快速检测试纸条（精选5篇）
快速检测试纸条 篇1
蛋白质是生命现象的基础物质, 与营养、免疫和新陈代谢等密切相关。它有多种生物学功能, 其中有酶的催化作用、激素的生理调节作用和血红蛋白的运载作用等。作为生命的物质基础之一, 蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息传递与表达等方面都起着至关重要的作用。食品中蛋白质含量的多少, 不仅代表食品的质量, 而且也关系着人体的健康, 对食品中蛋白质含量的检测就显得尤为重要。传统检测方法如凯氏定氮法, 操作繁琐, 试剂消耗量大, 且不能区分真假蛋白。目前国家标准对食品中蛋白质含量有严格的规定和要求, 但在监督执法过程中, 由于缺乏快速便捷的检测手段, 工商执法部门无法有效地将非蛋白质类的含氮物质从市场上剔除, 致使不法分子有机可乘, 因此急需研制出一种能够快速检测食品中蛋白质含量的方法。针对以上问题, 本文利用溴酚蓝在一定酸度条件下可与蛋白质结合发生颜色变化, 其颜色深浅与蛋白质含量成比例, 结合化学分析技术制成试纸条, 实现了对蛋白质的快速检测, 该法准确度高和操作简便。
1 试验材料与方法
1.1 主要试剂
牛血清蛋白 (BSA) , 专业生化试剂供应商;溴酚蓝, 天津市化学试剂研究所;氯化钠注射液 (4.5g500m L) , 辽宁民康制药有限公司;柠檬酸, 天津市瑞金特化学品有限公司;氢氧化钠, 汕头市西陇化工厂有限公司。所用试剂均为分析纯, 所用水为二次蒸馏水。
1.2 主要仪器
MICG 1A型便携式测色仪, 日本佐竹公司;AY120型电子分析天平 (感量0.0001g) , 日本岛津仪器公司;PHS-3C型p H计, 上海盛磁仪器有限公司。
1.3 试剂配置
牛血清蛋白 (BSA) 标准溶液 (1.0mg/m L) :准确称取1.0mg牛血清蛋白样品置于1.5m L的离心管中, 加入1 000μL的生理盐水, 使牛血清蛋白样品充分溶解。
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 (pH值3.48) :称取5.0g柠檬酸固体样品于50mL小烧杯中, 加入50mL纯水, 使柠檬酸充分溶解, 用pH计准确测定该溶液的pH值, 此时溶液的pH值低于3.00, 然后缓慢加入一定浓度的NaOH溶液, 边加入, 边用玻璃棒搅拌, 待显示器读数稳定在3.48即可。
溴酚蓝溶液 (2.5mg/mL) :准确称取25mg的溴酚蓝固体样品于离心管中, 然后先后加入2 500μL 0.05mol/L的NaOH溶液和7 500μL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 (体积比=1∶3) , 混合均匀, 备用。
1.4 检测方法
检测时, 利用移液枪准确量取120μL试样加入自行制备的蛋白质试纸条加样孔中, 即可将已加试样的试纸条插入便携式测色仪的卡槽中, 计时开始, 约4.5min, 启动检测仪器, 读取Lab测色体系的b值, 根据b值与蛋白质浓度间的关系即可获得样品中蛋白质的浓度。
2 结果与讨论
2.1 反应膜浸泡时间的选择
为了确定反应膜的浸泡时间长短对试验结果产生的影响, 试验中将反应膜浸泡在预先配制好的敏感试剂中, 浸泡时间分别为30、60、90、120、150和180s, 蛋白质浓度1.0mg/mL, 结果见表1。由表1可知:在30~180s的变化范围内, 反应膜浸泡时间的长短对蛋白质浓度的结果测定并没有明显的影响, b值基本稳定, 试验选择浸泡时间为30s。
