氧化应激

2024-05-20

氧化应激（精选8篇）

氧化应激篇1

1 乙醇代谢

酒精诱导氧化应激与乙醇代谢有关。人体内存在三种酒精代谢途径, 涉及以下一些酶类:乙醇脱氢酶、微粒体乙醇氧化系统 (MEOS) 和过氧化氢酶。这些途径均可产生自由基, 从而影响抗氧化系统。乙醇代谢的经典途径是, 在乙醇脱氢酶的作用下, 乙醇被催化为乙醛, 在此过程中形成自由基, 并伴随着NADH水平和NADHMAD+比例的改变[1]。乙醇被适量摄入后, 大部分在肝脏中被酒精脱氢酶代谢。

微粒体电子转导系统通过细胞色素P450同功酶系统也参与对乙醇的氧化作用。该家族的酶包括2E1、1AZ和3A4等异构体, 它们对乙醇的氧化活性不同, 慢性酒精摄入可诱导细胞色素P450 2E1异构体的生成, 因此, 在酗酒者体内, 该代谢机制尤其重要。除此之外, 在线粒体中对于ROS的形成和H2O2的产生, 2E1异构酶也是一个重要的催化剂。慢性酒精摄入者肝脏羟自由基含量增高也与该酶含量增高有关。

肝脏中过氧化物酶也参与乙醇的氧化作用, 该机制可能在大量摄入乙醇的人中更突出, 他们常常伴随脂肪酸在肝脏蓄积, 这是由于脂肪酸的过氧化作用导致的, 乙醇氧化产生乙醛, 后者被肝脏中的乙醛脱氢酶进一步氧化。粒体中的乙醛脱氢酶在维持乙醛低浓度水平方面起了一个关键的作用。乙酸继而被乙酰Co A合酶活化, 合成乙酰Co A[2]。

由于乙醇脱氢酶对乙醇的氧化作用以及随后的乙醛被氧化, 导致肝脏中NADH/NAD+比例的增加。该反应既发生于细胞质也发生于线粒体中, 可以分别通过乳酸/丙酮酸和β-羟基丁酸/乙酰乙酸的比例进行测定。在线粒体中, 低Km的乙醛脱氢酶催化产生大量NADH。细胞质NADH的还原等价物主要通过苹果酸—天冬氨酸穿梭运载, 被转移至线粒体中。如果这个组织是需氧的, 这些增加的NADH通过线粒体电子传导系统被氧化还原。因此, 乙醇氧化增加了线粒体中NADH的耗用。

2 线粒体的作用

乙醇代谢对肝脏的影响最早的一个表现是线粒体结构的改变。线粒体通常变大和变形, 变得肿胀或拉长, 嵴结构被破坏。在大鼠模型中, 线粒体结构的改变是伴随脂肪肝的进展发生的, 提示慢性酒精摄入影响肝脏能量代谢。乙醇相关的肝实质细胞活力下降是慢性乙醇摄入破坏肝细胞完整性的最早期表现。在后期, 酒精性肝病经典的标志, 即组织坏死, 星形细胞活化和 (或) 外周小血管纤维化才会出现。

线粒体与活性氧 (ROS) 的产生和防御均密切关联。线粒体本身即是氧化应激的靶子, 而它也参与了氧化应激相关信号控制细胞命运的机制。因此, 线粒体电子转移是细胞内ROS的主要来源。线粒体内ROS的形成可促进线粒体渗透性改变的不适当激活, 使细胞进入早期凋亡途径[1.2]。

酒精暴露后, 热休克蛋白60 (HSP60) , 蛋白二硫化异构酶, 线粒体乙醛脱氢酶, 蛋白抑制剂和其他的蛋白均被氧化。该方法也被用来鉴别酒精喂饲的小鼠肝脏中氧化的线粒体蛋白。乙醇与线粒体核糖核酸发生相互作用, 使之功能减弱, 线粒体合成蛋白能力下降。该反应也使参与氧化磷酸化的蛋白多肽合成下降, 并致使酶失活。该级联反应包括:线粒体呼吸功能下降, 三磷酸腺苷合成下降, 能量水平降低, 抗氧化剂消耗, 谷胱甘肽转运减弱, 结构异常, 线粒体DNA氧化改变, 线粒体失能和细胞损伤。所有这些因素相互作用加剧了凋亡和细胞坏死, 导致了酒精性肝损伤[3]。

3 信号转导

乙醇代谢的信号转导机制仍不是很明了。但是, 有一点是明确的, 即有丝分裂原蛋白激酶 (MAPK) 家族、核因子-κB (NF-κB) 和活性蛋白1 (AP-1) 等转录因子是参与酒精性肝病发生的关键因素。

转录因子NF-κB是一种广泛存在的多蛋白复合体, 可被许多细胞外刺激激活, 如细胞因子、化学因子、生长因子、缺氧再灌注、应激反应和免疫炎性反应。NF-κB被激活后启动了炎性基因, 并且可能在许多慢性炎性疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。

绝大部分凋亡诱导因子可以激活NF-κB, 从而调控凋亡前信号途径。凋亡过程中, Caspases对几种抗凋亡蛋白进行清除, 其中包括NF-κB。

MAPK信号途径对增生、分化、发育和凋亡启动非常重要。乙醇在多种细胞和器官系统影响MAPK, 因此发生不同的病理性结局。乙醛诱导的星形细胞产生的胶原与p38MAPK和JNK活化有关。JNK活化也参与肝实质细胞的增生和凋亡, JNK持续活化是凋亡信号。另一方面, p42/44MAPK是一种保护性信号途径。TNF诱导的p38MAPK活化可使肝细胞避免TGF-β介导的凋亡[2,3]。

转录因子AP-1包含许多基本蛋白, 在Kupffer细胞中, 乙醇通过激活NADPH氧化酶诱发氧化应激, 该反应继而激活氧化作用敏感转录因子, 导致某些细胞因子和CDI4表达上调。AP-l是CDI4的一个重要转录调节因子。

某些ROS和RNS信号分子的产生即是由细胞信号转导途径调控的。NF-κB的抑制性分子亚组被ATP磷酸化后, NF-κB即被激活。在未受到刺激的细胞中, NF-κB在细胞质中与抑制性蛋白IκB结合, 保持非激活状态。许多蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶及其相应的磷酸酶都是IκB的近似修饰物, 并且其上游的激酶/磷酸酶, 包括那些酪氨酸末端激酶也同样是IκB的近似修饰物。病理性刺激可引起磷酸化和IκB释放。NF-κB随后进入细胞核, 与DNA控制元件结合 (特异性启动子) , 诱导m RNA合成。

特定位点的磷酸化程度可以通过改变蛋白激酶 (PK) 和蛋白磷酸酶 (PP) , 或者同时改变两者的活性来调控。蛋白磷酸化主要由细胞外配体信号启动, 如激素、细胞因子和蛋白多肽生长因子。在细胞外信号中, 生长因子依赖的蛋白酪氨酸激酶 (PTKs) 和蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPs) 对有丝分裂、细胞黏附、细胞分化、原癌基因转化和凋亡至关重要。

内源性H2O2是刺激蛋白激酶途径的第二信使, 参与炎性基因表达。它通过蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPs) 的短暂灭活而发挥作用, 该酶包含一个亲核半胱氨酸作为活化位点的催化元素。PTPs催化的半胱氨酸硫酸盐位点被H2O2选择性氧化。半胱氨酸硫酸盐和H2O2的初始反应产生Sulfenic酸, 它反过来可以激活硫酸盐类。Sulfenic酸的氧化使酶恢复非活化状态避免磷酸化。但是, sulfenic酸是完全可还原的。H2O2的进一步氧化可产生Sullfinic酸 (-SO2H) 和亚硫酸 (-SO3H) 。这些终产物不能转化为半胱氨酸。

另一种涉及H2O2的途径可能也会抑制磷酸酶活化。在H2O2和谷胱甘肽过氧化酶 (GPx) 的作用下, 使GSH被氧化为GSSG。PTP中的游离半胱氨酸硫醇基团与GSSG相互作用形成混合性二硫化物, 并使酶去活化。细胞内的GSH和硫氧还蛋白 (Trdx) 活化可使该二硫化物降解, 从而使PTP恢复活化。当GSH储备不足时 (例如在高度氧化应激状态下) , 由于GSSG水平升高, 磷酸酶仍然去活化。NF-κB可激活多种靶基因, 被认为是一个重要的调节子[3,4]。

4 细胞因子

几种酒精性肝损伤模型均与细胞团于数量增多有关。慢性乙醇灌胃大鼠更易发生内毒素导致的肝损伤。许多类型肝损伤在最早期均有TNF-α生成。它启动了其他细胞因子的生成从而聚集炎性细胞, 杀死肝细胞, 并启动纤维化的修复反应。酒精性肝炎患者血清TNF-α浓度升高。有研究表明, 血清TNF-α浓度升高与肝损伤相关。TNF-α不仅对于肝细胞增生非常重要, 而且是细胞死亡或凋亡、坏死、胆汁郁积和纤维化肝损伤的重要调控剂。抗TNF-α抗体的确能够使酒精性肝病 (ALD) 模型大鼠避免肝损伤。有临床研究报道表明, 应用抗TNF-α单克隆抗体治疗严重酒精性肝炎患者效果良好。

