黄嘌呤氧化酶（共3篇）
黄嘌呤氧化酶 篇1
痛风是体内嘌呤长期代谢障碍,血尿酸升高引致组织损伤的一种疾病,属中医痹症范畴,表现为高尿酸血症,痛风性关节炎反复发作,关节畸形等,发作时严重影响人们的生活与工作,且不易根治。秋水仙碱及别嘌呤醇对治疗痛风虽然疗效显著,但副作用大。泽泻(Alisma orientale (Sam.) Juzep)、白芷(Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm)Benth.et Hook.f.)和青风藤(Sinomenium acutum (Thunb.)Rehd. et Wils)均为常用中药,近年来,很多医生将上述三种中药用于痛风的治疗[1,2,3,4,5,6,7]。泽泻属泽泻科植物Alisma orientalis (Sam.) Juzep,一般取其干燥块茎,具有利水消肿、渗湿、泄热的功效,主治水肿、小便不利、泄泻等症。泽泻的化学成分主要含泽泻萜醇A、B、C,挥发油,生物碱、天门冬素、树脂等。现代药理研究发现泽泻有利尿、降压、降血糖作用,还兼有抗脂肪肝及抑菌作用。白芷属伞形科植物Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahuriea (Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana (Boiss.)Shan et Yuan的干燥根,主要中医功效为解表散寒、祛风止痛、通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓,用于风寒感冒、头痛、牙痛、痹痛等多种疼痛症。白芷的化学成分主要是挥发油,并含欧前胡素、白当归素等多种香豆素类化合物等。药理作用有兴奋中枢神经、抑菌、解热、抗炎、镇痛、解痉、抗癌等作用。青风藤为防己科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.及毛青藤S.acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd. et Wils.的干燥根茎,有袪风湿、通经络、利小便之功效,可用于风湿痹证、水肿、脚气等疾病的治疗。化学成分含青风藤碱、青藤碱、尖防己碱等多种生物碱及豆甾醇,β-谷甾醇等。药理作用有抗炎、镇痛、镇静、镇咳、抑制免疫、抗心肌缺血、抗心律失常及降血压等[8]。以上三种药均有镇痛、祛湿作用,常用于风湿痹痛的治疗。本实验通过三种中药提取物对黄嘌呤氧化酶的作用,初步探讨其治疗痛风的部分作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器与试剂
① 材料:
泽泻,白芷,青风藤均购自宝鸡市中医医院,并经陕西中医学院胡本祥教授鉴定。
② 仪器:
Power Wave XS2连续波长酶标仪(美国Bio Tek公司);R-1002旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司);Advantage A10超纯水器(美国Merck Millipore公司);KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
③ 试剂:
黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶,美国Sigma公司;无水乙醇、95%乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、二甲基亚砜均为市售分析纯;超纯水自制。
1.2 方法
1.2.1 中药成分的提取
分别准确称取粉碎后的中药材30 g,加入提取溶剂(水、60%乙醇和95%乙醇)各300 mL,浸泡12 h,超声提取条件设为60℃,时间30 min,将上清液滤出,滤渣如前法再次提取2次,合并滤液,静置2 h、4 000 r5min-1离心,取上清液,用旋转蒸发仪蒸发至膏状,置于烘箱内70℃烘干,研粉备用。配制中药提取物溶液时,精确称取提取物粉末,水提物及60%醇提物均以水为溶剂,95%醇提物先以少量二甲基亚砜溶解后再用水加至刻度以配成所需的不同浓度溶液。
1.2.2 中药提取物对黄嘌呤氧化酶活性的影响
按如下顺序分别将溶液加入96孔板中:0.2 mol5L-1的pH 7.5磷酸盐缓冲液100 μL,中药提取物溶液50 μL(泽泻提取物浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg5mL-1,白芷和青风藤提取物浓度分别为0.25、0.5、0.75、1、1.25和1.5 mg5mL-1),1.5 mmol5L-1黄嘌呤溶液150 μL,0.05 IU5mL-1黄嘌呤氧化酶50 μL。震荡1 min,于37℃条件下反应10 min,用酶标仪测定290 nm处的吸光度值,每个样品均作3次重复,取均值。同时测相应浓度各提取物自身的吸光度以扣除干扰,并测无提取物时酶与底物反应的吸光度以作对照。按照公式(1)计算抑制率。
