应激因子（共4篇）
应激因子 篇1
驼鹿(Alces alces),俗称罕达犴、犴,自然生态分布在欧亚大陆和北美大陆的环北极地区,是北方体型最大的鹿科动物。因其性格温顺、外形独特,具有极高的观赏性,肉、筋、鼻、鞭、皮、茸等均有很高药用经济价值,所以滥捕、滥杀现象严重。现存数量极少,如我国境内驼鹿的现存数量仅为3千头左右,而且仍呈继续下降之势,因此,对驼鹿的保护工作迫在眉睫。但驼鹿难于驯养、繁殖,所以国内人工饲养种群数量极少,对驼鹿的相关性研究也较少。本文依据“应激”理论,对影响驼鹿的几种主要环境因子进行研究,同时通过对人工饲养繁育驼鹿与从野外新收购的驼鹿的血液成分进行比较分析,以期为驼鹿养殖提供适宜的环境参数,进而为驼鹿的人工养殖提供科学的理论依据。
1 应激
应激(Stress)是机体对内部或外界的超常剌激所产生的非特异性应答反应的总和。
对动物体而言,一定程度上的应激是维持动物内稳态所必需的,是一种特殊的、合理的适应性反应(防卫反应)。从生物进化论的观点来看,应激是自然选择所必需经历的过程。在某种程度上来说,缺乏应激反应,动物就不能适应自然界的生存条件。在动物的饲养管理过程中,可经常巧妙地利用适度应激来提高动物的适应性。因此,必须全面认识应激的实质,才能正确评价应激的结果。
2 环境因子中几种常见的应激源
能够对圈养驼鹿产生应激反应的几种常见的环境因子主要有:噪音、温度(过冷或过热)、湿度(过高或过低)、光照(过长或不足)以及异味等,本文现对这几种常见的环境因子来进行论述分析。
3 齐齐哈尔地区的自然条件概况
齐齐哈尔地区属黑龙江省西部温带草原区域,地势为丘陵和堆积——侵蚀平原、堆积平原和湖积平原,嫩江、松花江西界南界流经本区,南部多湖泊。气候属温带半湿润干旱气候类型,处湿润度较低的地区,年平均气温9.7℃,最高气温36℃,最低气温-36℃,7月份平均气温20~22℃,≥10℃年积温2747.4℃,平均年降水量429.8mm,无霜期137d,相对湿度62%,盛行风和西北,主风西北风。中心城区地处北纬47°17′~47°22′,东经124°12′。
4 试验时间、研究对象与方法
4.1 试验时间
2003年4月~10月。
4.2 研究对象
4.2.1 研究动物
齐齐哈尔市龙沙公园用于实验的驼鹿基本情况见表1。
4.2.2 饲养概况
齐齐哈尔市龙沙公园驼鹿饲养历史悠久,经验丰富,现存栏驼鹿8头,总体饲养状况良好,曾先后为国内多个动物园培育驼鹿100余头。
4.2.3 饲养场地情况
驼鹿生活在坐北朝南的圈舍内,采光、通风条件良好,舍内砖地,面积13.7m2(3.7m×3.7m);运动场砂土池,面积44.4m2(3.7m×12m)。
4.3 研究方法
4.3.1 对环境因子中几种常见的应激源的研究方法
4.3.1. 1 噪音对驼鹿的影响
通过观察分析噪音对驼鹿正常生活的影响,尤其是强噪音对怀孕驼鹿的影响。噪音强度是依据齐市环保局提供参照噪音指数确定的)。同时用相临圈舍同期其他种类孕鹿进行对比。
4.3.1. 2 湿度对驼鹿的影响
用干湿计每日测量圈舍及运动场的湿度,通过观察驼鹿的耐受程度,分析湿度对驼鹿的影响。
4.3.1. 3 温度对驼鹿的影响
用温度计每日测量圈舍及运动场的温度,通过观察驼鹿耐受程度,分析温度对驼鹿的影响。
4.3.1. 4 光照对驼鹿的影响
分析实验地的光照时间及特点,分析驼鹿的适应性变化,分析光照对驼鹿的影响。
4.3.1. 5 异味对驼鹿的影响
通过观察用化学消毒药品0.3%的来苏儿液体进行场地消毒以及对围栏喷刷油漆时驼鹿的表现,分析异味对驼鹿的影响。
4.3.2 血清学检测方法
抽取人工自繁饲养繁殖成活的T6以及新收养的当年野生T7的静脉血液,对其血细胞与血液成份进行比较,对圈养与野生驼鹿的机体免疫功能、红细胞代谢功能、肝功能、离子平衡、能量代谢、心脏功能等方面加以比较,分析圈养条件下驼鹿对应激产生的适应性。
5 结果与讨论
5.1 几种环境因子对驼鹿应激影响的结果
5.1.1 噪音对驼鹿应激影响的结果
2003年4月20日上午发现驼鹿3流产,流产胎儿达7月龄,发育良好,相邻的梅花鹿及马鹿孕鹿均未流产,饮食正常,后来都正常生产。
分析:是由于4月18日晚8:00时,距T3圈舍1 km处,中环商业广场开业时燃放的礼炮及礼花达30min,噪音70~80分贝,这一应激使T3产生了一定的应激反应,导致流产,同时T3与其他驼鹿还有惊厥、狂跳、蹄底磨损受伤出血甚至是肢体表面大面积擦伤和角茸折损等表现,这可能是由于突发性的剧烈噪音使驼鹿受到惊吓所致。
5.1.2 湿度对驼鹿应激影响的结果