另有研究显示[5], 己酮可可碱 (PTX) 、TNF-α的抑制剂和其他细胞因子可减少酒精肝炎患者发生肝肾综合症。PTX对酒精性肝炎患者肾功能的影响机制尚不明确。而且, 在PTX治疗患者的安慰剂对照组中, 血清TNF-α浓度并无明显下降。肝组织中其他细胞因子对TNF-α在体内对肝细胞的作用有影响。一些人和动物模型的研究表明, 长期酒精摄入不仅与TNF血清浓度升高有关, 还与某些白介素如IL-l、IL-6和IL-8的血清浓度升高有关。酒精性肝炎患者和无肝损伤的酒精依赖者, 其血清IL-8水平均升高。ALD患者IL-6血清水平升高。酒精肝病患者血清IL-6浓度与疾病的生化和临床症状有关联, 而血清IL-6浓度降低与疾病临床改善亦有关系。在酒精诱导肝损伤的兔子模型中, Kupffer细胞活性、TNF-α和相关细胞因子基因转录均增高, 肝炎和肝细胞死亡之间被发现有暂时性密切联系。

ROS和RNS, 在实质细胞中产生的、作为对细胞因子诱导的应激信号, 进一步动员细胞防御机制。如果这些防御机制被抑制, 细胞可能会坏死, 这样更加刺激炎症反应和白细胞渗透。而且, 在摄入乙醇的动物中, 其肝细胞对TNF-a和其他细胞因子引起的细胞毒素作用更敏感。摄入乙醇后, TNF-α诱导的肝细胞死亡包括三个主要的病理改变:酒精性脂肪变性、酒精性肝炎和肝硬化。这些现象部分可以用乙醇暴露后细胞线粒体渗透性转换 (MPT) 微孔被诱导生成来解释。L-肉碱可以减轻乙醇诱导的、TNF-α刺激的大鼠肝损伤。脂肪变性加剧了肝损伤, TNFa参与该过程。

长期酒精摄入可引起炎性分叶细胞和单核细胞向肝脏渗入。炎性白细胞迁移是由肝实质细胞和间质细胞产生的前炎性介质介导的。长期酗酒可诱发内毒血症和加剧脂多糖 (LPS) 介导的肝损伤。

酒精喂饲的大鼠与对照大鼠相比, 血清化学因子和细胞因子的基础浓度均增高。外源性内毒素可使酒精喂饲的大鼠血清化学因子和细胞因子水平进一步升高。这些现象的确切机制还不明了。但是, 慢性酗酒者对低剂量内毒素的前暴露可能使Kupffer细胞对ROS释放的增加和NF-κB的激活更加敏感。

另外一些研究表明, 酒精喂饲的大鼠, 其Kupffer细胞自动产生大量ROS。外源性给予LP S可增强酒精喂饲的大鼠ROS的释放。这种情况下, 化学因子和细胞因子m RNA表达也会上调[5,6]。

Kupffer细胞是炎性和细胞毒性介质的主要来源, 因为它们代表体内大多数的巨噬细胞, 因此它们在酒精性肝病的发生发展过程中至关重要。

5 活性氧 (ROS)

ROS是小的, 高反应性的含氧分子, 可相互作用并损伤复合细胞分子, 特别是在肝脏。乙醇代谢不仅直接参与ROS的生成, 也与氧化应激内环境的形成有关, 如缺氧、内毒血症和细胞因子释放。而且, 酒精可以改变体内某些金属离子水平, 因此促进ROS生成。最终, 酒精降低了可消除ROS的抗氧化物水平。酒精中毒后, 促氧化剂和抗氧化剂的平衡被破坏, 导致脂肪、蛋白质或DNA等生物大分子发生氧化损伤, 最终导致细胞损伤。肝细胞ROS生成和氧化应激在酒精性肝病发生发展中至关重要。氧化应激可能是酒精摄入后引起肝脏炎症和纤维化的主要机理。乙醇诱导的氧化应激对激活肝脏对自身和外来抗原的免疫反应十分重要[6]。

6 还原型谷胱甘肽 (GS H)

GSH是一种十分重要的细胞抗氧化剂, 对于减弱乙醇和其他许多化学物的毒性起很重要的作用。在表达GYP2E1细胞将GSH去除可使其丧失活力。这与线粒体损伤和线粒体膜电位降低有关。令人惊奇的是, CYP2EI表达的细胞可通过激活谷氨酸半胱氨酸连接酶而升高GSH水平。CYP2EI依赖型氧化应激、线粒体损伤、星形细胞活化和GSH内稳态共同参与乙醇的肝毒性作用。酗酒者的自由-SH浓度和给氢能力均下降。乙醇可通过产生氧化剂和抑制线粒体谷胱甘肽转运, 从而降低GSH水平。

ROS是分子氧电子传递链的副产物。呼吸过程中产生的超氧化阴离子和过氧化氢是羟自由基的前体, 该变换需要金属离子的参与。线粒体中的GSH是主要的抵御过氧化氢氧化作用的物质。细胞内的GSH一小部分分布在线粒体内, 通过载体将GSH从细胞质转运入线粒体中。由于该载体功能缺陷, 慢性乙醇喂饲时可选择性的清除线粒体中的GSH。因此肝细胞对细胞因子促氧化剂效应是敏感的。乙醇氧化代谢时产生促氧化剂。慢性酒精摄入诱导的选择性线粒体GSH转运缺陷, 可由线粒体内膜流动性降低所调控[7]。

Laneterburg等 (1984) 研究发现大剂量乙醇不产生氧化应激, 但可增加谷胱甘肽的利用, 同时破坏其合成。线粒体中主要的对抗氧化应激的系统即是利用GSH。迄今为止, 通过隔离线粒体研究谷胱甘肽合成的实验均未成功。因此, 谷胱甘肽被推测是在细胞质中合成后转运至线粒体, 从而形成一个相对封闭的谷胱甘肽池。摄入乙醇后GSH从细胞质向线粒体的转运被抑制, 从而导致线粒体谷胱甘肽池被清除。

在线粒体转运活性被破坏的基础上, 线粒体谷胱甘肽 (m GSH) 的清除使线粒体不能对抗ROS的氧化损伤。在实验模型中, 酒精使胆固醇浓度升高继而积聚于线粒体中, 这导致m GSH储备选择性降低, 而它可使肝细胞对TNFα诱导的细胞死亡敏感。酒精摄人造成的TNFα过量、鞘糖脂生成增加和选择性m GSH消除等3个因素共同使肝脏对酒精敏感。

在某些实验条件下, 酒精可增加肝脏GSH含量, 但这可能是氧化应激时GSH合成反应性增加的结果。慢性乙醇喂饲大鼠, 由于有效的谷胱甘肽循环, GSH水平增高。可惜的是, 乙醇诱导的肝损伤研究中关于线粒体谷胱甘肽含量的研究很少, 而更多地研究肝脏或细胞总GSH水平, 通常不检测封闭性GSH和GSSG。

另外一个重要的特征是, 细胞质和线粒体中GSH降解速度不同。GSSG在线粒体内积聚的主要后果是, 谷胱甘肽蛋白与二硫化物结合而发生蛋白硫醇氧化, 通过关键硫醇团的丢失调节蛋白功能。缺乏GSSG从线粒体流出时发生该情况。线粒体GSH的保持和释放是一个高度调控的过程。分离线粒体保存了绝大部分GSH, 这表明线粒体内膜对GSH没有渗透性。

现已清楚, 线粒体GSH的半衰期较细胞质GSH长。细胞质GSH的慢性清除对线粒体GSH含量也有影响。化学性诱导细胞损伤的启动与线粒体GSH的清除有关, 而与细胞质GSH的清除无关。乙醇介导的肝细胞功能紊乱与线粒体谷胱甘肽清除有关, 而与细胞质谷胱甘肽的清除无关。

在某些病理情况下, 如果基质GSH含量降至正常水平的50%, 则可危及细胞存活。线粒体内的GSSG不会被运输到细胞质中, 谷胱甘肽会增强复合体I生成的过氧化物。因此GSH的损失导致GSSG形成和蛋白质谷胱甘肽化。这种情形可显著增强氧化应激的毒效应, 导致包括细胞凋亡的损伤。

内源性谷胱甘肽-谷胱甘肽过氧化物酶系统和过氧化氢酶在肝细胞暴露于乙醇时是重要的抗氧化剂和细胞保护机制。谷胱甘肽还原酶与细胞还原型GSH水平的保持有关。乙醇暴露可增强谷胱甘肽还原酶和过氧化氢酶活性。慢性乙醇摄入诱导谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶抗氧化系统发生改变, 这可能会促进肝脏线粒体蛋白氧化修饰, 对肝脏产生不良效应。谷胱甘肽流转移酶 (GSTs) 是一组多态酶, 对于保护机体免于氧化应激非常重要[7,8]。

7 脂质代谢

乙醇处理后, 大鼠肝脏, 肾脏, 大脑和心脏组织中游离脂肪酸水平和乙烷基脂肪酸酯含量升高, 它们可能是发生酒精依赖综合征的重要介质。乙烷基脂肪酸酯是乙醇代谢的非氧化产物。乙烷基脂肪酸酯与血浆脂蛋白和白蛋白结合, 被转运到人体不同组织, 诱导该器官损伤。乙醇处理孕大鼠可导致饱和脂肪酸和长链脂肪酸乙烷基酯在母体和胎儿器官中堆积。孕期大鼠摄入乙醇可导致胎儿大脑中二十二碳六烯酸含量下降, 肝脏中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺下降, 血液中多不饱和脂肪酸水平下降。

乙醇的摄入也与血液中甘油三酯和HDL胆固醇水平升高有关。乙醇吸收导致血清胆固醇和肝脏胆固醇酯水平升高。乙醇也可引起血浆膜胆固醇区改变从而改变血浆膜跨膜流动梯度, 并与钙离子、钠离子、钾离子ATP酶活性降低有关。

