应激蛋白（精选6篇）
应激蛋白 篇1
热应激蛋白 (HSPs) 是指机体受到激源刺激后产生的具有高度保守性的一类重要的非特异性细胞保护蛋白, 对细胞生长、发育、分化、基因转录、蛋白质合成、折叠、运输等多方面发挥着重要的作用。根据分子量、同源性和功能, HSPs被分为大分子质量HSPs家族, 包括HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、HSP40家族, 以及小分子质量HSPs家族共6个家族, 本文重点介绍了HSP70、HSP90以及小分子质量HSPs家族的结构及功能。
1 HSP70家族
HSP70家族共有20多种蛋白质, 在大多数生物中含量最多, 热应激中表达量的升高最显著。
1.1 HSP70的基因结构
各种生物的HSP70基因具有进化上的高度保守性, 人类HSP70氨基酸序列与果蝇HSP70氨基酸序列的同源性约为70%, 大鼠与人类的HSP70氨基酸序列的同源性约为95%。迄今为止, 在所有生物中均未发现HSP70基因中有内含子, 这一特征保证了在转录启动时不需要剪接就可以产生成熟的m RNA, 以适应其快速大量表达的需要。
1.2 HSP70的生物学功能
1.2.1 分子伴侣
HSP70作为分子伴侣, 其作用是介导新合成、未折叠、错折叠或解折叠蛋白质的正确折叠和组装, 减少不正确的折叠途径, 并维持某些肽链的伸展状态, 以维护细胞的正常功能。当细胞受到激源刺激时, 某些蛋白质肽链伸展, 失去原有的折叠状态, 空间构型改变, 丧失原有功能, HSP70通过促进变性蛋白的修复和水解来维持蛋白质构型, 促进新的蛋白质取代老化变性蛋白质。HSP70可识别未折叠的前体蛋白, 防止其形成不同构象, 也可防止解聚的前体蛋白聚集, 以利于进一步折叠形成最终的装配产物。热应激时诱导产生的HSP70不仅能使细胞的耐热性增强, 而且能使细胞对其它激源的耐受性也增加, 同时能加快恢复蛋白质的正常合成, 从而补充热应激造成的蛋白质量的减少。
1.2.2 抗细胞凋亡
细胞凋亡是受基因调控的一种主动性细胞自杀过程, 应激诱导的细胞凋亡需要应激激酶的激活。研究发现, 细胞内HSP70水平的增高可以阻断信号通路, 抑制应激激酶激活, 从而减少细胞凋亡。HSP70能减轻应激损伤, 保护细胞蛋白质、DNA及RNA的合成途径免受损害, 还具有保护细胞内m RNA加工通路不受损害, 促进己糖转运, 增加细胞内糖原储备等作用。
1.2.3 抗氧化功能
HSP70在细胞内具有抗氧化的生物学活性, 可以增加超氧化物歧化酶的活性, 同时抑制NADPH氧化酶的产生, 从而保护细胞抵抗过氧化物的损害。还可使机体内源性抗氧化剂的合成和释放增加, 产生对热应激较强的抵抗力。
1.2.4 应激保护
有资料显示, HSP70的诱导与对其他应激耐受性的诱导有关。HSP70可结合被损伤的蛋白质, 从而预防它们发生聚集。耐热诱导与HSP70表达量之间的关系比与其他热应激蛋白之间的关系更为密切。
1.3 热应激条件下HSP70的表达
应激是机体受到激源刺激后所作出的全身性非特异性反应, 机体动员内部力量克服或消除各种激源对机体产生的不利影响。Wang等 (2008) 在体外培养牛主动脉内皮细胞以研究热应激后HSP70的动力学, 结果显示, 热应激后3 h和12 h出现HSP70的表达高峰, 6~16 h观测到HSP70从细胞质渐进移位到细胞核。杨圣等 (2007) 选择HSP70作为评价猪成肌细胞热应激效应的主要指标, 结果显示, 热应激状态能诱导猪成肌细胞内HSP70的高表达。孙培明等 (2006) 的研究结果表明, 热应激状态下肉鸡肝脏和心脏中HSP70 m RNA的表达水平与热应激的持续时间呈正相关。
2 HSP90家族
HSP90家族常见有HSP90、gp96等, 该家族基因序列高度保守, 其中一些基因是细胞正常生长所必需的因子。
2.1 HSP90的基因结构
HSP90家族的氨基酸序列高度保守, 真菌、植物以及脊椎动物等不同种属HSP90的同源性在61%~79%, 可见HSP90基因的高度保守性。不同种属HSP90 C端最后4个氨基酸均为glu-gluval-asp, 且HSP70也具有此结构, 这是HSP70与HSP90在结构上的唯一相似之处, 揭示此结构具有重要的意义, 有待进一步研究。
2.2 HSP90的生物学功能
2.2.1 参与蛋白质转运
Rous肉瘤病毒的酪氨酸激酶在合成后与一种磷蛋白及HSP90结合成可溶、无蛋白激酶活性的复合物, 此复合物转运到酪氨酸激酶行使功能的位点时便与HSP90解离, 并在酪氨酸位点上磷酸化后移动到质膜内作为蛋白激酶被激活。HSP90可与肌动蛋白结合且依赖于钙离子的浓度, 推测与HSP90的转运功能有关。
2.2.2 维持激素受体的稳定
HSP90能够维持游离类固醇激素受体的稳定和无活性状态, 直到类固醇激素与受体结合后才解离并恢复受体与DNA结合的活性, 使激素正常行使功能。类固醇 (雌激素、糖皮质激素等) 的受体在游离状态下必须与HSP90结合, 否则就与DNA相结合。HSP90调节受体的活性可能与其C端的高负极性区域有关, 该区域可形成α-螺旋, 且其极性分布与DNA中的磷酸基团相似, 因此HSP90代替DNA结合游离的激素受体直到有激素结合。
2.2.3 参与细胞周期调控
在一些恶性肿瘤细胞中, HSP90的表达显著升高, 表明HSP90可能参与了癌细胞的增殖。利用HSP90 c DNA转染U937细胞, 改变其表达水平, 发现HSP90的低表达可以降低细胞的分裂速度, 该实验揭示HSP90参与了细胞周期的调控。HSP90家族作为细胞周期调控因子, 参与并维持细胞的分裂速度。
2.2.4 参与免疫调节
免疫应答过程中, 抗原受体 (免疫球蛋白、MHC、TCR/CD3复合受体) 是免疫应答的基础, HSP90参与其肽链的折叠过程, 促进其正确装配以确保合成能行使正常功能的抗原受体。HSP90氨基酸序列的高度保守性使其能模拟宿主自身抗原, 逃避宿主的免疫系统从而避免免疫监视, 同时其特异性抗原决定簇能引起抗感染免疫和宿主自身免疫性疾病。
2.3 热应激条件下HSP90的表达
热应激条件下HSP90在各组织中的含量由高到低依次是脑、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心脏。HSP90 m RNA在热应激时的转录依赖于热应激的时间和温度, 而HSP90的表达与其m RNA含量的变化呈正相关。HSP90合成速度的快慢与应激的强度有关, 随着应激的增强, HSP90的合成速度也加快, 到达机体所能耐受的极限温度后则转向于降低。在热应激的初始阶段, HSP90表达量的增加可以增强细胞在不利环境中的生存力, HSP90基因缺失的细胞对热应激的耐受力明显低于正常细胞的耐受力。然而热应激的时间过长或强度过大, 导致细胞及机体严重损伤后, HSP90在热应激中的表达量反而会有所降低。
3 小分子质量HSPs家族 (s HSP)
3.1 s HSP的基因结构
s HSP的主要结构由N端域和C端域两个部分组成。s HSP N端域在同一物种之间具有相对保守性, 而在不同物种间却无保守性。多变的N端域能够调节低聚反应。C端域含有一个相当保守的α晶体蛋白结构域, 是所有小分子热应激蛋白家族成员所共有的结构域, 在同物种s HSP之间高度保守, 甚至在不同物种之间也具有很高的保守性。
3.2 s HSP的生物学功能
3.2.1 维持细胞稳定
s HSP的功能主要是与其它蛋白进行相互作用, 从而使信号传导、新陈代谢、转录、翻译等生命过程中的各种细胞蛋白保持稳定。当细胞收到激源刺激时, 会导致细胞蛋白变性, 部分变性的蛋白以一种不稳定的状态结合到s HSP上, 形成s HSP底物复合物, 以免聚集, 当恢复正常状态后, 部分变性蛋白从s HSP上解离下来, 重新折叠成正确构象。s HSP的底物多是多肽或低聚体蛋白。因此, s HSP能够非常有效地阻止蛋白变性, 从而保护细胞免受激源伤害。
3.2.2 稳定细胞骨架
细胞骨架的完整性和细胞功能的正常行使密切相关。研究表明, s HSP能够与细胞骨架原件联合, 在稳定和保护细胞骨架方面起关键作用。当细胞骨架不稳定时, 会激活p38/MAPKAP2激酶途径, 引起s HSP磷酸化, 磷酸化的s HSP就会发挥其生物学功能, 比如:通过微管相关蛋白与微管相结合以增加微管的稳定性;阻止微丝分裂, 促进微丝多聚化以保持微丝的稳定;维持中间丝的完整性, 避免中间丝异常聚合。
3.2.3 保护细胞膜
膜的流动性是重要的生理特征, 并与膜功能及细胞功能的调节密切相关。有研究表明, s HSP与膜脂的流动性有关。研究发现, 乳酸菌s HSP在热应激条件下能和细胞膜相互作用, 从而调节膜脂的流动性。
3.3 s HSP的磷酸化
