组:MTHFR基因功能正常MEPM细胞

MEPM细胞的生长情况, 其中补充叶酸浓度为20 μg/ml时,对MTHFR基因沉默后MEPM细胞的生长改善最大,基本与干扰前细胞生长情况相同。实验中采用了不含叶酸的RPMI- 1640培养基,避免了高叶酸含量的DMEM/F12培养基对实验的干扰。在随后的细胞周期研究中,在补充20 μg/ml的叶酸后,G1期的细胞明显减少,表明细胞增殖力增加。

本研究表明,MTHFR基因酶活力下降可以使MEPM细胞生长减慢并促进凋亡,而补充叶酸可以消除MTHFR基因沉默的不良影响。本实验也证实,MTHFR基因是腭裂发生的重要遗传因素,而补充合适剂量的叶酸可以维持MEPM细胞的正常增殖。

摘要：目的:探讨叶酸补充拮抗5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因下调的作用机制。方法:MTT法检测叶酸梯度补充后拮抗MTHFR基因功能下调对细胞增殖的影响;流式细胞仪分析MTHFR基因功能下调补充叶酸前后细胞周期的改变。结果:MTHFR基因功能下调后,不同剂量叶酸补充可以逆转MTHFR基因功能下调对EPM细胞的不良影响,影响程度与补充叶酸的浓度在一定范围内具有剂量依赖性。结论:MTHFR基因是重要的先天性唇腭裂候选基因,叶酸补充可以拮抗MTHFR基因功能下调对胚胎腭突发育的不良影响。