肿瘤坏死因子受体1

肿瘤坏死因子受体1（通用7篇）

肿瘤坏死因子受体1 篇1

免疫抑制剂被广泛应用于自身免疫病及移植抗宿主病的预防和治疗,目的在于控制免疫反应的加剧[1]。然而长期接受大剂量免疫抑制剂治疗,机体免疫功能遭到严重破坏,对外界病原菌的抵抗力减弱,极易发生难以控制的感染性疾病,尤其是侵袭性真菌感染,严重威胁免疫抑制患者的生存。巨噬细胞等固有免疫细胞通过模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)区分自我和非我,识别并结合微生物表面病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)启动快速的天然免疫防御反应,进而触发持久的特异性的适应性免疫反应[2],介导机体对致病真菌的杀灭和清除。环孢素A和霉酚酸酯是临床最常用的两种免疫抑制剂,与真菌感染的发病率和死亡率有着密切的联系。本研究通过体外模拟真菌感染试验,观察环孢素A和霉酚酸酯对酵母聚糖(Zymosan A)诱导的RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)表达的影响,从模式识别水平探讨环孢素A、霉酚酸酯与真菌感染之间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

小鼠RAW264.7巨噬细胞购自南京凯基生物公司细胞库。复苏细胞,用含10%新生牛血清的洛斯维·帕克纪念研究所(roswell park memorial institute,RPMI)1640培养基在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培养,0.25%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)胰蛋白酶消化传代2~3次后,以1×105个/ml密度接种于35 mm培养皿。

1.2 主要试剂

Zymosan A购自美国Sigma公司,超纯RNA提取试剂盒、Hi Fi-MMLV c DNA第一链合成试剂盒、PCR Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司,抗小鼠PE-Dectin-1抗体、抗小鼠PE-TLR2抗体购自德国美天旎生物技术有限公司,TNF-α酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自美国R&D公司,霉酚酸酯、环孢素A购自大连美仑生物技术有限公司。

1.3 实验分组

实验分霉酚酸酯+Zy组、环孢素A+Zy组、阳性对照组(Zy组)和空白对照组,其中霉酚酸酯+Zy组、环孢素A+Zy组又分为低浓度、中浓度和高浓度3个组别。具体步骤如下:(1)向各实验组的培养皿中分别加入霉酚酸酯(0.10、0.25和0.50μg/ml)或环孢素A(2.5、5.0和10.0μg/ml)预处理;阳性对照组和空白对照组加入等量完全培养基,24 h后弃净原培养基。(2)空白对照组给予等量完全培养基,其余各组分别加入100μg/ml Zymosan A刺激细胞[3]。

1.4 逆转录聚合酶链反应检测Dectin-1、TLR2m RNA表达

Zymosan A干预后4 h后,按照超纯RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。按照世纪康为Hi Fi-MMLV c DNA第一链合成试剂盒要求进行反转录,聚合酶链反应扩增条件为:95℃预变性5 min,95℃变性15 s,60℃退火1 min,共40个循环。引物合成由上海生物工程股份有限公司设计完成,序列如下:(1)Dectin-1正向引物:5'-AGACTTCAGCACTCAAGACATCCA-3',反向引物:5'-CAGGATTCCTAAACCCACTGCAA-3';(2)TLR2正向引物:5'-CCCACTTCAGGCTCTTTGAC-3',反向引物:5'-GCCACTCCAGGTAGGTCTTG-3';(3)脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk);(4)髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,My D88);(5)β-actin正向引物:5'-TGAAGATCAAGATCATTGCT CCTCC-3',反向引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTG GACGATG-3'。待反应结束后,采用2-△△CT进行相对定量分析。

1.5 流式细胞术检测Dectin-1、TLR2蛋白的表达

Zymosan A作用细胞3和6h后,用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化细胞并转移至流式管中,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)漂洗后重悬细胞,分别加5μl抗小鼠PE-Dectin-1抗体和抗小鼠PE-TLR2抗体,室温避光20 min进行荧光标记染色,PBS漂洗离心,弃掉残余抗体,上机检测各组细胞的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。

