心血管应激（共6篇）
心血管应激 篇1
吸烟现已明确其是心血管疾病的独立危险因素之一。而血管老化既是一种血管的增龄变化, 也是一种疾病状态下的血管病理改变, 它的发生可以极大地促进动脉粥样硬化及相关疾病的发生和进展。目前, 无论是对吸烟危害的研究, 还是对血管老化机制的探讨, 氧化应激都是其中的重要研究方向。因此, 本文就从氧化应激的角度, 对吸烟与血管老化的内在联系及相互作用机制作一探讨。氧化应激通常是指生物体出现的持久异常氧化还原状态, 由于氧化能力的异常提高, 从而导致细胞成分的过氧化修饰[1]。自由基和其他活性物质的大量产生, 随之造成的细胞氧化还原平衡的紊乱, 就会严重干扰其稳态的维持, 促使病理改变的发生。
正常条件下, 人体具备对氧化应激的耐受性, 能够控制具有潜在损伤作用的氧化应激因子。最充分的支持证据就是[2], 人体中具有非常发达的内源性抗氧化防御系统, 它能够拮抗多种活性物质和促氧化剂的作用。比如, 对于超氧化物和过氧化氢这两种典型的氧化物, 人体就具有完整的防御性保护成分。但是, 对于某些活性物质如一氧化氮的代谢产物、过亚硝酸盐等, 人体的防御能力还不强。值得注意的是, 人体的这种耐受性和防御能力会受到诸多因素的影响, 比如吸烟就是重要的破坏因素之一。当这些破坏因素作用于人体时, 自由基或活性物质的产生、清除发生障碍, 氧化还原平衡会向氧化增强状态转变, 由此导致氧化应激的产生。
1 吸烟与氧化应激
研究发现[3], 吸烟除了人所共知的尼古丁的危害之外, 在吸烟的气相和焦油中还存在着大量对人体有害的自由基, 它们可以直接或间接地攻击细胞膜成分, 产生氧化应激反应, 并且导致各种疾病的发生。
首先, 吸烟的过程实际上是一个不完全燃烧的过程, 会产生蒸馏和一系列的氧化还原反应。在这一系列复杂的氧化还原过程中, 很容易发生电子在众多烟草燃烧产物之间的转换, 在焦油和气相中形成多种稳定的和不稳定的产物和自由基。通过电子自旋共振波谱分析发现[4], 焦油中主要包括有几种特别稳定的自由基, 它们主要是醌类自由基 (Q/QH) 、多环芳烃自由基、石墨碳和磷自由基。其中前两者所占的比重较大, 并且是两类可以直接导致氧化应激的重要物质。而产生于气相中的自由基, 则多是瞬时不稳定的自由基, 它们主要是烷氧基 (RO-) 和烷基 (R-) 自由基等, 同样具有促使氧化应激反应发生的能力。
其次, 吸烟所产生自由基的毒性, 以及导致氧化应激反应的方式有直接和间接两种。所谓直接毒性, 就是指吸烟过程中产生的某些自由基可以直接损伤细胞成分, 形成病理改变。所谓间接毒性, 就是指吸烟所产生的焦油相和气相物质可以引起多形核白细胞的聚集和活化, 产生和释放大量活性氧自由基, 从而导致氧化应激损伤。除了上述常见的自由基之外, 吸烟产生的气相物质还会引起细胞膜脂质的过氧化, 从而产生脂类自由基。随着吸烟时间的延长, 脂类自由基和脂质过氧化水平在不断地增加, 其所引起的细胞膜损伤也日益严重。更值得注意的是, 由自旋捕集剂 (PMN) 产生的活性氧自由基, 既可以单独引起细胞成分的损伤, 又可以与吸烟产生的自由基产生联合作用, 共同对细胞产生毒害作用。细胞膜研究还表明[5], 吸烟产生的自由基不仅可以使细胞膜的流动性发生改变, 而且还可以使膜蛋白及酶的构象发生变化, 由此必然影响细胞内外物质的交换, 造成细胞功能的障碍。
再次, 研究已经充分证明, 吸烟通过其产生的氧化应激反应, 能够导致诸多病理改变及相关疾病的产生和进展。比如, 吸烟产生的多种自由基可以联合作用, 通过引起血脂紊乱、血管内皮功能障碍等病理改变, 从而导致血管结构和功能的异常, 心血管事件的发生率也随之上升[6,7]。张晓胡等[8]研究发现, 吸烟通过其产生的氧化应激反应, 能够引起内皮素合成酶释放增多, 血管舒缩功能出现障碍, 以及血管平滑肌细胞增殖活跃等;同时, 低密度脂蛋白 (LDL) 的氧化易患性也增加, 氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL) 水平随之升高, 从而促进了动脉硬化的产生。更进一步的研究结果还有, Raij等[9]认为, 吸烟时所产生的氧自由基, 特别是超氧阴离子可以降低血管内皮释放NO的生物活性, 并且可以抑制内皮细胞合成及表达一氧化氮合酶 (eNOs) 的功能。Cavusoglu等[10]的一项研究提示吸烟促发的氧化应激反应可使血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1) 的血浆浓度急剧上升, 引起内皮炎症反应和内皮功能障碍, 从而加速动脉硬化, 引发冠心病。Winkelmann等[11]研究发现吸烟合并冠心病者, 体内负荷后胰岛素水平及代表氧化应激和内皮功能受损的生化标志物明显高于无吸烟的冠心病患者, 提示吸烟可导致氧化应激的发生、内皮功能的受损和胰岛素的抵抗, 从而增加冠心病的严重程度。
2 血管老化与氧化应激
血管是由内膜、中层和外膜所组成, 构成内膜和中层的主要细胞是血管内皮细胞 (EC) 和平滑肌细胞 (VSMC) , 它们是防御各种应激因子的第一道防线, 并在氧化应激的作用下产生适应性修饰。如果血管内皮细胞和平滑肌细胞因氧化应激发生损伤, 则不可避免地引起血管老化。
首先, 在血管老化的过程中, 其最明显的改变就是顺应性的减小和血管壁的增厚。这种改变不仅仅是出现在老年人群中, 在年轻人群的病变血管中也会出现类似的结构改变。老化血管为了适应血流产生的剪切力和伸展力, 往往需要从根本上改变血管的内皮层, 使其增厚, 以及使内膜细胞的外基质成分发生改变;同时, 血管平滑肌细胞也出现增殖, 并随之产生细胞间质以及细胞外基质蛋白合成的增多[12]。老化血管通常表现为胶原蛋白的成倍增加和弹性蛋白含量的基本不变, 由于弹性蛋白相对含量的降低, 血管于是出现硬化。
其次, 多种活性的自由基物质能够通过氧化应激作用促进血管老化的病理改变。在这些物质中, 活性氧 (ROS) 和活性氮 (RNS) 所产生的生化过程及其调节最具有代表性。ROS如过氧化物和H2O2能引起血管内膜和中层的增厚, 并使血管壁产生炎症反应, 因此被视为血管疾病的“危险因子”。并且ROS在生长因子介导的病理改变中也扮演着重要的信号分子的角色。最新研究发现[13], ROS能够通过NF-κB依赖性途径诱导血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达, 特别是其中VEGFR2的表达。生理情况下, VEGF有助于血管内皮的修复, 而在病理状态下, 由过量ROS产生的过量VEGF就促进了内膜的增厚, 导致了血管的老化。RNS对血管系统的作用具有双重效应, 一方面能够发挥自由基的氧化应激作用, 而另一方面, 还能够通过环磷鸟苷酸 (cGMP) 系统调节各种具有保护性和有益的生理活动。RNS对血管内皮细胞的损害作用与VEGF密切相关。VEGF由VSMC释放, 是EC的促有丝分裂因子。Van-der-Zee等[14]发现在内皮细胞中VEGF可促进NO的合成。然而, 研究发现通过RNS诱导的对核转录因子活化蛋白-1 (AP-1) 与DNA结合的抑制, 能够下调VEGF的表达和减少NO的合成, 从而使血管的修复增殖功能受到抑制, 舒缩功能也出现碍[15]。并且还发现在缺氧状态下, RNS所导致的VEGF基因表达的下调会更加严重, 由此形成了相关病理改变的恶性循环。同时, RNS还能够激活对氧化还原敏感的转录因子如NF-κB和AP-1, 从而上调几种主要的促炎症蛋白, 其中包括有白介素 (IL) -1、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子 (TNF-α) 等, 由此可导致血管炎症反应的产生和加剧, 进一步促进血管老化的发展。而RNS对血管的有益作用主要表现在, NO不仅具有抗动脉粥样硬化的特性, 还能够抑制血小板的聚集、VSMC和EC的增殖以及白细胞的黏附等[16]。