在夏季,驼鹿特别喜湿喜水,当圈内及运动场的湿度低于40%时,驼鹿就表现呼吸加快,鼻镜干燥,精神萎靡,食欲减退,将头伸进水槽内和趴卧尿湿地等行为表现。如及时采取洒水增加湿度的措施,驼鹿的上述症状就可得到有效缓解,恢复正常,这同驼鹿野外生活习性相似。但当环境湿度过大(高于85%)时,驼鹿表现出不适性,尤其是在蹄部尤为明显,蹄壳过软,不耐磨损,易患蹄病,这一点与牛羊等蹄壳类动物相似。
5.1.3 温度对驼鹿应激影响的结果
当环境温度在5~25℃时,驼鹿表现出呼吸平稳,饮水、采食正常,其他各项生理指标也均在正常范围内。当环境温度高于30℃时,驼鹿就表现出呼吸急促(正常为30~40次)、饮水量增加、食欲减退等症状;当环境温度低于0℃时,驼鹿表现出饮水减少等症状。
5.1.4 光照对驼鹿应激影响的结果
驼鹿自然生态分布在欧亚大陆和北美大陆的环北极地区。在欧亚大陆的分布是:北自斯堪的那维亚半岛,经波兰东部、白俄罗斯、立陶宛,向东南达乌拉尔山脉南部和阿尔泰山系,向东一直延伸西伯利亚,东部沿海地区和黑龙江下游。在北美洲,驼鹿分布在从阿拉斯加,经加拿大,到美国的科罗拉多洲北部的五大湖沿岸。其分布区大约为北纬42°~66°(西半球)或42°~72°(东半球)。
在长期的物种进化过程中,驼鹿对栖息地的光照条件已表现出一定的适应性,并表现出一定的适应性。我国南方的一些动物园曾有从我园引进驼鹿的经历,虽然采取了放置冰块或安装空调来控制环境温度、喷洒水增加湿度以及按照我园驼鹿的日粮组成来饲喂驼鹿等一系列技术措施,但均未获得成功,分析其原因,除了在饲养管理方面存在的差异外,光照时间过长可能也起到了一定的作用。
5.1.5 异味对驼鹿应激影响的结果
对驼鹿圈舍用来苏儿进行消毒时,驼鹿有远离有这种味道的水槽、食槽以及拒绝采食和饮水的行为。另外,在对围栏喷刷油漆时,驼鹿油漆所散发出的刺激性气味也表现出了一定的不适性。
5.2 血液检验结果
5.2.1 血常规结果
详见表2、表3、表4。
5.2.2 血液成分结果
详见表5、表6、表7。
5.3 讨论
5.3.1 对环境因子中几种常见的应激源的讨论
5.3.1.1 可以看出,孕驼鹿与怀孕的马鹿、花鹿相比,对噪音的忍受程度较差,发生了流产。
5.3.1.2 驼鹿对环境温度、湿度的要求也较为苛刻,当温度、湿度以及光照不适宜时即可表现出一定的不适性。每当夏季炎热天气来临的时候,可采取遮荫蔽阳或向驼鹿舍内及运动场洒水等措施。
5.3.1.3 来苏儿这一消毒液体在空气中的气味浓度过高就可以引起驼鹿产生一定的应激反应,在生产中应避免使用来苏儿这一类具有较强刺激性气味的消毒液进行场地消毒,可改用其它如百毒杀等异味较小或无的消毒液,以免引起驼鹿的应激反应。
5.3.2 对血常规及血液成分对比的讨论
从血液成份对比上来看,经过几个月的人工饲养后,T6的部分血细胞成分的含量已发生变化,且白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞明显高于T7,这说明T6在圈养条件下,经过各种应激反应,已经获得了某些适应,自身免疫功能得到增强。同时,T6在细胞代谢、肝功能、离子平衡、能量代谢等方面也发生了相应的变化,且在饲养一段时间后与T7比较接近,说明T6的生理状态是正常的,已经适应了圈养环境。T6的血红蛋白等血液成分的含量明显高于T7,这说明我园饲养驼鹿的日粮结构较为合理。T6的血小板含量明显低于T7,说明T7的在受到外伤后凝血能力强于T6,这是驼鹿适应野外生存条件的一种适应性表现。
6 结论
在圈养驼鹿的过程中,由于经常受到各种环境应激源的刺激,使驼鹿产生了各种应激过程,同时也获得了适应,并得以生存和繁衍。在这一过程当中,其血液成份发生了相应的变化,对外界环境的适应能力得到提高。
圈养驼鹿对环境因子中几种常见的应激源(噪音、温度、湿度、光照以及异味等)的反应较为敏感,当应激强度过大时,就会产生一定的应激反应。
根据观察研究,特提出驼鹿适宜的环境参数,见表8。
7 建议
在驼鹿的饲养管理过程中,应尽可能依据驼鹿的生物学特性,采取多种措施,来减少和避免各种环境因子的产生,为驼鹿创造出具有良好条件的生存空间。同时,还可适当利用应激反应来提高驼鹿的适应能力,以解决驼鹿适应性差、难于人工圈养的问题,达到饲养繁殖乃至保护驼鹿这一珍贵濒危物种的目的。
应激因子 篇2
1.1 动物分组与造模
健康成年BALB/c小鼠40只, 雌雄各半, 清洁级, 体重24g~26g, 购自山西医科大学微生物实验室。室内温度21℃~23℃, 湿度50%左右, 自然昼夜节律光照, 适应性饲养1周。随机分为4组, 每组10只, 对照组, 5d、10d、15d应激组。参照造模方法[1]将小鼠束缚于自制的束缚筒内[2], 应激组小鼠接受束缚应激, 6h/d, 每次开始束缚的时间不同。15d组持续束缚15d, 当该组束缚5d后, 10d组开始接受束缚, 连续10d, 10d组进行束缚应激5d后, 5d组再开始接受束缚, 连续5d后, 3组同时停止束缚应激, 造模结束。实验鼠在清醒、安静状态下进行实验与处死。