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式中:A1为反应体系中加入提取物后的吸光度值,A2为提取物溶液的吸光度值,A0为体系中未加提取物的吸光度值。
1.2.3 提取物对黄嘌呤氧化酶抑制类型的判断
分别吸取不同浓度的中药提取物,再加入不同浓度的底物黄嘌呤(浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mmol5L-1),测定反应速度,通过Lineweave-Burk作图法判断提取物的抑制类型。
2 结果与分析
2.1 中药提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用
由图1可知,在浓度0.5 mg5mL-1至3 mg5mL-1范围内,泽泻60%乙醇提取物和95%乙醇提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用较强,当浓度为0.5 mg5mL-1时,60%醇提物抑制率为64.8%,当浓度为3 mg5mL-1时为86%,变化幅度较小。95%醇提物在浓度0.5 mg5mL-1时,抑制率为57.7%,浓度为3 mg5mL-1时,抑制率为77.4%,抑制率随浓度的增大而增强。而泽泻水提取物的抑制率较低,且与浓度无相关关系。
由图2可知,白芷水提取物和青风藤乙醇提取物在0.25 mg5mL-1至1.5 mg5mL-1浓度范围内对XOD具有较强的抑制作用。在此浓度范围,白芷水提取物的最小抑制率为63.2%,最大抑制率为72.7%,抑制率随浓度的增大而增强;青风藤95%乙醇提取物抑制率变化幅度较小,与浓度的递增无明显相关关系,抑制率最小为64.5%,最大为71.2%。青风藤60%乙醇提取物对XOD的抑制率与浓度也无明显的相关关系,抑制率最小为55.1%,最大为67.1%。青风藤的两种醇提物在浓度为0.5 mg5mL-1至1.25 mg5mL-1时,抑制率非常接近,推断发挥作用的可能是在此两种浓度的乙醇中溶解度相当的某种物质。实验中发现白芷的60%和95%乙醇提取物对XOD具有很弱的抑制作用,抑制率最高为31%。而青风藤水提取物无明显的抑制作用。
2.2 提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用机制的判断
由图3、图4得知,用不同浓度的泽泻95%乙醇提取物和60%乙醇提取物,在改变底物(黄嘌呤)时测得的酶促反应速度所得到的双倒数曲线,各曲线的交汇点均未在横坐标及纵坐标轴上,最大反应速度Vmax和Km值均随提取物浓度的改变而变化,
说明这两种醇提物对XOD的抑制作用既不是竞争性也不是非竞争性,可能两种抑制机制均存在。
由图5得知,白芷水提取物对在不同浓度时,经改变底物浓度,测得的反应速度所得到的双倒数曲线,各线也未交汇于坐标轴上,由此判断白芷水提物对XOD的抑制作用可能是混合性的。
3 讨论
高血尿酸和痛风是嘌呤代谢紊乱所致,嘌呤在代谢过程中生成黄嘌呤和次黄嘌呤,二者在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化生成终产物尿酸,随尿排出。因尿酸溶解度较小,若体内尿酸过高时便可析出结晶而可形成尿路结石或痛风。实验中发现,泽泻和青风藤的两种浓度的乙醇提取物对XOD均具有较强的抑制作用,抑制率最高可达到86%,而此两种药的水提取物抑制率均较低。古人在治疗痹痛的有些方剂中需要加入酒而煎药,目的在于行气血,通经络,助行药势,宣痹通阳。此外酒还是一种很好的溶媒,加酒同煎,方剂中的有效成分能够最大限度的溶出,增强物药的通经活络作用[9]。如《校注妇人良方》中仙方活命饮 “用酒一大碗,煎五七沸服。”借其通瘀而行周身,助药力直达病所。《伤寒论》中当归四逆加吴茱萸生姜汤“以水六升,清酒六升和,煮取五升,去渣,温分五服。”以温经散寒,养血通脉。本实验泽泻和青风藤项即印证了古人在有些药剂中加酒的做法。白芷的水提取物对XOD的抑制率较高而其乙醇提取物抑制率较低。通过各种浓度提取物对改变底物浓度后而得的双倒数曲线判断,泽泻的60%和95%乙醇提取物及白芷水提物对XOD的抑制均为混合性的。至于发挥作用的具体成分有待于进一步研究。本文实验结果为泽泻、白芷及青风藤对痛风及高尿酸血症的治疗提供了实验依据。
参考文献
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[5]关玉波,赵树森,刘振华.痛风定加中药外敷治疗痛风性关节炎的临床观察[J].中医药学报,2002,30(1):14.