1.6 ELISA检测TNF-α的表达

Zymosan A作用细胞12 h后收集上清液,按照TNF-α试剂盒说明书,检测各组上清液中TNF-α的浓度。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析,多组间的两两比较用Bonferroni法检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 霉酚酸酯、环孢素A对Zymosan A诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1和TLR2 m RNA表达的影响

Zymosan A单独RAW264.7巨噬细胞4 h后Dectin-1(1.757±0.020)和TLR2(2.970±0.649)表达水平与空白对照组(1.000±0.000)比较,经t检验,差异有统计学意义(t=99.546和74.816,P=0.000),Zymosan A上调巨噬细胞Dectin-1和TLR2的转录。就Dectin-1和TLR2 m RNA表达水平而言,霉酚酸酯0.10μg/ml+Zy组、霉酚酸酯0.25μg/ml+Zy组、霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy组、Zy组4组比较,经方差分析,差异有统计学意义(F=12.652和54.953,P=0.000)。环孢素A 2.5μg/ml+Zy组、环孢素A 5.0μg/ml+Zy组、环孢素A 10.0μg/ml+Zy组、Zy组Dectin-1和TLR2m RNA表达水比较,经方差分析,差异有统计学意义(F=138.202和34.434,P=0.000)。应用中、高浓度的霉酚酸酯和环孢素A预先处理RAW264.7巨噬细胞再受到Zymosan A刺激后,与单独应用Zymosan A刺激组比较,经Bonferroni法检验,Dectin-1 m RNA表达降低(P<0.05);3种浓度的霉酚酸酯和环孢素A预处理细胞后均能下调Zymosan A诱导的TLR2m RNA的表达水平(P<0.05)。见图1和表1、2。

2.2 霉酚酸酯、环孢素A对Zymosan A诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1和TLR2蛋白表达的影响

空白对照组Dectin-1蛋白免疫荧光强度为(32.483±2.597),Zymosan A单独刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞3 h后Dectin-1蛋白免疫荧光强度为(47.060±3.310),经t检验,差异有统计学意义(t=6.746,P=0.003),Zymosan A促进细胞表面Dectin-1蛋白表达。霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy组、环孢素A10.0μg/ml+Zy组、Zy组的Dectin-1蛋白MFI比较,经方差分析,差异有统计学意义(F=49.109,P=0.000)。预先给予0.50μg/ml霉酚酸酯或10.0μg/ml环孢素A处理后,再受到Zymosan A刺激的RAW264.7细胞表面Dectin-1蛋白荧光强度分别为(22.967±2.098)和(23.193±2.852),低于Zymosan A单独刺激组(P<0.01)。给予Zymosan A单独作用6 h后,巨噬细胞表面TLR2免疫荧光强度(776.453±29.847)高于空白对照组(549.153±35.424),差异有统计学意义(t=15.018,P=0.003);霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy组、环孢素A 10.0μg/ml+Zy组、Zy组的TLR2蛋白MFI比较,经方差分析,差异有统计学意义(F=34.434,P=0.000)。MMF 0.50μg/ml+Zy组和Cs A10.0μg/ml+Zy组的TLR2免疫荧光强度分别为(578.697±25.382)和(597.763±25.113),与Zymosan A单独作用组比较,经Bonferroni法检验,差异有统计学意义。见图2和表3、4。

A、B:霉酚酸酯;C、D:环孢素A。1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与Zy组比较,P<0.05

(n=6,±s)

注:P1:与Zy组的Dectin-1 m RNA比较;P2:与Zy组的TLR2 m RNA比较

(n=6,±s)

注:P1:与Zy组的Dectin-1 m RNA比较;P2:与Zy组的TLR2 m RNA比较

2.3 霉酚酸酯、环孢素A对Zymosan A诱导RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α的影响