再次, 在氧化应激的作用下, 蛋白质和脂质会产生非酶修饰, 即糖基化过程, 经过复杂而不可逆的分子反应后就合成了糖基化终末产物 (AGEs) 。AGEs是异质性复合物, 积聚在EC内或血管壁上, 从而加速血管的老化[17]。具体的机制主要是, AGEs能够明显地加快EC氧化态的形成, 并且可以通过与特异性受体 (RAGE) 结合以发挥第二信使的功能。AGEs与RAGE的结合既可以促使EC和VSMC的异常增殖, 以及血管内膜和中层的增厚、硬化;还可以活化核转录因子NF-κB和诱导VCAM-1和单核细胞趋化因子-1 (MCP-1) 的表达[18], 从而增加血管的炎症反应。因此, 现在普遍认为AGE/RAGE的相互作用可能是氧化应激和血管老化进展中的潜在机制。
最后, 细胞内出现的氧化应激反应, 以及由此所产生的对于相关基因表达的选择性诱导, 是血管老化的主要分子机制之一。不同的自由基物质可以直接或间接的方式刺激或“致敏”血管细胞, 使其产生活性氧, 进而调控基因的表达。同时, 自由基的生化研究还揭示[19], 许多的自由基及其代谢产物能够经常性地行使细胞内信号转导调节子的作用, 这就为研究氧化应激导致血管老化的机制提供了新的路径。
3 小 结
吸烟能够产生大量的自由基物质, 从而促使人体发生氧化应激反应;而氧化应激又能够通过多条途径促使血管老化的发生和进展。由此, 在众多研究都关注于吸烟与动脉粥样硬化的今天, 通过氧化应激这座桥梁, 将吸烟导致血管老化的机制, 作进一步的澄清, 将有助于深化我们对于吸烟造成血管损害的认识。再考虑到血管老化与动脉粥样硬化之间的密切联系, 有理由相信, 以氧化应激为纽带的对于吸烟与血管老化的研究, 必将为吸烟与动脉粥样硬化的研究注入新的内容。目前十分清楚的是, 血管系统具有体内全部最利于促发氧化应激反应的成分和条件, 而吸烟可以大大地优化和重组这些成分和条件。吸烟所促发的氧化应激, 主要通过EC和VSMC的变性增殖、血管的增厚硬化以及促进血管炎症反应等途径促使了血管的老化。因此, 吸烟异化了氧化应激的发生, 而氧化应激又成为了血管老化的基础。
氧化应激在心血管疾病中的作用 篇2
1 氧化应激概述
氧化应激的标志物主要为氧自由基,其种类很多, 其中活性氧族(reactive oxygen species,ROS)与氧化应激密切相关。超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH)、过氧化氢(H2O2 ) 、一氧化氮(NO)等都属于ROS。生理情况下机体产生的氧自由基很少,对机体生理功能是有利的,而且体内存在抗自由基抗氧化两大防御系统:一类是酶性防御系统,包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等;另一类是非酶性防御系统,包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽(GSH)等。它们对清除氧自由基、保护细胞及机体正常生理功能起重要作用。在正常情况下,自由基的产生和清除存在着动态平衡。但在某些病理情况下,机体的氧自由基过量生成和(或)抗氧化防御系统受损,氧自由基产生和清除的动态平衡遭到破坏, 活性氧产生的速率大于被清除的速率时, 就会造成活性氧的蓄积, 导致氧化应激的出现[4]。从而直接引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶类变性、核酸DNA损伤等,最终导致细胞死亡、组织损伤、心血管疾病、肿瘤及神经元退变等多种疾病的发生。此外,大量研究已经证实,ROS还可以作为重要的细胞内信使,对钙离子信号传递、蛋白质磷酸化过程及转录因子等均有不同的作用,通过活化许多信号传导通路,间接导致组织损伤。
2 氧化应激与心血管疾病
2.1 氧化应激与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化(atherosclerosis ,AS) 是心血管疾病中严重威胁人类生命健康的疾病之一。其发病机制目前尚未完全阐明。大多数学者认同Ross[5]提出的损伤-炎症反应学说,即动脉粥样硬化的形成是各种损伤因子致动脉壁内皮功能障碍后产生的过度炎症性反应。近年许多的研究表明, 氧化应激在AS 发生发展中发挥重要作用[6,7]。氧化应激主要通过氧化作用、促进局部炎症反应、诱导血管基因的改变和参与影响信号转导途径等多方面参与动脉粥样硬化的发生发展过程[8]。
氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是致动脉粥样硬化的独立危险因素,它在AS中有着重要作用,其中能够损伤内皮细胞,导致内皮功能障碍;趋化单核细胞至内皮下间隙,促进平滑肌细胞增殖,参与泡沫细胞形成;诱导大量炎症因子的生成,加速动脉硬化进程。氧化应激过程中生成ROS过多导致更多的低密度脂蛋白(LDL)被氧化修饰成ox-LDL, 加速AS。有报道[9]氧化应激过程中产生大量自由基和过氧化氢除可直接损伤内皮细胞,导致其坏死或凋亡外,还能增加中性粒细胞及单核细胞对内皮细胞的黏附性及活性,增强血小板聚集的敏感性,引发或加重动脉粥样硬化。动物模型证实亦证明氧化应激参与了动脉粥样硬化过程。有研究发现[10]在给兔喂高胆固醇食物后,其血管细胞 NADPH氧化酶活性明显升高,同时主动脉内氧离子产生持续增加,给予SOD或丙丁酚抗氧化治疗可逆转上述变化。
近来研究发现氧化应激能够诱导血管相关基因的改变,促进炎症反应的存在。单核细胞黏附于血管内皮是动脉粥样硬化病变的启始事件,黏附分子在其中发挥关键作用。参与此过程的重要黏附分子有血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等,在氧化应激可以诱导多种血管基因表达的改变,包括VCAM-1基因,MCP-1基因等。不同氧化物前体可直接刺激血管内皮细胞或平滑肌细胞,上调致动脉粥样硬化基因的表达,促进单核细胞黏附及炎性分子释放,加重局部炎症反应。有实验研究表明[11] 过氧化氢可诱导内皮细胞间黏附子-1(ICAM-1)蛋白及 mRNA表达增加,而抗氧化剂对此有抑制作用。上述表明氧化应激是动脉粥样硬化的又一促进因素。