s HSP的磷酸化是该家族成员的共同特点。钙离子载体、螯合物等通过调节蛋白激酶或磷酸酶活性, 能诱导s HSP的磷酸化;在生长因子、免疫血清、肿瘤等激源的刺激下, s HSP的磷酸化作用会增强。磷酸化作用也会导致s HSP低聚体状态发生改变, 从而使s HSP的生物学功能得以发挥。α晶体蛋白有3个磷酸化位点能被促有丝分裂原的活化蛋白激酶磷酸化。特定氨基酸残基的磷酸化使得s HSP低聚体复合物发生部分或完全解聚, 伴侣活性下降, 此时s HSP便行使另外的生物学功能了。
4 前景展望
热应激蛋白 (HSPs) 广泛存在于生物界, 在机体多种器官组织中均有表达, 对机体抗应激损伤有着极为重要的作用, 进一步探索和研究热应激蛋白的表达水平对于评价动物应激状况、抗应激能力及健康状况指标具有重要的现实意义。
摘要：热应激蛋白 (HSPs) 是机体在应激条件下产生的一类高度保守的蛋白质分子家族, 对畜禽抗应激机理有着重要的作用, 本文简要介绍了热应激蛋白的分类, 以及HSP70、HSP90和小分子质量HSPs家族的基因结构、功能及在热应激条件下的表达, 为畜禽生产中的抗应激机理研究提供理论参考。
关键词：热应激蛋白,抗应激,生物学功能,表达
应激蛋白 篇2
1 HSPs的概况
1.1 HSPs分类
根据HSPs相对分子质量的大小及同源程度, 一般可以把主要的HSPs分为4个家族:HSP90家族 (相对分子质量83000-90000) 、HSP70家族 (相对分子质量66000～78000) 、HSP60家族以及HSPs小分子量家族 (如HSP27) ;此外, 还有相对分子质量在105～1·1×105和8000而性质不同于上述家族的大分子HSPs和泛素。
1.2 HSPs的功能与作用
HSPs的生物学功能[3]包括: (1) HSPs赋予细胞或生物从各种应激中恢复的能力和保护它们免遭这些应激因素的损害, 其中, 表现最为明显的是热耐受能力的形成; (2) HSPs在保护细胞内重要遗传物质DNA在生物生长、发育和分化过程中具有重要作用; (3) HSPs与体内许多重要生物活性物质 (如类固醇、肿瘤坏死因子、癌基因等) 有着密切的联系, 参与体内许多调节过程; (4) 更重要的是HSPs作为分子伴侣[4], 它可以介导蛋向质分子内或分子间相互作用的蛋白质。在蛋白质折叠成天然构象、装配成天然状态或解聚与降解过程中, 它们可识别并稳定部分伸展的多肽中间产物, 促进蛋白的合成、折叠、运输、参与变性蛋白的清除: (5) 此外还有抗原提呈作用[5]、调控细胞增殖作用[6,7,8]、诱导免疫细胞[9,10]、以及细胞保护功能[11]。
因此HSPs与我们的许多疾病及其治疗都有直接或间接的关系, 比如常见的肿瘤。近年来, 已在氧化损伤、缺血、发热、炎症、心肌肥大、组织外伤、衰老、中暑、苯中毒等一系列疾病上观察到HSPs的异常表达;在许多感染性疾病、自身免疫性疾病 (如系统性红斑狼疮、胰岛素非依赖性糖尿病) 、高血压、冠心病患者血清或血浆中检测出HSPs抗体, 进而提出HSPs抗原抗体作为生物标志物的可能性;HSPs还对接触高温、NO、苯、粉尘等人有表达等方面的影响。
2针灸对HSPs的作用和影响
针灸作为我国传统医学的一部分以其独特防治疾病的特色正引起现代生命科学越来越多的关注。在防治疾病的过程中, 针灸虽然未向体内补充任何缺失的物质, 却同样达到平衡阴阳, 防病保健的目的。艾灸、电针等作为一种应激方式, 对于 HSPs的作用和影响自从1980年代末期就开始进入国内外学者的研究视野[12,13]。
国外有学者通过动物实验证明灸后肌肉组织升温可以产生HSPs, 而且主要在3～24小时后出现[14]。目前我国一些学者扩大了范围, 纷纷采用电针、刺血、针刺等方法对这一领域进行扩展研究。刘雨星[15]等人探讨了剌血疗法对AA大鼠炎症局部HSP70的调整作用, 发现刺血疗法可能通过提高HSP70的含量, 达到增高细胞存活率、减轻炎症损伤、增强热耐受力。刘志彬等人[16]研究了电针对大鼠慢性脊髓损伤HSP70及诱导型一氧化氮合酶表达的变化及对脊髓功能的影响, 结果表明电针治疗可以促进脊髓损伤大鼠的行为功能恢复, HSP70介导了电针的治疗过程, 保护了脊髓神经细胞并减轻继发性脊髓损伤。余晓慧[17]的研究证明电针能促进缺血后细胞凋亡相关基因HSP70的表达, 可对抗缺血性脑损伤。赵建新等人[18]研究发现电针在两个时间点均可上调小鼠海马细胞HSP70的表达, 降低凋亡率。暗示电针可能抑制细胞凋亡、保护神经元的作用, 可能是电针改善VD小鼠智能。路志红等人[19]采用重复电针刺激百会穴使得HSP70高表达。曾毅等人[20]用重复电针刺激“足三里”穴预处理诱导缺血耐受发现增强HSP90在脊髓前角的表达。王一菱等人[21]用电针可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的HSP70、iNOS及mRNA表达。王祥瑞等人[22]还用电针法对心脏手术病人的心肌细胞进行研究, 发现针刺有增加缺血心肌细胞HSP70 mRNA表达作用。马岩等人[23]用醒脑开窍针刺法增加了梗塞区皮质、纹状体、海马HSP70基因的表达, 证实了醒脑开窍针刺法对缺血后的脑细胞的保护作用优于常规针刺法, 揭示了该法保护脑细胞的部分分子机制。
从以上的研究情况我们可以看出, 采用针灸等方法研究HSPs的理论和实验还比较少, 基本上都处于用些比较常规的模型, 刺激机体产生HSPs;另外有些研究还观察一些HSPs可能产生的一些保护, 预防或者干预等效果;对于引起这些效果等机制问题的了解还基本停留在推断阶段。因此, 这方面的以后的研究应该重点选取一些对于疾病防治比较清楚, 效果比较确切的实验模型和方法, 或者对于现在研究较多且有一定研究基础的模型, 如脑或神经性疾病等, 进行全面的研究, 注重效果与机制之间的直接联系;这样无论是对于我国在这方面理论取得突破, 占领国际学术高端, 推动针灸现代研究的发展, 还是对于某些具体疾病的针灸等特色治疗措施提供坚实的科学基础, 提高广大人们的生活和健康水平都有很大的理论和现实意义。
3中药对HSPs的作用与影响
3.1 复方中药对HSPs的作用与影响
在HSPs的研究中, 最初就带有我国传统中医药的一些特点, 学者们往往选择一些疗效相对确切的复方中药进行研究。李国成等人对健脾益气方[24,25,26,27]作了较广泛的实验研究, 主要结论是健脾益气方能诱导急性胃黏膜损伤大鼠提高 HSPs的表达, 防止胃黏膜损伤, HSPs可能介导胃黏膜防御;健脾益气对消化性溃疡患者HP有清除作用, 同时HSP60表达增高, 推测这些作用可能与免疫反应相关:对于乙酸慢性胃溃疡来说, 健脾益气方高表达HSP27, 60, 70, 而且还优于化学药雷尼替丁。易屏等人[28]对消溃灵复方的研究表明HSP72和 HSP60在胃黏膜有高表达, 而且可以清除幽门螺旋菌HP, 这对于溃疡病人有很好的选择;其他的一些相关中药复方的研究[29]也支撑了这一基本事实。
补阳还五汤是治疗中风的常用药方之一, 故一些学者[30,31]借鉴其功效对沙土鼠脑缺血再灌注后脑组织HSPs进行了研究, 发现在脑缺血再灌注后48小时, HSP70mRNA及蛋白表达明显增强, 还可明显抑制HSP70的转录。而黄芪则除了可明显抑制其转录外, 还可轻度降低HSP70的翻译, 可能是通过抗缺血作用而抑制了缺血后HSP70 mRNA的表达, 值得注意的是补阳还五全汤的效果优于其有效部位。崔金涛, 于泽[32]的研究发现三七五参汤对心肌的保护作用可能除诱发HSP70表达外, 可能有其他途径, 值得进一步研究探讨。对脑功能及其疾病的研究也有一些报道[33,34,35]:通腑醒神胶囊灌肠灌胃治疗脑出血均能增强脑内HO-1、mRNA、HSP70表达, 但是灌肠比口服对脑出血急性期的治疗更为有效, 这也可能与直肠吸收有关:通脑灵通过调动机体自身的保护机制提高HSP70的合成, 从而起到抑制神经细胞凋亡作用;通心络胶囊能够明显抑制 Caspase-3、P53的表达, 促进HSP70的表达。李莉等人[36]观察盆炎康合剂对抗HSPS60抗体阳性的慢性盆腔炎的临床疗效, 发现它可改善和消除慢性盆腔炎患者的临床症状和体征, 在治疗下生殖道CT感染中, 盆炎康合剂加阿奇霉素联合治疗较单纯中药治疗更为有效。
3.2 单味中药对HSPs的作用与影响
近年来采用单味中药对HSPs的研究也展开了, 研究较多的是银杏[37,38,39], 体外实验显示紫外线照射后血管内皮细胞HSP72有较强表达;杏丁注射液在0.1mg/ml浓度即有很明显的促进HSP72表达的作用, 提示这可能保护血管内皮细胞在应激状态下免受损伤;银杏叶提取物可诱导大鼠肾缺血-再灌注组织中HSP70表达, 减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤;银杏制剂可能通过诱导大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的 HSP70及c-fos的表达, 发挥神经保护作用。