1.2 主要试剂与设备
旷场试验所用敞箱[3], 为高20cm、长宽45cm, 四周涂为黑色, 上面敞开, 底面用白线划分为面积相等的25块, 沿墙格称外周格, 其余为中央格。Q/GHSB 85-2001淋巴细胞分离液、pH 7.2~7.6PBS缓冲液、ZS-2自动酶标监测仪、TGL-16B高速台式离心机、深圳晶华公司IL-4, TNF-γELISA试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 观察体重行为变化
记录每只小鼠在实验中的形态变化及饮食情况, 比较体重改变的结果。
1.3.2 旷场实验
Open-Field法造模结束, 小鼠在安静、暗光的环境下进行旷场试验, 将小鼠置于中央格内然后计时, 记录小鼠在3min内中央格停留时间 (潜伏期) 、穿越临格次数、理毛修饰次数 (前肢抬举, 抓痒、洗脸、舔足等行为) 及粪便次数。行为评定采用盲法, 由三名观察者进行, 摄像机记录全程, 最后请3位观察者观看录像评分, 取其均数。
1.3.3 血标本采集
小鼠摘眼球取血置于抗凝管中, 2500r/min离心1 0min, 3 7℃孵育3h~4h, 取血清-2 0℃保存备用。
1.3.4 检测胸腺和脾脏指数
将处死小鼠分离脾脏和胸腺, 生理盐水冲洗, 滤纸吸干表面液体, 称重。计算脾脏指数和胸腺指数。
1.3.5 小鼠脾淋巴细胞
小鼠脾脏于300目不锈钢网研磨, PBS缓冲液冲洗, 滤液静置5min后吸取上清, 冲洗2次, 1 000r/min离心10min, 2mL PBS重悬;试管内加入2mL淋巴细胞分离液, 并在其上加入2 mL细胞悬液, 2 000r/min离心10min, 离心后吸取两层界面之间的脾淋巴细胞 (雾状层) , 置入另一试管, 洗2次, 每次1 000r/min离心5min, 适量PBS重悬沉淀, 计数。
1.3.6 肠系膜淋巴结淋巴细胞
无菌分离小鼠肠系膜淋巴结, 在300目不锈钢网过滤、冲洗、离心、沉淀、重悬计数。
1.3.7 细胞因子的检测
用ELISA法测IFN-γ和IL-4的含量, 具体步骤按试剂盒说明进行。
1.3.8 统计学处理
应用SPSS11.5统计分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用独立两样本t检验;其他指标用单因素方差分析, 组间比较SNK-q检验。
2 结果
2.1 行为及体重观察
应激组在3d出现相互撕咬、烦躁、惊恐和敌意等异常行为, 但体重增长差异不明显, 4d后随时间延长, 应激组则出现活动减少、精神萎靡、毛发灰暗, 食欲不振、尿量增多、大便稀的现象;并且体重呈现下降趋势, 与正常组有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 心理应激对小鼠旷场行为的影响
与对照组相比, 应激组小鼠在中央格停留时间明显延长, 穿格次数显著减少, 粪便次数增多, 组间修饰次数无统计学意义 (P>0.05) 。其中15d应激组中央格停留时间、穿格次数和粪便次数与对照组有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。
2.3 应激对小鼠脾脏和胸腺指数的影响
应激组小鼠脾脏指数受到明显抑制, 明显低于对照组 (P<0.05~P<0.01) , 胸腺指数与对照组之间无统计学意义。详见表2。
2.4 小鼠脾淋巴细胞数量和肠系膜淋巴结淋巴细胞数量变化
与对照组相比, 5d应激组脾淋巴细胞数量和肠系膜淋巴结淋巴细胞数量都明显降低 (P<0.05) , 10d、15d应激组有统计学意义 (P<0.01) 。详见表3。
×105
2.5 各组小鼠血清中IFN-γ和IL-4水平及IL-4/IFN-γ的变化
与对照组比较, 5d应激组血清中IFN-γ明显降低 (P<0.05) , 且随着应激时间延长而显著下降 (P<0.01) 。应激组血清中的IL-4水平虽呈上升趋势, 但与对照无统计学意义, IL-4/IFN-γ的比值明显高于对照 (P<0.05) , Th细胞向Th2偏移。详见表4。
3 讨论
近年来, 有关心理应激对机体行为和认知功能障碍的研究越来越受到重视, 持久过强的应激可以通过多种途径影响和改变中枢神经系统功能状态, 进而引起动物进食情绪和行为的异常[3]。本实验显示慢性应激抑制了小鼠的体重增长, 与对照相比体重下降趋势明显, 且随着应激时间的延长, 应激组的体重始终较低。Open-fild实验是动物在新异环境的探究、活动、紧张、恐惧情绪和行为表现的经典实验[4], 可衡量类于人的复杂情绪如焦虑、抑郁等的。随着应激时间的延长, 小鼠自主活动逐渐减少, 中央格停留时间延长;穿格次数呈递减趋势;粪便次数较正常组显著增多, 提示应激使小鼠对周围环境的探究能力减弱, 有兴趣减退、倦怠、食欲不振等行为, 产生类焦虑、抑郁等负性情绪效应, 行为情绪受到明显抑制, 且抑制的程度与应激时间有关。
