环氧化酶抑制剂（精选7篇）
环氧化酶抑制剂 篇1
环氧化酶是前列腺素合成过程中一个重要的限速酶, 可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物, 从而维持机体的各种生理病理过程。哺乳动物的环氧化酶至少有两种形式, 分别为COX-1和COX-2, 分别由Pgtsl、Ptgs Z基因编码, 具有不同的生物学功能。COX-1是一种结构酶, 稳定表达于许多组织中, 产生具有生理作用的前列腺素 (GPs) , 维持人体正常生理功能, 在炎症、伤口愈合等情况下可诱导COX-2表达。很多肿瘤组织COX-2表达水平也很高。目前肺癌已经是全球发病率最高的肿瘤之一, 五年生存率低于15%, 很多资料表明COX-2和类前列腺素的生成与肺癌的发病有关。以下就将选择性COX-2抑制剂对肺癌放疗的增敏作用作一综述。
1 COX-2生物学特点
环氧化酶是前列腺素PGs (PGI2) 合成过程中一个重要的限速酶, 可将花生四稀酸代谢成各种前列腺素产物, 从而维持机体的各种病理生理过程, 哺乳动物的COX有两种形式:COX-1和COX-2。很长一段时间环氧化酶 (cyclooxygenase, COX) 蛋白被认为是由单基因产生的, COX的基本结构由3个独立折叠的单位构成, 即表皮生长因子结构域、膜结合结构域及酶活性结构域。1990年COX的第2个同工酶 (COX-2) 在各种细胞中被发现, 其结构和功能都与“经典”的COX不同。因此, 将经典的命名为COX-1, 为结构酶;另一个命名为COX-2, 为诱导酶。COX-1和COX-2是前列腺素 (prostaglandin, PG) 合成过程中的限速酶, 均可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素。前列腺素的合成在肾脏中非常活跃, COX产物主要是通过其受体来发挥生物效应, COX产物的多样性及其受体的多样性决定了COX产物在肾脏中表现出复杂的生物学作用。PGE2及PGI2是扩血管效应, 而PGF2a及TXA2则对肾血管起收缩作用, 其中TXA2是肾脏血流动力学改变的关键因素。肾小球致密斑合成的PGE2可介导肾小球旁细胞对肾素的合成与释放。PG与血管紧张素Ⅱ、抗利尿激素、去甲肾上腺素、内皮素之间维持肾血管的舒缩平衡, PG在肾血流、肾小球滤过率及水电解质方面起着重要的平衡作用。
2 COX-2抑制剂的抗肿瘤作用
COX酶抑制剂分为选择性和非选择性两类。选择性COX抑制剂包括赛来昔布、罗非昔布和美洛昔康等, 非选择性抑制剂包括阿斯匹林、布洛芬、二氯芬酸及酮咯酸等。环氧化酶COX-2抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的相关机理: (1) 环氧合酶2介导理论, COX是生物合成PGE类的限速酶; (2) 非环氧化酶2理论, 环氧化酶2抑制剂对肿瘤细胞的抑制作用的机理还有很多争论。有些研究表明环氧化酶2抑制剂抗肿瘤增殖和诱导凋亡的作用机理中均涉及到COX-2依赖和非COX-2依赖途径, 并不完全依赖COX-2, 四烯酸的连接位点, 具有竞争性抑制COX酶的功能。抑制细胞凋亡研究表明, COX-2在许多肿瘤中的表达可抑制细胞凋亡, 从而抑制血管生成。
3 选择性COX-2对肺癌放疗增敏作用
(1) 降低细胞内PGE2水平已知, COX-2是前列腺素合成过程中的限速酶, 它可将花生四烯酸转变为各种前列腺素产物; (2) 诱导凋亡流式细胞仪进行7-AAD染色法检测凋亡发现, NS-398+放射组在H460细胞以协同方式诱导凋亡, 而在HCT-116细胞则为相加方式诱导凋亡; (3) 细胞周期的变化。众所周知, 细胞对射线的敏感性随细胞周期各时期的变化而变化。研究发现, 在一些恶性肿瘤化疗中加用COX-2抑制剂可起到增效作用。在表达或不表达COX-2的结肠癌细胞株, COX-2抑制剂NS2398和52Fu联用可使生长抑制作用增强。提示NS2398可作为结肠癌的辅助治疗。比较这些药物的副作用, 他们最终评估和综合了涉及41 000多例受试者、比较一种COX-2抑制剂与一种非选择性NSAID的26项随机研究的消化不良症状数据。他们还检查了涉及550例受试者, 比较一种NSAID加一种质子泵抑制剂与一种非选择性NSAID的4项随机试验的数据。此外, 研究者还观察了在同一研究人群中比较NSAIDs加一种质子泵抑制剂与一种COX-2抑制剂的另外2项试验。服用COX-2的病人患上心血管疾病的风险是服用安慰剂对照组的2.26倍。而在最新一期《美国医学杂志》上公布的一项研究报告认为, 在治疗骨关节炎的药物中, COX-2能够比传统的非类固醇类消炎止痛药显著地降低消化道出血和溃疡的风险。由辉瑞公司生产的西乐葆和默克公司生产的万络同属选择性COX-2抑制剂型非类固醇类镇痛药, 该类镇痛药于上世纪90年代问世, 专为避免传统非类固醇类镇痛药出现的胃肠出血而设计。
4 结语
目前很多研究表明COX-2参与了肺癌的发生、发展和转移, 但是选择性COX-2抑制剂在肺癌特别是早期和高分化HCC中能否起到预防和治疗的作用尚待进一步研究。因为COX-2抑制剂在肺癌的临床应用仍是空白, 同时也没有单独使用COX-2抑制剂对于预防肿瘤复发以及再发原发性肿瘤作用的研究, 所以下一步要继续探讨COX-2抑制剂与预防肺癌发生发展的关系, 以便为肝癌的综合治疗提供参考。
参考文献
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环氧化酶抑制剂 篇2
1 环氧化酶 (cyclooxygenase, COX)
环氧化酶是一个位于细胞膜上的分子量为71KD的糖蛋白, 是催化花生四烯酸转化为前列腺素H2 (prostaglandin H2, PGH2) 的关键酶和限速酶。PGH2可再进一步转化成多种前列腺素 (prostaglandins, PGs) , PGs与特定的G-蛋白偶联受体结合, 该受体被激活后, 能增加细胞间第二信使 (环磷酸腺苷和钙) 的浓度, 进而激发PGs的临床效应。
1991年Nishikawa等[5]发现COX有两种同工酶:COX-1 (结构性酶) , COX-2 (诱导酶) 。可被细胞因子或内毒素刺激呈数十倍增长, 由其产生的PGs参与炎症反应和疼痛致敏作用。
炎症时组织释放缓激肽、PGs和5-羟色胺等炎性介质。而COX-2抑制剂主要是通过选择性抑制COX-2, 阻断前列腺素 E2 (急性炎症时主要产生的前列腺素) 的生成来发挥镇痛作用的, 从而避免了传统NSAIDs由于抑制了COX-1而产生的胃肠道、肾脏和血小板相关的不良反应。