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[7]孟德儒.青风忍冬丸治疗痛风性关节炎66例临床观察[J].河北中医,2011,33(4):514-515.
[8]高学敏主编.中药学[M].北京:中国中医药出版社,2008:63,209,248.
[9]邓中甲主编.方剂学[M].北京:中国中医药出版社,2004:105.
黄嘌呤氧化酶 篇2
1 实验部分
1.1 试剂
黄嘌呤氧化酶和槲皮素购于Sigma公司, 缓冲溶液采用磷酸缓冲溶液 (PBS, pH 7.4) , 水为二次蒸馏水, 其余试剂为分析纯。
1.2 仪器与方法
UV-7504 PC (756MC) 紫外可见分光光度计 (上海) ;PHS-3C型pH计 (上海) 。
2 结果与讨论
2.1 槲皮素与黄嘌呤氧化酶相互作用的紫外光谱性质
由图1可见, 黄嘌呤氧化酶的吸收峰在270nm处;槲皮素的紫外光谱主要有两个吸收带, Ⅱ带在265nm的吸收峰在258nm处存在肩峰, Ⅰ带在376nm处有最大吸收。当槲皮素与黄嘌呤氧化酶溶液混合后, 两处吸收峰发生了转移。
(a) 25UL-1槲皮素和5×10-5mol/L黄嘌呤氧化酶混合溶液, (b) 5×10-5mol/L槲皮素溶液, (c) 25 UL-1酶单体[3]
265nm处吸收峰移至270nm, 红移了5nm。而376nm处吸收峰蓝移至374nm, 移动了2nm。Ⅰ带吸光度下降, Ⅱ带的双峰在混合后变化成单一的吸收峰。说明槲皮素对黄嘌呤氧化酶具有抑制作用。
2.2 槲皮素与黄嘌呤氧化酶孵育时间对紫外光谱的影响
图2显示了槲皮素与黄嘌呤氧化酶作用时间对紫外光谱吸收峰的影响, 随着孵育时间的增加Ⅰ带和Ⅱ带吸光度都在下降, 且具有线性关系, 其线性回归方程为:A=10.656+0.190t (min) , 相关系数为: (r) =0.9951;A=44.974-0.264t (min) , 相关系数为: (r) =-0.9874。说明槲皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制具有时间依赖性。
孵育时间: (a) 3min; (b) 45min; (c) 80min; (d) 120min, 槲皮素浓度2.5×10-5mol/L, 黄嘌呤氧化酶浓度25UL-1
3 结论
槲皮素对黄嘌呤氧化酶活性有抑制性, 并且随着槲皮素与黄嘌呤氧化酶作用时间的增加抑制作用增加。
参考文献
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[2]姚新生.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社, 1999, 191
黄嘌呤氧化酶 篇3
1氧化应激的损伤作用
ROS对心血管系统的病理作用源于其对血管细胞功能的影响,及其可消除某些血管保护性成分。 内皮释放的舒张因子(EDRF)和超氧阴离子(O2-·)之间的相互作用发生非常迅速,这使得一氧化氮(NO)没有机会发挥生物作用。 目前认为这种相互作用是内皮功能异常的最常见机制,该机制使血管内皮细胞不能为血管壁提供血管保护性因子[2,3]。 ROS对血管平滑肌细胞和纤维母细胞的直接作用在心血管疾病的早期阶段也发挥重要作用。 一些ROS对血管可发挥直接调节作用,另一些ROS通过对蛋白、脂质和DNA的毒性氧化而发挥调节作用。 过量产生的ROS导致血管再生和细胞增殖,同时激活大量的前炎症基因[4]。 此外,ROS也在关键的信号通路中发挥作用。 在生理浓度时ROS激活受体酪氨酸激酶和转录因子诱导抗氧化基因的表达,伴随着其他氧化还原敏感性转录因子的活化,影响细胞和组织的功能[5]。