应激能够影响动物和人体的免疫功能, 胸腺和脾脏为机体主要免疫器官。肠黏膜淋巴结合有不同免疫细胞, 是免疫应答的启动位点, 主要负责抗原的加工、处理及递呈。应激减轻小鼠脾脏重量, 使体积缩小, 脾脏指数与对照组相比有统计学意义。而胸腺指数差异不明显, 考虑为增龄性的萎缩。脾淋巴细胞的数量和肠系膜淋巴结的细胞数量受到抑制, 随应激时间的延长呈明显降低趋势。慢性应激抑制了小鼠的免疫功能。
T辅助细胞 (Th) 可分为Th0、Th1、Th2和Th3 4种亚群, 其中Th1和Th2细胞及其细胞因子的激活决定了免疫系统的有效作用。Th1和Th2细胞可分泌不同的细胞因子, IFN-γ主要由Th1细胞产生, 可促进细胞免疫, 通过激活TC细胞、NK细胞和巨噬细胞增强免疫功能[5];细胞因子IL-4由Th2细胞分泌, 促进B细胞增殖、分化和产生抗体, 介导体液免疫应答。本实验显示各应激组的Th1/Th2细胞失衡, IFN-γ的含量随应激时间的延长逐步下降, 显著低于对照组, 其他动物实验也证实[8], 应激影响细胞产生IFN-γ的能力并降低血中IFN-γ的水平, 并且下降程度与应激的程度成正比。细胞因子IL-4的含量虽有逐步上升趋势。IFN-γ和IL-4是一对相互拮抗的因子, 虽然IL-4的水平无显著升高, 但通过IFN-γ水平降低, 仍导致Th1/Th2的失衡, 从而导致机体的免疫功能降低。细胞因子调节免疫系统的应答之外, 还作为一种神经递质, 调节神经内分泌和行为的改变[7,8]。慢性应激如何使Th1/Th2细胞的漂移, 逆转或稳定Th1/Th2状态的药物和方法是否可以改善情绪和行为, 有待进一步研究。
参考文献
[1]McGivern RF, Rittenhouse P, Aird F, et al.Inhibition of the stressinduced neuroendocrine and behavioral responses in the rat by prepro-thyrotropin-releasing hormone 178-199[J].J Neuroscience, 1997, 17 (12) :4886-4894.
[2]卢莉, 李敏芳.慢性应激对小鼠行为和免疫功能的影响[J].中国临床心理学杂志, 2009, 17 (3) :370-371.
[3]Palermo Neto J, Massoco CO, Favare RC.Effects of maternal stress on anxiety levels, macrophage activity, and Ehrlich tumorgrowth[J].Neurotoxicol Teratol, 2001, 23 (5) :497-507.
[4]Lipkind D, Sakov A, Kafkafi N, et al.New replicable anxiety-related measures of wall vs.center behavior of mice in the open field[J].J Appl Physiol, 2004, 97:347-359.
[5]Lucey DR, Clerci M, Shearer GM.Type 1and Type2cytokine dysregulation in hunean infectious, neoplastic and inflammatory diseases[J].Clin Microbiol Rev, 1996, 9:532-562.
[6]Iwakabe K, Shimada M, Ohta A, et al.The restraint stress drives a shift in Th1/Th2balance toward Th2-dominant immunity in mice[J].Immunol Lett, 1998, 62:39-43.
[7]Ball TM.Cortisol circadian rhythms and stress responses in infants at risk of allergic disease[J].Neuroimmu nomodulation, 2006, 13 (56) :294-300.