2.2 氧化应激与细胞凋亡及心力衰竭
心力衰竭(heart failure,HF) 是各种心脏疾病发展至终末期的表现,指由各种心脏疾病导致心功能不全的一种综合征,绝大多数情况下是指心肌收缩力下降使心排血量(CO)不能满足机体代谢需要,器官、组织灌流不足,同时出现体循环和(或) 肺循环淤血的表现。其发病机制十分复杂。目前研究发现神经体液机制、细胞因子、氧化应激和心肌细胞凋亡均参与心力衰竭过程,而上述各个因素之间又存在着相互联系。心力衰竭过程中交感神经系统被激活, 儿茶酚胺和炎症因子的过度释放,导致大量氧自由基在体内积聚,从而加速氧化应激。有报道[12] 氧自由基可通过损伤心肌细胞膜和改变离子通道造成心肌细胞损伤;可分解胶原蛋白,促进胶原合成,导致心肌纤维化,促进心室重构;还能够导致血管内皮功能障碍,使内皮细胞依赖的血管舒张作用减弱,血管阻力增加。此外,近年研究表明,氧化应激参与了心肌细胞的凋亡。细胞内产生的 ROS所引起的继发性氧化应激反应对心肌细胞凋亡的发生起着非常重要的作用[13] 。ROS可上调促凋亡基因bax的表达,破坏线粒体内膜电势,导致细胞发生不可逆的凋亡。
2.3 氧化应激与高血压
越来越多的研究表明氧化应激与高血压血管性疾病密切相关。Khullar等[14]报道在原发性高血压病人中血氧化应激标志物升高,内源性抗氧化物质明显低于血压正常者,并且与舒张压呈负相关。此外,有强有力的证据表明ROS 对高血压发生起重要作用。在高血压时,ROS产生过多,它可以作为信使参与信号转导通路,影响细胞功能,调节血管紧张度,参与血管重构。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是人体内在的氧化剂, 可促使氧化应激的发生,在高血压中发挥重要作用。Campese等[15]通过实验表明AngⅡ可诱导主动脉产生ROS ,导致内皮依赖性血管舒张功能减退。此外, 近年研究显示O2- 和 H2O2 都能抑制肌浆网 Ca2+三磷酸腺苷(ATP),促进细胞外Ca2+ 内流,使胞浆中Ca2+增加,从而调节血管收缩[16]。氧化应激在高血压发生发展的病理生理过程中有重要作用。
2.4 氧化应激与其他心血管疾病
氧化应激与心肌肥厚有密切关系,ROS介导的细胞信号传导,通过转录因子的激活,调控DNA的表达, 参与细胞生长控制。Nakagami等[17]用AngⅡ诱导新生鼠心肌细胞肥大,研究发现O2-可介导心肌细胞的肥厚反应。此外,氧化应激还与多种心律失常、心肌缺血等有关系,抗氧化应激可以减少这些疾病的发生。
心血管应激 篇3
关键词：糖尿病,微血管病变,血糖波动,氧化应激
近年来, 越来越多的研究证据表明, 2型糖尿病患者餐后高血糖是心血管并发症的危险因子, 氧化应激与炎症反应参与了糖尿病并发症形成的病理过程。而目前有关2型糖尿病患者餐后氧化应激状态及炎症反应水平的临床研究较少。本研究观察2型糖尿病患者餐后高血糖对氧化应激指标的影响, 分析血糖波动幅度、氧化应激水平与糖尿病微血管病变的相关性。
1 资料与方法
1.1 临床资料
106例2型糖尿病患者来自2010年11月—2011年3月山西医科大学第一医院内分泌科住院患者, 男59例, 女47例, 年龄41岁~73岁 (57岁±16岁) 。入选标准:符合1999年世界卫生组织 (WHO) 糖尿病诊断标准;年龄30岁~80岁;签署知情同意书。排除标准:1型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病;合并糖尿病急性病变者;有急性感染或炎症者;有严重器质性疾患者, 如心、肺、肝、肾、脑等疾病等;合并有肿瘤、自身免疫性疾病、血液系统疾病, 其他影响糖代谢的疾病患者;服用影响糖代谢的药物, 如糖皮质激素等;近1个月曾服用维生素E、维生素C等抗氧化应激药物的患者。
1.2 分组及诊断标准
根据是否合并微血管病变分为3组。DM组:无糖尿病微血管病变组;DA1组:合并单一糖尿病微血管病变组 (包括糖尿病肾病或糖尿病视网膜病变) ;DA2组:同时合并糖尿病肾病与糖尿病视网膜病变组。其中糖尿病肾病的诊断标准:按Mogensen分期将Ⅲ期及其以上的糖尿病肾脏病变定为糖尿病肾病, 即24h尿白蛋白≥30 mg/24h (或UAER>200μg/min) 为糖尿病肾病;排除其他肾脏疾病及可能引起尿白蛋白增加的原因。糖尿病视网膜病变:由眼科专科医师进行眼底镜检查, 并按1984年第一届全国眼底病学术会议提出的“糖尿病视网膜病变分期标准草案”进行诊断。
1.3 研究方法
收集入选研究对象的一般临床资料, 包括性别、年龄、现病史、既往史、服药史等, 测量身高、体重 (清晨空腹) 、腰围、血压, 计算体重指数 (BMI) 。
患者经知情同意后, 受试者均隔夜禁食10h~12h, 于清晨安静状态下留取空腹静脉血, 测定空腹血糖 (PBG) 、空腹胰岛素 (FINS) 、血脂、血常规、丙二醛 (MDA) 等, 空腹抽血后行口服葡萄糖耐量试验 (OGTT) , 于进食后1h、2h、3h分别测静脉血浆葡萄糖水平。另取餐后2h血标本, 检测MDA。所有受试者行尿常规、肾系列、24h尿蛋白定量检测, 并进行胸片、心电图、眼底等检查。
血清MDA水平测定:留取的血标本分离血清后于-20℃冰箱保存统一检测, 所需试剂为南京建成生物研究所提供的MDA测定试剂盒, 采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法测定, 操作过程严格按照试剂盒的说明进行。
相关指标的计算方法:餐后血糖波动幅度 (PPGE) =餐后血糖 (PBG) 峰值-空腹血糖;平均血糖 (MBG) 为OGTT实验4个点血糖值的平均值。
1.4 统计学处理
所有数据均采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料用均数±标准差表示, 计数资料采用卡方检验;两组比较采用两样本比较的t检验;多组均数比较采用方差分析;多变量分析采用多重线性回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组一般资料比较 (见表1)
3组在性别比、BMI、腰围、尿酸 (UA) 、舒张压 (DBP) 、总胆固醇 (TC) 、三酰甘油 (TG) 、低密度脂蛋白 (LDL) 方面差异无统计学意义 (P>0.05) ;在病程、年龄、糖化血红蛋白 (HbA1c) 、高密度脂蛋白 (HDL) 、收缩压 (SBP) , 组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 在后续比较中均作了校正。
2.2 3组血糖水平比较 (见表2)
DA1组、DA2组的OGTT试验后各点血糖值、餐后血糖波动幅度 (PPGE) 分别较DM组增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;DA2组较DA1组高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