2抗氧化维生素缺乏临床有效性
离体和动物研究均证明维生素E、维生素C和维生素A具有抗氧化活性[6,7],同时考虑到ROS在心血管系统疾病中的作用。 因此,引入抗氧化维生素用于血管药理学研究是合理的。 然而,随机临床研究所得数据却具有争议性。 糖尿病、高胆脂醇血症、高同型半胱氨酸血症患者和吸烟者给予抗氧化剂可以改善血流介导的舒张(FMD)和血管内皮功能异常[8]。 但是,进一步研究显示单一消除ROS不能有效地阻止心血管疾病的病理过程[9]。 多中心临床研究没有证实维生素E在动脉粥样硬化病理过程或主要心血管事件中的保护作用。 事实上,Meta分析揭示给予维生素E的剂量超过400 IU/d可能增加心血管疾病患者的死亡风险[10]。
抗氧化剂清除ROS缺乏临床有效性的可能原因。 抗氧化剂可消除部分ROS,但不能消除过量产生的ROS,因此整个病理过程依然可以继续。此外,抗氧化剂,包括维生素,与O2-·之间的相互作用比NO慢一百万倍。 结果,超氧自由基与NO的相互作用是一个热力学的过程,导致了NO生物活性的丧失。 也有研究显示维生素不能充分渗入血管壁,因此它们可能在血浆中达到治疗水平,但在组织中不能达到治疗水平。最后,维生素E和O2-·相互作用可以形成自由基。 这种自由基分子在给予维生素C或辅酶Q的情况下可转变为维生素E。 然而,研究证实联合使用维生素E和C不能增强临床有效性。
由于临床研究没有证实抗氧化维生素治疗心血管疾病的有效性,这使人们意识到现有关于氧化应激的理解可能并不完全正确。 然而,在考虑治疗心血管疾病时依然不能忽视它们[11]。
3氧化应激发生的复杂分子机制——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的中心作用
ROS主要来源于氧化还原酶 ,如NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 氧化酶 、 黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶和环氧合酶。 同时,应该注意到这些来源(酶)之间的相互影响。 目前认为NADPH氧化酶和黄素氧化酶将O2转化为O2-·是这些事件的中心环节。 产生ROS的氧化酶可以被其他来源的ROS修饰。 一些氧化酶结构的变化导致NADPH氧化酶产生过量的ROS,而过量的ROS导致它们功能的异常,并进一步促进ROS的生成, 形成氧化应激的恶性循环 (图1)。 例如 ,巯基可逆的氧化随后发生不可逆的蛋白水解修饰,转换黄嘌呤脱氢酶(参与嘌呤代谢)转变为产生ROS的黄嘌呤氧化酶。 这种转变导致了分子量明显的变化 (图1)。 这种现象在许多血管疾病状态、糖尿病、动脉粥样硬化中被发现[3,12]。
许多因子如血管紧张素Ⅱ、内皮素、氧化 LDL(Ox-LDL)、生长因子、 细胞因子、趋化因子和血流紊乱可以增加 NADPH 氧化酶活性,导致超。 O-2·含量的增加导致血管壁的变化和内皮功能异常的。 ROS 的产生也依赖其他细胞氧化酶如黄嘌呤氧化酶或 e NOS[5]