2.2 加样量的选择
试验中设定反应膜的浸泡时间为30s, 加样量分别选择80、90、100、110、120、130、140、150和160μL, 蛋白质浓度1.0mg/mL。结果表明:当加样量少于120μL时, 蛋白质试样均不能完全浸润反应膜, 当加样量达到120μL时, 蛋白质溶液完全覆盖反应膜, 且与反应膜中敏感试剂反应良好, b值稳定, 因此试验中将加样量定为120μL。
2.3 试纸条检测时间的选择
为确定试纸条检测蛋白质的最佳时间, 在0.5~6min的时间范围内进行连续检测, 每0.5min检测1次, 蛋白质浓度为1.0mg/mL, 加样量定为120μL, 试验结果如图1所示。
由图1可知:在0.5~4.5min范围内, 反应膜蓝色逐渐加深, b值逐渐增大, 当检测时间达到4.5min后, 反应膜颜色不再变化, b值趋于稳定, 为了提高检测速度, 增加检测结果的准确性, 试验选择检测时间为4.5min。
2.4 试纸条法快速测定蛋白质试样
在以上条件优化的基础上, 试验中对不同浓度的蛋白质溶液进行检测试验, 加样量为120μL, 检测时间4.5min, 试验结果如图2所示。
由图2可知:蛋白质的浓度在25~1 000μg/mL范围内时, b值随着蛋白质浓度的增加而增大, 具有良好的线性关系, 其线性回归方程为y=0.002x+2.9948, 相关系数R=0.993。
3 结论
本研究选用了溴酚蓝为显色剂, 利用过滤膜、反应膜和基板制成了用于测定蛋白质浓度的试纸条, 实现了蛋白质试样的快速检测。结果表明:在蛋白质浓度25~1 000μg/mL范围内具有良好的线性关系, 相关系数R为0.993, 加样量为120μL, 反应时间为4.5min, 在现场检测蛋白质试样方面具有较好的应用前景。
参考文献
[1]王淡兮, 孙秀兰.蛋白质定量检测方法的探讨[J].粮食与食品工业, 2009, 16 (4) :49-51, 62.
[2]Chen L.Y., Remondetto G.E., Subirade M..Food protein-based materials as nutraceutical delivery systems[J].Trends in Food Science&Technology, 2006 (16) :272-283.
[3]牛巍, 侯彩云, 祝晓芳, 等.三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法在液态奶蛋白质检测中实用性研究[J].中国乳品工业, 2008, 36 (9) :59-61.
[4]吴迪, 曹芳, 冯水娟, 等.基于支持向量机算法的红外光谱技术在奶粉蛋白质含量快速检测中的应用[J].光谱学与光谱分析, 2008, 28 (5) :1071-1075.
[5]宗留香.半微量凯氏定氮法测定蛋白质工艺的改进[J].食品工业科技, 2007 (5) :232-234.
[6]张红医, 刘保生, 王甫丽.光度法研究溴酚蓝与牛血清蛋白的结合反应[J].光谱学与光谱分析, 2003 (2) :342-344.
[7]刘保生, 张红医, 王甫丽.溴酚蓝测定血清白蛋白的研究[J].光谱学与光谱分析, 2003 (5) :999-1001.
[8]方芳, 戚玉海, 张锋.灵敏的单一溴酚蓝测定尿蛋白[J].广东微量元素科学, 2007 (6) :37-39.