与DM组比较, 1) P<0.05;与DA2组比较, 2) P<0.05
2.3 3组氧化应激指标比较 (见表3)
DA1组、DA2组的△MDA值、0h MDA及2h MDA水平分别较DM组增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;DA2组较DA1组高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.4 血糖波动与氧化应激的相关性 (见表4)
将△MDA作为应变量, PBG、2hPBG、PPGE、HbA1c等糖代谢指标作为自变量, 行多重线性回归分析。△MDA与2hPBG、PPGE呈正相关, △MDA与其余指标无明显相关性。
3 讨论
大型前瞻性研究UKPDS与DCCT显示糖尿病血管并发症的发生有赖于高血糖状态[1,2]。Brownlee等[3,4]提出了联系高血糖与糖尿病并发症的一种假说, 该假说指出高血糖诱导过量过氧化产物的产生导致了糖尿病及其血管并发症的发生。慢性高血糖可以表现为两种形式:持续性的高血糖、波动性高血糖[5,6]。HbA1c是表示慢性持续性高血糖的有效指标, 目前临床实践中将其作为血糖控制达标的指标之一。然而EDIC研究显示, 即使是HbA1c在同等水平, 以传统方法治疗的病例组较强化治疗组而言, 其发展为糖尿病肾病的风险更高[7]。因而有研究者指出, 血糖波动在糖尿病并发症的发生发展中有更重要的作用[8]。
本研究通过测定2型糖尿病患者OGTT (0h、1h、2h、3h) , 观察到2型糖尿病合并微血管病变者各点血糖值均高于无微血管病变者, 差异有统计学意义, 提示2型糖尿病合并微血管病变者餐后血糖波动大于无微血管病变者。
目前评估血糖波动的指标很多。近来应用动态血糖监测系统 (CGMS) [9,10]通过测定组织间液葡萄糖的浓度来换算血糖浓度, 能够准确记录24h血糖波动的情况, 连续72h的血糖监测可以获得平均血糖、平均血糖波动幅度 (MAGE) 、血糖等多项评价血糖波动性的指标。本研究中采用PPGE[11]评估患者血糖波动。PPGE可以描述餐后短时间内的血糖波动, 但由于血糖波动还包括低血糖及日间血糖波动等情况, 故要更全面地评估2型糖尿病患者血糖波动情况还需进一步研究。
人体内氧化应激损伤和抗氧化应激处在一种动态平衡之中。2型糖尿病患者存在二者之间的平衡失调[12,13]。氧化应激水平的增高与糖尿病及其病变的发生发展有关, 这可能与高糖状态下糖代谢、脂代谢紊乱导致自由基生成增加而清除自由基系统明显受损有关。机体在氧化应激状态下脂质发生过氧化产生MDA, MDA是测定脂质过氧化产物方便而敏感的指标。
本研究观察到合并糖尿病微血管病变者空腹及餐后2h血清MDA均较无微血管病变者高。提示2型糖尿病患者氧化应激水平增高加重微血管病变的发生发展。
已有大量研究表明血管内皮细胞功能失调与损伤是糖尿病血管病变的始动环节, 而目前血糖波动损伤血管内皮细胞的机制尚未阐明。Quagliaro等[14]研究发现恒定性与波动性高浓度葡萄糖均可通过依赖PKC活化的还原型辅酶I/Ⅱ[NAD (P) H]氧化酶刺激活性氧的过度生成导致细胞凋亡增加, 而波动性高糖更为明显, 从而支持波动性高糖参与了糖尿病血管损伤的形成。Piconi等[15]证明波动性高血糖是通过在线粒体转运链中的Ros产物来增加氧化应激和诱导血管内皮细胞凋亡的。目前关于血糖波动与氧化应激的临床研究报道较少。
心血管应激 篇4
关键词：中药配伍组分,糖尿病血管病变,氧化应激损伤,机理研究
糖尿病 ( diabetes mellitus, DM) 是一组由于胰岛素分泌缺陷和 ( 或) 胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病, 持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致心、脑等大血管及肾脏、视网膜、皮肤等微血管病变[1]。糖尿病血管病变 ( diabetic angiopathies, DA) 是临床常见的糖尿病并发症之一, 也是导致患者伤残、死亡的主要原因之一[2]。英国一项前瞻性糖尿病研究 ( UKPDS) 证实新诊断的2 型糖尿病患者在发病后的第9 年, 大血管与微血管并发症发生率分别为20% 和9% , 且大血管病变占所有死因的59%[3], 为患者的生命和生活质量带来极大危害。
DA的发病机制及其与糖尿病代谢紊乱之间的关系尚未完全明了, 目前的研究表明可能与遗传易感性、肥胖、高血糖诱导性损伤、晚期糖化终产物途径、氧化应激损伤、多元醇代谢旁路、脂代谢紊乱、内皮功能紊乱等多种因素有关[4]。本研究采用四氧嘧啶静脉推注配合腹主动脉内膜球囊损伤术诱导大兔的DA模型, 观测中药配伍组分 ( 40% 麦冬多糖、30% 黄连生物碱、30% 三七总皂苷) 对DA模型大兔高血糖诱导性损伤、晚期糖基化终末产物途径、氧化应激损伤的影响, 以探讨中药配伍组分治疗DA的作用机制。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 动物雄性纯种新西兰大白兔85 只, 体质量 ( 2. 5 ± 0. 3) kg, 由辽宁长生生物技术有限公司提供。实验动物许可证为辽宁省科学技术厅签发, 许可证号: SCXK ( 辽) 2010-0001, 购入后正常饲养7天, 饲料由辽宁长生生物技术有限公司提供。单笼喂养, 温度 ( 22 ± 2) ℃、湿度 ( 70 ± 5) % , 自由饮食, 实验前适应性喂养1 周。
1.1.2药物中药配伍组分 (40%麦冬多糖、30%黄连生物碱、30%三七总皂苷) , 麦冬多糖、黄连生物碱 (北京阜康仁生物制药科技有限公司) , 三七总皂苷 (北京同仁堂制药有限公司) ;辛伐他汀20 mg (杭州默沙东制药有限公司, 批号:140213) ;四氧嘧啶 (BDH Limited Poole England, 批号:5272460J) 。
1.1.3主要试剂生化指标试剂盒及一抗、二抗试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ;血糖检测使用三诺SXT-1快速血糖测试仪及快速血糖测试条。
1. 1. 4 主要仪器UV-1801 紫外/ 可见分光光度计 ( 北京北分瑞利分析仪器 ( 集团) 公司生产) ; 318C酶标仪 ( 上海三科仪器有限公司生产) 。
1. 2 模型制备及分组