2 COX-2抑制剂对骨折愈合和骨整合的影响
2.1 COX-2抑制剂对骨折愈合的影响
随着对COX-2抑制剂安全性研究的深入, 学者发现不仅NSAIDs对骨折愈合有负面效应, 许多选择性环氧化酶-2抑制剂对骨折愈合也有影响。Simon等[6]用吲哚美辛 (1 mg/kg·d) 、塞来昔布 (4 mg/kg·d) 和罗非昔布 (3 mg/kg·d) 对大鼠骨折模型进行试验。8周后, 塞来昔布组和罗非昔布组仍能发现骨折线存在。其中, 罗非昔布组尤为明显, 在X线下没有一份样本出现正常骨痂的桥接。说明选择性COX-2抑制剂延迟了大鼠骨折的愈合。Xie等[7]也认为选择性COX-2抑制剂严重影响了骨折局部骨膜前体细胞的活化、增殖、分化, 从而影响到骨折愈合早期的骨纤维愈合, 虽然提示选择性COX-2抑制剂的作用可能是剂量依赖性的, 是可逆的, 但其应用确实影响了骨折愈合。而且COX-2基因变异小鼠的骨折愈合也是延迟的。Rundle等[8]研究表明, 用COX-2进行基因治疗促进了大鼠骨痂组织的形成, 促进了骨折愈合的过程。大量证据表明, COX-2对骨折愈合起着不可或缺的作用。
2.2 COX-2抑制剂对骨折愈合影响的可能机制
骨折愈合是一个包括生长因子、细胞因子及前列腺素等物质的释放、间充质干细胞的募集与增生和其向成骨细胞和软骨细胞的分化, 最终形成膜内化骨或软骨内化骨的复杂过程。在软骨内化骨的过程中, 间充质干细胞首先分化为软骨细胞, 并进一步凋亡, 导致骨基质的钙化。钙化的基质即可以作为骨形成的模板, 成骨细胞在此模板上沉积, 完成软骨内化骨。而在膜内化骨的过程中, 间充质干细胞直接分化成为成骨细胞。
由此可见, 间充质干细胞的分化在骨折的愈合过程中起着枢纽作用。尽管我们对间充质干细胞的募集和分化机制并不十分了解, 但前列腺素作为一个重要的炎性介质, 对骨折后的骨形成和再吸收无疑起着不可取代的作用。
前列腺素E2在成骨细胞增殖分化成为骨细胞系和骨细胞的进一步增殖成熟过程中起着重要作用, 其机制为促进细胞内环磷酸腺苷的大量表达, 环磷酸腺苷作为信号分子促使间充质干细胞募集、增殖及分化, 并进一步促进骨折部位的软骨内化骨和膜内化骨。亦有体外实验证实, 前列腺素E2可通过刺激E-Prostanoid 2和E-Prostanoid 4受体促进MC3T3-E1等成骨细胞系的增殖成熟。细胞内环磷酸腺苷显著增多, 碱性磷酸酶活性和Ⅰ型胶原的合成上升[9]。
早在30年前便有研究显示, 在兔的胫骨骨折后的3～14 d, 组织中的前列腺素 (E、F) 水平和COX-2信使核糖核酸 (messenger ribonucleic acid, mRNA) 均增高。COX-2 mRNA的水平在骨折愈合的第14天达到峰值, 在第21天的时候恢复到基线水平[10]。多数动物试验都提示多种选择性COX-2抑制剂均有可能阻碍骨折的愈合, 但其根本原因都是因为抑制了COX-2的生成进而影响了前列腺素E2的产生。有研究报道, 在动物模型上使用前列腺素E2确实增加了骨折愈合的概率。系统性或局部注射前列腺素E2也刺激了骨生成。而且, 通过抑制COX而阻断前列腺素的合成, 进而减少骨形成已在活体内得到证明[11]。
Zhang等[1,12]2001～2002年报道在COX-2基因敲除的小鼠中, 观察到间充质细胞的持续不分化和成骨细胞的低生成, 并最终导致较高概率的骨折不愈合。相比之下对照组COX-1基因敲除的小鼠并没有出现这一情况。随后他们分别对COX-2基因敲除和野生型小鼠的骨髓基质细胞进行培养并观察成骨细胞的生成, 结果COX-2缺失的小鼠骨结节生成较对照组减少了50%, 而加入外源性前列腺素E2后, 骨结节生成减少得到了恢复。进一步研究表明, 由于COX-2的缺失, 阻碍了间充质干细胞的募集和分化成为成骨细胞, 进而阻碍了膜内化骨和软骨内化骨。Kellinsalmi[2]研究发现, 选择性COX-2抑制剂确实抑制干细胞向成骨细胞及破骨细胞的分化, 但同时也发现COX-2抑制剂刺激了人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化, 但对这一现象并没有作出合理的解释。
2.3 COX-2抑制剂影响骨折愈合存在的争议
有研究显示:在动物骨折模型中使用选择性COX-2抑制剂并不影响骨折愈合的时间或效果。Brown等[13]用小鼠的股骨骨折模型研究非选择性COX抑制剂和选择性COX-2抑制剂对骨折愈合的影响。研究结果显示:在骨折后第4周和第8周, 测量骨折纤维愈合、软骨内成骨和不成熟的骨形成的指标, 在吲哚美辛组和塞来昔布组较空白对照组均有下降, 且有统计学意义。但在任何一个时间点上, 塞来昔布组与空白对照组在机械强度或是影像形态学上均没有显示出差异。在12周时, 三组小鼠骨折模型在放射学、生物力学、组织学上都没有显著差异。Mullis[14]对骨折的生物机械学与生物化学指标进行检测得出结论, 传统NSAIDs和选择性COX-2抑制剂的应用对骨折愈合均没有影响。Gerstenfeld等[10]报道, 使用选择性的COX-2抑制剂塞来昔布并不导致骨折愈合在影像学或生物力学上的差异, 即使证实给予的塞来昔布剂量已达到足以完全抑制前列腺素生成的程度。
Long等[15]从脊柱融合的角度研究了选择性环氧化酶-2抑制剂对骨愈合的影响。动物实验结果显示, 8周后吲哚美辛组兔脊柱融合率为18%, 塞来昔布组为45%, 对照组为64%。提示非选择性的COX抑制剂对脊柱融合有影响, 而塞来昔布组对脊柱融合的影响不具有统计学意义。
2.4 COX-2抑制剂对骨整合的影响
骨整合是指活骨与荷载种植体表面直接有序的结构和功能连接。随着人工关节假体置换手术的普及及手术后假体松动研究的开展, 人们对人工关节置换后骨整合的过程越来越重视。作为关节置换手术后及术后功能康复训练时疼痛处方的COX-2抑制剂是否对骨整合有影响, 很早就引起了学者的重视。
Goodman等[3]分别用水、萘普生 (110 mg/kg·d) 、罗非昔布 (12.5 mg/d) 的新西兰白兔做单侧胫骨植入物的骨整合试验。6周后发现与对照组相比, 萘普生组和罗非昔布组均明显抑制了骨整合过程 (P值分别为0.031和0.035) , 且萘普生组和罗非昔布组均减少了CD51 (+) 破骨样细胞。罗非昔布组减少了区域内成骨细胞的数量, 而萘普生组对成骨细胞数量减少的作用并没有统计学意义。随后, 他又用同样的方法检测短时间使用COX-2抑制剂对骨整合的影响[16]。三组新西兰白兔分别在6周中的前两周和后两周及全程6周给予罗非昔布 (12.5 mg/d) 。6周后结果显示, 全程6周给药的兔子骨整合的过程受抑制明显强于6周中前两周或后两周的兔子, 提示COX-2抑制剂对骨整合的抑制作用与用药时间有关。