乙醇对脂质代谢的影响非常复杂。当乙醇存在时, 它便成为肝脏的一种较好的“燃料”, 代替脂肪作为能量来源, 这有利于脂肪积累。另外, 乙醇氧化作用导致的氧化还原状态改变, 通过增强甘油酯形成促进脂质合成。慢性酒精摄入导致线粒体的氧化能力下降, 这也有助于脂肪肝发生。脂肪堆积对于脂蛋白分泌和高脂血症起了促发作用。在酒精摄入早期, 肝损伤还很小的时候, 高脂血症是可逆的, 而在后期的高脂血症则可造成严重肝损伤。

酒精会导致脂蛋白代谢缺陷。VLDL和LDL在饮酒者血液中的堆积是由于LDL受体表达降低引起的。乙醇引起脂蛋白构象发生改变 (从α到β) 。慢性乙醇摄入影响股磷脂脱酚化和再酸化作用。LDL水平增高可能是动脉硬化形成的主要因素[8、9]。

过氧化反应和超氧化物生成与细胞色素P4502E1量有关。微粒体中CYPZE1的诱导, 导致羟自由基 (HER) 的生成, 这是乙醇诱发肝脏中自由基形成的另外一条途径。另外, 乙醇可通过氧化酶催化诱导自由基的形成, 最终产生氧自由基。还有一个自由基产生的原因是, 线粒体氧化代谢发生改变, 从线粒体的流出物增加。乙醇代谢与Kupffer细胞的激活、NF-κB的活化、TNFα的生成和自由基的产生以及氧化应激密切相关。几乎所有的生物结构可被活性氧 (ROS) 修饰。酒精诱导氧化应激的机制, 以及在酒精性组织损伤中自由基的作用, 显然是重要的研究领域, 因为对于避免和改善酒精毒性效应来说, 具有重要的治疗意义。

8 羟自由基

乙醇可引起1-羟自由基生成。其反应性可导致肝脏发生酒精免疫性破坏。在乙醇摄入过程中形成的含量最丰富的两种难是丙二醛和乙醛。它们可与蛋白质发生复杂的反应产生新的混合加合物, 即为丙二醛-乙醛蛋白加合物 (MAAs) 。这些MAA修饰蛋白具有免疫活性可诱发酒精喂饲兔子和ALD病人产生抗体。MAA加合物可诱导T细胞增殖。另外, 它们具有前炎症因子特性, 可刺激肝窦状内皮细胞和Kupffer细胞分泌细胞因子/化学因子。乙醇处理导致丙二醛或HNE蛋白加合物在肝脏堆积, 抗氧化能力下降, 羟自由基增加。羟自由基可能参与肝脏蛋白质的烷化[10]。

9 氧化剂-抗氧化剂系统生物标志物

氧化应激可发生在不带有严重肝疾病的重度饮酒者体内。微粒体丙二醛形成增多和抗氧化剂α维生素E水平下降, 可刺激肝细胞色素P450单加氧酶活性。因此, 血清丙二醛和α维生素E的水平被推荐为酒精性氧化应激的生物标志物。对于重度饮酒者, 氧化型LDL、高级糖基化终产物和乙醒蛋白加合物水平的升高是典型的结果[11]。

1 0 结论

乙醇的氧化作用与肝细胞氧化还原内稳态的改变有关, 可导致多种代谢紊乱。乙醇本身、高乳酸血症和NADH升高, 均会增加黄嘌呤氧化酶活性, 这样便导致超氧化物的形成。脂质

《中国公共卫生管理》杂志

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参考文献

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氧化应激篇2

[关键词] 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶氧化应激糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种严重的糖尿病并发症，目前在经济发达国家已成为成人致盲的主要原因。高血糖会导致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)过量产生，使多个组织发生氧化应激，而氧自由基则可以通过糖基化终末产物(AGEs)等多条途径参与DR的损伤过程。最近有研究表明，氧化应激最终有可能是通过激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly ADP-ribose polymerase，PARP)而发挥作用的[1]，而PARP抑制剂的使用为DR的治疗带来新的前景。

1 PARP的结构与功能

1.1 PARP的结构

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 (poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一类存在于多数真核细胞中的催化聚ADP核糖化的核酶。PARP最早于1963年由法国斯特拉斯堡Mandel小组在肝细胞核中发现[2]。它主要存在于细胞核内，少量存在于细胞浆内[3]。目前研究发现，PARP家族至少有：PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4/VPARP、Tankyrase-1和-2 6个成员。PARP-1是PARP家族中最早被发现，而且特性了解最清楚的成员。它是由1014个氨基酸残基组成的一条多肽链，分子量为116 kDa，含有3个功能性结构域：DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD，46kDa)，自身修饰域(the automodification domain，AMD，22kDa)和C-端催化域(catalytic domain，54 kDa)。其中DBD含两个锌指结构(Zn-finger)及核定位信号（nuclear localization signal，NLS），这两个锌指结构参与识别DNA缺口，第1个锌指识别DNA单链和双链断裂，它的突变会降低PARP的激活；第2个锌指只参与DNA单链断裂的识别，NLS含有与凋亡相关的DEVD模体。AMD能使ADP与糖基结合，发生PARP自身糖基化，并使PARP形成二聚体。C-末端的催化结构域含有NAD+结合位点，能把NAD+转化为ADP核糖，此序列高

度保守[4、5]。

1.2 PARP的功能

PARP具有维持染色体结构完整，参与DNA复制和转录的功能，在维持基因组稳定和细胞死亡过程中发挥作用。DNA断裂可以激发基因重组，PARP能结合到受损DNA的断端从而减少重组发生，并使受损的DNA避免受核酸外切酶的作用而产生重组中间物。PARP在DNA损伤时被激活，作为DNA损伤的分子感受器识别并结合到DNA的断裂部位，从而保护裸露的DNA末端免遭核酸酶的分解，参与DNA的修复[6]。PARP还能通过协调DNA修复与DNA复制、转录、细胞周期的推进之间的关系，来促进DNA修复[7]。

PARP激活促进DNA的修复，但过度的PARP活化将引起细胞能量耗竭而死亡。Lin等研究发现，在PARP的催化下，每转化一个ADP核糖，需要消耗2个ATP才能从尼克酰胺再合成一分子的NAD+，尼克酰胺转化成尼克酰胺单核苷酸(NMN)需要消耗5-磷酸-α-D-核糖-1-焦磷酸和一个ATP，NMN再转化为NAD+又需要另一个ATP。这样，PARP的过度活化可以导致无谓的NAD+转化和ATP消耗。NAD+的消耗也能通过降低糖酵解和氧化磷酸化的方式减少ATP[8]，最终导致细胞死亡。

2 PARP与细胞氧化损伤

2.1氧化应激损伤引起线粒体DNA（mtDNA）损伤的机制

2.1.1自由基介导的mtDNA损伤

自由基主要来源于线粒体氧化磷酸化过程，是线粒体正常代谢的副产物，由线粒体电子传递链产生，但是过量的自由基产生便会损伤线粒体。自由基可以广泛攻击体内生物大分子。由于mtDNA缺乏组蛋白，与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近，复制快速且无校读功能以及缺乏有效的DNA修复机制，所以mtDNA较易受自由基攻击、氧化损伤而引起突变，其突变率是核DNA的10倍。

自由基通过攻击mtDNA的碱基和糖基，最终可导致mtDNA的点突变、缺失和插入突变，其中以片段缺失多见。氮氧自由基还可以使DNA脱氨基并诱导其突变，并增强线粒体对氧化应激的敏感性。当线粒体受到损伤，内膜通透性增加时，线粒体释放细胞色素C和凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)，诱导细胞凋亡。

2.1.2 脂质过氧化导致mtDNA损伤

Nakayama等在1984年发现α-生育酚（维生素E）可通过将氢给予脂质自由基而抑制DNA自由基的形成。两年后，他又发现α-生育酚可以阻止甲基亚麻酸过氧化氢(methyl linoleate hydroperoxide)诱导的DNA损伤。Andrew M.H于1988年观察到α-生育酚可同时阻止脂质过氧化和DNA损伤。尽管脂质过氧化作用诱导mtDNA损伤的确切机制并未得以阐明，但可以推测脂质过氧化过程中产生的LO•、LOO•等自由基可以发挥类似•OH对DNA的攻击作用。

线粒体是机体能量的主要产生场所，机体内80%以上的能量产生于线粒体。由于线粒体是机体的“动力工厂”，mtDNA损伤可导致线粒体功能缺陷，引起细胞能量不足而造成细胞的衰老与死亡。氧化应激通过以上各种途径攻击mtDNA，导致mtDNA链断裂等改变，进而激活PARP，从而引发后续的一系列生化反应。

2.2 PARP对DNA的损伤和保护作用

PARP-1参与调节DNA的修复、基因组完整性的维持及在转录复制分化水平上各种蛋白质的表达。适度的细胞损害可以造成安全范围内的细胞死亡，这些细胞死亡是由凋亡及严重的DNA损害所导致的不可逆转的死亡。轻微的DNA损害刺激了PARP-1，这有利于DNA的修复及细胞的存活。然而，过度的PARP激活则导致细胞坏死。如过氧化亚硝酸盐（ONOO-）等诱导的氧化和/或硝硫氰酯应激常常导致大量的DNA断裂，ONOO-能够潜在触发DNA链的断裂及继发的PARP的激活。缺血/再灌注损伤与氧化及硝硫氰酯应激有关，最终也能导致PARP的激活，耗竭与之相关联的NAD+及ATP，这种耗竭导致细胞功能异常并最终发生坏死，坏死的细胞释放炎症介质，进一步加重周围组织损伤。PARP作为凋亡与坏死之间的分子开关的作用，已经在给予PARP抑制剂的大鼠实验中被证实，PARP抑制剂能在氧化应激的细胞中抑制或灭活PARP并能保存细胞中的NAD+及ATP。在这种情况下，细胞能保持正常的形态，保护细胞避免坏死。