雄性新西兰大白兔适应性喂养1 周后, 耳缘静脉抽血检测空腹血糖。随机取10 只作为空白对照组, 其余75 大兔耳缘静脉推注无菌生理盐水配制的5% 四氧嘧啶100 mg / ( kg·bw) , 死亡8 只; 72 小时后测空腹血糖 ( fasting blood glucose, FBG) 选取13. 5 mmol / L≤FBG≤23. 5 mmol / L大兔, 不符合上述血糖标准者7 只剔除。剩余60 只随机分为5 个实验组, 每组12 只, 分别为: ( 1) 中药组分高剂量组; ( 2) 中药组分中剂量组; ( 3) 中药组分低剂量组; ( 4) 辛伐他汀20 mg对照组; ( 5) 模型对照组。实验组开始喂含2% 胆固醇、0. 5% 胆酸和5% 猪油的高脂饲料30 g / ( kg·d) , 空白对照组喂食普通饲料30 g / ( kg·d) , 每只分4 餐喂养。实验组开始灌胃, 用药剂量参照《药理学实验教程》[5], 具体剂量为中药配伍组分高剂量组450 mg / ( kg·d) 、中剂量组150 mg / ( kg·d) 、低剂量组50 mg / ( kg·d) ; 对照组予辛伐他丁0. 8 mg/ ( kg·d) ; 空白对照组及模型对照组以10 m L/ ( kg·d) 生理盐水灌胃; 均为2 次/天。1 周后用实验各组在40 mg / ( kg ·bw) 戊巴比妥钠麻醉下用 ( 3. 5 ~ 4. 0) mm × ( 8 ~ 12) mm球囊导管行腹主动脉内膜球囊损伤术[6], 术后继续以上述饲料及药物喂养10 周。记录兔的活动状态、毛色、精神状态、饮食、二便情况。每2 周检测FBG一次, 每周称量体重并调整给药剂量。
1. 3 检测指标及方法
给药结束后, 在处死前空腹12 小时, 取耳静脉血, 并分离血清。实验结束时, 将各组兔子麻醉后处死, 由腹腔往上剪开至胸腔, 以胸腔撑开器撑开肋骨, 将兔心脏小心剪下, 放入预冷PBS中清洗干净后, 剪除心脏上残余之脂肪及血管, 以拭镜纸轻轻将水分吸干剪去左右心房及右心室, 留取左心室组织, 10% 组织匀浆后, 3000 rmp离心15 分钟, 取上清液, 检测相关指标。
1. 3. 1 糖基化终末产物相关指标检测给药前后的FBG、糖基化终末产物 ( advanced glycation end products, AGEs) 。
1. 3. 2氧化应激相关指标血浆一氧化氮 ( nitrogen oxide, NO) 、一氧化氮合酶 ( nitric oxide synthase, NOS) 、丙二醛 ( malondialdehyde, MAD) 、超氧化物歧化酶 ( superoxide dismutase, SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( glutathione peroxidase, GSH-Px) 。
1. 4 统计学处理
采用统计软件SPSS 17. 0 进行统计分析, 数据用均数 ± 标准差 (± s) 表示, 多组间比较应用单因素方差分析 ( one-way ANOVA) , 两组间比较采用LSD法, 以P < 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 中药配伍组分对血糖相关指标的影响
给药前, 中药配伍组分高、中、低剂量组及辛伐他汀组FBG与模型组比较, 没有明显统计学差异 ( P > 0. 05) , 表明给药前实验各组FBG在同一基线水平, 具有可比性; 而空白对照组的FBG与模型组比较, 差异有统计学意义 ( P < 0. 01) , 表明模型组FBG达到造模标准。连续给药10 周后, 中药配伍组分高、中、低剂量组对糖尿病大兔的FBG、AGEs均有降低作用, 显著低于模型组 ( P < 0. 05) ; 而辛伐他汀组与模型组比较, 差异无统计学意义 ( P > 0. 05) , 见表1。
注: 与模型对照组比较, aP < 0. 01, bP < 0. 05。
2. 2 中药配伍组分对氧化应激相关指标的影响
模型组SOD、GSH-Px均低于空白组, NO、NOS、MDA均高于空白组, 差异有统计学意义 ( P < 0.01) 。给药后, 中药配伍组分高、中剂量组及辛伐他汀组对糖尿病大兔的SOD、GSH-Px均有升高作用, 对NO、NOS、MDA有降低作用, 与模型组比较, 差异有统计学意义 ( P < 0. 01) ; 低剂量组对GSH-Px有升高作用, 对NOS有降低作用, 与模型组比较, 差异有统计学意义 ( P < 0. 05) , 见表2。
3 讨论
DA以高血糖的诱导性损伤为主要特征[7], 一旦高血糖达到临床诊断标准, 持续慢性的高血糖状态便加速了糖尿病微血管和大血管病变的发展恶化, 并可以通过激活多种途径发挥作用, 主要包括晚期糖化终产物途径[8]、氧化应激损伤[9]、多元醇通路等途径[10]。AGEs是由蛋白质、脂质和核酸在高血糖和 ( 或) 氧化应激的条件下, 通过Maillard反应生成的非酶糖基化的稳定复合物。AGEs一方面可以直接破坏细胞及基质间的连接和相互作用, 影响血管壁和基底膜的完整性, 影响器官组织的结构和功能; 另一方面AGEs与血管内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞、系膜细胞等细胞膜上的特异糖基化终产物受体 ( receptor for advanced glycation end products, RAGE ) 结合, RAGE作为一个信号转导受体, 激活丝裂原活化蛋白激酶 ( mitogen activated protein kinases, MAPK ) 及细胞核因子-κB ( nuclear factor kappa B, NF-κB ) 信号通路 ( 细胞增殖与炎症) 、Ras通路 ( 应激和细胞凋亡) 、Rac /Cdc42 通路 ( 细胞生长和运动) 以及Jak /Stat通路 ( 基因表达调控) , 促进细胞增殖, 增加血管通透性, 引起巨噬细胞迁移, 刺激内皮素的形成, 增加IV型胶原、蛋白聚糖及纤维的合成, 导致细胞外基质扩张、血管基底膜增厚、微血管通透性增加、甚至微血管闭塞等糖尿病微血管病变[11]。因此控制高血糖和减少AGEs、AGEs-RAGE的形成是改善DA病变的重要途径。
此外, AGEs形成过程中的分子重排、AGEsRAGE相互作用的过程也可通过多种机制使活性氧基团产生增多而参与氧化应激损伤[12]。2004 年在美国召开的糖尿病学会 ( American diabetes association, ADA) 年会中, Brownlee[13]提出了氧化应激是糖尿病并发症的统一机制学说, 其中SOD、GSH-Px、MDA、NO、NOS等在糖尿病血管并发症中起着重要的作用。SOD是广泛存在于生物体内的一类金属蛋白酶, 其活性可反映体内抗氧化能力, 根据其所含金属辅基不同可以分为三类, 其中Cu. Zn-SOD是活性氧清除过程中第一个发挥作用的抗氧化酶[14], 可以同GSH-Px及过氧化物酶一起彻底清除耗氧过程中产生的超氧自由基和H2O2等有害物质, 对抗和阻断自由基对细胞造成的损伤, 修复损伤的细胞。GSH是机体抗氧化应激损伤的重要组成部分, 主要通过GSH-Px及谷胱甘肽-S转移酶催化, 对各种电子化合物及过氧化物的解毒起到重要作用, 当细胞内GSH、GSH-Px总量下降, 线粒体摄取其含量减少时, 可加重氧化应激损伤[15]。MDA是膜脂质降解产生的代谢产物, 用来反映脂质过氧化的指标, 其含量的变化间接反映组织中氧自由基含量的变化[16]。NO是一个具有广泛生理活性的小分子, 可由一氧化氮合酶NOS催化L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应生成, NOS表达上调进而导致NO释放的增加是DA早期发病机制的主要因素之一[17]。