应激因子 篇3
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
雄性SD大鼠,体质量200~250 g,由南华大学动物实验中心提供。考马斯亮兰、MDA及T-AOC试剂盒均购自南京建成生物公司。MIF引物由北京鼎国昌盛生物技术公司合成。NF-КB/p65 ELISA试剂盒和MIF抗体购自武汉博士德生物工程公司。
1.2 动物分组及模型制备
1.2.1 30只雄性SD大鼠,随机分为三组
假手术组(n=10)、脓毒症组(n=10)、胰岛素治疗组(n=10)。采用盲肠结扎穿孔方法建立脓毒症模型[7]。胰岛素治疗组造模后即予皮下注射胰岛素(0.5 IU/kg),假手术组和脓毒症组皮下注射等量生理盐水。三组分别在造模后1/2 h、1 h、2 h、6 h监测血糖。
1.2.2 各组大鼠造模后12 h全部处死
10%水合氯醛麻醉打开胸腔主动脉取血,用于血气分析。分离左上肺,吸水纸吸去肺表面血液后称湿质量(W),然后置80℃烘箱烘干,48 h后再称干质量(D),计算出W/D。另取左下肺肺组织100 mg加入9 m L生理盐水制成肺组织匀浆,离心,留取上清液,于-70℃冰箱保存,备生化指标统一测定。剩余部分用于RT-PCR检测。4%多聚甲醛溶液心室灌流,取右肺甲醛固定以备病理切片。
1.3 肺组织匀浆丙MDA、T-AOC检测
按试剂盒说明书步骤用考马斯亮兰定蛋白,免疫比浊法经全自动生化分析仪测定。
1.4 肺组织NF-КB/p65检测
按试剂盒说明书步骤采用ELISA法半定量检测NF-КB/p65含量。
1.5 MIF m RNA的RT-PCR检测
提取肺组织总RNA。引物序列为:上游5'-CAT GACTTTTAGTGGCACGAG-3',下游5'-GGCTGCGTT CATGTCGTAATAG-3',产物长175 bp。GADPH作内参,引物序列为:上游5'-ACCACAGTCCATGCCATC AC-3',下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',产物长452 bp。采用二者扩增产物琼脂糖电泳条带灰度比值半定量检测MIF m RNA表达水平。
1.6 肺组织中MIF蛋白表达的检测
切片后免疫组织化学法染色,采用平均阳性染色面积百分比法半定量分析MIF蛋白表达的部位与强弱。
1.7 肺病理形态学分析
石蜡切片HE染色观察肺组织病理学改变及炎症细胞浸润情况。
1.8 统计学分析
实验数据采用SPSS 17.0统计软件处理,结果用均数±标准差表示,采用单因素方差分析,组间两两比较用q检验,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 模型建立后6 h各组大鼠的一般情况及血糖水平
假手术组大鼠精神状态基本正常,呼吸平稳,自由活动、摄食、饮水;脓毒症组精神状态最差,呼吸急促,眼半闭,萎靡,蜷缩呈一团,反应迟钝,刺激可见有少许活动,少量摄食、饮水;胰岛素治疗组精神状态较差,呼吸稍促,萎靡,可见有少许活动,摄食、饮水较少;三组血糖水平无明显差异。
2.2 动脉血Pa O2、肺W/D比较
与假手术组比较,胰岛素治疗组Pa O2下降16.11%,W/D值上升18.56%。脓毒症组Pa O2下降32.98%,W/D值上升45.54%;与脓毒症组比较,胰岛素治疗组Pa O2上升25.19%,W/D值下降18.54%。差异均有显著性(P<0.05)(见表1)。
注:1)与假手术组比较,P<0.05;2)与脓毒症组比较,P<0.05
2.3 肺组织匀浆MDA、T-AOC水平比较
与假手术组比较,胰岛素治疗组MDA上升122.79%,T-AOC下降38.38%。脓毒症组MDA上升240.58%,T-AOC下降60.36%;与脓毒症组比较,胰岛素治疗组MDA下降34.58%,T-AOC上升55.44%。差异均有显著性(P<0.05)(见表2)。
注:1)与假手术组比较,P<0.05;2)与脓毒症组比较,P<0.05
2.4 肺组织NF-КB/p65、MIF m RNA表达水平比较
与假手术组比较,胰岛素治疗组NF-κB/p65上升201.32%,MIF m RNA上升123.81%。脓毒症组NF-κB/p65上升428.48%,MIF m RNA上升276.19%;与脓毒症组比较,胰岛素治疗组NF-κB/p65下降42.98%,MIF m RNA下降40.51%。差异均有显著性(P<0.05)(见表3)。
注:1)与假手术组比较,P<0.05;2)与脓毒症组比较,P<0.05
2.5 肺组织免疫组化染色分析MIF蛋白表达部位及相对含量
阳性着色表现为胞质染成棕黄色或棕褐色。假手术组可见极少量阳性表达(见图1)。脓毒症组阳性表达较假手术组上升583.33%,表达多分布于巨噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞(见图2)。胰岛素治疗组阳性表达较假手术组上升266.67%,较脓毒症组下降46.34%(见图3)。差异均有显著性(P<0.05)(见表4)。
2.6 肺组织光镜下病理学变化
假手术组肺泡结构清晰,极少量炎性细胞浸润,无充血、出血现象(见图4)。脓毒症组肺泡结构破坏,肺泡隔明显增宽及充血,肺泡壁毛细血管扩张、淤血,肺内大片状炎性细胞浸润(见图5)。胰岛素治疗组炎性病变较脓毒症组明显减轻(见图6)。
注:1)与假手术组比较,P<0.05;2)与脓毒症组比较,P<0.05