PARP的另外一个作用就是参与氧化损伤DNA蛋白的降解、清除，避免进一步损伤细胞。蛋白酶体系统是一类能降解、清除氧化损伤蛋白的物质，在维持细胞内正常的代谢环境中起重要作用。研究表明，PARP-1在ROS中的作用是诱导核蛋白酶体的激活，poly-(ADP-ribose) (pADPR)、PARP 及20S核蛋白酶体之间的相互作用增强了酶的活性。PARP-1能干扰核蛋白酶体的非共价键，激活的PARP通过非共价相互作用增加了20S核蛋白酶体的蛋白水解活性，从而有利于氧化损伤DNA蛋白的降解、清除。所以，PARP最有可能是DNA修复及氧化蛋白质清除的协调交叉点。

PARP激活的积极及消极方面的作用：PARP的促进细胞死亡及细胞保护作用看上去似乎是相反的两个方面。氧化应激所致DNA的断裂使PARP高度激活，进而导致NAD+及ATP的耗竭及细胞坏死的持续。另一方面，PARP也利于损伤细胞中的DNA修复。

3 氧化应激与糖尿病视网膜病变

在2004年美国召开的糖尿病学会年会中，Brownlee提出：线粒体电子传递链过氧化物产生过量是诱导高血糖血管损伤进而导致诸如DR等糖尿病并发症的共同机制。氧化应激反映的是体内活性氧及氮簇(ROS/RNS)与抗氧化防御系统之间的消长状态。ROS/RNS过多的产生会通过细胞的脂质过氧化作用、蛋白质的氧化及DNA的改变（链断裂及基本结构变形）导致组织的损伤，并作为急慢性疾病（如缺血/再灌注损伤、全身炎症反应综合征、感染性休克、糖尿病、中风及关节炎）的一个主要发病机制。

血糖水平升高能引起细胞线粒体产生大量的ROS、非酶蛋白糖基化以及葡萄糖的自身氧化，从而引起氧化应激。正常情况下，机体通过激活转录因子AP-1、NF-κB等诱导抗氧化酶如：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等的表达，清除自由基，对细胞产生特异性保护作用。但在高血糖情况下，抗氧化酶的表达受到抑制，视网膜抗氧化系统防御能力减弱。研究发现，在高糖环境中培养视网膜Müller细胞和血管内皮细胞，细胞线粒体中的超氧化物生成增多，导致视网膜内皮细胞凋亡，而使用抗氧化剂如锰超氧化物歧化酶(MnSOD)或者脂质酸能阻止细胞凋亡。在DR早期，NO的合成能被高血糖诱导生成的超氧阴离子抑制，但随即由于NADPH氧化酶的活化、NF-κB的表达上调，激活了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，从而合成了大量的NO，并且与超氧阴离子很快合成ONOO-，ONOO-可导致DNA单链断裂，激活PARP，活化的PARP可使ADP-核糖从其底物NAD+解离，转移到自身或其他蛋白，NAD+的耗竭可消耗ATP，导致细胞功能障碍。

氧化应激对视网膜血管内皮细胞、周细胞、神经节细胞和血-视网膜屏障均有影响。研究表明，注入链唑霉素（STZ）的糖尿病大鼠视网膜超氧化物岐化酶水平降低，其他抗氧化物如还原型谷胱甘肽(GSH) 水平下调。GSH等大量消耗，使得视网膜毛细血管内皮细胞处于氧化应激和硝基化应激状态，诱导细胞凋亡，释放致炎因子如血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、内皮素-1(ET-1)等，导致早期DR血流动力学改变和微血管病变。Li和Renier发现，在培养牛视网膜血管内皮细胞中，氧化应激损伤可致视网膜内皮细胞活性氧生成增多，同时VEGF表达上调，说明氧化应激与视网膜上VEGF的过度表达有关。El-Remessy等通过比较不同葡萄糖浓度下培养的视网膜内皮细胞，发现高血糖状态下的视网膜内皮细胞产生的硝基酪氨酸增加[27]。在糖尿病大鼠视网膜和高糖培养的视网膜内皮细胞中都可发现NO含量增高，而且NO使血-视网膜屏障通透性增高。在高血糖状态下，氧化应激通过以上各种方式损伤视网膜内皮细胞，损伤的内皮细胞能产生ROS，ROS破坏DNA，导致PARP快速激活。异常活化的PARP会大量消耗细胞内底物NAD+，减慢糖酵解、电子运输、ATP形成及GAPDH的ADP核糖基化作用，使细胞的ATP合成减少，细胞因ATP耗竭能量缺乏而发生坏死，坏死的细胞释放炎症介质，进一步损伤周围组织。另外，PARP还能启动核转录因子如NF-κB，AP-1等，释放大量炎症因子，导致糖尿病视网膜微血管的急性内皮功能障碍，进而引起严重的视网膜病变。

4 PARP与糖尿病视网膜病变

4.1 PARP在糖尿病视网膜中的高表达

最近研究发现，在注入STZ4周的糖尿病大鼠的视网膜神经细胞层中发现PARP的存在。此外，其他研究发现[32]，在注入STZ12周大鼠的视网膜神经细胞层、内核层、外核层及视网膜血管的内皮细胞及周皮细胞的细胞核内亦有PARP的高表达。Irina G等研究表明，PARP抑制剂3-aminobenzamide和1，5-异喹啉能明显抑制糖尿病视网膜上氧化应激导致的MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）和NF-κB的激活、ET-1和环氧合酶-2的过度表达及炎症反应。在Zheng等人的研究中，还发现一种PARP抑制剂PJ-34，同样能抑制上述反应。

4.2 PARP激活致糖尿病性视网膜病变的可能机制

Ling Zheng等人在体外研究中发现，高糖浓聚物比普通水平血糖诱导更多的PARP与核转录因子（NF-κB）的p50亚单位结合。与5mmol/L的葡萄糖浓度相比，在提高葡萄糖浓度（25mmol/L）后有更多的PARP被合成p50的亚单位结合。研究表明，牛视网膜血管内皮细胞中被激活的PARP可以直接干扰NF-κB的两个亚单位(p50 和 p65)，并调节它们的转录活性。在高糖环境中，增加p50与PARP之间的相互作用有助于聚集NF-κB的其他共活化物，如组蛋白乙酰转移酶p300，以形成一个转录复合物，调节NF-κB相关基因的表达。另外，有研究发现，PARP参与了NF-κB的激活及炎症因子的表达，包括细胞间粘附分子-1、TNF-β、iNOS等。NF-κB的激活、细胞间粘附分子-1、TNF-β、iNOS与糖尿病所致的血管内皮功能障碍有关。因此，PARP的活化可能部分通过调节NF-κB从而在高血糖导致的视网膜血管内皮细胞的死亡中起重要作用。

5 PARP抑制剂在糖尿病性视网膜病变中的应用

Sugawara等人研究发现，高糖环境下会导致细胞中NF-κB活性的增加，但在PARP活性被抑制的细胞中，NF-κB的活性也下降。PARP抑制剂PJ-34阻止了高血糖所致的NF-κB激活作用的增加。Zingarelli、Salzman和Szabo 等人报道，在PARP活性被抑制的细胞中，细胞粘附分子-1的表达也被抑制。PARP的抑制可能通过抑制NF-κB的活性及细胞间粘附分子的表达，从而抑制了糖尿病视网膜上白细胞的粘附。另外他们还发现，PARP抑制剂能够改善血管内皮功能，从而减少白细胞与受损的血管内皮粘附。在Irina G等的研究中，也证明PARP抑制剂能抵抗STZ-糖尿病大鼠VEGF的过度表达和神经细胞的凋亡作用。而VEGF能增加血管的渗透性及诱导增生性糖网病血管的发生。最近报道，PARP还能够调节与细胞凋亡有关的几种基因，包括caspase-1和caspase-3。但是至于哪一种细胞凋亡基因在糖尿病视网膜疾病中被激活及PARP如何调控它们还有待进一步研究。

6 展望

糖尿视网膜病变是眼科的常见病、多发病，但目前尚无有效的治疗方法来逆转DR的发展与转归。糖尿病大鼠视网膜微血管PARP活性明显增加，给予PARP抑制剂如PJ34治疗后，可纠正糖尿病内皮细胞的功能紊乱，视网膜病变显著改善。虽然PARP在DR发病机制中的具体作用还有待进一步研究，但目前研究已经发现PARP抑制剂在改善糖尿病视网膜病变上起着不可忽视的作用，有望在改善DR的发生和预后中发挥更大的作用，为DR的预防和治疗上带来新的希望。

参考文献

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[2] Masutani M,Nakagama H,Sugimura T.Poly(ADP-ribose) and carcinogenesis. Genes Chromosomes Cancer 2003;339-348

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[4] Ngwa PA，Fuertes MA,Valladares B，AlonsoC，PerezJM. Poly(ADP-ribose) polymerases:homology,structural domains and functions.Novel therapeutical applications.Prog biophys Mol Biol 2005;88:143-172

[5] Virag L,Szabo C.The therapeutic potential of poly (ADP- ribose) poly- merase inhibitors.Pharmacol Rev 2002；54:375-429

[6] KarenLGilliams-Francis,AuroraAQuaye,Janice RNaegele.PARP cleavage, DNA fragmention,and pyknosis during excitotoxin-induced neuronal death[J].Experimental Neurology,2003,184∶359~372.