注: 与模型对照组比较, aP < 0. 01, bP < 0. 05
中医理论认为DA的发病是在先天禀赋不足、后天饮食不节、外感六淫, 内伤七情等多种因素参与下, 引发机体燥热内盛, 阴津耗伤, 血流滞涩, 黏滞不畅而成消渴病及其并发症, 其主要病机为阴虚燥热兼有血瘀。根据这一理论, 本研究依据DA中医学现代研究进展, 结合传统的药性药效理论, 以黄连生物碱、麦冬多糖、三七总皂苷组成中药配伍组分, 以滋阴清热、活血祛瘀, 与病机相吻合。黄连性苦、寒, 具有清热燥湿, 泻火解毒的功效, 黄连生物碱是黄连的主要成分, 可降低体内胰高血糖素水平, 促进胰岛B细胞再生与功能恢复, 抑制肝脏糖原异生及醛糖还原酶, 促进外周组织对葡萄糖的酵解, 增强胰岛素的敏感性, 从而发挥降糖机制[18], 此外还可以通过减少AGEs及AGEs-RAGE的形成, 降低MDA含量提高SOD活性, 抑制P38-MAPK通道等改善氧化应激损伤[19]。麦冬性微寒, 具有养阴生津, 润肺清心的功效; 其有效成分为麦冬多糖, 具有降低血糖、增强胰岛素的敏感性的作用, 其作用机制可能与其促进脂肪细胞高表达瘦素、脂联素因子及抑制肿瘤坏死因子-α、抵抗素等有关, 还可对损伤的胰岛B细胞有修复重用[20]; 且麦冬多糖还具有抗衰老、抗过敏、抗氧化应激、增强免疫力的作用, 可降低血清MDA含量、增加SOD活性, 有效改善氧化应激对于皮肤、血管、脏器等造成的损伤[21]。三七, 性温味甘、微苦, 有散瘀止血, 消肿定痛之功; 现代药理学研究表明, 三七的主要成分三七总皂苷能改善外周血T淋巴细胞亚群, 明显抑制NF-κB的活性, 阻止或下调病理因素刺激下内皮细胞ICAM-l、VCAM-l的激活和表达, 减少中性粒细胞与血管内皮细胞之间的黏附反应, 有效抑制NO、NOS、MDA, 增强SOD、GSH-Px, 具有改善微循环、保护组织抗氧化能力、影响自由基生成、抗炎症、抗凝、增强免疫力、延缓衰老等药理作用[22,23]。
心血管应激 篇5
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂:
SD大鼠由山西医科大学动物实验中心提供。吡格列酮 (沈阳施德) , GW9662 (sigma公司) , DMEM高糖型培养基 (Gibco) , 胎牛血清 (杭州四季青公司) , 特异性小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白 (武汉博士德) DAB显色试剂盒 (武汉博士德) , 钙离子定量检测试剂盒和碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒 (南京建成生物工程研究所) , TUNEL试剂盒 (罗氏公司) SP免疫组化试剂盒 (北京博奥森) , 余为市售分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 VSMCs培养及鉴定:
采用无菌方法取160 g左右Sprague-Dawley雄性大鼠胸主动脉中膜, 将中膜剪成约1 mm×1 mm大小, 贴培养皿底部, 放入含20%胎牛血清的DMEM培养基, 置于37℃、5%CO2的孵箱中培养, 用0.125%胰蛋白酶消化传代。实验选用第5~10代细胞。经SMα-actin免疫细胞化学染色确定为平滑肌细胞。
1.2.2 分组及处理:
取上述平滑肌细胞生长至融合状态后, 分别置于六孔板中进行试验。本实验分6组: (1) 空白对照组 (加入10%DMEM细胞培养液) ; (2) 钙化组 (加入钙化培养基, 钙化培养基是在常规培养基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸 (β-GP) 和10 mmol/L丙酮酸钠) ; (3) 钙化+PPAR-γ抑制剂 (加入钙化培养基、25 mmol/L GW9662) ; (4) 钙化+PIO (10、50、100μmol/L) 组 (加入钙化培养基中以及加入不同浓度 (10、50、100μmol/L吡格列酮) 。每组设3个复孔, 细胞每隔两天换液1次, 连续培养15 d[4]。
1.2.3 VSMCs钙化的染色鉴定:
取1.5 cm×0.5 cm的盖玻片数枚放入6孔板内, 以1.2×105接种密度进行细胞爬片。分别制作实验组和对照组的细胞爬片。取出盖玻片先用预冷4℃的PBS缓冲液洗涤2次, 浸入冰丙酮中固定20 min。 (1) 将细胞玻片放入1%茜素红S溶液内染色30 min, 用0.2%醋酸溶液快速冲洗l次, 滤纸吸干。系列酒精脱水, 二甲苯固定、封片。显微镜下钙盐沉积处被染为橘红色。 (2) Von Kossa染色:将细胞玻片放入5%硝酸银溶液避光孵育15 min, 紫外灯照射10 min, 洗涤后浸入1%硫代硫酸铵溶液1 min, 洗涤后碱性品红复染。显微镜下观察钙盐沉积处为黑色。
1.2.4 VSMCs的钙含量测定:
弃上层培养基, 用PBS缓冲液冲洗细胞2次, 加入适量0.6 N盐酸, 37℃去钙化作用24 h。采用钙离子定量检测试剂盒测定。剩余细胞用PBS洗3次, 加入0.05 mol/L Na OH/0.1%SDS细胞裂解液, 30 min后提取胞质蛋白, 用BCA法蛋白分析试剂盒测定总蛋白, 钙含量用蛋白含量标准化。
1.2.5 VSMCs的碱性磷酸酶活性测定:
弃上层培养基, 用PBS缓冲液冲洗细胞2次, 加入适量含1%Triton X-100的生理盐水, 置于4℃冰箱24 h。用超声波处理25 s后反复吹打, 使细胞充分破裂 (倒置显微镜下观察到细胞破碎、无完整的细胞结构) , 离心后取上清用碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒测定ALP活性。测量时提取胞质蛋白并测定总蛋白含量, 用其校正细胞层ALP活性。
1.2.6 流式细胞术检测VSMCs凋亡率:
各组细胞用0.25%胰酶 (无EDTA) 消化, 血清终止消化后转移至离心管, 1000 rpm离心10 min, 弃上清, 用PBS冲洗2~3次, 弃上清, 每管500μL buffer重悬, 分别加入Annexin V-FITC, PI染液各5μL, 避光反应15 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。
1.2.7 TUNEL法检测VSMCs凋亡率:
弃上层培养基, 收集细胞, 采用细胞凋亡原位检测试剂盒, 即TUNEL法进行检测, 之后用DAPI染液染色封片, 荧光倒置显微镜下观察。TUNEL阳性呈绿色荧光, DAPI呈蓝色荧光。每个细胞爬片观察4个独立视野, 计算每100个细胞的凋亡个数, 计算凋亡率。