超灵敏度检测铅离子试纸条问世 篇2
据介绍, 铅离子是一类主要的环境污染物, 具有致癌性, 能够对人体健康以及生态环境产生极大的危害。传统的检测方法主要是一些色谱、质谱技术, 但这些方法操作麻烦, 且需要昂贵的仪器, 因而限制了它们的广泛应用。
曾令文团队应用的试纸条具有很高的灵敏度, 可以检测出10p M的铅离子。这一数值远远低于美国环境保护署规定的饮用水中铅离子的最大允许量72n M。
业内专家表示, 该团队构建的非酶信号扩增试纸条操作简便, 不需要使用检测仪器, 为环境中重金属铅离子污染的快速、灵敏检测提供了一种有效的手段, 降低了检测成本, 在环境重金属检测领域具有重要的应用价值。
快速检测试纸条 篇3
1 免疫层析快速诊断试纸条的基本原理
免疫层析快速诊断试纸条是利用抗原抗体反应, 在硝酸纤维素膜 (NC) 上预先包被特异性抗体 (抗待检物抗体) (或抗原) 和第二抗体 (抗金标抗体的抗体) 两种捕获剂, 分别作为检测线 (T线) 和质控线 (C线) 。反应物是固定于金标结合垫 (玻璃纤维膜) 上的金标抗待测物抗体。根据胶体金标记物的不同可以分成竞争法和夹心法等不同反应模式。以最常用的双抗体夹心检测抗原为例, 当待检液浸泡或滴入试纸条的样品垫后, 通过吸水纤维的毛细作用, 待检液迅速湿透金标结合垫, 金标结合垫上的胶体金结合物 (Au) Ab1 (金标抗待检物抗体) 被溶解, 并随待检液一起沿层析材料向前泳动。若待检液中存在待检抗原 (Ag) , 则它就会和胶体金结合物 (Au) Ab1发生特异性免疫反应, 形成胶体金结合物-待测抗原的免疫复合物, 即 (Au) Ab1-Ag免疫复合物, 然后随待检液流经NC膜上T线的捕获试剂 (一般是待测抗原Ag的另一表位特异性抗体, 用Ab2表示) 。T线的捕获试剂捕获 (Au) Ab1-Ag免疫复合物, 即与该免疫复合物发生特异性免疫反应, 形成胶体金结合物-待测抗原-捕获试剂的免疫复合物, 即 (Au) Ab1-Ag-Ab2免疫复合物, 从而使 (Au) Ab1-Ag免疫复合物截留在T线处而显色。从加样垫中泳动过来的过量胶体金标记的抗体, 无论携带抗原与否, 均可被包被于C线的抗金标抗体的抗体 (Ab3) 所捕获而显色, 表明整个反应体系是正确的。T线和C线处均有胶体金标记物滞留而显色 (红色或紫色) 时, 则表示检测结果为阳性结果, 即待检液中有待测抗原;若仅C线处显色, 而T线处未显色, 则表示为阴性结果, 即待检液中无待测抗原;若C线处未观察到颜色, 则表示此次检测无效, 此时无论T线处是否观察到颜色, 结果都是无意义的。
2 免疫层析快速诊断试纸条的制备
2.1 胶体金的制备方法
氯金酸 (HAu Cl4) 在还原剂的作用下, 聚合成一定大小的金颗粒, 形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态, 故称胶体金 (collidai gold) 。目前, 制备胶体金的方法有多种, 根据时间的先后, 依次为抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、乙醛超声波还原法、放射性胶体金法、硼氢化钠还原法、鞣酸-柠檬酸三钠还原法、白磷还原法、白磷还原法的改良法和微波制备胶体金法, 其中最常用的是柠檬酸三钠还原法。
2.1.1 玻璃器皿的清洁和硅化
所有使用的玻璃器皿先用自来水清洗干净, 烘箱干燥后, 浸入清洁液浸泡24h, 取出后用自来水洗净清洁液, 然后每个玻璃器皿用自来水冲洗5~10次, 蒸馏水洗5次, 用超纯水洗3~4次, 烘箱干燥后硅化。硅化方法:在通风橱中, 将玻璃器皿浸入5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液中作用3min, 器皿充分被硅化后, 干燥, 再用超纯水冲洗干净, 干燥备用。专用的玻璃器皿也可以第一次生成的胶体金稳定其表面, 弃去后以超纯水冲洗干净, 可代替硅化处理。