ROS具有平行双向活性 ,Nox蛋白可以发挥保护和损伤作用。 ROS是调节血管张力、基因表达、增殖、 迁移和分化的重要信号分子。 另一个方面,心血管危险因素和血管疾病促进ROS的产生而加快动脉粥样硬化、血管功能异常、高血压、血管肥大和血栓的病理过程。 因此,有效地抑制NADPH氧化酶对于理解其结构、活性和功能非常重要[13]。
4NADPH氧化酶结构和激活
NADPH氧化酶家族包括多个同源物, 它们的表达、结构和功能各异。 简要来说,这些同源物包括Nox1、 Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1和Duox2。 Nox亚型包含一个FAD和NADPH结合位点, 两个血红素分子和6个跨膜结构域。 Duox亚型也包含同样的结构域; 然而, 有一个7次跨膜的结构域并具有过氧化物酶同源性[14]。
NADPH氧化酶在不同的血管细胞中的表达各异。 Nox1和Nox5分别主要表达于血管平滑肌细胞和内皮细胞[15]。 Nox2在内皮细胞、外膜纤维细胞和血管平滑肌细胞中被发现。 而上述所有细胞中均有Nox4的表达。 重要的是在特定情况下,不同的类型细胞中一种以上的Nox亚型被激活, 而促进氧化应激的发生, 并且在一些情况下不同的Nox亚基可能相互作用。 Nox3主要表达于内耳,包括螺旋神经节、耳庭和耳蜗上皮细胞。 Duox1和Duox2表达水平很高,特别是在甲状腺,参与了甲状腺激素的氧化[14]。 同系物分布部位的不同可能与它们在健康和疾病中发挥的作用不同相关。血管NADPH氧化酶,特别是Nox1、Nox2和Nox5, 通过单一电子转移产生ROS而主要产生O2-·。 Nox4是一个例外,因为它的E环有一个特殊的改变,可以产生过氧化氢H2O2, 尽管Nox4的生物学特征依然有争议。 H2O2是一个重要的血管扩张剂,它可以产生内皮依赖性舒张反应, 并可降低小鼠的血压。 H2O2可增加内皮细胞NOS的表达和活性,并可直接氧化蛋白激酶Giα 亚基,产生血管舒张作用[15]。 此外,目前认为Nox不同亚型在动脉粥样硬化的发展过程中表达的部位不同。 Nox4可以增加动脉粥样硬化斑块的稳定性, 在斑块发展的早期阶段Nox2似乎对动脉粥样硬化的进展起关键作用, 而Nox5也可表达于人类动脉粥样硬化斑块不稳定的位置[16]。
5NADPH氧化酶信号通路和调节的复杂性
NADPH氧化酶的活性可被因子 、 激素 、 剪切应力、血流停止、凝血酶、5-羟色胺、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ、组胺、缓激肽、溶血磷脂酸、佛波醇(PMA)、前列腺素F2α(PGF2α)和鞘氨醇1-磷酸等所影响。近期的研究重 点是葡萄 糖的刺激 作用 、 高级糖化 产物 (AGE)、 非酯化脂肪酸 (NEFAs)、 肿瘤坏死因子和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对NADPH氧化酶活性和表达的影响[17,18]。
刺激细胞膜表面的受体, 如血管紧张素Ⅱ受体, 可激活NADPH氧化酶。 血管紧张素Ⅱ结合AT1受体后导致磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)的激活。 两者都可以产生二酰甘油(DAG),而PLC还可以产生三磷酸肌醇(IP3)。 DAG和IP3诱导了钙离子的释放, 而激活蛋白激酶C(PKC)。 PKC磷酸化p47phox亚基需要其他因子与该亚基的结合,而激活NADPH氧化酶。 NADPH氧化酶同样也可以通过脂性第二信使激活氧化酶[17]。