对于丹参的研究[40,41], 表明丹参可促进癫痫大鼠脑内HSP70免疫反应阳性神经元的数目明显增多 (P<0.01) , 染色阳性强度亦增强, 有一定保护作用:丹参注射液可通过增强缺血再灌注损伤后脊髓神经元HSPs70的表达保护大鼠肢体。黄芪[30,42]也可以通过增强脑缺血再灌注后HSP70 mRNA及蛋白表达保护大脑。另外安宫牛黄散和复方中的朱砂、雄黄对外伤性脑水肿大鼠脑组织的保护作用可能与通过增加诱导HSP70 mRNA表达、抑制iNos活力和炎症细胞因子TNF-a, IL-lp的合成有关[43]。水蛭提取液对实验性脑出血周围组织的HSP70与TGFβ-1表达增强可能保护作用脑血管[44]。
3.3 中药有效成分对HSPs的作用与影响
由于复方及单味中药成分太复杂, 不易于探讨具体的影响和量化效果, 所以越来越多的日光转向中药有效成分的研究上。研究最多和最早的川芎嗪, 川芎嗪干预可使缺血大脑皮层HSP70表达明显增强, 皮层神经细胞的缺血损伤减轻[45];对脑水肿也有治疗作用[46,47] (黄芪甙也有类似情况) ;但YMH是通过减少耳蜗血管纹HSP70表达, 改善听功能的葛根素的研究表明[48,49,50]它不但可以促进脑缺血后HSP70表达增强, 有利于神经性等病变;而且葛根素可抑制HSP60特异性免疫反应, 改善血管内皮舒张功能。对三七总皂甙的研究表明[51,52]IHSP70在缺血再灌注心肌中呈高诱导表达, 可能可以作为衡量心肌缺血再灌注损伤程度的重要指标, PNS和热休克预处理均对缺血再灌注心肌有良好的保护作用;同时也有研究显示三七总皂甙高表达的 HSP70参与了脊髓继发损伤的病理生理机制, PNS可能通过诱导脊髓组织HSP70神经元的表达而起保护作用。其他的有效成分如大黄多糖[53]能促进损伤的大脑皮层的HSP70表达来保护大脑;丹参中的丹酚酸B (Sal B) 预适应的细胞能诱导HSPs70合成[54];儿茶素单体EGCG联合热休克干预可能与激活细胞内某些降解HSP70蛋白及P-HP的酶或因子有关, 对胃癌细胞有抑制作用[55]。另外复方阿魏酸可促使缺血脑皮层HSP70表达增强, 减轻皮层神经细胞的缺血损伤, 对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[56]。
4展望
4.1 中医药模型与HSPs
从目前的研究我们可以看出现在大致有单纯热休克模型、消化性溃疡模型、夹闭模型、脊髓损伤模型、心脑缺血再灌注模型、水肿模型、听力障碍模型、癫痫模型、实验性脑出血模型等多种模型。但是对于大多数模型, 一般情况的研究只是试探性的, 做一些比较粗浅的, 以观察实验现象为主要目的的探讨, 也没有这领域丰富的研究材料作为支撑, 故深度也不够。针对这种现实, 某些研究小组可以集中力量, 对于现在研究相对较多, 希望较大的模型如心、脑缺血再灌注模型展开比较全面, 系统的研究;或者选取国际上其他类型药物研究较多, 有公认效果的模型如拘束应激模型, 应用我国特有的中药进行深入和对比性的研究和探讨。
4.2 中医药与HSPs的类别和实验技术
对目前所有中医药影响HSPs的文献作一个统计, 发现HSP的类别只涉及到HSP90、HSP72、HSP70、HSP60、HSP40、HSP27和mHSP几个少数的种类, 其中HSP70最多大约占51%, 其次是HSP60、HSP90;同时研究两个种类的HSPs的文献不足10篇, 故研究的范围比较窄。从获取组织和细胞的部位看, 虽然涉及了脑、心肌、胃、肾、脊髓、耳等器官和组织, 但一般同一文献却只检测一个地方的某种指标。当然这对于研究来说效率可能提高了, 然而由于在这方面是初步研究, 在没有较直接的理论指导时可能出现重要乃至关键的一些指标没有及时、准确的获取, 对研究质量有很人的影响, 有些还可能是本质上的;所以在做系统全面研究的时候, 务必把这些因素考虑进去, 并且防范于未然。
从检测HSPs的实验技术来看, 现在的这类文献主要采用比较常规的免疫组化法、Northern blot和Western blot等, 这些手段不仅烦琐, 效率低下, 而且灵敏度也不够, 有的还处于定性水平。现代分子生物学理论和技术迅猛发展, 实验技能日新月异, 这方面的研究应该也必须跟上时代进步的步伐, 选取最前沿和最合适的方法和手段促进中医药对HSPs的研究。
4.3 中医药与HSPs的机理和对象
在机理方面, 基本还处理对于因热而产生 HSPs这种最为原始和直观的解释, 应当借鉴其他国际上研究相关疾病, 药物或者HSPs与其他物质环境联系的参考材料, 在大胆猜测、严密逻辑推导、小心求证的精神下, 特别在某种模型或疾病全面, 系统研究时重点考虑机理方面的影响, 尤其是直接的证据, 笔者认为从细胞生物学的角度, 特别是网络信号传导方面去研究, 应该最有希望取得突破。
在研究对象方面, 现有的实验基本都是采用大鼠或小鼠的动物模型, 少数采用细胞实验, 个别采用人体的一些细菌 (如溃疡病人的幽门螺杆菌HP) 。考虑到我国的现实问题, 进行大量的动物实验需要的人力、物力、财人都太大, 可能对于初期的全面、系统研究不太科学;因此, 建立好某些疾病相关中药细胞模型, 无疑是进行大规模实验的一个有效途径, 而且良好的细胞实验对于机制的研究也可以提供十分有力的证据。在细胞层次有比较明显的效果后, 再进行一些对比或验证性动物实验, 这应该是一条较好的思路。当然, 某些在反复使用证明低毒而疗效确切或国家已批准上市的中药可以在医院医生给病人合理合法使用同时做一些指标检测 (如血液、HP等) , 以推动临床研究及药物开发。
4.4 中医药与HSPs的开发与应用
由于国际上一般不认可化学成分异常纷繁复杂的中药, 故从国际学术的角度很多学者往往只重视有效成分的研究, 但就如同中药治疗疾病一样, 有效成分、单方或拆方效果往往不如复方[43];故对于中药的分解需要慎重, 阐明机制和注重效果应当并行, 有学者针对有效部位[31,57]进行研究这可能是个两全其美的方法。
应激蛋白 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
TCE(纯度99.5%)购自天津威晨化学试剂公司。达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)细胞培养液、胎牛血清、D-Hank’s液、二甲亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma-Aldrich公司。IP细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、人HSP 70酶联免疫试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司。主要仪器设备:二氧化碳培养箱(SHELLAB 3552-2)、超净工作台(鑫贝西BBS-SDC-A)、台式离心机(Sigma 3K15)、酶标仪(BIO RAD i Mark)、电热恒温水浴箱(DK-600)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Hep G2细胞株来自美国模式培养物集存库(ATCC),用含10%胎牛血清的DMEM培养液在5%CO2、37℃条件下培养。以DMSO为溶剂配置TCE储备液,用细胞培养液稀释至试验所需浓度,DMSO的终浓度为1%(体积分数)。TCE染毒浓度按Hu等[6]91报道初设为0~10 mmol/L,后根据MTT试验结果调整为0~8 mmol/L。每个染毒浓度设3个重复样本,并独立重复1次试验。每次试验均包括含1%DMSO和不含DMSO 2种对照,二者结果无统计学差异,图表结果中0 mmol/L表示含1%DMSO的对照。细胞染毒培养24 h后移除培养液,用IP细胞裂解液裂解细胞并收集至EP管,4℃条件下10 000×g离心5 min取上清,-20℃保存备用。
1.2.2 细胞活力试验
在96孔板内染毒培养Hep G2细胞24 h后,每孔加入5 mg/ml MTT试剂20μl继续培养4 h,移除培养液后每孔加入DMSO 150μl,孵育10 min,用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光度(A)值(以%表示细胞活力)。
1.2.3 MDA、GSH和HSP 70水平检测
采用商品化的酶联免疫试剂盒检测,严格按相应的使用说明操作。
1.3 统计学分析