[7] Jackson SP.The recognition of DNA damage[J].Curr Opin Genet Dev,1996,6:19-25.

氧化应激与器官损害篇3

1 氧化应激与肺脏

人体气道的外侧表面积有1~2 m2,与环境直接接触,因此最易受到吸入气体(烟雾、硫氧化物及N2等)的氧化损伤,同时肺泡细胞还暴露在局部产生的内源性氧化物中。氧化应激参与了众多肺部疾病的发病过程。这些疾病虽然发病特点各不同,但其共同病理基础都是肺内炎性细胞的活化、聚集和氧化-抗氧化系统的失衡[1]。

ROS引起肺损伤的机制:(1)脂质过氧化:不仅直接导致生物膜损伤和各种功能障碍,过程中还生成大量新的ROS和高细胞毒性可与蛋白质交联的丙二醛(MDA)。(2)ROS可与蛋白质中氨基酸残基起反应,破坏蛋白质的一级结构和功能。(3)ROS可直接攻击核酸,可致DNA严重损伤、断裂,最终可导致细胞死亡。(4)ROS可以活化转录因子,尤其是核因子(NF)-κB,后者参与调节许多前炎症基因,从而间接参与肺损伤。另外,ROS可减弱肺部抗蛋白酶保护层。ROS使人类主要抗蛋白酶如α-抗蛋白酶1(α1-AT),白细胞蛋白酶抑制剂失活[2]。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)是一种具有气流受限特征的肺部疾病,气流受限不完全可逆,呈进行性发展。氧化应激能引起脂质过氧化,导致抗蛋白酶失活、气道上皮损伤、黏液分泌增加。众多证据表明COPD患者存在氧化应激增强,氧化一抗氧化失衡[3]。有研究证实COPD急性发作期血浆总抗氧化能力低于不吸烟健康人。COPD临床恢复期患者血单个核细胞产生ROS细胞数较COPD缓解期多,产生ROS总量高[4]。

哮喘是一种可逆性气道阻塞伴有气道高反应性的慢性炎症疾病,以炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸粒细胞等)大量注入和激活为特征;炎症和免疫细胞可以产生大量ROS,而后者对肺泡上皮细胞产生直接氧化损伤[5]。ROS通过增加气道反应性和直接刺激气道黏膜引起组胺释放而参与哮喘的发病机制,而哮喘恶化时又会产生更多的ROS[6]。目前哮喘的治疗按照其严重程度而定,故对哮喘严重程度的评估具有重要意义。NADEEM等[7]的研究表明哮喘患者氧化应激和抗氧化能力与其疾病的严重程度无显著相关性;PICADO等[8]对此进行的研究结果表明除了GSH2px外,其它诸如维生素A、C、E以及锰、锌、硒等均与哮喘严重程度无关。YAMADA等[9]的研究结果表明急性发作期患者与稳定期患者相比,其血清中抗氧化剂硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)显著提高,而这些急性发作期患者在发作时血清中TRX与缓解后相比,亦显著提高。稳定期患者按照哮喘严重程度分类TRX无显著差异。

2 氧化应激与肝脏

氧化应激造成肝细胞损伤的可能机制:(1)肝细胞大小膜泡的形成;(2)膜通透性、流动性丧失;(3)肝细胞钙超载,激活Ca2+依赖蛋白酶,活化磷脂酶及核酸内切酶等;(4)线粒体功能异常和ATP耗竭;(5)直接活化信号转导分子。CZAJA等[10]证实,甲萘醌通过氧化应激机制诱导RALA肝细胞死亡,与活化蛋白AP-1有关。

MAHMOOD等[11]发现,丙型肝炎患者血清活性氧分子增加;肝组织中经脱氧鸟苷、MDA及相关产物增加,主要分布在碎屑样坏死区及门静脉周围。肝组织铁蓄积也远高于乙型肝炎患者,铁含量增加的机制尚不清楚,其结果导致血中氧化应激指标即MDA,碳基蛋白水平增加。氧化应激程度还与血清ALT水平直接相关。慢性病毒性肝炎患者氧化应激损伤常伴有致纤维化因子一肿瘤坏死因子α(TNF-α)和TGF-β升高,TGF-β在肝组织有轻度炎症时即升高,并与组织损伤及纤维化程度直接相关。

肝缺血再灌注损伤是肝组织细胞缺血一段时间后重新恢复血液供应时发生肝代谢解毒能力降低、循环阻力升高甚至肝功能衰竭的复杂的病理过程,其发生机制较复杂,目前认为氧自由基及其引发的脂质过氧化反应是其主要的发生机理[12]。肝缺血时,一方面由于ATP减少,膜泵功能发生障碍,黄嘌呤脱氢酶(XD)大量转变为黄嘌呤氧化酶(XO);另一方面ATP不能用来释放能量,并依次降解为ADP、AMP和次黄嘌呤,故在缺血组织内次黄嘌呤大量堆积;再灌注时,大量分子氧随血液进入缺血组织,XO在再催化次黄嘌呤转变为黄嘌呤并进而生成尿酸的反应中,都以分子氧为电子接受体,因此产生大量的氧自由基;此外,ATP减少导致氧自由基清除系统(如SOD等)功能发生障碍,进一步促使氧自由基水平的升高。氧自由基具有极为活泼的反应性,介导脂质过氧化反应增强,可使膜受体、膜蛋白酶和离子通道的脂质微环境发生改变,导致功能障碍,同时由于脂质过氧化反应代谢产物MDA与膜磷脂、蛋白质分子等形成共扼交联和聚合结构,使膜的基本特性破坏,致细胞死亡[13]。

3 氧化应激与心血管

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是以血管内皮细胞完整性破坏,平滑肌细胞和成纤维细胞增生为主的疾病。其主要特点是在大、中动脉内膜下脂质粥样斑块形成。ROS通过使过氧化脂质增加,导致红细胞和血浆蛋白交联而使血黏度升高。同时,ROS激活单核细胞,通过核因子κB的激活诱导诸如肿瘤坏死因子、白介素等多种细胞因子的表达。细胞因子诱导巨噬细胞和内皮细胞进入内皮层,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,OX-LDL)被巨噬细胞膜上的清道夫受体识别,进行不受负反馈调节的摄取。脂质过度积聚,平滑肌细胞在ROS的间接作用下迁移、增生,形成泡沫细胞,最终导致AS形成[14]。另外,研究证实,与稳定型心绞痛相比,ROS产物在不稳定型心绞痛中表达很高,这表明ROS可能也参与调节斑块的稳定性。ROS诱导基质降解酶(如:基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9)的表达启动了斑块的不稳定性[15]。

心肌缺血/再灌注损伤基本病理生理学与再灌注后最初数分钟内氧自由基过量产生和细胞内钙超载或再分配密切相关。再灌注初始阶段,自由基释放与再灌注诱导抗氧化剂减少并存,丰富的氧供引发了复流数分钟内氧自由基爆发,大量氧自由基产生远胜过机体内源性抗氧化系统的保护作用,导致了脂质过氧化和胞膜完整性破坏,脂质过氧化是再灌注损伤的重要因素。细胞膜损伤使Ca2+内流增加,导致细胞内Ca2+超载。随着再灌注时间延长,多形核中性粒细胞激活并聚集于受损细胞处,中性粒细胞血液流变学特性以及局部血小板黏附、聚集及微血栓形成有助于滞留在毛细血管中,导致无复流现象发生,进一步使自由基产生增多。此外,大量聚集和黏附的中性粒细胞释放氧自由基、蛋白酶和炎性介质(如核因子κB、细胞间黏附因子1、肿瘤坏死因子等),并增加了中性粒细胞向受损心肌的渗透,从而诱发心肌炎性反应,进一步加重心肌的损伤[16]。

VAZIRI等应用Sprague-Dawley大鼠,喂服谷胱甘肽合成酶抑制剂buthionin sulfoximine(BSO,500mg/L饮用水)2周以造成谷胱甘肽耗竭促进氧化应激。为研究谷胱甘肽耗竭造成的氧化应激,一组大鼠继续同时应用BSO和抗氧化剂(维生素E、C)。安慰剂治疗组和抗氧化剂治疗组大鼠作为对照组。BSO处理大鼠表现出谷胱甘肽耗竭、氧化应激、严重的持续性高血压、尿中一氧化氮(NO)代谢产物排泄减少,所有主要器官中均有大量的硝基酪氨酸蓄积(表明ROS介导的NO失活和螯合)。联合抗氧化治疗后,尽管仍存在严重的谷胱甘肽(GSH)耗竭,但高血压降低,组织中硝基酪氨酸蓄积减少,尿中NO代谢产物排泄减少。相反,抗氧化治疗对正常大鼠的血压,组织硝基酪氨酸蓄积和NO代谢产物排泄情况均无影响。这为氧化应激介导了高血压提供了证据。p22phox是NADPH氧化酶的重要亚单位,p22phox启动子930(A/G)多态性,决定高血压患者对氧化应激的基因敏感性,可能是与高血压相关的新的遗传标志物。有研究表明,对抗ROS能使血压降低,内皮功能、肾功能改善,逆转动脉重构[17]。SOD过度表达降低血压和氧化标志物,增加NO和内皮依赖的舒张;SOD拟似物Tempol可以降低AngⅡ诱导的主动脉过氧化物的生成,部分逆转高血压和动脉重构[18]。