Fernanda[17]用美洛昔康研究植入钛钉的小鼠骨整合过程是否受到影响。通过骨与植入物的接触面、骨面的皮质骨、松质骨以及骨密度判断骨整合进程。结果显示, 持续使用美洛昔康显著减弱了钛钉植入物与周围骨质的整合过程。
3 目前存在争议可能的原因
目前, 选择性COX-2抑制剂对骨折愈合影响的动物试验结果不一致。Dimmen等[18]和Akritopoulos等[19]甚至曾于2008年先后于同一本杂志上发表了关于塞来昔布对骨折愈合影响的两篇文章, 结果却截然相反。当时评论是迷惑仍然存在。
Einhorn[20]认为不同试验的不同结果多是由于不同的实验动物种类和不同的实验方法造成的。骨折动物模型的建立方法较多, 大多采用较为方便的闭合骨折方法, 术后不固定或外固定。然而闭合骨折的骨折类型难以统一, 分析比较的可比性较差。而脊柱融合的实验从理论上来说并不能完全代表骨折愈合的过程, 因为它对破骨细胞活性的依赖性更小。并且许多动物实验在药物剂量、给药时间和骨折评估的时间点上存在许多问题, 因为虽然骨折愈合的过程可能需要数月, 然而止痛药的使用却只需要几天或几周[21]。
环氧化酶抑制剂 篇3
关键词：结肠癌,多药耐药,环氧化酶-2抑制剂,P-糖蛋白
多药耐药(multidrug resistance,MDR)是目前化疗中需要克服的最大难点[1],针对MDR的逆转已经有了一系列的进展,但是由于化学药物的毒副作用无法忽略,成为逆转剂应用于临床的最大障碍。COX-2抑制剂可干预肿瘤的生长及浸润转移的作用已得到证实,但其抗癌机制尚不明确,COX-2可通过各种途径参与肿瘤多药耐药的发生,大量研究主要针对P-gp[2],COX-2抑制剂可减少P-gp的表达,使细胞内有效药物浓度降低从而达到逆转耐药的作用。COX-2抑制剂与化疗药物联合使用为临床化疗效果的提高提供了新的前景[3,4],COX-2也有望成为新一代的耐药指标,协助临床诊断与治疗。NS-398是COX-2选择性抑制剂,大剂量时对肿瘤细胞以及正常细胞均有明显的抑制作用。COX-2参与肿瘤多药耐药机制,小剂量的NS-398可能逆转肿瘤细胞的部分耐药作用,并对正常细胞的损伤微乎其微,充分发挥药物临床应用的潜力。本实验以结肠癌细胞株HCT-8/FU为研究对象,选择NS-398做为COX-2抑制剂,观察无毒剂量的NS-398对其耐药性的逆转作用,并初步探讨其作用机制。从而为无毒剂量的NS-398广泛应用于临床提供实验基础与理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人结肠癌细胞株HCT-8/FU购自凯基生物科技发展有限公司;NS-398为Cayman公司产品,溶于20 mmol/L二甲基亚砜中;5-氟尿嘧啶(5-FU)为天津金耀氨基酸有限公司产品;RPMI 1640培养基购于GIBCO公司;胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自碧云天生物技术研究所;Annexin V/PI双染试剂盒为美国B-D公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
HCT-8/FU细胞培养于无Hepes含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素与链霉素、含15 000 ng/mL 5-FU的RPMI-1640培养基中,以维持其耐药性,置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中传代培养,取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 CCK-8法测定NS-398对HCT-8/FU细胞毒性
取对数生长期的细胞株HCT-8/FU,用RP-MI-1640培养基调整细胞悬液浓度为1×105/m L,接种于96孔板,200μL/孔,细胞贴壁后加药,0、10、20、30、50、100、200μmol/L不同浓度的NS-398,每一浓度组设4个复孔。培养24 h后,每孔加入20?l CCK-8液继续培养4 h,采用全自动酶联免疫检测仪在490 nm波长测定吸光度OD值,取3个孔OD值均数计算细胞增殖抑制率。抑制率=1-(实验组OD值-空白对照OD值)/(对照组OD值-空白对照OD值)×100%。选取单独用药组细胞抑制率小于10%的药物浓度为NS-398的无毒剂量。
1.2.3 CCK-8法测定NS-398对HCT-8/FU细胞MDR的逆转作用
取对数生长期的HCT-8/FU细胞按1×105/mL接种于96孔板,细胞贴壁后加药。设5-FU单用组、5-FU+10μmol/L、5-FU+20μmol/L NS-398等三组;5-FU等倍稀释成7个药物浓度梯度,每组设4个复孔,终体积为200μL,培养24 h,每孔加入CCK-8 20μL,继续培养4 h,在酶标仪490 nm处测吸光度OD值,取3个孔OD值均数计算细胞增殖抑制率。抑制率=1-(实验组OD值-空白对照OD值)/(对照组OD值-空白对照OD值)×100%(各自对照组为各组0浓度的FU)。计算耐药逆转倍数(5-FU单用组IC50与联合用药组IC50比值)。
1.2.4 免疫细胞化学法检测细胞P-gp的表达
实验设0μmol/L、20μmol/L NS-398组,取对数生长期细胞,按每孔2×105个接种于放盖玻片的6孔板中,贴壁后加入不同实验浓度药物,培养24小时后取出盖玻片,4℃冷丙酮固定10 min,按常规S-P两步法染色。根据细胞染色阳性率分级,无阳性为阴性(-),阳性率低于25%为弱阳性(+),阳性率在25%-75%之间为中阳性(++),阳性率大于75%为强阳性(+++)。
1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡
根据AnnexinV-PI凋亡试剂盒说明检测不同浓度NS-398诱导HCT-8/FU细胞凋亡的情况,实验设0μmol/L NS-398、10μmol/L NS-398、20μmol/L NS-398三组,收集各组药物作用24 h的HCT-8/FU细胞,离心,弃上清,用预冷PBS洗涤2次,分别加入185μL buffer、10μL Annexin V室温避光孵育15 min,再加入5μL PI,避光5 min后再加入200μL buffer,用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0软件进行统计分析,结果以均数±标准差表示,采用方差分析和两组资料比较的t检验,当P<0.05时差异具有显著性。