所有数值结果以±s表示。使用STATA 13.0对数据进行单因素方差分析和组间比较(bonferroni法)、回归分析。所有统计学检验均为双侧检验,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 不同浓度TCE暴露后的细胞活力
如图1所示,TCE浓度为0.25~8.00 mmol/L时,Hep G2细胞活力与TCE浓度为0 mmol/L时比较,差异无统计学意义;细胞形态无明显变化(图2 A-D)。TCE浓度为10 mmol/L时,Hep G2细胞活力低于TCE浓度为0 mmol/L时的活力,差异有统计学意义(t=-26.44,P<0.01),部分细胞形态呈细长梭形,折光性发生改变,并出现一定数目未贴壁的悬浮细胞(图2 E)。
注:黑点表示细胞活力均数,短垂线表示标准差,*表示与TCE浓度为0 mmol/L时细胞活力比较,P<0.01
注:A—TCE浓度为0.00 mmol/L;B—TCE浓度为0.50 mmol/L;C—TCE浓度为2.00 mmol/L;D—TCE浓度为8.00 mmol/L;E—TCE浓度为10.00 mmol/L
2.2 TCE暴露浓度与细胞内MDA水平的关系
不同浓度TCE染毒组间MDA水平差异有统计学意义(F=13.51,P<0.01);随着TCE浓度增高,MDA水平呈上升趋势(β=20.59,P<0.01)。进一步两两比较,当TCE浓度为2.00、4.00、8.00 mmol/L时,MDA水平高于TCE为0.00 mmol/L时的水平,差异均有统计学意义(t=163.26,150.24,140.10,均P<0.01)。见表1。
2.3 TCE暴露浓度与细胞内GSH水平的关系
不同浓度TCE染毒组间GSH水平差异有统计学意义(F=26.03,P<0.01);随着TCE浓度增高,GSH水平呈下降趋势(β=-0.98,P<0.01)。进一步两两比较,当TCE浓度为2.00、4.00、8.00 mmol/L时,GSH水平低于TCE为0.00 mmol/L时的水平,差异均有统计学意义(t=-7.49,-7.31,-8.03,均P<0.01)。见表1。
2.4 TCE暴露浓度与细胞内HSP 70水平的关系
不同浓度TCE染毒组间HSP 70水平差异有统计学意义(F=12.13,P<0.01);但随着TCE浓度增高,HSP 70水平无明显变化趋势。进一步两两比较,TCE浓度为0.25 mmol/L时,HSP 70水平高于TCE浓度为0 mmol/L时的水平,差异有统计学意义(t=22.66,P<0.05)。见表1。
注:TCE—三氯乙烯;MDA—丙二醛;GSH—谷胱甘肽;HSP70—热休克蛋白70。与TCE染毒浓度为0.00 mmol/L组比较,aP<0.05,bP<0.01。
3 讨论
Hep G2细胞与原代肝细胞相比易于获得和培养,并且保留了生物转化过程中的I相和II相酶。虽然它在代谢酶的水平和活力方面与原代肝细胞存在一定差距,但先前HU等[6]的研究表明,用TCE染毒Hep G2细胞研究相关作用机制是可行的,因此,本研究用Hep G2细胞作为体外模型探讨TCE在不显著影响细胞活力情况下对机体的氧化损伤,以及细胞内HSP 70在TCE所致氧化损伤中的可能作用。研究结果显示,细胞内MDA和GSH水平随TCE暴露浓度增高分别呈上升和下降趋势,而细胞内HSP 70水平则未随TCE浓度升高呈明显趋势变化。
TCE通过机体代谢形成以三氯乙酸、三氯乙醇、水合氯醛、S-二氯谷胱甘肽为主的大量产物[7,8],TCE及代谢产物可能具有多种不同的作用模式,因此,TCE的毒作用机制十分复杂。研究表明,氧化应激可能是TCE发挥毒作用的重要途径。例如文献[9,10,11]表明氧化应激及氧化代谢产物可能介导TCE所致肝毒性反应和肝损伤。TCE引起氧化应激水平增高还与抗核抗体、抗DNA单链/双链抗体水平升高有关[12]。本研究用脂质过氧化损伤指标MDA和抗氧化指标GSH反应细胞氧化应激水平,结果显示细胞脂质过氧化水平增高而抗氧化能力降低,说明TCE在不显著影响细胞活力情况下即可导致细胞发生氧化应激,并且TCE暴露浓度与氧化应激水平呈剂量—效应关系。
TCE引起的氧化应激不仅导致细胞发生脂质过氧化损伤,而且导致蛋白质分子羰化和硝化[13],脂质过氧化损伤产生的醛类如MDA又能与蛋白质形成加合物,影响细胞的正常功能。当机体发生应激反应时HSP能帮助细胞维持稳态,在冠心病、癌症、败血症等疾病和衰老中均发现HSP水平升高与氧化应激有关[14]。BARTOSIEWICZ等[15]用基因芯片筛查的方法发现TCE特异性引起HSP基因表达上调。HSP可能通过降低脂质过氧化引起的蛋白变性,以及辅助蛋白酶降解羰化和硝化蛋白而减轻TCE导致的肝细胞损害和自身免疫反应等。目前为止,HSP在TCE所致氧化应激中的作用尚无研究报道。本研究首选在细胞内表达量丰富、功能重要的HSP 70为研究对象,结果发现,随着TCE浓度增高HSP 70水平与对照组比较无显著差异。根据结果认为,在细胞活力未受显著影响的情况下HSP 70可能不参与TCE所致氧化应激反应,HSP 70在TCE浓度为0.25 mmol/L时升高可能是毒物兴奋效应。
综上所述,在本研究TCE暴露水平范围内,细胞脂质过氧化水平增高而抗氧化能力降低,HSP 70可能不参与这一过程。但不排除细胞内其他重要应激蛋白如HSP 60、HSP 90等可能参与较低水平TCE引起的氧化应激反应,我们将在后续实验中进一步探索这些蛋白的作用。
作者声明
应激蛋白 篇4
1 对象与方法
1. 1对象整群抽取山西医科大学三年级临床专业医学生为研究对象。共发放问卷344份, 收回有效问卷322份, 有效率为93.6%。在考试期间采集有效唾液样本328份, 在平时学习期间采集有效唾液样本309份, 匹配2次唾液样本及有效问卷, 最终有效样本为307人。其中男生124名, 女生183名; 平均年龄为 ( 21.67±0.65) 岁。
1. 2 方法
1. 2. 1考试焦虑量表 ( TAS Anxiety Scale, TAS) 由临床心理学家Sarason教授[5]于1978年编制完成, 是目前国际上广泛使用的最著名的考试焦虑量表之一。1999年中国学者王才康[6]对量表进行翻译修订, 具有良好的信、效度。量表共有37个项目, 各项目均以“是”记1分, “否”记0分。其中第3, 15, 26, 27, 29, 33题为反向记分, 所有项目得分总和即为量表总分。得分 <12分考试焦虑属轻度, 12 ~20分属中度, >20分属较高水平[7]。
1. 2. 2身体不适感调查表自编调查表。包括睡眠症状、头部症状、胃肠道症状及免疫状况4个方面, 具体包括睡眠不佳症状、疲乏无力症状、头晕头痛症状、腹泻症状、食欲不振或亢进症状、感冒症状及腰腹痛症状7项症状。单项无症状, 记0分, 有症状, 记1分, 最高7分, 最低0分。总分越高, 表明躯体不适感症状越多。
1. 2. 3唾液采集以班级为单位进生理指标测试行, 共采集2次, 分别于平时学习期间和考试期间采集。第1次采集时间为开学后第3周; 第2次采集时间为期末考试周。唾液标本采集前告知被试注意事项, 要求被试于采集唾液的前1天晚上临睡前刷牙后禁食、禁水、禁烟, 次晨在安静状态下 ( 尚未漱口、锻炼等活动) , 7:30—9: 00于指定会议室采集唾液。被试先领取一次性口杯漱口, 清洁口腔; 再领取试管, 在试管壁上写上自己的学号。统一按照指导语 ( 低头, 口微张, 舌抵上颚, 让唾液自然流出) , 并播放刺激唾液分泌的食物视频和图片, 让每位被试留取唾液3 ~5mL。收集好标本后以3 000 r /min, 离心10 min, 取1mL上清液 - 20℃冰箱冰冻保存。采用双抗体酶联免疫吸附试验法 ( ELISA) 对受试者唾液中的免疫球蛋白A ( SIgA) 和皮质醇 ( Cor) 进行检测 ( 考生在平常学习期间测试SIgA、Cor简称SIgA -a、Cor -a, 考试应激期间测试SIgA、Cor简称SIgA - b、Cor - b, 两者差值简称为SIgA -c、Cor -c。
1. 3问卷调查由3名山西医科大学应用心理学专业硕士研究生负责, 于期末考试前以班级为单位进行集体测试。施测前, 由调查员向被试说明调查的目的、意义和要求, 施测时统一指导语, 完成后当场收回问卷。
1. 4采用 SPSS 17. 0 对数据进行分析统计学方法和处理, 统计方法包括 t 检验、相关分析及方差分析。
2 结果
2. 1考试焦虑及身体不适感情况医学生TAS总分为 ( 13.89±5.47) 分, 轻度焦虑者43.3%, 中度焦虑者占43.0%, 较高水平焦虑者占13.7%。女生总体及不同程度考试焦虑状况高于男生, 差异均无统计学意义 ( P值均 >0.05) 。医学生考试期间出现躯体不适感共158名, 占51. 5% 。其中睡眠不佳症状的医学生占46. 8% ; 疲乏无力症状的占29. 7% ; 头晕头痛症状的占25.3%; 腹泻症状的占23. 4%; 食欲不振或亢进症状的占13.7%; 感冒症状的占10. 8%; 腰腹痛症状的占8. 2%。女生身体不适感得分高于男生 ( P < 0.05) 。见表1。