2.1.2 制备胶体金的方法和步骤
以制备20nm胶体金为例:取0.01%氯金酸100m L置于硅化锥形瓶中, 微波炉加热至沸腾, 搅动下迅速加入1%柠檬酸三钠2.25m L, 摇匀继续煮沸3min, 直至氯金酸变为红色后, 取出。冷却至室温后用超纯水恢复到原体积, 即可制备得到20nm的胶体金溶液, 避光4℃保存备用。胶体金颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的, 保持其他条件恒定, 仅改变加入的柠檬酸三钠的量, 可制得不同粒径的胶体金, 基本的规律是柠檬酸三钠用量越多, 胶体金颗粒的直径越小, 柠檬酸三钠的用量越少, 胶体金颗粒的直径越大。
2.2 胶体金标记物的制备
胶体金标记物的制备过程就是胶体金和标记物的结合与纯化过程。
2.2.1 胶体金的标记
取20m L 4℃保存的胶体金溶液于50m L硅化过的烧杯中, 恢复至室温后, 用0.1mol/L K2CO3调整p H至抗体最适p H值。将最适标记量抗体加入稀释液中混匀, 在磁力搅拌下, 缓慢滴加到胶体金中, 继续搅拌15min, 室温静置10~15min, 搅拌下, 缓慢滴加10%BSA作为稳定剂, 以使其终浓度为1%, 搅拌15min后室温放置10min, 置4℃冰箱保存备用。
2.2.2 胶体金标记物的纯化
胶体金标记物的纯化是除去其中未标记的蛋白和未充分标记的胶体金, 以及在标记过程中可能形成的各种聚合物, 以得到稳定的胶体金标记物。多用低温超速离心方法, 先用3000rpm离心10min, 收集上清, 除去其中的胶体金聚合物, 再4℃12000rpm离心30min, 可见离心物质分为3层, 上清液含有尚未结合的抗体, 最下面的深黑色斑点即为尚未结合的胶体金颗粒聚集物, 中间絮状沉淀即为结合良好的胶体金标记物。弃上清, 收集絮状沉淀, 将沉淀以原体积的PBS (含1%BSA) 溶解, 重复离心1次, 沉淀溶于原体积的1/10的PBS (含1%BSA) 中, 4℃保存备用。
2.3 试纸条的制备、组装及储存
2.3.1 金标结合垫的制备
金标结合垫结合胶体金标记物的方式主要有定量非接触喷点法和浸泡法。定量非接触喷点是用喷点仪喷胶体金标记物到结合垫上, 此法可实现定量喷点。浸泡法是直接将结合垫浸泡在胶体金标记物溶液中。定量喷点法具有比浸泡法更好的吸附均一性。用喷点仪将稀释后的胶体金标记物喷到玻璃纤维上, 37℃干燥后, 即为金标结合垫, 切成0.7cm宽的长条, 加入干燥剂, 密封4℃保存备用。
2.3.2 硝酸纤维素膜 (NCM) 的包被
目前有两种点样方式即划膜式和非接触式。划膜式容易对层析的胶体金标记物形成阻力, 导致假阳性。非接触点膜式优于划膜式。用喷点仪将稀释的抗待检物抗体或抗原和抗金标抗体的抗体分别喷于NC膜上, 做为检测线和质控线, 干燥后密封保存备用。
2.3.3 试纸条的组装及储存
将NC膜、结合垫、吸收垫和样品垫依次粘在单面PVC板上, 其中金标结合垫、吸收垫均层叠在NC膜上, 分别与NC膜重叠约2mm, 样品垫层叠于金标结合垫上, 二者重叠约2mm。要注意伸展平贴, 贴后不能有空隙。用切割机将粘贴好的试纸板切成宽为0.4cm试纸条, 切好的试纸条装入检测卡内, 置于含有干燥剂的铝箔袋中密封, 4℃保存。
3 免疫层析快速诊断试纸条在动物疾病诊断中的应用