2 结果
2.1 NS-398对HCT-8/FU细胞毒性
NS-398非细胞毒性剂量的确定,CCK-8法测定显示,COX-2选择性抑制剂NS-398在20μmol/L及以下浓度条件下对HCT-8/FU细胞株的抑制作用逐渐下降。在20μmol/L终浓度条件下,NS-398对耐药株细胞抑制率小于10%,无明显细胞毒性作用,见图1。
2.2 NS-398对HCT-8/FU细胞逆转作用
通过0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L NS-398分别与不同浓度的5-FU作用24 h后,IC50时5-FU的浓度分别为137.4 mg/m L、38.7 mg/m L和12.8 mg/m L,各组之间比较差异有统计学意义(P<0.001)。10μmol/LNS-398逆转3.55倍,20μmol/L NS-398逆转10.73倍。HCT-8/FU细胞具有明显的耐药逆转作用,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。
2.3 NS-398对HCT-8/FU细胞膜P-gp表达情况
细胞经NS-398作用24 h之后P-gp的表达明显减少,由强阳性(+++)变为弱阳性(+)。以上结果说明NS-398可抑制P-gp的表达。
2.4 NS-398对HCT-8/FU细胞早期凋亡的影响
流式细胞术检测结果显示,NS-398 10μmol/L、20μmol/L作用于HCT-8/FU细胞,细胞早期凋亡率分别为(11.95±0.325167)%及(21.49±0.690217)%,与0μmol/L NS-398组(2.92±0.20518)%比较,差异有统计学意义(P<0.01);NS-398作用组间也存在统计学差异(P<0.01),表明NS-398在一定浓度范围内呈剂量依赖性增加HCT-8/FU细胞凋亡,见图3与附表。
注:覮10μmol/L NS-398组与20μmol/L NS-398组早期凋亡率分别与0μmol/L NS-398组比较,P<0.01;10μmol/L NS-398组与20μmol/L NS-398组早期凋亡率比较,P<0.01;晚期凋亡率两两比较,P<0.01。
3 讨论
结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,近30年来发病率和死亡率呈上升趋势,位居我国恶性肿瘤死亡率的第5位[5],其治疗首选手术切除,术后5年生存率约50%。研究表明,术后辅以化疗可减少复发、转移而提高生存率;对于不手术或晚期患者而言,化疗显得更加重要。然而癌细胞多药耐药(MDR)的产生,使得结肠癌化疗的效果明显低于其它肿瘤,使众多联合化疗方案的有效率大大降低[6]。目前,逆转剂的研究已经有了初步的进展,但是由于药物发挥逆转作用所需的剂量较大,其毒副作用不可忽视,成为应用于临床的最大障碍。因此,找到能够有效应用于临床的逆转剂是改善肿瘤化疗失败的关键因素。
有研究表明,COX-2参与了肿瘤血管生成[7],与肿瘤浸润和转移密切相关[8],在胃癌、肠癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞中异常表达;应用COX-2抑制剂可干预肿瘤的生长及浸润转移。COX-2抑制剂与化疗药物联合使用为临床化疗效果的提高提供了新的前景[9,10],由于COX-2可通过各种途径参与肿瘤多药耐药的发生,而COX-2抑制剂可能通过抑制细胞膜P-gp[11]和多药耐药相关蛋白的表达[12]以及阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡等逆转肿瘤细胞的多药耐药[13],有望成为耐药逆转的新靶点。
NS-398是一种高效的COX-2选择性抑制剂,对COX-1的亲和力较弱,常用剂量不干扰COX-1相关的正常生理过程。PATEL等[14]通过腺病毒介导将COX-2 c DNA转染到大鼠肾小球系膜细胞发现,COX-2的表达增加可引起P-gp表达相应增加,COX-2选择性抑制剂NS-398可阻断COX-2介导的P-gp过度表达并抑制其活性,为COX-2抑制剂应用于肿瘤治疗开辟了新的途径。
该研究采用无毒剂量NS-398检测其对HCT-8/FU细胞株的耐药逆转情况,经10μmol/L和20μmol/L的NS-398作用后,细胞的耐药逆转倍数分别为3.55和10.73倍,明显起到逆转耐药作用,且具有剂量依赖关系。在机制方面,结肠癌耐药机制主要与P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、拓扑异构酶Ⅱ、蛋白激酶C、谷胱甘肽氧化还原系统等因素有关,本实验中免疫细胞化学法结果显示NS-398可使P-gp表达显著降低,表明NS-398可下调P-gp的表达,P-gp是位于细胞膜上的药物外排蛋白,可将进入细胞的药物泵出细胞从而使细胞内有效药物浓度降低,起到对HCT-8/FU细胞多药耐药的逆转作用,说明了P-gp是NS-398逆转HCT-8/FU多药耐药的主要机制。抗凋亡是肿瘤细胞多药耐药的另一重要机制。本研究结果发现NS-398可促进HCT-8/FU细胞早期凋亡,在一定的浓度范围内呈剂量依赖性,其抗凋亡机制是多方面的,主要与抗凋亡基因survivin有关,可能通过Wnt/beta-catenin信号传导通路来发挥作用[15],在肿瘤细胞中主要表现为抗凋亡和促增殖,其具体机制还需要进一步研究。
环氧化酶抑制剂 篇4
关键词：帕金森病,多巴胺,环加氧酶抑制药
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经系统变性疾病,以中脑黑质多巴胺(Dopamine,DA)能神经元进行性变性丢失为主要神经病理学特征,但PD的病因和发病机制仍不清楚[1]。环氧化酶-2(COX-2)是炎症过程中的重要介质,PD患者尸检中脑黑质存在COX-2表达增加,以及临床上使用非激素类抗炎药物能减少PD发病的危险均提示COX-2在PD发病机制中的重要作用[2]。本研究利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine,MPTP)诱导的小鼠帕金森病模型,观察选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对帕金森病可能的保护作用及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