注: ( ) 内数字为检出率/%。
2. 2 SIgA和Cor检测结果总体SIgA - b与SIgA a相比有所降低, Cor - b与Cor - a相比有所升高, 差异均有统计学意义 ( P值均 <0.05) 。男、女生SIgA b与SIgA - a相比有所降低, Cor - b与Cor - a相比有所升高, 差异均有统计学意义 ( P值均 <0.05) 。见表2。男生SIgA - c高于女生, 而女生Cor - c高于男生, 差异均无统计学意义 ( P值均 >0.05) 。
2. 3考试焦虑与SIgA - c、Cor - c及身体不适感的相关分析对考试焦虑、SIgA - c、Cor - c、身体不适感进行相关分析, 结果显示, 考试焦虑与身体不适感呈正相关 ( r =0.199, P <0.05) 。
2. 4 不同考试焦虑程度医学生 SIgA - c、Cor - c 和身体不适感比较SIgA - c、Cor - c 均有随考试焦虑程度的加重呈升高的趋势, 差异均无统计学意义 ( P值均 >0.05) 。身体不适感得分随考试焦虑程度的加重而升高, 差异有统计学意义 ( P <0.05) 。见表3。
3 讨论
本研究显示, 医学生轻度考试焦虑者占43. 3%, 中度焦虑者占43.0%, 高度焦虑者占13.7%。与以往研究结果[8,9]一致。可能因为医学院校不仅学制周期长、课业量极其繁重, 同时还要面临激烈的就业和考研竞争。医学专业的学科性质和工作性质对医学工作者的素质和能力要求极高。随着现代社会人们对生活质量、生命质量意识的增强, 对于医务人员的期望也越来越高。医学生的考试焦虑状况不容忽视, 高校应采取有效措施以降低医学生考试焦虑水平。
考试作为医学生重要的应激源, 不仅引起心理方面的变化, 也会引发生理方面的变化。本研究结果显示, 考试期间Cor水平与平时学习期间相比有所升高;考试期间SIgA水平与正常学习期相比有所降低, 与以往研究结果[10,11,12]一致。
医学心理学认为, 神经系统、内分泌系统和免疫系统是应激的生理反应, 并且是最终影响心身健康的3个心身中介机制[13]。应激状态下各种神经内分泌的改变会影响免疫功能, 尤其是儿茶酚胺和皮质激素, 两者对免疫功能的影响主要是抑制, 因此, 过强或持久的应激通常会造成免疫功能的抑制[14]。本研究唾液SIgA和Cor值在考试应激期间的变化, 支持了现代应激理论, 即应激可引起下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴激活, 使体内Cor水平升高以及SIgA水平降低, 造成机体免疫功能下降。提示考试应激会导致大学生内分泌及免疫系统功能改变, 应引起高校心理卫生工作者的重视。
本调查结果发现, 多数医学生在考试期间由于紧张焦虑和劳累容易出现一些躯体症状, 排在首位的是睡眠症状, 与以往研究结果[15,16]一致。可能是各种生理和心理影响共同作用的结果。睡眠状态不好一方面与考试焦虑有关, 另一方面也与考试期间的作息时间改变有很大关系, 消化功能不良也是面对考试应激常出现的一种症状。由于承受着巨大压力, 考生考试期间用餐时间不规律, 进餐过程仓促, 易出现食欲不振或肠胃不适等现象。
随着医学模式的改变, 人们逐步地认识到心理社会因素和生物学因素一样影响着身心健康。本研究发现, 考试焦虑与身体不适感呈正相关。身体不适感得分随考试焦虑程度的加重而升高, 与以往研究结果[17,18,19]一致。可能与下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴功能的激活有关, 因此, 在针对考试应激的心理卫生工作中, 应将心理健康、神经内分泌免疫系统及身体不适感联系起来, 作为一个整体来看待, 以达到有效治疗。
此外, 女生SIgA -c、Cor -c及身体不适感得分均高于男生, 与以往研究结果[20,21]一致。可能与女生特有的心理特点有关, 女生情感易于波动, 更容易受考试这一负性刺激的影响, 从而产生紧张、焦躁、恐惧的情绪。同时, 女生在心理和生理承受力上均差于男生, 由此产生如心率加快、多汗、口干等生理反应, 而这些又加重焦虑情绪, 造成恶性循环。因此, 在高校心理卫生工作中, 应给予女生更多的关心和帮助。
总之, 考试应激对大学生的心理、生理都有着重要影响, 而作为心理反应的焦虑等情绪体验又对生理反应起着一定的中介作用。鉴于此, 高校应以心理干预为切入点, 帮助大学生调整好心态, 调节好情绪, 同时辅以生理方面的健康教育或治疗, 使大学生心理及生理都处于较好的应试状态, 对于其身心健康, 以及取得良好的学习成绩, 都是至关重要的。
摘要：目的 探讨考试应激对医学生心身反应、唾液免疫球蛋白 (SIgA) 及皮质醇 (Cor) 的影响, 为高校开展心理健康教育工作提供参考。方法 整群抽取山西医科大学三年级临床专业医学生307名, 运用考试焦虑量表进行测试, 并采集考试期间与平时学习期间有效唾液样本进行生理指标的测试。结果 医学生考试期间轻度焦虑者占43.3%, 中度焦虑者占43.0%, 较高水平焦虑者占13.7%;有躯体不适感者占51.5%。考试期间与正常学习期间相比, 医学生SIgA水平有所降低, Cor水平有所升高 (P值均<0.05) 。考试焦虑与身体不适感呈正相关 (P<0.05) 。SIgA-c、Cor-c及身体不适感有随考试焦虑程度的加重呈升高的趋势。女生考试焦虑、Cor-c及身体不适感得分均高于男生。结论 考试应激对大学生的心理、生理方面均有重要影响。在高校的心理卫生工作中, 应以心理干预为切入点, 同时辅以生理方面的健康教育或治疗。
应激蛋白 篇5
到目前为止,许多物种的组织蛋白酶基因序列已在GenBank中登录,包括哺乳动物、鸟类、鱼类、节肢动物的昆虫和甲壳动物,但软体动物双壳类中仅报道了栉孔扇贝(Chlamys farreri)和大珠母贝(Pinctada maxima)的组织蛋白酶D基因[6,7],以及合浦珠母贝(P.fucada)的组织蛋白酶L1、L2基因[8,9],其他珍珠贝的组织蛋白酶基因尚未见报道。企鹅珍珠贝(Pteria penguin)是一种热带、亚热带的大型海产经济双壳贝类,主要分布于中国的广东、广西、海南、台湾沿海以及日本九州的南部、琉球群岛直至菲律宾等地,具有生长快、个体大、生命力强和珍珠质分泌旺盛的特点,可用于培育附壳珠和大型游离珍珠。该研究克隆了企鹅珍珠贝组织蛋白酶D的cDNA序列,并对其在脂多糖(LPS)和哈维弧菌(Vibrio harveyi)刺激下的组织应激表达特征进行了初步研究,以期为进一步探究其抗病抗逆机理奠定基础,为珍珠贝类抗逆育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 总RNA提取和cDNA合成
企鹅珍珠贝取自海南三亚,壳长5.98~8.37 cm,体质量10.12~28.44 g,于25~27 ℃充气海水中暂养1周后取肝胰脏组织快速保存于RNA样品保存剂(Takara)中,参照Trizol(Invitrogen)说明书提取总RNA。用紫外分光光度计测量光密度OD260 nm和OD280 nm,以确定RNA的浓度和纯度。然后用M-MLV逆转录酶(Takara)合成一链cDNA,反应体系为RNA 1 μg,Oligo-dT(50 μmol·L-1)1 μL,加RNase free dH2O至6 μL,70 ℃保温10 min后冰上急冷2 min以上;在上述混合液中加入5×M-MLV 缓冲液2 μL,dNTPs (10 mmol·L-1) 0.5 μL,RNase Inhibitor 10 U,M-MLV 200 U,加RNase free dH2O至10 μL,42 ℃保温1 h,70 ℃保温15 min后冰上冷却,-20 ℃保存。
1.2 全长cDNA的克隆与测序
基因克隆方法参照黄桂菊等[10],所用引物见表1。用笔者实验室的大珠母贝组织蛋白酶D简并引物pmCTSDF1、pmCTSDF2扩增企鹅珍珠贝的中间片段,PCR反应总体积为20 μL,包括单链cDNA 0.5μL、dNTPs 0.2 mmol·L-1,引物各1 μmol·L-1、MgCl2 4.0 mmol·L-1、10× buffer 2 μL和Taq酶0.5 U。PCR扩增程序为94 ℃ 5 min,35个循环;94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min。根据扩增得到的中间片段设计特异性引物pgCTSD 3′ F1、pgCTSD 3′ F2和pgCTSD 5′ R1、pgCTSD 5′ R2(表1)用于RACE PCR。