4 氧化应激与老年痴呆症

原发性老年痴呆(Alzheimer’s disease,AD),是老年期痴呆中最常见的类型。临床主要表现为记忆力进行性减退,认知功能下降,并伴有人格和情感障碍等。目前AD的发病机制尚不清楚,大量研究表明,β2淀粉样蛋白(β-amyploidprotein,Aβ)沉积在AD发病中起关键作用。AD的病因学中,其理论之一就是氧化应激学说,近年研究发现,Aβ的毒性作用与自由基有关。氧化应激参与了Aβ致神经毒性的调节,其机制可能是间接通过胞内活性氧,如氢氧化物等的产生增多而引起的。许多证据显示[19],在老年痴呆症患者出现神经元及病理变化的极早期,在易感神经元中就有氧化损伤出现,说明氧化损伤是导致疾病的一个早期因素。很多氧化应激标志物在神经缠结还未形成之前就已经可以检测到。白羰基及硝化酪氨酸残基水平的升高,标志着蛋白质的氧化修饰。蛋白质组织学研究发现一些特异性氧化的蛋白,其中很多是参与ATP生成或糖酵解的酶,如肌酸激酶,其参与产生用于ATP合成的高能磷酸盐。因此,对这些蛋白的氧化修饰可导致老年痴呆症患者的代谢损伤[20]。此外,氧化过程还可产生一些蛋白的相互交联,这些非正常的蛋白即使在高度泛素化之后,仍然无法在细胞内及细胞外清除。此类能抵抗蛋白水解作用的神经纤维缠结在老年痴呆症的病理过程中发挥重要的作用[21]。

5 氧化应激与抗氧化治疗

内在的抗氧化防御可以被分成一、二、三级。一级防御是指阻止自由基形成的系统,如在细胞外液中拥有结合铁的特性的转铁蛋白和乳铁蛋白等。二级防御移动或灭活形成的ROS。包括酶系统比如超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶,和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),以及非酶样分子比如还原型谷胱甘肽(GSH)、维生素E、维生素C、白蛋白、黏蛋白等。三级防御用来移动和(或)修复氧化破坏的分子,对蛋白和脱氧核糖核苷酸特别重要[22]。

褪黑素(melatonin,MLT)是一种由松果体产生的激素,具有显著清除活性氧的能力。应用MLT可以减轻肾脏氧化应激,延缓肾脏纤维化。MLT还可降低血脂水平。在链脲霉素诱导的糖尿病模型中,MLT可以减少蛋白尿,抑制肾脏TGF-β和纤维连接蛋白的表达。对环孢素肾病模型应用MLT预处理,可以减轻肾小管和肾小球的损伤[23]。QUIROZ等[24]人发现肾切除后服用褪黑素12周的斯普拉-道来(氏)大鼠有明显改善氧化应激并且显著减弱了NF-κB的激活,肾间质炎症以及肾小球硬化和肾小管间质性损害。

维生素E是常见的脂溶性抗氧化剂,其抗氧化作用表现在对许多脂溶性自由基有高度的反应性,是超氧自由基的中间受体,能抑制单氧活性,并通过细胞外非酶机制清除自由基,与不饱和脂肪酸竞争与自由基的结合,从而阻止脂质氧化过程中的连锁反应。维生素E间接调节细胞内GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)的活性,使其水平升高,还可调节信号传导途径影响细胞对氧化应激的反应[25]。维生素E可以抑制蛋白激酶C和NF-кB的活化,降低血小板的黏附性,阻止血管平滑肌的增殖,抑制单核巨噬细胞释放炎症介质,对炎症进展和动脉粥样硬化的发生具有保护作用[26]。口服大剂量维生素E可以改善血液透析患者的氧化应激状态并具有抗炎效应[27]。

值得注意的是,YASMIR等[28]提出活性氧簇介导的组织损伤和功能不全的保护取决于多种抗氧化酶和氧化物清除分子的协作以及活性的平衡。除非特别缺乏,单一且大剂量地补充这些分子中或者它们的同功物,可能导致抗氧化系统的失衡进而效果微弱或者没有,甚至可能有潜在的危险。

6 氧化应激与麻醉期吸入氧浓度

氧化应激篇4

1 材料与方法

1.1 试剂

1 640培养基购自美国Gibico公司,胰酶(Trypsin)购自北京邦定生物医学公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司,13和50 nm、10 μm氧化铝颗粒、丝裂霉素C均购于美国Sigma公司,cy 5.5荧光标记氧化铝颗粒由大连理工大学孙世国教授惠赠,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)购于南京建成生物工程公司。

1.2 仪器

二氧化碳培养箱由德国Heraeus公司生产,SW-CJ-2F型超净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产,KY-I 型微型空气压缩机由绍兴市卫星医疗设备制造有限公司生产,80-2B型离心沉淀机由盐城市科学仪器厂生产,LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器由江阴滨江医疗设备厂生产,AB104-N电子天平由上海电子仪器厂生产,OLYMPUS BX51荧光显微镜由日本OLYMPUS公司生产,nano-ZS90纳米粒度仪由英国Malvern公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 纳米颗粒的表征

用双蒸水配制纳米氧化铝悬液,超声处理10 min后,用nano-ZS90纳米粒度仪(Malvern)检测纳米颗粒的尺寸及电位。

1.3.2 CHL细胞培养及染毒

1.3.2.1 CHL细胞培养

CHL细胞由中国辐射防治研究院安评中心惠赠,将CHL细胞以1×105/ml的密度接种在细胞培养瓶中,然后于培养箱(37 ℃、5%CO2、95%湿度)中培养。

1.3.2.2 染毒

选取生长良好的同批次CHL细胞,待其铺满瓶底70%～80%时染毒。分别用13和50 nm氧化铝和 10 nm氧化铝颗粒对CHL细胞染毒。设剂量组为空白对照组、低剂量组(15 μg/ml)、中剂量组(30 μg/ml)、高剂量组(60 μg/ml),阳性对照组(丝裂霉素C 0.5 μg/ml),继续培养24 h以收集细胞进行各项指标检测。不同粒径的氧化铝颗粒染毒前超声处理10 min。

1.3.3 碱性SCGE试验

1.3.3.1 单细胞悬液的制备及电泳

CHL细胞染毒24 h后弃去培养基,用0.25%胰酶消化,弃胰酶,用PBS洗脱细胞,1 000 r/min,离心4 min,收集各组细胞并分散成单个细胞,制备成1×106/ml细胞悬液。细胞悬液与低熔点琼脂糖(LMPA)混合,滴在正常熔点琼脂糖(NMPA)涂片上;细胞裂解液使细胞膜破裂,碱性缓冲液使DNA解螺旋,室温下置恒压25 V,电流300 mA,电泳25 min。切断电源,用中和缓冲液浸洗3次×5 min。EB染色,荧光显微镜下观察。拍摄×400倍照片,每个样品至少随机挑选100个细胞测定。

1.3.3.2 分析

用CometIMI 11.0软件分析,测量Olive尾矩,即尾部DNA百分含量×(尾光密度中心-头光密度中心)。

1.3.4 氧化应激指标的检测

染毒24 h后的CHL细胞,用胰酶消化、洗涤、离心、收集细胞同上,再用生理盐水清洗2次,细胞悬液用超声粉碎器粉碎,离心收集上清液进行氧化应激指标的检测。试验过程按照谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒的说明书进行。

1.3.5 荧光标记纳米颗粒进入细胞情况

取cy 5.5荧光标记的纳米氧化铝颗粒(13 nm)、纳米氧化铝颗粒(50 nm)、微米氧化铝颗粒(10 μm)染毒细胞,染毒终浓度为30 μg/ml,染毒3 h时用Hoechst荧光染液加入细胞培养液中,终浓度为5 μg/ml,15 min后用D-Hanks液清洗2次,在荧光显微镜下观察不同粒径氧化铝颗粒进入细胞情况并摄片。

1.3.6 统计分析

采用SPSS 13.0统计软件对各项指标的实验数据进行处理,用undefined表示,采用析因设计方差分析进行不同因素、不同水平间的比较,多重比较用LSD检验。

2 结果

2.1 纳米氧化铝的表征

不同粒径的纳米氧化铝颗粒表征具体数值见表1。

2.2 SCGE检测结果

试验所得的彗星图像见图1。空白对照组彗星头部DNA致密,无明显尾部或尾部很短。各染毒组头部DNA集中,亮度较强,尾部由DNA断片组成呈扫帚状,荧光强度不及头部。利用CometIMI 11.0软件进行数据分析,各组的Olive尾矩数据见表2。不同粒径组Olive尾矩之间差异没有统计学意义。但不同粒径组随着染毒剂量增加,Olive尾矩与空白对照组相比,有增加趋势,高剂量组增加明显,中、高剂量组与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

60 μg/ml组阳性对照组

注:a与空白对照组相比,aP<0.05,bP<0.01。

2.3 荧光显微镜下观察氧化铝颗粒进入细胞情况

Hoechst染色可见CHL细胞的细胞核呈现均匀蓝染的荧光。cy5.5荧光标记氧化铝颗粒为红色颗粒(白色箭头)。融合图为Hoechst染色图和荧光标记氧化铝图组合,图中显示纳米氧化铝颗粒染毒组可见较多的荧光标记的纳米颗粒进入胞质,微米氧化铝颗粒组较少。见图2。