空白对照组可检测到低水平TNF-α[(720.450±61.642)pg/ml],Zymosan A共培养的RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α水平为(1 908.752±32.070)pg/ml,经t检验,差异有统计学意义(t=34.203,P=0.003),Zymosan A能够促进TNF-α的表达。霉酚酸酯0.10μg/ml+Zy组、霉酚酸酯0.25μg/ml+Zy组、霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy组、环孢素A2.5μg/ml+Zy组、环孢素A 5.0μg/ml+Zy组、环孢素A 10.0μg/ml+Zy组与、Zy组的TNF-α分泌水平比较,经方差分析,差异有统计学意义(F=675.899,P=0.000)。不同浓度的环孢素A和霉酚酸酯均能抑制Zymosan A诱导的TNF-α的释放水平,其中大剂量的环孢素A(10.0μg/ml)抑制作用最为明显。见图3和表5。

A、B:霉酚酸酯+Zymosan A;C、D:环孢素A+Zymosan A。绿色线条代表空白对照组,紫色线条代表ZA组,黄色线条代表霉酚酸酯0.50μg/ml+Zymosan A组或环孢素A10.0μg/ml+Zymosan A组

(n=3,±s)

注:t1、P1:与空白对照组的Dectin-1蛋白比较;t2、P2:与空白对照组的TLR2蛋白比较

(n=3,±s)

注:P1:与Zy组的Dectin-1蛋白比较;P2:与Zy组的TLR2蛋白比较

1)与空白组比较,P<0.05;2)与Zy组比较,P<0.05

(n=4,pg/ml,±s)

注:P1:与Zy组比较;P2:与Cs A 10.0μg/ml+Zy组比较

3 讨论

免疫抑制剂的应用为器官移植后的抗宿主排斥反应、自身免疫性疾病、非自身免疫性疾病,如肿瘤和过敏性疾病等的预防及治疗提供了有效的方法和手段[4]。然而,因免疫功能过度受损引发的感染性疾病,尤其是侵袭性真菌感染,一直是免疫抑制人群面临的重要问题。尽管新的抗真菌药物已被研发出来,但是因为早期诊断困难,病情进展速度快,且发病率和病死率呈逐年攀升趋势,因此侵袭性真菌病仍严重威胁着免疫低下患者的生存。

外来病原体入侵机体时,启动先天性免疫反应和适应性免疫反应形成稳固复杂的免疫网络清除致病真菌。巨噬细胞等固有免疫细胞是先天性免疫系统中的“前哨兵”。通过细胞表面或内部的PRRs识别暴露于病原微生物表面的PAMPs,启动快速有机的炎症信号转导通路,分泌大量炎症细胞因子和趋化因子,驱动并局限中性粒细胞等炎症细胞到达感染部位,触发细胞的吞噬作用、呼吸爆发等功能,进而启动适应性免疫反应,促进机体对真菌病原体的清除[5,6]。大量研究发现,与真菌感染密切相关的PPRs,主要涉及C型凝集素受体家族(C-type lectin family,CLRs)和Toll样受体家族[7],其中尤以Dectin-1和TLR2的研究最为广泛,是近年来真菌相关免疫识别机制的研究热点。

Zymosan A来源于酿酒酵母细胞壁,富含β-葡聚糖和甘露聚糖,常被用来模拟体外真菌感染的免疫学研究。Dectin-1和TLR2协同参与Zymosan A的免疫识别过程,通过激活下游的Syk和My D88信号通路,最终导致核转录因子活性增强并释放大量的细胞因子TNF-α,协同放大炎症反应[8]。本实验结果表明,在Zymosan A刺激小鼠巨噬细胞的早期,可显著上调受体Dectin-1、TLR2 m RNA和蛋白的表达水平,促进细胞因子TNF-α的释放,最终诱导炎症反应的发生。