3 讨论
目前认为ALI/ARDS是肺组织对严重感染、创伤、休克及大量输血、输液等打击后产生广泛而过度的炎症反应。NF-κB是调控炎症反应和氧化应激的一种重要核转录因子,通过调节多种前炎性因子/趋化因子、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)等的表达,在炎症和免疫反应、氧化应激等过程中发挥重要甚至中心作用[7,8,9]。脓毒症中当大量内毒素刺激炎性细胞时,NF-κB迅速激活[10],启动包括MIF在内的一系列炎性因子的转录。MIF作为一种前炎性因子和促炎因子,具有抑制巨噬细胞游走并促进其在炎症局部浸润、增生、激活的功能,在脓毒症的发生、发展过程中发挥着重要的作用[11,12,13]。在大鼠急性胰腺炎模型中,早期给予抗炎因子IL-10治疗,可降低促炎因子MIF的产生,从而减轻胰腺炎相关ALI的损害,对肺组织有一定的保护作用[14]。在脓毒症导致的ALI患者,其肺组织MIF m RNA和蛋白表达水平明显高于正常对照组[15]。由此可见,NF-КB活化进而上调MIF的基因转录和蛋白表达水平、扩大氧化应激是脓毒症ALI/ARDS的关键发病环节之一[16]。
近年来,研究发现胰岛素除具有调节机体物质与能量代谢的功能外,还参与了抗炎、抗氧化应激和抗凋亡等广泛的组织细胞保护作用[17]。胰岛素通过与细胞表面胰岛素受体结合经多种信号途径显著抑制细胞核内NF-κB表达,进而抑制了其所调控的炎症相关基因转录,抑制促炎因子和增加抗炎因子的合成与释放,抑制氧化应激和ROS生成[4,5,6]。DANDONA等[18]在人体研究中发现输注胰岛素能在数小时内产生快速抗炎作用,包括:抑制NF-κB活化,降低炎症相关因子和ROS的浓度。JESCHKE等[19]对受热损伤的大鼠随机给予盐水及胰岛素,观察不同时间点各种炎症因子的变化,结果发现胰岛素组MIF较对照组明显降低。因此,可以推测:胰岛素可能通过抑制NF-κB活化进而下调MIF的表达和拮抗氧化应激而对脓毒症ALI/ARDS具有保护作用。
本研究发现:脓毒症组较假手术组大鼠肺组织中NF-κB/p65含量明显上升、巨噬细胞浸润和炎症反应程度明显增强、MIF表达明显增高且病理损伤严重处MIF表达尤其明显。这些结果提示MIF参与了脓毒症ALI过程,可以作为ALI/ARDS诊断的较敏感的化学免疫指标。此外,脓毒症大鼠MDA含量明显上升,T-AOC明显下降,提示氧化应激也参与了脓毒症ALI过程。这些结果与急性肺水肿的发生、肺泡隔增宽及充血致氧弥散障碍和肺泡结构破坏致通气/血流比例失调而最终导致Pa O2下降是一致的。由此可以推测:脓毒症时内毒素可以刺激肺组织NF-κB活化,启动MIF m RNA的转录,上调MIF的蛋白表达水平,促使炎性细胞在肺组织募集及活化,进一步产生炎症因子和ROS,形成炎症的瀑布样链锁反应,导致肺上皮细胞以及血管内皮细胞受损,影响细胞间隙以及钠水转运系统及表面活性物质的产生,急性肺水肿和透明膜的形成,顽固性低氧血症,最终发展成ARDS。这也提示:通过抑制NF-κB活化进而下调MIF的表达和抑制氧化应激可能有益于控制脓毒症ALI/ARDS的发生、发展,临床上可以考虑作为一种常规治疗策略。胰岛素治疗组大鼠血糖水平与其它组无明显差异,但是与脓毒症组比较,NF-κB/p65、MIF m RNA、MIF、MDA、W/D值水平明显下降,而T-AOC、Pa O2水平明显上升,且肺组织中巨噬细胞浸润、炎症反应和病理损伤程度明显改善。提示小剂量胰岛素在不影响血糖稳定的基础上可以明显抑制NF-κB活化,进而下调MIF的基因转录和蛋白表达水平、拮抗氧化应激。减轻肺组织中巨噬细胞浸润、炎症反应和病理损伤程度,改善急性肺水肿和Pa O2水平,对脓毒症ALI具有较好的保护作用。本实验结果可以为胰岛素调节血糖之外的抗炎作用机制研究提供进一步的依据,也可以为胰岛素临床应用于治疗脓毒症ALI提供理论支持。
本研究结果显示:小剂量胰岛素通过下调MIF的表达和抑制氧化应激对脓毒症急性肺损伤有保护作用,其机制可能与抑制NF-κB活化有关。但是,胰岛素抑制NF-κB活化进而下调MIF表达和抑制氧化应激的具体信号途径尚需进一步研究。
摘要：目的 观察小剂量胰岛素对脓毒症大鼠急性肺损伤巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和氧化应激的影响,探讨胰岛素的肺保护作用及其机制。方法 30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、脓毒症组、胰岛素治疗组,以盲肠结扎穿孔法建立脓毒症大鼠模型。各组于建模后12 h处死,分别测定动脉血氧分压(PaO2)、肺湿干质量比(W/D)、肺组织匀浆丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)测定、肺组织NF-КB/p65及MIF表达水平及肺损伤病理程度等。结果 脓毒症组肺W/D、MDA、NF-КB/p65、MIF、MIF mRNA及病理损伤程度较假手术组显著上升(P<0.05),T-AOC和PaO2显著下降(P<0.05);而胰岛素治疗组与脓毒症组比较肺W/D、MDA、NF-КB/p65、MIF、MIF mRNA及病理损伤程度显著下降(P<0.05),T-AOC和PaO2显著上升(P<0.05)。结论 小剂量胰岛素能够下调MIF的表达和抑制氧化应激,对脓毒症大鼠急性肺损伤有保护作用,其机制可能与抑制NF-КB活化有关。