MPTP(Sigma,USA),Probenecid(Sigma,US-A),兔多克隆抗大鼠COX-2(Sanda,USA),兔抗TH单克隆抗体(Sigma,USA),生物素标记的羊抗兔Ig G抗血清(迈新生物技术公司)。塞来昔布由安徽合肥森瑞公司提供。其余试剂为国产分析纯,脑立体定位仪。
1.2 动物分组和模型制备
健康雄性C57BL6小鼠30只,鼠龄4周左右,体重20～25 g。随机分为A、B、C 3组,A组10只为生理盐水对照组,B组10只为模型组,C组10只为塞来昔布处理组。小鼠皮下注射MPTP 20 mg/(kg·次),连续注射4次,每次间隔2 h,复制急性帕金森病鼠模型。对照组注射生理盐水代替MPTP。C组塞来昔布处理组除每天给予模型组相同的MPTP处理外,从实验第1天起每天给予塞来昔布20 mg/kg,生理盐水溶解,腹腔注射,直至处死。对照组注射与B组等体积生理盐水。上述动物分别于实验开始后14 d处死。
1.3 TH免疫组织化学测定
于末次注射24 h后用水合氯醛将小鼠深度麻醉后断头取脑固定,修整中脑组织块进行冠状连续冷冻切片。将中脑切片浸入兔抗TH(1∶5 000Chemcon),随后依次进入生物素化IgG工作液和SABC三抗工作液(北京中山),室温下各孵育2 h,辣根过氧化物酶标记的DAB将免疫产物显为棕黄色。在孵育过程中用PBS溶液代替一抗做空白对照,免疫组织化学染色后,将切片裱于多聚赖氨酸处理的载玻片上,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。用光学显微镜观察并确定TH免疫阳性细胞及免疫阳性产物分布部位。每只(动物随机取3张切片,每张切片随机取3个高倍视野,计数每张切片TH阳性神经元数目,并求平均值。
1.4 免疫印迹法检测黑质COX-2蛋白表达
动物在深麻醉下断头处死,在冰盘中迅速取出大脑,使用脑Matrice(Brain Scientific Inc,USA)仔细小心分离中脑黑质部分,称重后迅速液氮冷冻,随后标本放入-80℃冰箱中保存直至使用。使用蛋白提取液(Tris-HCL 100 mmol/L,EGTA 1 mmol/L,ED-TA 1 mmol/L,Leupeptin 1μg/m L,PMSF 250μmol/L,Trysin inhibiter 50μg/m L,aprotinin 1μg/m L)提取蛋白质,考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度。样本(50μg)加SDS缓冲液煮沸5 min,4℃冷却,经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转印蛋白到PVDF膜,含5%脱脂奶粉封闭液封闭12 h,加抗COX-2抗体(1∶200)4℃孵育24 h,PBS液漂洗后加二抗37℃1 h,洗后加三抗,37℃1 h。DAB染色,用UVP凝胶成像系统照相并分析。
1.5 统计学方法
全部数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析。所有数据用表示。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 塞来昔布对MPTP诱导的多巴胺能神经元丧失的影响
对照组黑质区可见大量TH阳性神经元,深染,阳性产物分布于胞浆。模型组TH阳性神经元较对照组明显减少,染色较浅;塞来昔布处理组TH阳性神经元较对照组明显减少但显著多于模型组,染色较深。统计学处理:对照组TH阳性神经元(92.38±6.29)%明显高于模型组(18.76±4.62)%(P<0.05)和塞来昔布处理组(39.55±9.01)%(P<0.05);塞来昔布处理组显著高于模型组,P<0.05,见附表。
注:1)与A组比较,P<0.05;2)与B组比较,P<0.05
2.2 塞来昔布对黑质COX-2蛋白表达的作用
PBS注射侧黑质有少量COX-2蛋白表达,MPTP致帕金森病模型组COX-2蛋白表达明显高于PBS对照组(P<0.05),而塞来昔布能明显减少黑质COX-2蛋白表达水平,塞来昔布处理组与生理盐水治疗组比较差异有显著性(P<0.05),见附表。
3 讨论
PD是一种以静止震颤、动作减少、强直等为主要临床表现并以中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性丢失为主要神经[3]。到目前为止国内外已建立了众多的动物模型来研究PD[4],其中应用最为广泛的是MPTP小鼠模型[5]。MPTP是近20多年来神经科学者们所知并公认的可以诱发小鼠SN-Str通路DA能神经元变性,可模拟出人类PD症状的神经毒性物质[6,7]。MPTP穿过血脑屏障后被单胺氧化酶B(MAO-B)转化为相应的二氢吡啶(MPDP+),MPDP+随之氧化为1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),MPP+可抑制TH的活性而减少DA的合成,通过抑制活性复合体(NADH脱氢酶)I,增加自由基的生成及氧化应激,进而促进Bax的表达、抑制Bcl-2的表达及其在线粒体外膜上的分布,从而改变线粒体膜的通透性,使膜内的某些蛋白,如细胞色素C等进入细胞质,继而激活Caspases级联反应,启动凋亡过程[8,9]。本研究复制的PD小鼠模型病理学特征的神经系统变性疾病具有PD典型的行为学表现;Western blot结果显示腹侧中脑TH蛋白的表达下降,这提示本实验PD动物模型存在DA能神经元大量丢失,说明本实验建立的动物模型符合实验要求。