环孢素A和霉酚酸酯目前是肾移植患者术后最常用的两种免疫抑制剂,在减少移植物抗宿主反应促进移植术后移植物存活的同时,也往往能够引起患者感染症状加重,甚至发生难控性真菌感染,引起病死率显著升高。目前,有关环孢素A和霉酚酸酯对病原体识别过程的影响,具体机制尚不清楚。特异性T淋巴细胞功能调节药环孢素A,能够选择性抑制T淋巴细胞相关因子如IL-2、TNF-α的分泌,同时削弱宿主的体液/细胞免疫。此外,环孢素A发挥免疫抑制功能的具体机制可能也涉及到模式识别水平。GREENBLATT等[9]认为,环孢素A通过抑制Dectin-1通路下调细胞因子IL-10的表达,来调控对中性粒细胞的抗真菌免疫功能,而与TLR2/Myd88通路无关,并由此得出Dectin-1是环孢素A作用机制的上游元件。洪英礼等[10]通过实验观察到,与空白对照组大鼠比较,皮下注射环孢素A的大鼠TLR2和TLR4m RNA和蛋白水平明显升高。而本研究结果则显示,中浓度和高浓度的环孢素A能够抑制Zymosan A激活Dectin-1 m RNA和蛋白水平的表达,低、中、高3种浓度的环孢素A均能下调Zymosan A诱导的TLR2的转录和翻译,且具有一定的剂量依赖性。本实验结果还表明,环孢素A能够抑制Zymosan A诱导的TNF-α的释放,大剂量的环孢素作用尤为明显。由此笔者推测环孢素A能同时抑制Dectin-1/Syk和TLR2/Myd88信号通路,抑制炎症细胞因子TNF-α的分泌。霉酚酸酯是一种具有抗代谢功能及强效免疫抑制功能的霉酚酸半合成物,其有效活性成分为霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)。前期研究发现,霉酚酸酯主要通过抑制T/B淋巴细胞增殖,并减少B淋巴细胞分泌相关抗体发挥强效、选择性的免疫抑制功能[11],而关于霉酚酸酯是否影响机体模式识别功能的文献报道十分罕见。本研究结果表明,与同环孢素作用相似,霉酚酸酯也能够下调正常状态细胞Dectin-1、TLR2的转录和翻译,对Zymosan A诱导的Dectin-1、TLR2 m RNA和蛋白的表达也表现出一定的抑制作用,降低TNF-α的释放水平,从而抑制机体免疫防御机制被激活。

笔者推测霉酚酸酯和环孢素A通过下调激活状态下的模式识别受体Dectin-1和TLR2的转录和翻译,抑制巨噬细胞炎症细胞因子TNF-α的释放,导致机体处于免疫耐受状态,降低机体对真菌病原体的敏感性,无法有效地清除入侵的真菌病原体,这可能是免疫抑制剂霉酚酸酯和环孢素A诱导感染加重,甚至难控性侵袭性真菌感染的发病机制之一。除环孢素A和霉酚酸酯外,其他种类免疫抑制剂诱发真菌感染的发病机制是否与调节Dectin-1和TLR2信号通路的激活相关,尚需要体内外基础实验和临床实验的进一步验证。通过探讨免疫抑制剂在受体识别过程中的重要靶点,揭示免疫抑制剂加重真菌感染的具体发病机制,为将来研究预防和控制免疫抑制患者并发真菌感染的靶向药物,改善临床预后提供一定的理论和实践意义。

参考文献

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肿瘤坏死因子受体1 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料选取我院2012 年2 月~2015 年2 月收治的AS患者64 例, 随机分为对照组和试验组各32 例。 对照组男29 例, 女3 例, 年龄19~27 (23.86±3.63) 岁。 试验组男28 例, 女4 例, 年龄18~27 (23.79±3.61) 岁, 所有患者符合1984 年修订的纽约强直性脊柱炎诊断标准, 脊柱疼痛的视觉评分 (VAS) ≥4, 病情处于活动期, 患者均签署知情同意书。 两组一般资料无显著差异 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法对照组予以重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白 (上海中信国健药业股份有限公司生产) 50mg, 皮下注射, 1 次/w。 试验组在此基础之上结合运动疗法, 包括: (1) 扩胸运动:双手交叉, 与肩平行, 右手抓住左臂, 左手抓住右臂;吐气, 双手用力向前扩展, 感觉胸大肌在用力;保持4s后, 放松;10 次/d。 (2) 腰侧群肌运动:身体侧躺在床上的一叠棉被上, 脚放轻松垂下、双手举高垂下直至感觉到腰的侧面紧绷, 维持半分钟, 坐起, 换另一侧重复, 5 遍/次, 3 次/d。 (3) 猫背运动:如猫状低头、趴跪着, 塌背伸头抬臀、尽量拉伸, 背如弓形般, 使背部充分拉伸、复原, 10 遍/次, 3 次/d。 (4) 侧体运动:左手贴左腰、举右臂贴右耳, 向右侧体, 完成后换另一侧重复, 5 遍/次, 3 次/d。 (5) 小燕飞:双膝、双手支撑于床上, 抬右手向前探的同时最大限度向后踢左腿, 维持10s, 换另一侧, 10 次/d。