近年来, 随着免疫层析快速诊断检测手段的不断提高和养殖业对疾病检测的要求, 免疫层析快速诊断试纸条在动物疾病诊断中也得到了初步的应用。国内, 该技术在病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫病的诊断中逐渐得到推广应用。
3.1 病毒性疾病的诊断
黄印尧等应用双抗原夹心法建立了免疫金标快速诊断试纸条法检测猪伪狂犬病抗体, 与ELISA法对16份猪血液或血清进行猪伪狂犬抗体检测, 结果符合率达100%。金颜辉等在玻璃纤维膜包被胶体金标记PCV-2抗原, 在NC膜上检测线和对照线处分别包被PCV-2抗原和兔抗PCV-2抗体, 制成猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸。该试纸与ELISA试剂比较, 两者都具有微量、特异、准确的优点, 且金标试纸独具操作方便、快速和结果直观、容易判定的优点。蒋韬等用胶体金标记O型豚鼠口蹄疫病毒抗体, 形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上, 兔抗O型FMDV抗体和羊抗豚鼠Ig G分别包被于NC膜上作为检测带和质控带, 组装成快速诊断试纸条。在田间试验中, 53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测, 两种方法的阳性率分别为95.45%和90.91%, 符合率为98.37%, 而其研制的胶体金免疫层析方法简便、快速、具有良好的特异性和敏感性, 非常适合基层兽医实验室诊断时使用。
3.2 细菌性疾病的诊断
檀华等将胶体金标记上金黄色葡萄球菌蛋白A, 用类鼻疽多糖抗原致敏NC膜, 组装成免疫层析试纸条。用该试纸条和间接血凝试验检测了3份兔血清、16份猪血清和26份人血清标本, 试验结果表明该诊断试纸与间接血凝试验的结果一致, 具有较好的特异性和敏感性。张书环等用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原, 制备牛结核抗体检待检纸条。交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应, 具有较高的特异性。与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应和韩国试纸条比较符合率分别为85%、79.73%和98.75%。朱明东等应用GICA法, 建立快速诊断牛布鲁氏菌病的新方法, 试验结果表明检测的敏感性和特异性分别达到91.3%和97.3%, 用该方法诊断牛布鲁氏菌病, 不仅具有试剂敏感、特异, 且血清用量少, 操作简便, 更适合于布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查及现场应用。
3.3 寄生虫病的诊断
唐雨德等建立了检测囊虫抗体的GICA法, 用GICA法检测囊虫病猪血清均为阳性, 正常猪及其他疾病猪血清结果均为阴性, 同ELISA法比较, 两种方法检测囊虫抗体的相符率达96.8%。李学伍等以旋毛虫重组分泌抗原为基础, 成功研制出旋毛虫病快速检测试纸条, 试验结果显示该试纸条具有良好的特异性和敏感性, 与猪肺线虫、猪囊尾蚴、猪细颈囊尾蚴、猪米氏住肉孢子虫、猪蛔虫无交叉反应, 与ELISA及消化法的检测结果符合率为100%。邓瑞广等用免疫层析快速诊断试纸条检测10份猪旋毛虫病阳性样品, 结果均为阳性;检测18份猪蛔虫病、12份猪囊虫病、11份猪细颈囊尾蚴病阳性样品和10份健康猪阴性样品, 结果全部呈阴性;检测6份人工感染猪旋毛虫病阳性血清抗体效价, 结果与ELISA方法相一致。用该试纸条诊断旋毛虫病, 特异性高, 敏感性强, 重复性和稳定性好, 方法简便, 快速实用。王艳华等成功研制的检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条, 检测结果与弓形虫IHA检测结果的符合率为82.5%, 且较弓形虫IHA诊断试剂能提前2d检测到抗体。