有大量资料表明,PD发病过程中黑质DA能神经元的变性丢失与COX-2表达关系密切[10]。李冬冬[11]等用C57BL种系环加氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)缺陷小鼠,腹腔注射MPTP制备帕金森病小鼠模型,用免疫组织化学方法观察COX-2对帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元的影响,行为学及免疫组织化学观察显示,野生型帕金森病小鼠的死亡率明显高于COX-2缺陷杂合子帕金森病小鼠(P<0.01),野生型帕金森病小鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫反应阳性神经元数目较杂合子帕金森病小鼠明显减少(P<0.01)。提示COX-2可能与帕金森病时黑质多巴胺能神经元的损伤有关。前列腺素,尤其是PEG2和前列环素与炎症反应的关系最为密切。而催化前列腺素合成的关键酶是环加氧酶,环加氧酶有两种同工酶COX-1和COX-2,大多数组织在正常情况下表达COX-1,而不表达COX-2,目前研究发现多种有丝分裂原包括细胞因子、激素以及佛波酯等可诱导组织表达COX-2,炎症刺激不影响COX-1的表达,但可以迅速引起COX-2的表达增加,目前认为COX-2在炎症反应中发挥重要的作用。最近的研究还发现海人酸诱导的神经元的凋亡伴有COX-2表达的增高,体外研究发现,兴奋性神经毒引起神经元的死亡常伴发选择性COX-2 m RNA的高表达,表明COX-2可能与神经元的死亡有关[12]。有文献报道早老性痴呆患者脑内神经元COX-2表达长期升高[13]。
在MPTP的PD模型中,COX-2水平和小胶质细胞数目呈明显的正相关关系,和多巴胺能神经元数目呈负相关,抑制COX-2或COX-2基因缺陷能明显减少小胶质细胞激活,保护多巴胺能神经元免受神经毒素的损伤。本研究表明MPTP能导致黑质高度表达COX-2蛋白含量增加,使用COX-2选择性抑制剂塞来昔布能明显抑制COX-2蛋白表达,同时黑质多巴胺能神经元丢失也显著减少,提示COX-2涉及炎症介导的多巴胺能神经元变性机制,塞来昔布能保护MPTP诱导的多巴胺能神经元损害。
环氧化酶抑制剂 篇5
1.1 试剂和仪器
DMEM细胞培养液、小牛血清、胰蛋白酶购自Hyclone公司, MTT购自Sigma公司, β-拉帕醌购自Selleck公司;Bcl-2、Bax一抗购自Cell Signaling公司。
1.2 细胞培养
T47D细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液内, 置于37℃培养箱中培养。细胞单层贴壁生长至70%~80%融合时, 以0.25%胰蛋白酶消化、传代。
1.3 实验分组
对照组;β-拉帕醌高 (8umol/L) 、中 (4umol/L) 、低 (2umol/L) 剂量组。
2 方法
2.1 细胞增殖抑制实验
取对数增殖期细胞接种于96孔培养板, 贴壁后给药, 分别培养24、48、72 h。加入预先配制的MTT液50u L, 37℃继续孵育4 h。加入150u L DMSO后, 在波长490 nm处测定各孔光吸收值 (A) , 按下列公式计算细胞增殖抑制率:
2.2 蛋白印迹法检测凋亡蛋白的表达
提取各组细胞蛋白, SDS-PAGE分离, 电转并5%脱脂奶粉封闭, 加入一抗4℃反应过夜;二抗室温反应60 min;ECL增强发光。以actin蛋白作内参照, 图像分析软件进行半定量分析。
2.3 统计学处理
用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。
3 实验结果
3.1 细胞的增殖抑制作用
MTT检测结果显示, β-拉帕醌分别作用T47D细胞24、48和72h后, 细胞增殖速度下降明显, 结果见表1。
3.2 凋亡相关蛋白的表达
蛋白印迹检测结果显示, 用药组细胞bcl-2表达明显下降, 而bax蛋白表达明显增加, 用药组bcl-2/bax比值明显降低, 见图2。
4 讨论
凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中, 与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系。因此, 诱导瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一个新热点。本实验中MTT结果显示β-拉帕醌对乳腺癌细胞T47D的增殖具有明显的抑制作用, 并具有量效关系。
凋亡的过程受到多基因调控。Bcl-2和Bax是一对凋亡相关调控基因, Bcl-2主要通过与其家族成员Bax形成二聚体而发挥作用, 当Bcl-2表达量较高时, Bcl-2和Bax形成异源二聚体而抑制凋亡;当Bax表达较高时, bax之间形成同源二聚体而促进凋亡。在本实验中, 用药组Bcl-2蛋白表达则明显减弱, Bax蛋白表达明显增强, Bcl-2/Bax比值明显降低, 说明β-拉帕醌可有效诱导乳腺癌细胞凋亡, 这可能是抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。
摘要：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。研究表明, 乳腺癌的增殖及耐药是导致患者死亡的主要原因。因此, 明确乳腺癌的发生发展机制, 寻找有效的治疗靶点是延长乳腺癌患者生存时间的关键。最近研究表明, 醌氧化还原酶在多种肿瘤中表达异常增高, 并与肿瘤的不良预后密切相关。本研究通过在乳腺癌细胞株T47D中给予醌氧化还原酶抑制剂β-拉帕醌, 观察其对乳腺癌细胞增殖作用的影响, 并探讨可能的分子机制。
关键词：乳腺癌,细胞,蛋白
参考文献
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环氧化酶抑制剂 篇6
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集我院2007年6月~2009年6月间住院且接受TURBT治疗的初发膀胱癌患者52例(2微米激光电切术26例、等离子电切术28例)。所有患者术前均排除淋巴结或其他转移灶可能。52例中男性45例,女性7例,男女比例约6.5∶1;年龄20~85岁,平均年龄60.5岁。手术由同一术者完成,术后均按正规疗程予膀胱灌注化疗(吡柔比星30 mg,每周1次共8次,再每月1次共10次)。术后随访20~42个月,平均28.6个月,期间复查膀胱镜及泌尿系B超(24个月前每3个月1次,之后每6个月1次),将尿路内任何部位出现新的尿路上皮肿瘤视为复发。
1.2 实验方法
鼠抗人COX-2单克隆抗体购自英国Abcam公司,SP试剂盒购自北京中山生物有限公司。实验过程严格按照SP试剂盒操作流程,步骤如下:组织腊块连续切片,烤片20 min,常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,3%H2O2灭活内源性过氧化酶,抗原修复,鼠抗人一抗4℃过夜,生物素标记二抗作用30 min,链霉素抗生物素蛋白作用30 min,DAB染色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片。
1.3 结果判定