1.3 观察指标强直性脊柱炎患者的生活质量调查问卷 (ASQo L) 、强直性脊柱炎疾病活动指数 (BASDAI、ASDAS3) 、毕氏强直性脊柱炎功能指数 (BASFI) 、强直性脊柱炎度量指数 (BASMI) 、扩胸度、脊柱活动度 (Schober) 、红细胞沉降率 (ESR) 、C反应蛋白 (CRP) 。 疗效评定标准采用强直性脊柱炎评估指标 (ASAS20) [4]进行评定, 具体内容包括以下四项:病人的总体评价 (VAS评分) 、脊柱疼痛 (VAS评分) 、功能指数 (BASFI) 、脊柱炎症 (BASDAI后两项的平均值) ;达到强直性脊柱炎疗效评价标准20 反应的患者比例 (ASAS20) , 应界定为: (1) 与初值相比, 以上4 个指标中有3 个改善至少达到20%, 并且绝对分至少有1 分的进步。 (2) 上述指标中未能达到20%改善的一项, 与初诊相比无恶化。

1.4 统计学方法数据采用SPSS 20.0 软件进行分析, 计量资料用表示, 组间比较采用t检验, 计数资料用百分比表示, 组间比较采用 χ2检验, P<0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后各项指标比较治疗后, 试验组所有指标均较治疗前显著改善 (P<0.05) , 而对照组的扩胸度、Schober和BASMI与治疗前没有显著变化 (P >0.05) , 且试验组的改良Schober试验、BASMI、ASQo L以及扩胸度显著优于对照组 (P<0.05) , 见表1。

2.2两组ASAS20有效率比较治疗后, 两组ASAS20有效率没有统计学差异 (P>0.05) , 见表2。

3 讨论

对于AS的治疗在于控制炎症, 减轻或缓解症状, 维持正常姿势和最佳功能位置, 防止畸形, 目前较为有效和得到认可的药物主要是非甾体抗炎药、肿瘤坏死因子 (TNF-α) 拮抗剂等, 而运动治疗作为治疗AS的重要方法之一, 也越来越受到重视。

本研究采用运动疗法联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗AS患者, 与单纯给予重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗进行对比, 结果显示, 治疗后, 采用运动疗法联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗的所有指标均较治疗前显著改善 (P<0.05) , 而单纯给予重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗的扩胸度、Schober和BASMI与治疗前没有显著变化 (P>0.05) , 且采用运动疗法联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗的改良Schober试验、BASMI、ASQo L以及扩胸度显著优于单纯给予重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗者, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;且本研究还对两组患者治疗后的ASAS20 有效率进行了测量和比较, 结果显示, 治疗后, 两组ASAS20 有效率没有统计学差异 (P>0.05) 。 这一结果与魏艳林等[4]的研究结果基本一致, 说明重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对强直性脊柱炎患者的功能指数、活动指数及炎症指标都能起到明显的改善, 达到较好的治疗效果, 这也与很多国内外研究结果不谋而合[5~8];而在重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白的基础上再结合有效的运动疗法进行治疗, 可以显著改善患者的机体功能、胸廓活动度和脊椎活动度, 临床效果更佳。

综上所述, 针对强直性脊柱炎患者, 采用运动疗法联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白治疗可以更有效改善患者的机体功能、胸廓活动度和脊椎活动度, 临床疗效更加。