应激因子 篇4
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2012年1月-2014年12月于南京市江宁区中医医院接受治疗的80例早期DR患者作为研究对象。按照随机数字表法随机分为对照组(n=40,76眼)和观察组(n=40,74眼)。所有患者均符合2型糖尿病的相关标准[3],均经眼底检查和荧光血管造影确诊为DR的Ⅰ~Ⅲ期,并排除视网膜黄斑水肿、脑血管疾病、心血管疾病、肾病综合征、高渗综合征、屈光间质浑浊,药物应用禁忌、严重心肺及肝肾功能不全等患者。对照组和观察组患者在性别、年龄、糖尿病病程及DR分期、空腹血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白、血脂以及血压等基线资料方面比较大体一致(P>0.05),所有患者对治疗方案知情同意,并签订知情同意书。见表1。
1.2 研究方法
1.2.1 治疗方法
所有入选患者均给予常规治疗,主要包括控制血糖、血压、抗血小板聚集、调脂、维生素B1、维生素C、甲钴胺等。在此基础上,对照组患者给予前列地尔注射液(本溪恒康制药有限公司,国药准字H20093175)10μg+生理盐水100 ml静脉滴注治疗,1次/d,连续应用2周。而观察组患者在对照组基础上联合给予依帕司他(扬子江药业集团南京海陵药业有限公司,国药准字H20040012)50 mg/次,口服治疗,3次/d,连续应用2周。
1.2.2 疗效评价及观察指标
疗效结束后,进行早期DR疗效评价,标准如下:显效:经过治疗,患者眼底视网膜出血、渗出、血肿、微血管瘤、荧光造影渗漏点等各项病变中至少3项较治疗前显著减轻,血管直径扩张≥10%;有效:经过治疗,患者上述眼底各项病变至少2项较治疗前显著减轻,血管直径扩张≥5%;无效:经过治疗,患者眼底各项病变及血管直径较治疗前无改善,甚至进一步恶化。其中显效病例和有效病例均为早期DR治疗有效。治疗前后,抽取患者静脉血,检测比较对照组和观察组患者血清氧化应激指标:丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)及炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素2(Interleukin 2,IL-2)、白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10)水平。其中MDA、SOD、TAOC分别采用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法、Fe3+/Fe2+化学法检测(试剂盒均购于南京森贝伽生物科技有限公司),TNF-α、IL-2、IL-10则采用ELISA法检测(试剂盒由上海恒远生物科技公司提供)。并于治疗期间,观察患者不良反应发生情况。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用t检验,计数资料用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基线资料比较
基线资料比较,见表1。
2.2 临床疗效比较
疗效评价后,对照组和观察组患者治疗总有效率分别为80.0%和95.0%。经χ2检验比较,差异有统计学意义(χ2=4.114,P=0.042),观察组患者总有效率高于对照组。见表2。
2.3 氧化应激指标比较
治疗前,经独立样本t检验,观察组和对照组患者氧化应激指标MDA、SOD、TAC水平组间比较,差异无统计学意义(t=0.876、0.267和0.438;P=0.384、0.790和0.662,P>0.05)。治疗前后,经独立样本t检验,对照组和观察组上述氧化应激指标较治疗前有一定程度改善,差异有统计学意义(对照组t=3.988、3.200和3.136;P=0.000、0.002和0.002,观察组t=11.349、8.302和5.305;P=0.000、0.000和0.000,P<0.05)。经配对t检验,患者MDA、SOD、TAC等氧化应激指标水平治疗前后差值组间比较差异有统计学意义(t=6.197、4.934和2.709;P=0.000、0.000和0.008,P<0.05),观察组患者治疗后MDA水平低于对照组,SOD、TAC水平高于对照组。见表3。
2.4 炎症因子水平比较
治疗前,经独立样本t检验,观察组和对照组患者炎症因子TNF-α、IL-2、IL-10水平组间比较,差异无统计学意义(t=0.639、0.200和0.371;P=0.525、0.842和0.712,P>0.05)。治疗前后,经独立样本t检验,对照组和观察组上述炎症因子指标较治疗前均有一定程度改善,差异有统计学意义(对照组t=7.184、3.297、6.789;P=0.000、0.002,0.000,观察组t=15.156、7.383、9.997;P=0.000、0.000,0.000,P<0.05)。经配对t检验,患者TNF-α、IL-2、IL-10炎症因子水平治疗前后差值组间比较差异有统计学意义(t=9.448、4.593、3.660;P=0.000、0.000和0.001,P<0.05),观察组患者治疗后TNF-α、IL-2水平低于对照组,IL-10水平高于对照组。见表4。
2.5 不良反应