COX-2蛋白阳性表达为胞浆内黄染颗粒,随机选择5个高倍镜视野进行判断,以标本中>10%的肿瘤细胞表达COX-2视为阳性结果,<10%的肿瘤细胞表达COX-2视为阴性结果[3]。
1.4 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件进行分析。组间均数间比较采用t检验,率的比较采用χ2检验,评估肿瘤复发的相关影响因素采用Kaplan-Meier分析,统计结果P<0.05为差异有显著性。
2 结果
52例膀胱肿瘤患者中单发40例,多发12例;TNM分期Ta 10例,T1 25例,T2 17例;WHO肿瘤病理分级G1 26例,G2 22例,G3 4例。术后均获得随访,平均随访28.6个月,复发9例,其中7例为术前诊断多发肿瘤病例,2例单发;9例中分期分级为T1G 32例,T2G 26例,T2G 31例。52例组织标本中COX-2阳性表达30例(图1、2),阴性表达22例(图3)。COX-2蛋白阳性表达主要定位于细胞浆中,呈棕色弥漫分布,大多分布在癌组织中,癌周血管内皮细胞亦可见有阳性表达。COX-2的阳性表达率与膀胱肿瘤T分期有明显相关性(P=0.024),而与患者的年龄(P=0.586)、性别(P=0.641)、病理G分级(P=0.706)、单/多发病灶(P=0.959)之间没有相关性。单因素分析显示膀胱肿瘤患者术后复发与其临床T分期(P=0.003)、单/多发病灶(P=0.016)密切相关,而与COX-2的阳性表达率(P=0.963)、肿瘤G分级(P=0.344)、性别(P=0.321)间没有相关性。
3 讨论
环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素合成过程中重要的限速酶,通过催化花生四烯酸代谢为前列腺素类产物,从而对机体的生理和病理过程产生影响。COX可分为两个亚型,COX-1和COX-2。COX-1表达于大多数正常组织中,参与机体正常的生理活动。而COX-2属于诱导型酶类,可由各种刺激因素,如炎症、缺氧等诱导产生,近年来COX-2在肿瘤的分化、凋亡等多种生物学行为中的作用越来越受到重视,具体的作用机制尚未明确,可能与促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡等有关。多项研究发现COX-2在泌尿系统肿瘤组织中均有表达,且对于肿瘤的发展以及侵袭均有促进作用[4,5]。本研究显示COX-2蛋白在膀胱癌大多数癌细胞胞浆中以及癌周血管内皮细胞中均可见阳性表达,分析COX-2可能通过刺激局部组织前列腺素的大量合成,促进肿瘤血管的形成,进而引起肿瘤的侵袭性增加,导致肿瘤疾病的进展。
膀胱癌最主要的病理类型为移行细胞癌。初发者约75%为浅表性乳头状瘤,行单纯手术切除治疗后复发率高是其特点,术后5年内复发率可高达50%左右[6]。且膀胱癌有多中心性生长特点,虽然这种生物学特性的发生机理尚不明确,但多发肿瘤较单发肿瘤更易复发是显而易见的[7]。本研究结果显示52例患者术后复发9例,其中7例术前诊断为多发肿瘤。随着肿瘤的复发,尤其是多次复发者,可发展为肌层浸润性癌或转移癌,导致疾病进展。如何有效预防术后复发成为膀胱癌治疗的难题。多项研究探讨了膀胱肿瘤复发与其临床、病理因素间的相关性。何建华等[8]通过COX回归分析了120例浅表性膀胱癌患者,平均随访84个月,结果发现肿瘤的病例分级、TNM分期及复发情况均是影响膀胱癌术后复发的独立危险因素。赵凯亮等[9]回顾性分析了206例膀胱癌患者资料,结果显示3年、5年的复发率分别为36.8%和44.7%,影响复发的主要因素是年龄、组织学分级和术后膀胱灌注。FRIEDRICH等[10]分析了接受TUR手术治疗的105例非肌层浸润性膀胱癌患者,结果发现DNA甲基化分析法可作为膀胱癌诊断和评估预后的方法之一。有关COX-2表达与膀胱癌复发的相关性研究见有报道,但结论不一。如FRIEDRICH等[1]发现COX-2表达与Ta/T1期膀胱癌的侵袭性有关,但与肿瘤的复发与进展无关。KIM等[2]则认为T1G3期膀胱癌COX-2的表达量对于预测肿瘤复发和进展有重要意义。最近AZIZ等[11]通过检测266例行膀胱全切加化疗的肌层侵润性膀胱肿瘤组织中COX-2的表达情况,并总结患者临床、病理资料,结果多因素分析显示淋巴结转移、新辅助化疗、辅助化疗以及COX-2阳性表达率均是膀胱肿瘤患者特异性生存率的相关因素,认为COX-2有望成为监测膀胱癌预后的指标之一。
本研究结果显示COX-2阳性表达率与肿瘤的T分期之间有显著相关性(P<0.05),而与膀胱癌患者的年龄、性别、G分级、单/多发病灶之间没有相关性。进一步通过Kaplan-Meier单因素分析显示膀胱肿瘤的T分期、单/多发病灶可作为预测膀胱癌复发的相关因素,且T分期用于预测肿瘤的复发更有显著性意义(P<0.01),符合大多学者认同的观点。而本结果显示COX-2的阳性表达与膀胱癌复发的预测没有相关性(P>0.05),且本组52例患者术后平均随访28.6个月,共9例复发,复发率17.3%,分析可能与以下因素有关:(1)病例以浅表性膀胱肿瘤为主,术后病理G分级较低,G3仅4例;(2)随访时间较短,可延长随访期至术后5年;(3)患者术后灌注化疗依从性高,均按照疗程完成了膀胱灌注,灌注化疗的效果一定程度上降低了肿瘤复发的几率;(4)TURBT术式成熟,对于浅表性肿瘤能够保证瘤体的完整切除,极大程度上减少了因手术切除不彻底而导致的肿瘤复发。因此TURBT可作为治疗浅表性膀胱肿瘤的理想术式,且对于部分肌层侵润性膀胱肿瘤同样可以选择。
近来COX-2抑制剂塞来考昔(Celecoxib)用于膀胱癌的化学预防也逐渐受到学者的关注,DHAWAN等[12]收集了13例侵润性膀胱癌病例,在患者行诊断性电切术后给予Celecoxib口服,400 mg每天2次,服用2~6周,直至行根治性膀胱切除术前。采用TUNEL及免疫组化方法分别分析同一患者经诊断性电切术和根治性膀胱切除术先后获得的肿瘤标本,结果在13例根治性膀胱切除术标本中有3例无侵润性肿瘤残余,有7例可见肿瘤病灶发生凋亡改变,而对照组(未服用Celecoxib)13例中仅3例发生凋亡改变(P<0.04),且Celecoxib治疗组肿瘤组织中VEGF的表达量较对照组显著降低(P<0.026),提示抑制COX-2表达能够产生抗肿瘤效应。通过进一步研究COX-2抑制剂在膀胱癌化学预防中的作用机制,有望为临床上制定更完善的膀胱癌诊治方案奠定基础。