1.2.8 RT-PCR测定GRP-78, caspase-12和PPAR-γm RNA的表达:
见表1。应用RNA提取试剂盒提取RNA, 并用微量分光光度计进行检测其吸光度在1.8~2.0, 其后取5μL RNA按照反转录试剂盒制备c DNA后, 进行PCR扩增。
1.3 统计学处理:
数据用 (±s) 表示, 采用SPSS 13.0统计软件进行处理, 组间比较采用单方差分析, 多重比较采用LSD法。
2 结果
2.1 血管平滑肌鉴定:
倒置显微镜下观察, 可见原代平滑肌细胞从组织块边缘游出 (图1A) 血管平滑肌细胞呈梭型, 逐渐呈现束状排列, 出现典型的“峰谷样”样生长。经特异性免疫组化SMα-actin染色, 可见胞质内SMα-actin表达丰富, 细丝状排列, 符合血管平滑肌细胞特征。
2.2 钙化的血管平滑肌细胞鉴定:
倒置显微镜下观察, 可见血管平滑肌细胞透明度下降, 表现为多层生长状态, 部分细胞脱死亡。空白对照组与单纯钙化组相比:茜素红S染色时, 钙化组 (A2) 与对照组 (A1) 比较可见橘红色区域, 散装分布, 证实有钙盐沉积;Von Kassa染色时, 钙化组 (B2) 与对照组 (B1) 比较可见黑色沉积区域, 证实有钙盐沉积。
图1原代培养大鼠VSMCs及鉴定 (×200) A, B为原代大鼠VSMCs, C为大鼠VSMCs SMα-actin免疫细胞化学染色
图2茜素红S染色细胞结节处可见橘红色沉积;Von Kossa染色细胞结节处可见黑色颗粒沉积
2.3 吡格列酮对VSMCs钙含量、碱性磷酸酶活性:
见表2。与对照组相比, 钙化组的钙含量、ALP活性含量均升高 (P<0.01) ;不同浓度吡格列酮组的钙含量、ALP活性与钙化组相比较均明显升高 (P<0.05) , 且呈剂量依赖。
注:a为P<0.01, 与空白对照组相比;b为P<0.05, 与钙化组相比
2.4吡咯咧酮对VSMCs凋亡的影响:
钙化组与对照组相比, 出现大量细胞凋亡, 差异显著 (P<0.01) ;不同浓度吡咯列酮处理后在流式图中B4区和B2区的细胞分布均明显增多, 即促进了细胞钙化造成的凋亡和坏死, 凋亡率均较钙化组明显减低 (P<0.05) , 且吡咯列酮的作用呈现剂量依赖关系 (表3和图3) 。
注:a为P<0.01, 与对照组比较;b为P<0.05, 与钙化组比较
2.5 TUNEL法检测各组VSMCs凋亡率:
倒置荧光显微镜下观察, 可见TUNEL阳性信号呈绿色荧光, 而所有细胞核经DAPI荧光染料复染后, 呈蓝色。与对照组相比, 钙化组和钙化+PIO处理组凋亡细胞增多, 差异显著 (P<0.01) ;PIO处理组与钙化组相比, 细胞凋亡率显著增高 (P<0.05) 。见图4。
注:倒置荧光显微镜下观察, 可见TUNEL阳性信号呈绿色荧光, 而所有细胞核经DAPI荧光染料复染后, 呈蓝色。柱状图中:1正常组;2钙化组;3钙化+10μmol/L PIO;4钙化+50μmol/L PIO;5钙化+100μmol/L PIO;6钙化+GW9662;a为P<0.05与正常对照组比较;b为P<0.05与钙化组比较。
2.6 GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA的表达:
与空白组比较, 钙化组和钙化组+PIO处理组, GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA表达增高, 差异显著 (P<0.01) ;与钙化组比较, 钙化+PIO处理组GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA表达显著增高 (P<0.05) , 且呈剂量依赖。见图5。
3 讨论
血管钙化与冠心病、心肌梗死、脑卒中等多种疾病相关, 是发生心、脑血管急症的重要危险因子。以往认为VC是钙盐在细胞内和细胞外基质的被动沉积, 近年来研究发现VC是一种与骨发育类似的主动的、可调控的生物学过程, 类似于骨和软骨形成过程中的骨化, 主要特征是血管细胞尤其是血管平滑肌细胞成骨样表型转换[5,6]。随血管平滑肌细胞组织钙化的进展, 原有的细胞功能发生改变, 具备了骨细胞的特征和功能, 呈现出骨细胞特异性蛋白及基因表达。
图5各组VSMCs m RNA表达的比较a为P<0.01, 与空白对照组相比;b为P<0.05, 与钙化组相比。
内质网应激是内质网内环境在外界环境影响下, 内质网折叠蛋白质发生未折叠或者异常蛋白蓄积, 导致“未折叠蛋白反应。”已有研究证实内质网应激参与细胞凋亡的过程, 通过上调GRP78来发挥作用[7], 同时GRP78被公认为内质网应激的标志。caspase-12的激活是促发内质网凋亡的重要途径。Proudfoot等[8]实验发现:人体VSMC在钙化发生前就出现细胞凋亡特征, 其培养l周后出现来源于VSMC凋亡小体的基质囊泡 (基质囊泡是正常软骨内骨钙化的生发中心) ;进而说明了凋亡小体的功能类似骨基质囊泡, 其能够蓄积钙, 促进VSMC骨相分化。
吡格列酮作为PPAR-γ激活剂已广泛应用于临床糖尿病的治疗, 除此之外, 有报道称该类药物可减轻动脉粥样硬化和促进血管平滑肌细胞凋亡的作用, 其机制可能是通过快速激活TGFβ1, 进而引起细胞凋亡[9]。研究发现, PPAR-γ激活时, 凋亡相关基因p53和bal-2出现异常表达, 促进平滑肌细胞凋亡[10]。但吡咯咧酮是否通过激活PPAR-γ, 进而影响血管平滑肌细胞凋亡, 促进血管平滑肌细胞钙化鲜有报道。因此, 本实验采用体外BGP诱导血管平滑肌细胞钙化, 观察比格咧酮对血管平滑肌细胞钙化的影响及机制。结果发现离体的血管平滑肌细胞可以形成明显的矿化结节, 钙含量及ALP活性较对照组明显增加, 标志着局部细胞已发生成骨细胞样化。血管平滑肌细胞钙化后, 凋亡率明显增加, 内质网应激指标GRP78及caspase-12m RNA水平明显增加;同时比格咧酮处理后, 上述改变加重。结果证实比格咧酮可以促进PPAR-γ的表达, 促进血管平滑肌细胞钙化, 促使血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转化, 其机制可能是作用于内质网, 通过上调GRP78及caspase-12, 促使内质网应激状态加重, 引起过度内质网应激, 加重细胞钙化。但抑制PPAR-γ活性作为很有前途的抗血管钙化手段, 还需对其在VC中的作用做进一步研究。
摘要：目的 探讨吡咯列酮通过内质网应激致凋亡途径对大鼠血管平滑肌细胞钙化影响。方法 利用β-甘油磷酸钠联合丙酮酸钠制备钙化血管平滑肌细胞模型, 予不同浓度 (10、50、100μmol/L) 吡咯咧酮干预。用Von Kossa染色及茜素红S染色观察细胞钙化程度, 用甲基百里香酚蓝法测定各组细胞中钙含量, 磷酸苯二钠法测定细胞中碱性磷酸酶 (ALP) 活性。采用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡率, 实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞PPAR-γ、GRP78和caspased-12表达。观察吡咯列酮通过内质网应激致凋亡对大鼠血管平滑肌细胞钙化影响及其可能的分子机制。结果 钙化血管平滑肌细胞其钙含量、ALP活性较普通细胞增多 (P<0.01) , 而吡格列酮呈剂量依赖性地促进钙化大鼠血管平滑肌细胞的钙含量、ALP活性, 以及PPAR-γ、GRP78、caspase-12m RNA表达 (P<0.05) 。结论 吡咯列酮通过内质网应激致凋亡途径作用可促进β-磷酸甘油诱导的血管平滑肌细胞钙化, 其作用可能与PPAR-γ及GRP78、caspase-12表达上调有关。