治疗过程中,两组患者均无严重不良反应病例。其中对照组患者出现3例注射部位血管疼痛,皮疹1例;观察组患者出现2例注射部位血管疼痛,皮疹1例,胃肠道反应4例,症状均较轻,对症处理后均缓解,药物安全性良好。
注:1)与本组治疗前比较,P<0.05;2)两组患者治疗后比较,P<0.05
注:1)与本组治疗前比较,P<0.05;2)两组患者治疗后比较,P<0.05
3 讨论
DR是糖尿病的常见慢性并发症之一,长期存在的高血糖环境将导致视网膜微血管细胞发生通透性增加、硬度增加、过度增殖、血管闭塞、出血等一系列病理变化,最后致微血管细胞结构完全丧失,引起视力不同程度下降,甚至失明[4]。DR的Ⅰ~Ⅲ期为非增殖性病变,是疾病的早期阶段,其有效治疗能够延缓疾病进展至增殖期,意义重大[5]。严格控制血糖是延缓DR进展的基础治疗,但是目前早期DR无特效治疗手段,寻找有效的早期DR治疗方法仍然是临床上的一大挑战。
前列地尔注射液是一种新型载体制剂,将前列腺素E1(Prostaglandin,PGE1)包裹于脂微球中,利于脂微球特异性分布于体内组织的特点,将PGE1输送到病变部位,发挥抑制血小板聚集、抗炎、改善血管内皮功能等作用,从而减轻血管收缩痉挛、增加缺血区血液供应,能够一定程度改善早期DR的临床症状[6]。而且,该种剂型能够减少PGE1在肺内被灭活及对血管的刺激,作用时间长,不良反应少[7]。依帕司他是一种醛酶还原酶抑制剂,可以阻断多元醇代谢途径激活,而多元醇代谢途径是糖尿病并发症发生的普遍生化基础,因此该药物在早期DR治疗中具有充实的理论基础[8]。但是,目前关于依帕司他联合前列地尔注射液治疗早期DR的研究甚少。本研究中,常规治疗基础上,与单用前列地尔注射液组比较,联合依帕司他组患者早期DR的治疗总有效率明显提高,结果表明该联合方案可以通过不同作用机制发挥协同作用,有效改善患者眼底视网膜出血、渗出、血肿、微血管瘤、荧光造影渗漏点等病变,并扩张视网膜微血管,从而促进临床症状的改善。
研究显示[9],氧化应激是DR发生、发展的一个中心环节,视网膜组织中多不饱和酸含量极为丰富,氧摄取量高,葡萄糖氧化过程频繁,在氧化应激中极其容易受到损伤。因此,抗氧化应激治疗对DR治疗具有积极意义。目前,MDA、SOD、TAC是临床上常用的反映氧化应激的指标,其中MDA与机体脂质过氧化程度正相关,表明机体氧化应激水平高,而SOD、TAC是反应机体抗氧化能力的重要指标[10]。另外,研究表明[11],炎症反应与DR的发生、发展密切相关,多种炎症因子在DR中发挥重要作用,而减轻机体炎症反应是DR治疗的另一个重要方面。其中TNF-α、IL-2是重要的促炎因子,参与了阻塞毛细血管、损伤视网膜细胞、血管收缩以及微血栓形成等病理过程,在DR患者中其水平明显升高,加重病情,促进疾病进展[12]。而IL-10是一种抗炎因子,具有抑制T淋巴细胞活化增殖作用,抑制TNF-α等促炎因子合成分泌,对抗过度的炎症反应,而DR患者中IL-10水平明显降低[13]。本研究中,与单用前列地尔注射液组比较,联合依帕司他组患者治疗后氧化应激指标MDA水平降低,SOD、TAC水平升高,炎症因子TNF-α、IL-2水平降低,IL-10水平升高,组间比较差异有统计学意义,结果表明依帕司他在减轻氧化应激及炎症反应中具有更显著的优势,这可能是其提高早期DR临床疗效的重要作用机制。
综上所述,依帕司他联合前列地尔注射液是早期DR的有效治疗方案,能够明显提高临床疗效,减轻机体氧化应激和炎症反应,且不良反应轻微,临床上值得进一步研究。
摘要：目的 探讨依帕司他联合前列地尔注射液治疗早期糖尿病视网膜病变(DR)疗效及对血清氧化应激和炎症因子的影响。方法 收集80例符合纳入标准的早期DR患者作为研究对象。按照随机数字表法随机分为对照组(n=40,76眼)和观察组(n=40,74眼)。所有患者均给予常规治疗,在此基础上,对照组患者给予前列地尔注射液治疗,而观察组患者在对照组基础上联合给予依帕司他治疗。疗程结束后,比较对照组和观察组DR临床疗效、氧化应激指标、炎症因子水平。并于治疗期间观察患者不良反应发生情况。结果 疗效评价显示,观察组患者治疗总有效率明显高于对照组(95.0%vs 80.0%,P<0.05)。治疗后,与对照组比较,观察组患者氧化应激指标丙二醛(MDA)水平降低[(9.28±2.04)vs(12.17±2.13)nmol/ml],超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(TAC)水平升高[(93.18±10.02)vs(82.53±9.27)u/ml],[(20.52±3.84)vs(18.28±3.55)u/ml],炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素2(IL-2)水平降低[(11.51±2.12)vs(16.36±2.45)ng/L],[(70.48±12.14)vs(82.56±11.37)ng/L],白细胞介素10(IL-10)水平升高[(64.52±8.97)vs(57.38±8.47)pg/ml],组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗期间,两组患者均未出现严重不良反应。结论 依帕司他联合前列地尔注射液是早期DR的有效治疗方案,能够明显提高临床疗效,减轻机体氧化应激和炎症反应,且不良反应轻微,临床上值得进一步研究。