参考文献

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肿瘤坏死因子受体1 篇3

1 材料与方法

1.1实验动物

100 只8 周龄SPF级雄性Wistar大鼠,体质量200 ~ 220 g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号: SYXK( 京) 2012-0001。于北京中医药大学动物中心严格按照北京中医药大学动物伦理委员会有关实验动物伦理审查和管理规定进行。按照随机的原则将100 只动物分成4 组,其中模型组( AMI group) 40 只,术后成活19 只,死亡21只,成活率为47. 50% ,其中死亡大鼠死亡原因为术中或术后心律失常。给药组( PTX group) 35 只,术后成活15 只。假手术组( Sham group) 15 只。正常组( normal group,N group) 10 只。

1. 2 主要实验设备和仪器

心电图解析系统SP-2006_LAN( 北京软隆生物技术有限公司) ; 自发行为动物检测系统( JLBehv-LAR-1,上海吉量软件科技有限公司) ; 强迫游泳分析系统( Etho Vision XT,Noldus公司,荷兰) 。

1. 3 实验试剂

己酮可可碱( Enzo Life Sciences公司,批号:L 02465) 。

1. 4 心肌梗死动物模型建立

心肌梗死动物模型的建立,对比后参考True-blood的方法［7］并在其基础上予以改进,将Wistar大鼠用10% 的水合氯醛( 0. 4 m L/100g) 麻醉后,仰位固定于手术台上,采用生物信号定量分析系统SP-2006 _LAN( 北京软隆生物技术有限公司) 记录大鼠术前及术后标准体表心电图。正中剃毛,碘酒常规消毒,手术刀正中切开,用止血钳钝性分离肋间肌肉,自左侧4 ~ 5 肋间开胸,暴露心脏,在肺动脉圆锥及左心耳之间,距左冠状动脉起点2 ~ 3mm处,用3 ~ 0 无创缝合线结扎左冠状动脉前降支,立刻将心脏送回胸腔,挤出胸腔内气体,待心率及呼吸平稳后用5 ~ 0 缝合线缝合,假手术组在心脏左冠状动脉左前降支处穿线不接扎,余过程与模型建立相同。正常组不予以任何手术处理。术后模型组及假手术组大鼠肌注青霉素钠注射液80 000 U / 天,共3 天,以防止感染。动物清醒后按常规饲养。模型成功标准为心电图显示Ⅱ导联出现ST段弓背抬高0. 2 m V以上( 见图1、图2) 。假手术组术后ST段的抬高不明显( 见图3、图4) 。术后1 ~7天给药组连续7 天每日上午10 点进行腹腔注射PTX( 0. 2 m L/100g) ,模型组给等体积的生理盐水。

1. 5 行为学观察

1. 5. 1 蔗糖水消耗实验［8］蔗糖水消耗实验于大鼠手术前,手术后2 周进行。本实验是以大鼠蔗糖水摄取量降低作为指标,用于评估大鼠快感缺乏［9-10］。实验前48 小时,训练大鼠适应饮用蔗糖水。同时给予每只大鼠两瓶水: 一瓶为1% 蔗糖水,一瓶为纯净水。大鼠禁食禁水24 小时,而后在安静避光的环境下进行蔗糖水消耗实验。然后每笼分别给予已定量的蔗糖水( 1% 蔗糖水) 和纯净水两瓶液体,60 分钟后取走液体并分别称重。蔗糖水消耗百分比= 蔗糖水消耗量/总液体消耗量 ×100%

1. 5. 2 自发行为实验自发行为实验所用装置为不透明的材料所制成,箱体为正方体,通过箱体所带摄像头来观察大鼠在箱体的运动状态。根据参考文献［11］,本实验于大鼠手术后第2 周进行。实验时将大鼠轻慢置于中心方格内,关闭箱门,观察大鼠在5分钟内的活动总路程,活动总时间和站立次数。