关键词：血管钙化,内质网应激,血管平滑肌细胞,吡咯列酮
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心血管应激 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2012 年6 月-2014 年6 月在该校附院接受住院治疗的老年糖尿病肾病患者99 例作为观察组对象。根据2010 年中华医学会制定的糖尿病肾病分期标准分为早期糖尿病肾病组、中晚期糖尿病肾病组。早期糖尿病肾病组患者51 例。其中,男性28例,女性23 例;年龄60~71 岁,平均(63.14±5.27)岁;糖尿病病程4~11 年,平均(7.69±2.21)年。中晚期糖尿病肾病组患者48 例。其中,男性26 例,女性22 例;年龄61~76 岁,平均(65.71±8.66)岁;糖尿病病程7~17 年,平均(11.35±3.27)年。另取同期在本院进行健康体检且不伴有糖尿病肾病的老年人50 例作为对照组。其中,男性26 例,女性24 例;年龄61~78 岁,平均(69.37±7.88)岁。
1.2 观察指标
1.2.1 氧化应激水平各组患者均抽取外周静脉血,采用羟胺法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA),酶联免疫吸附法测定晚期蛋白氧化产物(advanced oxidation protein products,AOPP)水平。
1.2.2 血管新生指标各组患者均抽取外周静脉血,测定血清血管内皮生长因子(vascular endothe-lial growth factor,VEGF)、色素上皮衍生因子(pig-ment epithelium-derived factor,PEDF)、 内皮抑素(endostatin,ES)。
1.2.3 T细胞含量各组患者均抽取外周静脉血,测定T细胞亚群含量,包括CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0 软件对数据进行统计学分析,三组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD法,P <0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 氧化应激水平
方差分析显示三组之间有差异,且经LSD两两比较显示,早期DN组、中晚期DN组患者血清SOD、MDA及AOPP水平高于正常对照组,且中晚期DN组患者血清SOD、MDA及AOPP水平高于早期DN组(P <0.05),具体见表1。
2.2 血管新生指标
方差分析显示三组之间有差异,且经LSD两两比较显示,早期DN组、中晚期DN组患者血清VEGF、PEDF及ES水平高于正常对照组,且中晚期DN组患者血清VEGF、PEDF及ES水平高于早期DN组(P <0.05),具体见表2。
2.3 T细胞含量
方差分析显示三组之间CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平有差异,且经LSD两两比较显示,早期DN组、中晚期DN组患者血清CD4+及CD4+/CD8+水平高于正常对照组,CD8+水平低于正常对照组(P <0.05),早期DN组与中晚期DN组间差异不明显,具体见表3。
3 讨论
较多研究显示氧化应激在DN发生发展过程中扮演了重要角色,随着DN病情加重机体抗活性氧能力逐步下降。超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内氧自由基的天然清除剂,属于金属蛋白酶,可以清除自由基O2,可以反映体内氧化应激状态[3]。丙二醛(MDA)是膜脂质过氧化最重要的产物之一,其产生可以加剧膜的损伤,可以与含游离氨基酸的蛋白质发生交联,增加血管基膜厚度。晚期蛋白氧化产物(AOPP)是反映蛋白氧化程度的敏感指标,其作为没有氧化的物质是链式反应的终末产物[4]。上述研究比较各组间血清氧化应激指标水平,结果显示:早期DN组、中晚期DN组患者血清SOD、MDA及AOPP水平高于正常对照组,且中晚期DN组患者血清SOD、MDA及AOPP水平高于早期DN组(P <0.05),提示抗氧化应激降低是DN病情加重的重要因素之一[5,6]。
在DN中异常新生血管表达增加,此类新生血管在结构上是不成熟的,可以导致血管通透性增加、血浆蛋白外渗、肾小囊玻璃滴状病变、小动脉透明样变等DN的典型病理改变[7]。血管内皮生长因子(VEGF) 为特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子,可以促进内皮细胞分裂增殖、迁移,对于促进血管新生及增强血管通透性具有积极作用。生理状态下VEGF在肾脏足细胞上表达,在伴发糖尿病时糖基化终末产物、各种细胞因子增多,加上肾小球高压等因素,均导致肾脏VEGF表达上调[8,9]。内皮抑素(ES)是一种抑制血管再生的蛋白质,是目前已知最有效的血管新生抑制因子之一,可以有效抑制VEGF等促血管生长因子诱导的内皮细胞增殖迁移,与VEGF一起参与调控血管新生过程。色素上皮衍生因子(PEDF)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族,其与受体结合后可以激活下游信号传导,发挥营养保护神经,组织血管新生、抗炎症等作用,是目前最高效的内源性血管生成抑制因子[10,11]。上述研究比较了各组患者的血清血管新生指标水平,结果显示早期DN组、中晚期DN组患者血清VEGF、PEDF、ES水平高于正常对照组,中晚期DN组患者血清VEGF、PEDF、ES水平高于早期DN组(P <0.05),提示在DN患者体内VEGF病理性增多的同时,机体为了达到新的平衡,反馈性促进PEDF及ES等血管抑制性因子的表达[12]。
近年来越来越多的研究证实DN患者存在明显的细胞免疫及体液免疫异常,故免疫因素可能是DN发生的一个重要因素。机体免疫系统激活产生的炎症因子可导致血管内皮损伤进而促进血管并发症的发生。上述研究比较各组患者的T细胞含量,结果显示:早期DN组、中晚期DN组患者血清CD4+、CD4+/CD8+水平高于正常对照组,CD8+水平低于正常对照组(P <0.05),早期DN组与中晚期DN组间差异不明显,提示DN患者存在明显的细胞免疫功能异常,且随着病情加重免疫功能紊乱加剧[13]。