4 发展前景
快速检测试纸条 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
(1) 金标试纸条由蓝十字生物药业有限公司提供; (2) HBs Ag灵敏度标准品:中国药品生物制品检定所产品; (3) HBs Ag酶免诊断试剂盒:3V生物工程有限公司产品, HBs Ag、HBc Ag、HBe Ag阳性对照血清; (4) 血清标本:500份体检及临床血清标本, 其中乙型肝炎患者49份, 健康人血清451份。
1.2 方法
(1) 5 ng/mL标准品, 用生理盐水分别稀释成4, 3, 2, 1 ng/mL几种浓度。各取0.2 m L置于洁净试管中, 用金标试纸条进行检测, 严格按照说明书操作; (2) HBs Ag、HBc Ag、HBe Ag阳性对照血清各取3份, 每份0.2 m L加入洁净试管中, 用金标法进行检测; (3) 用金标试纸条各10条分别置于37℃室温保存5 d做热稳定实验。
2 结果
2.1
用金标法对5种浓度HBs Ag阳性标准品进行检测, 强阳性标准品 (4~5 ng/mL) 在2 min内即可在检测到红色胶体金颗粒聚集;阳性标准品 (3 ng/mL) 在5 min内即可出现2条紫红色线条;弱阳性标本 (1~2 ng/mL) 约需20 min确定结果, 说明金标法敏感性较强, 灵敏度可达1 ng/mL, 可以满足临床要求。
2.2
将金标试纸条分别插入HBs Ag、HBc Ag、HBe Ag阳性的对照血清中, 结果只有HBs Ag阳性对照血清管中试纸出现2条红线, 说明该试纸特异性强, 不易出现假阳性。
2.3
分别用金标法、ELISA法对500份血清进行检测, 所得结果:两种方法47例阳性结果一致, 有449例阴性结果一致, 有4份血清两法检测结果不符, 比较两法一致性, 符合率为99%.4份两法不符血清中有3例金标法呈弱阳性, 而ELISA为阴性, 但ELISA吸光度值均接近临界值;另外1例金标法阴性, ELISA为弱阳性。通过计算, 可得出金标法临床灵敏度为95%, 特异性为99%, 准确度为98%, 阳性率为98%.
2.4
将金标试纸于37℃、25℃各放置5 d后, 测定不同的血清标本, 所得结果于放置4℃的试纸显示结果无差异, 说明其稳定性较好, 易于保存。
3 讨论
HBs Ag的检测作为乙型肝炎病毒感染的一个重要指标, 目前多采用ELISA法, 由于其试剂盒中酶标试剂不易保存, 操作规程繁琐, 时间长, 且易引起标本间交叉污染, 或阳性标本对人体的污染, 给实验检测工作带来一些不便, 尤其不能满足临床急诊需要。
近几年, 随着免疫化学技术的发展, 出现了胶体金免疫层析法, 其原理是用双抗体夹心法检测血清中HBs Ag, 血清中HBs Ag先与胶体金标记的抗-HBs单克隆抗体起反应, 然后再与包被于硝基纤维素膜上的抗-HBs单克隆抗体作用, 并在该处显紫红色。判断结果是出现2条红色线为阳性, 只有对照线出现时为阴性。该法集免疫反应与免疫层析的特点, 灵敏度高、特异性强, 且易保存, 易操作, 患者可随来随查, 适用于大批健康体检, 流行病学调查及门诊急诊标本应用[2]。当然, 该法只能做定性检查, 灵敏度较差, 易将少数弱阳性标本忽视, 出现假阴性具体原因和改善的方法有待于进一步探讨。
参考文献
[1]王兰兰.临床免疫学和免疫检验[M].第3版.北京:人民卫生出版社, 2003:94-96.