2.4 氧化应激指标

CHL细胞中GSH含量,在不同粒径组之间差异无统计学意义(P>0.05)。但各粒径组随着染毒剂量增加,细胞GSH呈逐渐下降趋势,中、高剂量与空白对照组比,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞中SOD活力,在不同粒径组之间差异无统计学意义(P>0.05)。但各粒径组随染毒剂量增加,SOD活力有降低的趋势,高剂量与空白对照组比,差异有统计学意义(P<0.05)。纳米氧化铝颗粒(50 nm)组的低、中剂量引起细胞的SOD活力短暂上升,与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组SOD活力明显降低,与空白对照组比,差异有统计学意义(P<0.01)。微米氧化铝颗粒(10μm)中剂量引起细胞的SOD活力短暂上升,与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组,明显下降,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞中MDA含量,在不同粒径组之间差异有统计学意义(P<0.05),纳米氧化铝颗粒(50 nm)组的MDA含量比纳米氧化铝颗粒(13 nm)组、微米氧化铝颗粒(10 μm)组含量高。不同粒径组各剂量的细胞MDA随着染毒剂量的增加有逐渐升高的趋势,纳米氧化铝颗粒(13 nm)组的MDA含量在高剂量时最明显,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);纳米氧化铝颗粒(50 nm)组及微米氧化铝颗粒(10 μm)组MDA含量逐渐升高,在中、高剂量时,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

注:GSH—谷胱甘肽;SOD—超氧化物歧化酶;MDA—丙二醛。与空白对照组相比,aP<0.05,bP<0.01。

3 讨论

遗传毒理的评价终点主要是染色体、DNA、基因3个水平。SCGE是一种在细胞水平检测DNA损伤的方法,通过计算各组细胞彗星的Olive尾矩,判断DNA损伤程度。目前最常用的是碱性彗星实验,能够检测单链DNA断裂、双链DNA断裂及碱性不稳定点[5]。遗传毒理的评价常用的哺乳动物细胞为CHL细胞及中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1细胞)等,本实验以CHL细胞为研究对象,了解不同粒径纳米氧化铝颗粒对CHL细胞DNA的影响,为其遗传毒性综合评价提供参考。

本次彗星实验中,随着染毒剂量增加,不同粒径组的各剂量组的细胞Olive尾矩,相对于空白对照组,有增加趋势,中、高剂量组升高明显,表明纳米、微米氧化铝颗粒均可以引起细胞DNA损伤,且随着染毒剂量增加,DNA的损伤加重。但不同粒径氧化铝颗粒的相同染毒剂量组之间的DNA损伤差异没有统计学意义。另外,阳性对照组平均细胞Olive尾矩是不同粒径组的最高剂量组的三四倍,提示纳米、微米氧化铝颗粒对细胞DNA的损伤作用相对阳性对照组比较弱。

目前研究表明,纳米颗粒可以对细胞产生氧化应激损害。本实验中我们首先观察纳米、微米氧化铝颗粒进入细胞情况。通过使用荧光标记的纳米及微米氧化铝颗粒和Hoechst染色发现,纳米氧化铝颗粒染毒组可见较多的荧光标记的纳米颗粒进入细胞质,围绕细胞核周围,微米氧化铝颗粒组较少,表明CHL细胞可以摄取纳米及微米氧化铝颗粒。研究表明,其他的一些纳米颗粒也可以被细胞摄取。Woodruff 等[6]2012年通过透射电子显示微镜(TEM)及能量色散X-射线光谱(EDS)观察到用纳米TiO2染毒后的TK6细胞内有纳米TiO2,但没有观察到细胞DNA的损害。另外,我们对细胞的GSH、SOD、MDA等氧化应激指标进行测定。本次试验数据表明,随着染毒剂量的增加,各染毒剂量组细胞GSH含量逐渐降低。SOD含量在纳米氧化铝(13 nm)组有降低的趋势,纳米氧化铝(50 nm)组及微米氧化铝(10 μm)组引起细胞的SOD活力短暂上升,推测为低、中剂量的刺激后的代偿。细胞MDA的含量,随着染毒剂量的增加各组的MDA含量呈现升高趋势。综合上述结果显示,随着染毒剂量的增加,细胞的氧化应激反应指标SOD、GSH活力下降,MDA含量上升,表明纳米颗粒进入细胞后,不仅导致CHL细胞膜的损害,同时破坏细胞内抗氧化酶体系的平衡,而且对细胞膜的损伤高于对细胞内大分子物质作用,纳米氧化铝(50 nm)组对于细胞膜的损害比纳米氧化铝(13 nm)组及微米氧化铝(10 μm)组严重。氧化应激各指标的变化与细胞DNA损伤变化,即随着染毒剂量的增加而氧化应激、DNA损伤明显,推测纳米氧化铝颗粒及微米氧化铝颗粒引起细胞氧化损伤可能是其导致细胞DNA损伤的原因,但具体机制有待进一步研究。

综上所述,纳米、微米氧化铝颗粒可以进入细胞,并引起细胞的氧化应激反应,造成膜的脂质过氧化,引起细胞内遗传物质DNA的损伤,并有浓度依赖效应。

摘要：目的通过研究不同粒径及不同浓度纳米氧化铝颗粒对中国仓鼠肺细胞(CHL细胞)DNA损伤及氧化应激的影响,探索纳米氧化铝颗粒遗传毒性及作用机制。方法选用13、50 nm和10μm 3种粒径的氧化铝颗粒为3个粒径组,每种粒径氧化铝又分别设低剂量(15μg/ml)、中剂量(30μg/ml)、高剂量(60μg/ml)组,另设空白对照组和阳性对照组。染毒24h后处理细胞。用荧光显微镜观察cy 5.5荧光标记纳米颗粒进入细胞的情况。用单细胞琼脂糖凝胶电泳(SCGE)检测DNA损伤,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)评估氧化应激反应的指标。结果荧光标记的纳米颗粒在细胞核周围分布。SCGE结果显示,与空白对照组相比,各染毒剂量组Olive尾矩有增加趋势,中、高剂量组Olive尾矩均明显增加(P<0.05)。氧化应激指标结果显示,随着染毒剂量的增加各种氧化应激指标明显变化,高剂量组与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论纳米氧化铝颗粒可以引起CHL细胞DNA损伤和氧化应激反应,氧化应激反应可能是导致遗传毒性的机制之一。

关键词：纳米氧化铝颗粒,单细胞琼脂糖凝胶电泳,DNA损伤,氧化应激

参考文献

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从氧化应激探讨吸烟与血管老化篇5

正常条件下, 人体具备对氧化应激的耐受性, 能够控制具有潜在损伤作用的氧化应激因子。最充分的支持证据就是[2], 人体中具有非常发达的内源性抗氧化防御系统, 它能够拮抗多种活性物质和促氧化剂的作用。比如, 对于超氧化物和过氧化氢这两种典型的氧化物, 人体就具有完整的防御性保护成分。但是, 对于某些活性物质如一氧化氮的代谢产物、过亚硝酸盐等, 人体的防御能力还不强。值得注意的是, 人体的这种耐受性和防御能力会受到诸多因素的影响, 比如吸烟就是重要的破坏因素之一。当这些破坏因素作用于人体时, 自由基或活性物质的产生、清除发生障碍, 氧化还原平衡会向氧化增强状态转变, 由此导致氧化应激的产生。

1 吸烟与氧化应激

研究发现[3], 吸烟除了人所共知的尼古丁的危害之外, 在吸烟的气相和焦油中还存在着大量对人体有害的自由基, 它们可以直接或间接地攻击细胞膜成分, 产生氧化应激反应, 并且导致各种疾病的发生。

首先, 吸烟的过程实际上是一个不完全燃烧的过程, 会产生蒸馏和一系列的氧化还原反应。在这一系列复杂的氧化还原过程中, 很容易发生电子在众多烟草燃烧产物之间的转换, 在焦油和气相中形成多种稳定的和不稳定的产物和自由基。通过电子自旋共振波谱分析发现[4], 焦油中主要包括有几种特别稳定的自由基, 它们主要是醌类自由基 (Q/QH) 、多环芳烃自由基、石墨碳和磷自由基。其中前两者所占的比重较大, 并且是两类可以直接导致氧化应激的重要物质。而产生于气相中的自由基, 则多是瞬时不稳定的自由基, 它们主要是烷氧基 (RO-) 和烷基 (R-) 自由基等, 同样具有促使氧化应激反应发生的能力。

其次, 吸烟所产生自由基的毒性, 以及导致氧化应激反应的方式有直接和间接两种。所谓直接毒性, 就是指吸烟过程中产生的某些自由基可以直接损伤细胞成分, 形成病理改变。所谓间接毒性, 就是指吸烟所产生的焦油相和气相物质可以引起多形核白细胞的聚集和活化, 产生和释放大量活性氧自由基, 从而导致氧化应激损伤。除了上述常见的自由基之外, 吸烟产生的气相物质还会引起细胞膜脂质的过氧化, 从而产生脂类自由基。随着吸烟时间的延长, 脂类自由基和脂质过氧化水平在不断地增加, 其所引起的细胞膜损伤也日益严重。更值得注意的是, 由自旋捕集剂 (PMN) 产生的活性氧自由基, 既可以单独引起细胞成分的损伤, 又可以与吸烟产生的自由基产生联合作用, 共同对细胞产生毒害作用。细胞膜研究还表明[5], 吸烟产生的自由基不仅可以使细胞膜的流动性发生改变, 而且还可以使膜蛋白及酶的构象发生变化, 由此必然影响细胞内外物质的交换, 造成细胞功能的障碍。