3′RACE:用引物pgCTSD3′ F1和Adaptor进行第一轮扩增,除引物外反应体系与中间片段克隆的相同,反应程序为94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 30 s,35个循环;72 ℃ 10 min,将第一轮PCR产物稀释50倍作为模板,以pgCTSD3′ F2和Adaptor为引物进行第二轮扩增,反应体系同上,反应程序为94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 20 s,35个循环;72 ℃ 10 min。
5′RACE:采用加尾法,用PCR产物纯化试剂盒纯化回收cDNA第一链,然后用末端转移酶TdT在第一链cDNA 3′端加上poly(C)尾作为第一轮PCR扩增的模板,用Oligo dG和pgCTSD 5′ R1引物,反应体系同3′RACE,反应程序为94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,53 ℃ 30s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min。将第一轮PCR产物稀释50倍作为模板,用Oligo dG和pgCTSD 5′ R2进行第二轮PCR扩增,除引物外反应体系同上,反应程序为94 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;最后72 ℃ 10 min。
中间片段产物和RACE产物经电泳后切胶回收,将回收产物克隆到pMD-18T载体中,转化至大肠杆菌DH5α,经菌液鉴定后送往上海生工公司测序。
1.3 序列特征分析
将5′RACE片段、中间片段和3′RACE片段序列进行拼接,然后用DNAStar软件预测氨基酸序列;分别用SingalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、Prosite (http://www.expasy.ch/prosite)、PredictProtein的PHD(http:∥www.predic-tprotein.org/)和Swiss(http:∥swissmodel.expasy.or-g/)软件预测信号肽、蛋白结构域和三级结构;用NCBI中的BLASTp搜索同源蛋白,然后用ClustalX进行多序列比对,用MEGA 3.1软件重建系统发育进化树。
1.4 LPS和弧菌刺激试验
试验于2010年5月在海南三亚南海水产研究所热带水产研究开发中心进行。企鹅珍珠贝经水泥池驯养后用于试验,设空白对照组、处理对照组、LPS刺激组和哈维弧菌刺激组,各组3个重复,每个重复用3个贝。空白对照组不做任何处理;处理对照组闭壳肌注射200 μL PBS;LPS刺激组:取LPS溶解于PBS中,使LPS终质量浓度达10 μg·mL-1,闭壳肌内注射LPS 200 μL;弧菌刺激组:哈维弧菌经2216E液体培养基扩大培养后离心收取菌液,平板计数法计数后用PBS悬浮哈维弧菌,使OD600 nm=0.4,闭壳肌内注射200 μL悬液哈维弧菌。6 h后取4组企鹅珍珠贝的闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织保存于RNA样品保存剂中,带回实验室用于表达分析。
1.5 组织表达分析
参照Trizol(Invitrogen)说明书提取闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织的总RNA,并检测其浓度和纯度。用RQ1 RNase-free DNase消化总RNA样品中的DNA。用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)试剂盒合成一链cDNA用于荧光定量表达分析。根据pgCTSD的cDNA序列设计特异性引物pgCTSD F和pgCTSD R(表1)。PCR反应体系为20 μL:2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL,1 μL cDNA,0.4 μmol·L-1引物(10 μmol·L-1),8.6 μL双蒸水,每个样品设置3个PCR重复,β-actin基因为内参基因[11],引物序列见表1。反应程序为95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,57 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,40个循环;之后进行溶解曲线(melting curve)分析,以确定PCR反应的特异性。采用相对法CT(2-ΔΔCTmethod)分析pgCTSD的组织表达水平,ΔCT为目的基因CT值与内参基因CT值的差值,以空白对照组闭壳肌的ΔCT为基准,与其他各组的ΔCT的差值为ΔΔCT,最后用公式2-ΔΔCT计算相对表达量。用GraphPad Prism 5.0软件进行空白对照组和处理对照组间、处理对照组和刺激试验组间的t检验分析。
2 结果
2.1 pgCTSD的序列分析
将5′RACE片段(355 bp)、中间片段(376 bp)和3′RACE片段(1 347 bp)进行拼接得到1 767 bp的全长cDNA序列(图1),命名为pgCTSD(P.penguin
cathepsin D,GenBank登录号:HM989013),其中5′UTR为38 bp,3′UTR为553 bp,ORF 1 176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽(Met1-Ala18)、前体域(Leu19-Lys47)和成熟域(Tyr48-Ser392),分子量为42.3 kDa,等电点为8.04。pgCTSD一级结构包含2段天冬氨酸蛋白酶签名序列(Val84-Val95和Ala272-Gly283)、2个N-连接的糖基化位点(Asn124和Asn237)和1段非消化性组织蛋白酶D的特征序列(DVPPPNGP)。
2.2 pgCTSD的同源性比较和系统发生分析
pgCTSD与大珠母贝的pgCTSD相似性最高(79%),与栉孔扇贝的相似性为75%,与其他物种的相似性为59%~75%(表2)。非消化性组织蛋白酶D的特征序列与其他物种相似,序列都符合DxPxPxA/GP氨基酸排列顺序[12]。
NJ树表明,组织蛋白酶D分为2支,一支包
括哺乳动物、鸟类与鱼类;另一支包括节肢动物和软体动物。其中大珠母贝、企鹅珍珠贝和栉孔扇贝聚成一小支(图2)。
2.3pgCTSD mRNA组织表达与应激表达特征分析
未进行任何处理的空白对照组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中最少,肝胰脏中表达量最高,2-ΔΔCT值分别为1和197.4(图3-a和图3-b,空白组)。处理对照组注射PBS 6 h后肝胰脏在各组织中仍保持最高表达量(P>0.5),2-ΔΔCT值为160.8,与空白对照组相比,闭壳肌和性腺的表达量显著上升(P<0.1),2-ΔΔCT值分别为1.9和55.3,肝胰脏有所下降,外套膜和鳃组织显著下降(P<0.1),2-ΔΔCT值分别为31.6和24.0(图3-a和图3-b,PBS组)。试验组注射LPS 6 h后,除性腺外各组织表达量相差不大,外套膜最高,2-ΔΔCT值为30.6,与处理对照组相比,闭壳肌的表达量显著上升(P<0.1),2-ΔΔCT值为19.2,性腺和肝胰脏显著下降(P<0.1),2-ΔΔCT值为0、25.4,外套膜和鳃组织变化不显著(图3-a,LPS组)。弧菌刺激6 h后性腺的表达量在各组中最高,2-ΔΔCT值为56.9,与对照组相比,闭壳肌和鳃组织的表达量显著上升(P<0.1),2-ΔΔCT值为13.3和42.7,肝胰脏和外套膜显著下降(P<0.1),2-ΔΔCT值为26.4和9.6,性腺无显著变化(图3-b,弧菌组)。
4 讨论
此研究获得的企鹅珍珠贝pgCTSD与其他组织蛋白酶D一样是由信号肽、前体域和成熟域三部分组成,其中信号肽长18个氨基酸残基,与大珠母贝相同[7],而美国龙虾(Homarus americanus)[13]和金鲷(Sparus aurata)[14]分别为16个和19个,人类[15]和猪[16]均为20个,物种间存在较大差异。在N-糖基化位点数量方面,企鹅珍珠贝pgCTSD(2个)与大珠母贝[7]相同,与虹鳟(1个)[17]、美国龙虾CTSD1(3个)[13]、金鲷[14](3个)等不同。在所分析的物种中企鹅珍珠贝的pgCTSD与大珠母贝pgCTSD的一致性最高,亲缘关系最近,与传统分类关系相符。