快速检测试纸条 篇5
盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检测卡 (试纸条) 在使用前进行质量验证是确保试纸条检测结果准确有效的重要手段, 必不可少。笔者在实际工作中对6个厂家的12批次产品进行了质量验证, 现将验证方法及体会写下来, 供同行商榷。为了便于叙述, 下面以盐酸克伦特罗检测卡为例, 进行叙述。
1 验证参数及判定标准
1.1 检测阈值、假阴性率、假阳性率
即试剂条能检测出来的最低浓度值。当检测阈值等于试纸条标示的检测限时, 该试纸条为合格。当其小于或大于检测限时, 会导致高的假阳性率或高的假阴性率, 此试纸条判为不合格。
1.2 判定标准
国内外对于快速检测技术的一个基本原则是“绝不能有假阴性, 但允许有假阳性”。按照农业部兽药残专家委员会评审快速检测卡 (试纸条) 备案时的有关要求, 快速检测卡 (试纸条) 的假阳性率应<10%。
2 材料
2.1 空白猪尿样品
20头份, 分别编号为A1、A2、A3、……、A20。从鹤壁市某养猪场采集, 用液-质联用仪方法检测, 未检出盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。
2.2 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品
从中国计量科学研究院购买。
2.3 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准储备液 (1 mg/mL)
配制方法:准确称取盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品约10.0 mg, 分别置于10 m L容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度。贮存于-18℃冰箱中, 有效期为1年。
2.4 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准中间工作液 (10μɡ/mL)
配制方法:用微量移液器移取标准储备液100μL, 置于10 mL容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度。贮存于-18℃冰箱中, 有效期为1个月。
2.5 微量移液器0~1 000μL。
2.6 瘦肉精试纸条
盐酸克伦特罗试纸条 (检测限为3ng/mL) 、莱克多巴胺试纸条 (检测限为2 ng/mL或5 ng/mL) 、沙丁胺醇试纸条 (检测限为5 ng/mL或3ng/mL)
2.7 阴性猪尿样品一
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。
2.8 阴性猪尿样品二
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。再分别移取适量盐酸克伦特罗的标准中间工作液加入空白猪尿中, 配制浓度为盐酸克伦特罗检测卡 (试纸条) 标示的检测限-1的阴性猪尿样品 (即盐酸克伦特罗的浓度为2 ng/mL) , 混匀备用, 现配现用。
用同样的方法分别制备莱克多巴胺、沙丁胺醇的阴性猪尿样品 (莱克多巴胺的浓度为4 ng/mL或1 ng/mL、沙丁胺醇的浓度为2 ng/mL或4 ng/mL) 。
2.9 阳性添加样品
2.9.1 阳性猪尿样品一:
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。再移取适量盐酸克伦特罗标准中间工作液加入空白猪尿中, 配制浓度为盐酸克伦特罗检测卡 (试纸条) 标示的检测限的阳性猪尿样品 (即盐酸克伦特罗的浓度为3 ng/mL) , 混匀备用, 现配现用。
用同样方法, 制备莱克多巴胺、沙丁胺醇阳性猪尿样品一 (莱克多巴胺的浓度为5 ng/mL或2 ng/mL、沙丁胺醇的浓度为3 ng/mL或5 ng/mL) 。
2.9.2 阳性猪尿样品二:
制备方法:取2.1空白猪尿样品任1头份 (比如:A1) 5 mL, 置于50 mL塑料瓶中。再移取适量盐酸克伦特罗标准中间工作液加入空白猪尿中, 配制浓度分别为10ng/ml的盐酸克伦特罗阳性猪尿样品混匀备用, 现配现用。
用同样方法, 制备莱克多巴胺、沙丁胺醇阳性猪尿样品二 (莱克多巴胺的浓度为10 ng/mL、沙丁胺醇的浓度为10 ng/mL) 。
3 方法
3.1 试纸条的使用步骤及结果判读
3.1.1 将未开封的试纸条恢复至室温。