同样有一些反馈机制使NADPH氧化酶的调节更加复杂。 例如,过氧化氢激活c-Src(酪氨酸激酶,分子伴侣v-Src),这可能通过激活c-Abl或导致表皮生长因子受体(EGFR)反式激活(激活PI3-激酶产生PIP3)增强NADPH氧化酶活性 ,而对ROS的产生起正反馈作用。 值得注意的是虽然NADPH氧化酶影响其他氧化酶产生的ROS,而它们自身的活性也可以被其他氧化酶产生ROS所影响[19]。
6NADPH氧化酶激活的分子后果
超氧阴离子,NADPH氧化酶主要的产物, 与NO反应产生过氧硝酸盐,这是内皮功能异常的主要特征性机制[20]。 超氧阴离子可自发或酶促变为更稳定的H2O2。 过氧化氢可被转化为活性氮和活性氯而攻击LDL和HDL,促进斑块的形成[21]。 H2O2可影响蛋白激酶和磷酸酶。H2O2通过钝化磷酸酶和激活一些蛋白激酶调节蛋白的磷酸化。 一个公认的例子是细胞内ROS的增加可能抑制酪氨酸磷酸酶, 并增加酪氨酸激酶活性。 这可能导致丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)磷酸化。而Akt激酶 (IP3-激酶下游 )和半胱天冬酶-3激活涉及细胞凋亡过程,并被ROS调控[22]。
ROS主要通过在DNA结合域的关键氨基酸残基上形成二硫键调控转率因子活性或间接通过调节氧化还原信号通路(磷酸化/去磷酸化)而发挥作用。 激活的蛋白-1(AP-1)通过MAPKs和NF-κB通路发挥作用, 特别是通过ERK1/2和c-jun N-端蛋白激酶 (JNKs)导致前-炎症基因的表达 ,伴随细胞因子和趋化因子的生产[23]。而NF-κB可诱导E-选择素、细胞间黏附分 子 -1 (ICAM-1) 和血管细 胞黏附分 子 -1 (VCAM-1) 的表达而涉及单核细胞黏附到内皮细胞和它们的激活[24]。
除了调节细胞内的信号通路之外,ROS促进了DNS、 脂质和蛋白的损伤 。 ROS诱导DNA损伤激活poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP),导致PKC激活和进一步增强NF-κB的活性[25]。
在上面描述的信号通路, 涉及其他中间蛋白,如细胞内还原因子(谷胱甘肽、过氧化氢酶、氧化酵素和SOD)[26]。
通过这些分子机制,ROS影响血小板聚集、 单核细胞迁移、 脂质过氧化和氧化还原敏感性基因的表达。 ROS也涉及调节内皮功能异常、血管平滑肌细胞 (VSMC)生长、增殖、分化、凋亡、迁移和免疫反应。 说明这些潜在的机制是发展新型治疗动脉粥样硬化和血管功能异常药物最重要的第一步。
7NADPH氧化酶靶点
激活NADPH氧化酶涉及复杂的机制,这些酶以不同活性水平被激活。首先,降低NADPH氧化酶的表达可以抑制其活性。 通过阻断其细胞溶质亚单位转移到细胞膜也可以降低NADPH氧化酶的活性。 其他方式可能为通过使用PKC抑制剂阻止p47phox亚单位磷酸化,或通过阻止p47phox亚单位结合到其他亚单位。此外,通过减少信号传导和抑制Rac1移位已经被证实可以减少ROS的产生[5]。 最后 ,需要特别重视的是策略目标不应该是抑制所有已知的氧化酶,而是抑制特定的NADPH氧化酶亚型。 这些靶点可以帮助指导研究新型的NADPH氧化酶抑制剂。