正常情况下企鹅珍珠贝pgCTSD在肝胰脏、鳃和外套膜中的表达量较高,其中在肝胰腺中最高,与栉孔扇贝、大菱鲆一致[18,19],但在LPS和弧菌刺激后相对表达量的变化情况不同。在肝胰腺中与正常表达量相比,PBS和LPS、弧菌刺激都引起表达量下降,但LPS和弧菌刺激后的表达量比PBS刺激和正常情况的表达量低很多,可能是因为产生了大量应激蛋白[19],导致CTSD表达的延迟,而LPS和弧菌又消耗了大量CTSD,因此CTSD表达量大幅下降。在大菱鲆和栉孔扇贝[18,19]中也发现类似情况,表明组织蛋白酶参与了免疫反应,肝胰腺是贝类重要的免疫器官。大菱鲆在弧菌刺激后CTSD在肝胰脏的表达水平经历了下降、上升、再下降又上升的过程[19],而笔者只检测了企鹅珍珠贝刺激6 h后pgCTSD在肝胰脏中的表达变化,其时空表达模式还有待进一步研究。
LPS和哈维弧菌刺激企鹅珍珠贝6 h后pgCTSD表达情况有所不同,前者性腺表达量显著下降,外套膜和鳃组织中无显著变化;后者性腺无明显变化,外套膜显著下降,鳃组织显著上升。两者表达情况的差异可能与刺激物成分不同有关。LPS是革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)的细胞壁成分,组成比较单一,而哈维弧菌包含多种致病因子,如胞外蛋白(OMP)、LPS和胞外产物(ECP)等。虽然LPS能刺激多种细胞因子的表达[20],但对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的研究表明,单一成分的LPS的致病性比哈维弧菌弱[21]。表明企鹅珍珠贝CTSD对不同致病成分的表达反应有所不同。
应激蛋白 篇6
本研究旨在运用补肾祛瘀化痰法以中医辨证论治为理论基础,以抗氧化治疗为基础,为中医药治疗氧化应激对机体的损伤提供新治疗方法。
1方法
1. 1实验动物及实验药物
实验动物清洁级8周龄ApoE基因敲除小鼠32只,均为雄性,体重( 20 ±2) g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号为: SCXK( 京) 2011-0012; 8周龄相同遗传背景C57BL /6J小鼠16只,均为雄性,体重( 20 ±2) g,购自军事医学科学院动物实验室,动物许可证号为: SCXK( 军) 2007-004。 实验药物补肾祛痰化瘀法组方( 通脉益智胶囊,生产批号: 20111206) 由女贞子15 g、何首乌20 g、丹参30 g、赤芍15 g、石菖蒲20 g、远志10 g、漏芦10 g等组成,将上述药材水煎煮后浓缩干燥,粉碎过筛,混匀制成胶囊,由中日友好医院试剂科提供。
1. 2实验设备
主要实验仪器全自动生化分析仪( 美国Beck- man公司,CX4) ,高速离心机,电子天平,图像分析仪( SPOT-2,美国Diagnostic Instrument Inc. ) 。722型可见光分光光度仪( CliniBio 128c) ,酶标仪。
1. 3主要实验试剂
超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD) 试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxi- dase,GSH-Px ) 活力试剂盒、丙二醛( malondialde- hyde,MDA) 含量试剂盒、总蛋白质含量试剂盒( 以上试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司) 、甲苯胺蓝试剂( 由东直门医院病理科提供) 、8-羟基脱氧鸟苷抗体及二抗试剂盒( 以上试剂购自博奥森生物科技有限公司) 。
1. 4分组及给药
将32只ApoE基因敲除小鼠随机分为4组,即成年中药组、老年中药组、成年对照组及老年对照组,每组均8只; 将同品系16只C57BL/6J小鼠随机分为2组,即成年正常组及老年正常组,每组均8只。饲养场地为北京中医药大学清洁级动物房,普通饮食,充足摄食及饮水,室温( 25 ± 2) ℃,风力0级。成年中药组小鼠至16周起、老年中药组小鼠至32周起,以750 mg / kg·d灌胃12周( 本剂量根据人与实验动物用药剂量换算得出) ,成年、老年模型组与正常组均以同体积生理盐水灌胃12周,每天一次。
1. 5实验动物取材
当成年组小鼠至28周龄时,老年组小鼠至44周龄时,成年中药组、对照组、正常组及老年中药组、对照组、正常组均随机选取6只小鼠,于4 ℃冰浴条件下迅速断颈、取脑,去除嗅球、小脑及脑干后,将其放置于冻存管中再浸入液氮中保存。各组剩余小鼠予腹腔注射4%水合氯醛( 约10 ml/kg) 麻醉动物,仰卧固定,开胸后暴露心脏,用注射液针头经左心室插入升主动脉,剪开右心耳,快速灌注生理盐水约100 ml至肝脏无血色,随后灌注4% 多聚甲醛约至尾及肢体应僵直。固定后立即断头开颅取脑,每组脑组织标记后迅速用4% 多聚甲醛浸泡。4天后取海马部分,石蜡包埋,冠状切片,片厚5 μm。
1. 6检测脑组织氧化应激状态:
进行检测时,将脑组织加9倍冰生理盐水制成100 g / L脑制成匀浆,并按照蛋白浓度试剂盒,SOD、 GSH-Px活力测定试剂盒、MDA测定试剂盒说明,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力、GSH-Px活力及硫代巴比妥酸法测定MDA含量。
1. 7甲苯胺蓝染色法观察海马及皮层神经细胞排列及尼氏体分布
将切片置于0. 5%甲苯胺蓝( 甲苯胺蓝1 g + 无水乙醇100 ml。使用时与1∶ 1的新鲜0. 1% NaCl溶液混合) 中室温下染色30分钟; 75%、95%、100%酒精中梯度脱色各1分钟,二甲苯透明10分钟,中性树胶封片。显微镜下观察照相并对尼氏体阳性神经细胞进行计数。
1. 8兔超敏二步法免疫组化检测8-羟基脱氧鸟苷的表达
用免疫组织化学法检测小鼠海马CA1区及皮层8-羟基脱氧鸟苷的表达。每组随机挑选6张切片,烤片后常规脱蜡,并去除非特异性过氧化物,微波抗原修复。滴加Ⅰ抗,予8-羟基脱氧鸟苷浓度为1∶ 50,37℃ 孵育1小时,然后放入4℃ 冰箱中过夜。 PBS-T液洗清洗后,加入Ⅱ抗( 加入试剂1后孵育1小时,PBS-T清洗后再加入试剂2,孵育1小时,用PBS-T液洗及Tris-Hcl清洗) 。DAB显色,记录显色时间,乙醇脱水、透明、中性树脂封片,加盖玻片。 选取同批染色切片进行显微镜观察。免疫组化图像结果分析: 将切片取相同位置,在40 ×10倍视野下,以胞浆染成棕褐色为阳性细胞标志,使用日本OLYMPUS BX60型显微镜和SPOT-Ⅱ( diagnostic in- struments. Inc) 软件采集图像,用IpWIN5软件对海马CA1区及皮层进行平均光密度值计算并计数阳性细胞数目。
1. 9统计方法
本实验采用SPSS 18. 0统计软件对实验数据进行分析、处理。本实验均为计量资料,以均数 ± 标准差( ± s) 表示,各组氧化应激指标均符合正态分布且方差齐,故多组之间比较使用单因素方差分析; 组间多重比较中,使用LSD法。若P > 0. 05则表示无明显差异,若P <0. 05则表示有差异,若P < 0. 01则表示有显著差异。
2结果
2. 1考马斯亮蓝蛋白浓度计算结果
成年组各组之间脑组织蛋白浓度符合正态分布且方差齐,单因素方差分析无明显差异,F = 1. 987,P = 0. 168( P > 0. 05) 。老年组各组之间亦符合正态分布且方差齐,单因素方差分析具有明显差异,F =5. 411,P =0. 017( P < 0. 05) ; 组间多重比较利用LSD法,老年正常组与老年对照组相比,脑组织蛋白浓度较高,P =0. 008( P <0. 01) ; 老年中药组与老年对照组相比,脑组织蛋白浓度亦升高,P = 0. 022( P < 0. 05) ,老年中药组与老年正常组相比,P = 0. 624( P > 0. 05) ,无统计学差异。见表1。
2. 2 SOD、GSH-Px活力测定及MDA含量测定
SOD活力测定: 成年组中,各组均符合正态分布且方差齐,应用单因素方差分析得出F =0. 392,P = 0. 682( P > 0. 05) ,说明成年组各组之间SOD活力无明显差异。老年组中,各组均符合正态分布但方差不齐,根据Welch检验得出P =0. 02( P <0. 05) , 说明各组之间存在差异; 组间多重比较时采用Tam- hane法,老年正常组与老年对照组相比,SOD活力显著升高,P =0. 002( P <0. 01) ; 老年中药组与老年对照组相比,SOD活力明显升高,P = 0. 016( P < 0. 05) ,老年中药组与老年正常组相比,P = 0. 798( P > 0. 05) ,无统计学差异。