摘要：目的 探讨环氧化酶-2(C0X-2)在预测经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)后肿瘤复发中的作用。方法 收集52例行TURBT治疗的膀胱肿瘤患者资料,采用免疫组化方法检测肿瘤组织标本中COX-2的阳性表达,分析其与患者临床病理资料以及术后随访资料间的相关性。结果 52例标本中COX-2阳性表达30例,术后平均随访28.6个月,复发9例。COX-2阳性表达率与肿瘤T分期明显相关(P<0.05),与患者年龄、性别、病理G分级、单/多发病灶之间没有相关性,单因素分析显示膀胱肿瘤术后复发与临床T分期(P<0.01)、单/多发病灶(P<0.05)密切相关,而与COX-2阳性表达率、肿瘤G分级、性别没有相关性。结论 COX-2作为TURBT术后肿瘤复发的预测因子及其具体机制有待进一步研究。
关键词：环氧化酶-2,膀胱肿瘤,经尿道膀胱肿瘤电切术,复发
参考文献
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环氧化酶抑制剂 篇7
1 资料与方法
1.1 材料
药物:雷公藤和防己的干燥根购于广州市药材公司。经粉碎,各称取10 g,用双蒸水浸泡2 h,然后煮沸提取两次,第一次30 min,第二次20 min,过滤,合并滤液,减压蒸干,用0.5%羧甲基纤维素钠分散,定容为10 ml,使其浓度为1 g/ml生药,使用前摇匀。动物:SD雄性大鼠,体重180～220 g,购自中山大学实验动物中心。试剂和仪器:塞来昔布(Celecoxib),纯度为99.6%,由辉瑞制药有限公司惠赠;吲哚美辛,中国药品与生物制品检定所标准品;6-keto-PGF1α放免试剂盒购自解放军总医院东亚放免研究所;其他试剂为国产分析纯。放免γ计数器由中国科学院上海核研究所日环仪器厂出品。
1.2 方法
参照文献[3]方法,将30只雄性SD大鼠随机分为10组,每组3鼠。禁食20 h、禁水1 h后,其中5组分别给予0.5%羧甲基纤维素钠(阴性对照组)、0.2%吲哚美辛(非选择性环氧化酶抑制剂)、0.6%塞来昔布(环氧化酶2选择性抑制剂)、雷公藤(1 g/ml)和防己(1 g/ml)灌胃,所有药物均分散于0.5%羧甲基纤维素钠中,剂量为5 ml/kg。另外5组先予无水乙醇1 ml灌胃,1 h后再给予上述剂量的药物和对照。4 h后,用乙醚麻醉,剖腹取胃,沿胃大弯切开使胃黏膜面外翻,经冰生理盐水漂洗后,肉眼观察胃黏膜改变,并按文献[4]方法计算溃疡指数,即:条索状损伤长度>1 mm者,测量其长度,每毫米计1分;若其宽度>1 mm者,将计分按宽度的mm数加倍;长宽均<1 mm者计0.5分,将计分相加即为该只动物的溃疡指数。并立即于胃体后壁相同部位取黏膜1块,快速称取约60 mg,在4 ℃下用生理盐水制成每毫升含20 mg组织的匀浆,-20 ℃冻存备用。冻存的组织匀浆4 ℃解冻后,4 ℃离心3 500 romin-1,15 min,取上清按试剂盒要求测125I-6-Keto-PGF1α的放射活性。
1.3 统计学方法
数据用
2 结果
未给乙醇时,雷公藤和防己灌胃后对正常大鼠胃黏膜6-Keto-PGF1α的生成没有抑制,也不损伤胃黏膜(P>0.05),这与塞来昔布相似,但与吲哚美辛不同,吲哚美辛对正常大鼠胃黏膜6-Keto-PGF1α的生成有抑制(P<0.01),且胃黏膜上可见有多发点状和条索状糜烂及出血,溃疡指数明显增加(P<0.05)。
给乙醇1 ml灌胃后,对照组大鼠胃黏膜可见溃疡、糜烂、水肿,胃腔内有少许凝血块,但未见穿孔,病变主要累及胃底及胃体,溃疡指数与未给乙醇组比较明显升高(P<0.05)。给雷公藤和防己后,胃损伤进一步加重,与给乙醇对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),对6-Keto-PGF1α的生成也有抑制作用(P<0.05),与吲哚美辛和塞来昔布的作用相似。结果见表1。
注:与未给乙醇羧甲基纤维素钠对照组比较★P<0.05,★★P<0.01;与给乙醇羧甲基纤维素钠对照组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01
3 讨论
环氧化酶(COX)是花生四烯酸(AA)合成前列腺素(PGs)过程中一个重要的限速酶。随着COX-2的发现,一般认为COX-1属于结构性酶,负责维持身体的正常机能,与体内内环境稳定相关;COX-2则是一种诱导酶,在炎症反应、肿瘤的形成中有重要作用,抑制COX-2可以发挥抗炎作用[5]。在正常胃黏膜中,口服吲哚美辛强烈抑制6-Keto-PGF1α生成以及血小板TXB释放,并且引起胃黏膜损伤,但口服选择性COX-2抑制剂罗非昔布不会损伤胃黏膜[6]。然而近来越来越多的证据证明,COX-2不仅介导疼痛和炎症,同时能对维持正常胃黏膜生理功能起作用,当胃黏膜损伤时COX-2表达上调,从而发挥对胃黏膜的保护作用,并参与病变的修复过程[7]。特异性COX-2抑制剂,能削弱胃黏膜的抵抗力,通过破坏胃黏膜屏障的物质,加速胃黏膜的损伤[8]。本实验也发现,正常大鼠给吲哚美辛后能抑制6-Keto-PGF1α生成,引起胃黏膜损伤,而塞来昔布则与对照组差异无统计学意义;但如果给药前先用无水乙醇造成大鼠的胃黏膜损伤后,吲哚美辛和塞来昔布都能抑制6-Keto-PGF1α生成,并加重胃黏膜损伤。
雷公藤、防己两种中药常用于类风湿性关节炎的治疗[9,10]。本实验表明,雷公藤、防己的水提物对正常大鼠胃黏膜6-Keto-PGF1α的生成没有抑制,也不损伤胃黏膜,但对给乙醇后造成胃黏膜损伤大鼠的胃黏膜,其6-Keto-PGF1α的生成有明显抑制,且会加重已有的胃损伤。提示雷公藤、防己水提物对正常大鼠胃黏膜的环氧化酶无影响,但能抑制乙醇诱导大鼠胃黏膜中环氧化酶的活性。在临床应用时,因其对正常胃黏膜无影响,组方选药可以广泛使用,而对患有胃溃疡的患者,选药时则应慎重,因其可能加重已有的溃疡。
摘要：目的 探讨雷公藤,防己水提取物对大鼠胃黏膜环氧化酶的影响。方法 观察雷公藤、防己水提物对正常大鼠和乙醇诱导胃黏膜损伤大鼠的胃黏膜溃疡指数的变化;测定大鼠胃壁组织6-keto-PGF1α的含量。结果 正常大鼠的胃黏膜溃疡指数和6-keto-PGF1α的含量在给药前后差异无统计学意义(P>0.05),而乙醇诱导大鼠的胃黏膜溃疡指数显著增加(P<0.05);6-keto-PGF1α的含量显著减少(P<0.05)。结论 雷公藤、防己水提物对正常大鼠胃黏膜的环氧化酶无影响,但能抑制乙醇诱导大鼠胃黏膜中环氧化酶的活性。
关键词：雷公藤,防己,环氧化酶
参考文献
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