再次, 研究已经充分证明, 吸烟通过其产生的氧化应激反应, 能够导致诸多病理改变及相关疾病的产生和进展。比如, 吸烟产生的多种自由基可以联合作用, 通过引起血脂紊乱、血管内皮功能障碍等病理改变, 从而导致血管结构和功能的异常, 心血管事件的发生率也随之上升[6,7]。张晓胡等[8]研究发现, 吸烟通过其产生的氧化应激反应, 能够引起内皮素合成酶释放增多, 血管舒缩功能出现障碍, 以及血管平滑肌细胞增殖活跃等;同时, 低密度脂蛋白 (LDL) 的氧化易患性也增加, 氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL) 水平随之升高, 从而促进了动脉硬化的产生。更进一步的研究结果还有, Raij等[9]认为, 吸烟时所产生的氧自由基, 特别是超氧阴离子可以降低血管内皮释放NO的生物活性, 并且可以抑制内皮细胞合成及表达一氧化氮合酶 (eNOs) 的功能。Cavusoglu等[10]的一项研究提示吸烟促发的氧化应激反应可使血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1) 的血浆浓度急剧上升, 引起内皮炎症反应和内皮功能障碍, 从而加速动脉硬化, 引发冠心病。Winkelmann等[11]研究发现吸烟合并冠心病者, 体内负荷后胰岛素水平及代表氧化应激和内皮功能受损的生化标志物明显高于无吸烟的冠心病患者, 提示吸烟可导致氧化应激的发生、内皮功能的受损和胰岛素的抵抗, 从而增加冠心病的严重程度。

2 血管老化与氧化应激

血管是由内膜、中层和外膜所组成, 构成内膜和中层的主要细胞是血管内皮细胞 (EC) 和平滑肌细胞 (VSMC) , 它们是防御各种应激因子的第一道防线, 并在氧化应激的作用下产生适应性修饰。如果血管内皮细胞和平滑肌细胞因氧化应激发生损伤, 则不可避免地引起血管老化。

首先, 在血管老化的过程中, 其最明显的改变就是顺应性的减小和血管壁的增厚。这种改变不仅仅是出现在老年人群中, 在年轻人群的病变血管中也会出现类似的结构改变。老化血管为了适应血流产生的剪切力和伸展力, 往往需要从根本上改变血管的内皮层, 使其增厚, 以及使内膜细胞的外基质成分发生改变;同时, 血管平滑肌细胞也出现增殖, 并随之产生细胞间质以及细胞外基质蛋白合成的增多[12]。老化血管通常表现为胶原蛋白的成倍增加和弹性蛋白含量的基本不变, 由于弹性蛋白相对含量的降低, 血管于是出现硬化。

其次, 多种活性的自由基物质能够通过氧化应激作用促进血管老化的病理改变。在这些物质中, 活性氧 (ROS) 和活性氮 (RNS) 所产生的生化过程及其调节最具有代表性。ROS如过氧化物和H2O2能引起血管内膜和中层的增厚, 并使血管壁产生炎症反应, 因此被视为血管疾病的“危险因子”。并且ROS在生长因子介导的病理改变中也扮演着重要的信号分子的角色。最新研究发现[13], ROS能够通过NF-κB依赖性途径诱导血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达, 特别是其中VEGFR2的表达。生理情况下, VEGF有助于血管内皮的修复, 而在病理状态下, 由过量ROS产生的过量VEGF就促进了内膜的增厚, 导致了血管的老化。RNS对血管系统的作用具有双重效应, 一方面能够发挥自由基的氧化应激作用, 而另一方面, 还能够通过环磷鸟苷酸 (cGMP) 系统调节各种具有保护性和有益的生理活动。RNS对血管内皮细胞的损害作用与VEGF密切相关。VEGF由VSMC释放, 是EC的促有丝分裂因子。Van-der-Zee等[14]发现在内皮细胞中VEGF可促进NO的合成。然而, 研究发现通过RNS诱导的对核转录因子活化蛋白-1 (AP-1) 与DNA结合的抑制, 能够下调VEGF的表达和减少NO的合成, 从而使血管的修复增殖功能受到抑制, 舒缩功能也出现碍[15]。并且还发现在缺氧状态下, RNS所导致的VEGF基因表达的下调会更加严重, 由此形成了相关病理改变的恶性循环。同时, RNS还能够激活对氧化还原敏感的转录因子如NF-κB和AP-1, 从而上调几种主要的促炎症蛋白, 其中包括有白介素 (IL) -1、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子 (TNF-α) 等, 由此可导致血管炎症反应的产生和加剧, 进一步促进血管老化的发展。而RNS对血管的有益作用主要表现在, NO不仅具有抗动脉粥样硬化的特性, 还能够抑制血小板的聚集、VSMC和EC的增殖以及白细胞的黏附等[16]。

再次, 在氧化应激的作用下, 蛋白质和脂质会产生非酶修饰, 即糖基化过程, 经过复杂而不可逆的分子反应后就合成了糖基化终末产物 (AGEs) 。AGEs是异质性复合物, 积聚在EC内或血管壁上, 从而加速血管的老化[17]。具体的机制主要是, AGEs能够明显地加快EC氧化态的形成, 并且可以通过与特异性受体 (RAGE) 结合以发挥第二信使的功能。AGEs与RAGE的结合既可以促使EC和VSMC的异常增殖, 以及血管内膜和中层的增厚、硬化;还可以活化核转录因子NF-κB和诱导VCAM-1和单核细胞趋化因子-1 (MCP-1) 的表达[18], 从而增加血管的炎症反应。因此, 现在普遍认为AGE/RAGE的相互作用可能是氧化应激和血管老化进展中的潜在机制。

最后, 细胞内出现的氧化应激反应, 以及由此所产生的对于相关基因表达的选择性诱导, 是血管老化的主要分子机制之一。不同的自由基物质可以直接或间接的方式刺激或“致敏”血管细胞, 使其产生活性氧, 进而调控基因的表达。同时, 自由基的生化研究还揭示[19], 许多的自由基及其代谢产物能够经常性地行使细胞内信号转导调节子的作用, 这就为研究氧化应激导致血管老化的机制提供了新的路径。

3 小结

氧化应激篇6

1 材料与方法

1.1 材料

HAEC及内皮细胞培养基购自于美国Scien Cell研究实验室 (Scien Cell 6100) 。胎牛血清购自于杭州四季青生物工程材料研究所。人NO、诱导型一氧化氮合酶 (i NOS) 及内皮型一氧化氮合酶 (e NOS) ELISA检测试剂盒购自于美国R and D公司。超氧化物岐化酶 (SOD) 、丙二醛 (MDA) 测试盒购自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分组

分为对照组 (葡萄糖浓度为5.5 mmol/L) 、高糖组 (葡萄糖浓度为30 mmol/L) 、米格列奈组 (30 mmol/L葡萄糖浓度+10μmol/L米格列奈) 。

1.2.2 细胞培养HAEC

在含10%胎牛血清的培养瓶中常规培养, 条件为:5%CO237℃。在HAECs达80%左右融合时用含2%马血清的DMEM培养液诱导分化成为成熟HAEC。

1.2.3一氧化氮及一氧化氮合酶测定

按说明书制成浓度分为12.5、25、50、100、200μmol/L的标准品稀释液, 分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔加入稀释好的标准液50μL;在酶标包被板上待测样品孔内先加样品稀释液40μL, 然后再加待测样品10μL (样品最终稀释度为5倍) 。轻轻晃动混匀, 37℃温育30 min。弃液甩干后每孔加入酶标试剂50μL, 空白孔除外。轻轻晃动摇匀, 37℃温育30 min。再次弃液甩干, 加入显色剂A50μL, 再加入显色剂B 50μL, 轻轻振荡混匀, 37℃避光显色10 min。取出酶标板, 每孔加终止液50μL, 终止反应。以空白孔调零, 在450 nm波长下测量各孔的吸光度值 (OD值) 。根据标准曲线计算出对应样品浓度。

1.2.4 超氧化物歧化酶的检测

取细胞培养液, 3500 r/min离心10 min, 取上清0.1 m L待测。按照说明书要求加入0.1 m L试剂1摇动几下试管, 再加入试剂2、3、4各0.1 m L, 混匀, 塑料薄膜封口, 刺一小孔, 37℃水浴40 min, 加入显色剂1 m L, 混匀, 室温放置10 min, 于波长550 nm处, 1 cm光径比色杯, 蒸馏水调零, 测各管OD值, 根据公式计算SOD活力。

1.2.5 丙二醛的检测

取培养液, 3500 r/min离心10 min, 取上清0.05 m L待测。按照说明书要求加入0.05 m L试剂1摇动几下试管, 再加入0.75 m L试剂2及0.25 m L试剂3, 混匀, 塑料薄膜封口, 刺一小孔, 95℃水浴40 min, 取出后流水冷却。再次3500 r/min离心10 min, 取上清液, 532 nm处, 1 cm光径比色杯, 蒸馏水调零, 测各管OD值, 根据公式计算上清液中MDA含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 采用one-way ANOVA进行显著性检验, 组间比较采用S-N-K检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物干预HAECs不同时间NO的变化

以浓度为5.5 mmol/L及30 mmol/L的葡萄糖、30 mmol/L的葡萄糖+10μmol/L的米格列奈干预HAECs, 收集培养24、48、72 h的细胞上清液, ELISA法测定NO的含量。结果显示, 与对照组相比, 高糖组24 h NO检测值增高, 且差异有统计学意义 (P<0.05) , 之后随着时间延长, NO含量明显减少 (P<0.05) 。与高糖组相比, 米格列奈组24 h NO含量降低, 之后增高, 48 h及72 h NO含量较高糖组高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

(μmol/L, ±s, n=5)