GSH-Px活力测定: 成年组中,各组均符合正态分布且方差齐,应用单因素方差分析得出F = 1. 987,P = 0. 168 ( P > 0. 05) ,说明成年组各组之间GSH-Px活力无明显差异。老年组中,各组均符合正态分布且方差齐,应用单因素方差分析得出F = 4. 23,P = 0. 034( P < 0. 05) ; 组间多重比较利用LSD法,老年正常组与老年对照组相比,GSH-Px活力较高,P =0. 019( P <0. 05) ; 老年中药组与老年对照组相比,GSH-Px活力升高,P =0. 042( P <0. 05) ,老年中药组与老年正常组相比,P =0. 327( P >0. 05) ,无统计学差异。
MDA含量测定: 成年组中,各组均符合正态分布且方差齐,应用单因素方差分析得出F =1. 500,P = 0. 251( P > 0. 05) ,说明成年组各组之间MDA含量无明显差异。老年组中,各组均符合正态分布且方差齐,应用单因素方差分析得出F = 5. 226,P = 0. 019( P < 0. 05) ; 组间多重比较利用LSD法,老年正常组与老年对照组相比,脑组织MDA含量明显升高,P =0. 013( P <0. 05) ; 老年中药组与老年对照组相比,脑组织MDA含量亦明显升高P =0. 014( P < 0. 05) ,老年中药组与老年正常组相比,P = 0. 961 ( P >0. 05) ,无统计学差异。见表2。
2. 3甲苯胺蓝染色观察各组海马神经细胞排列及尼氏体分布情况
ApoE基因敲除小鼠海马CA1区均可见胞体中有蓝紫色的颗粒———尼氏体阳性表达,神经细胞胞核淡染,并可清晰观察神经细胞排列情况。成年各组之间尼氏体表达数量及平均光密度值均无明显差异( P > 0. 05) 。与老年正常组比较,老年对照组尼氏体表达数量均显著减少P =0. 000( P <0. 01) , 平均光密度亦明显减低P =0. 032( P <0. 05) ; 与老年中药组比较,老年对照组尼氏体表达数量均明显减少P =0. 027( P <0. 05) ; 且平均光密度值明显降低P =0. 041( P < 0. 05) 。显微镜下观察可见老年对照组较老年中药组、老年正常组的海马CA1区神经细胞排列松散,层次紊乱,细胞间隙较大,海马细胞层数少,可见部分神经细胞变性、坏死、凋亡。而成年组神经细胞排列紧密、层次清晰,细胞完整,尼氏体分布均匀、致密。见表3、图1。
2. 48-羟基脱氧鸟苷在海马CA1区及皮层中的表达
自由基与DNA上的碱基加合,通过酶作用后, 形成羟基脱氧鸟苷,8-羟基脱氧鸟苷是脱氧核苷的主要产物。可以直接诱导基因的突变和癌基因的表达。8-羟基脱氧鸟苷棕褐色阳性染色多出现在细胞核中,成年组8-羟基脱氧鸟苷表达均无明显差异,P >0. 05。与老年正常组相比,老年对照组8-羟基脱氧鸟苷表达升高,阳性细胞计数显著增加,P = 0. 006( P < 0. 01 ) ,且平均光密度明显增加,P = 0. 016( P < 0. 05) ; 而与老年中药组相比,老年对照组表达明显升高,阳性细胞计数明显增加,P = 0. 025( P < 0. 05 ) ,且平均光密度明显增加,P = 0. 037( P < 0. 05) 。见表4、图2。
3讨论
氧化应激与衰老、心血管疾病、肺部疾病及神经退行性病变均有一定的相关性［1-2］,故对抗氧化已成为延缓衰老、防治疾病、改善生活质量的不可或缺的方式之一。但是,根据流行病学的调查,合成抗氧化剂治疗是存在争议和不确定性的。现在常用的抗氧化剂一般有维生素C、维生素E及银杏制剂等,但由于作用不稳定、药物规格等限制,抗氧化治疗尚未用于一线治疗。补肾祛痰化瘀法的组方,主要由女贞子、何首乌、丹参、赤芍、石菖蒲、远志、漏芦等药物组成。方中女贞子、何首乌等补肝益肾、填精充髓、有滋阴强壮、延缓衰老之力,为君药; 丹参、赤芍等活血化瘀为臣药; 石菖蒲、远志等芳香化浊、祛痰利窍为佐药; 使以漏芦清热通窍疏经,诸药合之,共奏补肝益肾、化瘀祛痰、益寿延年之效。在中医药抗氧化、抗衰老方面提供新的治疗方法。
目前,实验室检测氧化水平的指标常用的有超氧化物歧化酶、丙二醛、还原性谷胱甘肽过氧化物酶、8-羟基脱氧鸟苷及一氧化氮等,可在蛋白水平和分子水平上检测药物对机体氧化应激水平的影响。 超氧化物歧化酶( SOD) 是一种重要的抗氧化酶,是生物体内清除自由基的首要物质。SOD可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害,并及时修复受损细胞,复原因自由基造成的对细胞伤害。丙二醛( MDA) 是一种脂质过氧化产物,它的含量代表着脂质过氧化水平,含量的升高从某种程度上反映了机体脂质过氧化的程度,间接反映出细胞受损的程度。谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的组成成分,可保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害,是机体对抗过氧化能力的指标之一。活性氧过度蓄积可造成DNA的氧化损伤,产生8-羟基脱氧鸟苷,并由于其为代谢终产物,在体内稳定存在,在体液中的水平不受饮食等因素影响［3-4］,故8- 羟基脱氧鸟苷可作为机体DNA氧化损伤的标志物而被广泛的应用于科研实验中。
实验结果显示,成年( 28周龄) ApoE基因敲除小鼠与同周龄C57BL/6J小鼠氧化水平没有明显差异( P >0. 05) ,而老年( 44周龄) ApoE基因敲除小鼠与同周龄C57BL/6J小鼠相比,其脑组织氧化应激水平显著升高( P <0. 01或P <0. 05) 。这可能由于ApoE基因敲除小鼠在非高脂饮食状态下、不同周龄动脉粥样硬化的病理变化是不同的。研究表明［5］,ApoE基因敲除小鼠非高脂饮食组与高脂饮食组在28周龄时,全部形成斑块,但非高脂饮食组仅有一只形成粥样斑块,其余的仅为纤维斑块。而当ApoE基因敲除小鼠增长至44周龄时,无论非高脂饮食组或高脂饮食组均形成粥样斑块,大量泡沫细胞崩解,深部为大量无定形坏死物质,斑块破裂、官腔狭窄明显。鉴于氧化应激与动脉粥样硬化的相关性［6］,可说明非高脂饮食情况下的28周龄ApoE基因敲除小鼠,其氧化应激水平较低,与C57BL /6J小鼠并无明显的差异; 而44周龄的ApoE基因敲除小鼠已有很严重动脉粥样硬化,各种病理变化导致多种炎性因子的释放,从而使机体过氧化产物剧增,而且导致DNA的氧化损伤从而导致氧化应激水平的上升,故与C57BL/6J小鼠相比,有显著的差异。
氧化应激作为认知障碍的危险因素一直受到医学界的广泛关注,如何使机体减缓衰老、抵抗氧化是目前医学界努力的方向和目标。随着研究的深入,大量研究表明［7-8］,目前市场流行的抗氧化剂,例如维生素C、维生素E及 β-胡萝卜素对改善氧化应激所造成的伤害均是收效甚微的,使用现有的合成型抗氧化剂不能代替每日规律地食用水果和蔬菜等天然抗氧化剂。而中医药亦可在减缓衰老、抵抗氧化、改善人类生活质量发挥重要的作用。
摘要：目的 评估不同周龄载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因敲除小鼠的氧化应激水平,并探讨补肾祛痰化瘀法对ApoE基因敲除小鼠氧化应激水平的影响。方法 将成年组及老年组ApoE基因敲除小鼠共32只随机分为中药组及对照组,并取相同遗传背景的C57BL/6J小鼠共16只随机分成成年正常组及老年正常组,连续给予补肾祛痰化瘀法组方灌胃12周,成年组至28周龄、老年组至44周龄时予检测脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力,及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;并进行甲苯胺蓝染色观察海马CA1区神经细胞分布情况及尼氏体数量,免疫组化法检测8-羟基脱氧鸟苷(Oxo-2'-deoxyguanosine,8-OHDG)表达情况。结果 氧化应激水平均符合正态分布,故采用单因素方差分析进行数据统计。ApoE基因敲除小鼠及C57小鼠28周龄时脑内氧化应激水平无明显差异;随着小鼠的周龄的增加,至44周时,老年ApoE基因敲除小鼠对照组其脑内MDA及8-OHDG表达水平明显增高,而SOD及GSH-Px表达水平明显降低,与老年正常组C57小鼠的脑内氧化应激水平具有明显差异(P<0.05);而老年中药组与老年正常组相比,无明显差异。结论 老年ApoE基因敲除小鼠氧化应激水平较高,而补肾祛痰化瘀法具有一定的抗氧化作用,可抵抗部分机体氧化作用,并控制机体氧化应激水平。