3.1.2 将试纸条水平放置, 用滴管向试纸卡孔缓慢逐渐加入3滴不含气泡的检测液 (约80μL) 。
3.1.3 反应3~5 min后判读结果。
3.1.4 结果判定:用肉眼观察, 依照说明书进行结果判定。
3.2 检测阈值的测定
用盐酸克伦特罗试纸条分别对阴性猪尿样品一、阴性猪尿样品二、阳性猪尿样品一、阳性猪尿样品二进行检测, 每个样品两个重复, 记录下来呈现阳性的最低浓度值。如果阳性猪尿样品二也不呈现阳性, 则配制浓度更高的阳性猪尿样品进行检测, 直至出现阳性结果为止。然后, 在出现阳性的最低浓度值和该值前一个浓度值之间配制数量差为1 ng/mL的系列浓度的阳性猪尿样品, 每个浓度各用2条试纸条进行检测, 出现阳性的最低浓度值即为该试纸条的检测阈值。
3.3 假阳性率的测定
取空白的猪尿样品A1、A2、A3、……、A20各1份, 每份量为10 mL, 然后, 按照阴性猪尿样品二的制备方法, 制备A1′、A2′、A3′、……、A20′等20份阴性猪尿样品。对A1、A2、A3、……、A20, A1′、A2′、A3′、……、A20′等40份猪尿样品用检测卡检测, 每个样品做2个重复, 在常温 (20~30℃) 条件下, 按照说明书, 进行结果判定, 统计假阳性数, 按照下面的公式计算假阳性率。
假阳性率=假阳性数/80х100%
3.4 假阴性率的测定
按照阳性猪尿样品一的制备方法, 制备A1″、A2″、A3″、……、A20″等20个阳性猪尿样品, 用检测卡进行检测, 每个样品做两个重复, 在常温 (20~30℃) 条件下, 按照说明书, 进行结果判定, 统计假阴性数, 按照下面的公式计算假阴性率。
假阴性率=假阴性数/40х100%
4 结果
笔者在工作中, 对6个厂家12批次的试纸条进行了验证, 现将结果简要整理如表1。
5 讨论
5.1 验证参数有哪些
试纸条在使用前, 应对3个参数进行验证, 分别是:检测阈值、假阴性率、假阳性率。
但是, 从表格中我们发现, 检测阈值高于检测限的情况 (7/12) 较为常见, 有的产品检测阈值甚至达到30 ng/m L, 是检测限的6倍。另外, 根据国家相关规定, 试纸条用于筛选方法时, 假阴性率必须为零。因此笔者认为, 如果没有条件对3个参数都进行验证时, 应至少对“检测阈值”、“假阴性率”这两个参数进行验证。
5.2 每批产品是否都要验证
从表中可以看出, 试纸条产品质量参差不齐, 差别极大。即使有备案文号的试纸条每批产品的质量也有差异, 如杭州B公司生产的两批莱克多巴胺试纸条。因此建议, 每批产品使用前, 均须进行验证。
5.3 检测阈值的问题
“检测阈值”这个参数应先验证, 根据它的结果, 再考虑其它参数是否需要验证。当其高于或低于检测限时, 由于出现高的假阴性率或假阳性率, 导致问题畜产品流入市场或增加了监管部门确认经费的负担, 因此均应判为不合格。只有二者相等时, 才进行另外两个参数的验证。
5.4 假阳性率的问题
由于尿液中样本成分复杂, 特别是在含有盐酸克伦特罗结构相近的代谢物时, 都将导致出现假阳性, 因此, 试纸条出现假阳性是不可避免的。但由于检测卡主要用于筛选方法, 可以允许一定的假阳性率。根据相关规定, 假阳性率允许10%以下。
摘要：当前, 国内生产盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检测卡 (试纸条) 的厂家众多, 试剂条的质量参差不齐, 同一厂家不同批次的产品质量差异很大, 致使现场检测过程中, 要么假阳性样品数量太多, 增加了监管部门确认经费的负担, 要么出理假阴性样品, 导致兽药残留超标的畜产品流入市场, 造成畜产品质量安全隐患。如何在使用前进行质量验证是确保试纸条检测结果准确有效的重要手段。文章探讨了快速检测试纸条的质量验证试验, 提出三个验证参数"检测阈值、假阴性率、假阳性率"。指出“检测阈值”是个重要参数。
关键词：试纸条,质量验证,方法
参考文献
[1]农业部.农医发[2005]17号文件“关于发布《兽药残留酶联免疫试剂 (盒) 备案审查技术资料要求》和《兽药残留酶联免疫试剂 (盒) 备案参考评判标准》的通知”.2005.
[2]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.GB/T22147-2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定.2008.
[3]农业部.农业部1025号公告-16-2008动物尿液中盐酸克伦特罗残留检测气相色谱-质谱法.2008.