1. 5. 3 强迫游泳实验本实验为行为绝望实验法,其基本原理为当大鼠放置在一个有限的空间使之游泳,观察大鼠在水中的行为,大鼠不动时间越长,表示抑郁程度越高。本实验于手术后30 天进行,参考文献［12-13］将每只大鼠于下午13: 00 在安静状态下分别置于水温24 ~ 25℃,水深30 cm,21 cm × 21 cm× 50 cm的有机玻璃缸中,进行预游泳,每只大鼠游泳时间为15 分钟。24 小时后进行正式游泳实验。同时间,同条件下让每只大鼠强迫游泳5 分钟,并同时使用强迫游泳分析系统( Etho Vision XT,Noldus公司,荷兰) 记录大鼠游泳时间、挣扎时间及不动时间并对指标进行分析。

1. 6 组织学检测

TNF-α,IL-1β 在大鼠血浆内和脑组织内浓度。术后33 天取材。用10% 的水合氯醛( 0. 4 m L/100g)麻醉大鼠,腹主动脉取血4 m L,注入肝素钠离心管并离心,取上清液,- 80℃ 保存; 断颈法处死大鼠,取脑组织,将脑组织于-80℃保存。大鼠腹主动脉取血于用肝素钠采血管内,离心机3000 rpm离心10 分钟,取上清液,大鼠脑组织匀浆。用Rat TNF-α El ISA KIT试剂盒检测( Multi Science) 和Rat IL-1β El ISA KIT试剂盒检测( Multi Science) 。

1. 7 统计学处理

所有数据应用SPSS 20. 0 统计软件包进行分析。数据以均数 ± 标准差( ± s) 表示。数据均服从正态分布,并采用单因素方差分析( one-way ANO-VA) ,两两比较时采用LSD法,P < 0. 05 为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2. 1 各组大鼠蔗糖水消耗实验比较

各组大鼠蔗糖水消耗百分比经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术与正常组相比,大鼠蔗糖水消耗百分比没有明显差异( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠蔗糖水消耗百分比明显减少,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组与模型组相比,PTX组大鼠蔗糖水消耗百分比明显高于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表1。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 2 各组大鼠自发行为实验比较

各组大鼠三项自发行为指标经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术与正常组相比,大鼠的活动总路程,总时间和站立次数差异无统计学意义( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠的活动总路程,总时间和站立次数明显减少,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组和模型组相比,PTX组大鼠的活动总路程,总时间和站立次数明显高于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0.05) 。见表2。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 3 各组大鼠强迫游泳实验比较

各组大鼠强迫游泳三项指标经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术组与正常组相比,大鼠的游泳时间,不动时间和挣扎时间差异无统计学意义( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠游泳时间和挣扎时间明显减少,但不动时间增加,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组与模型组相比,PTX组大鼠的游泳时间和挣扎时间明显高于模型组大鼠,但不动时间明显低于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表3。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 4 各组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度

各组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05 组间两两比较采用LSD法。假手术组与正常组相比,大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度无统计学意义( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度均增加,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组和模型组相比,PTX组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度均低于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表4。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 5 各组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度

各组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术组与正常组相比,大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度无统计学差异( P > 0. 05) 。模型组和假手术组相比,模型组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度均增加,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组和模型组相比,PTX组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度均低于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表5。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

3 讨论

传统中医认为识神是指人的精神意识思维活动,是以人的意志为转移的,大脑的后天活动,本源于大脑却隶属于心,这是由于心主血脉为大脑的识神活动提供了物质基础。目前临床统计表明心血管疾病并发情绪障碍的概率为8% ~ 44%［14］。抗抑郁药对心肌梗死的治疗疗效甚微,因此探求心肌梗死后抑郁相关病理机制尤为重要。目前在急性心梗模型的基础研究中,慢性轻度不可预见性应激抑郁模型是目前较为理想的抑郁动物模型之一［15-16］。根据参考文献,抑郁症动物模型至少应符合3 个标准［17］: ( 1) 表观信度: 例如动物的行为特点看上去是否象人类的抑郁症; ( 2) 内在信度: 引起行为改变的原因和因果关系是否和抑郁症一样; ( 3)预测信度: 对人类有效的抗抑郁药是否能可靠地改变动物的这种行为。本实验结果表明大鼠冠状动脉前降支结扎2 周后,模型组大鼠与正常组和假手术组大鼠相比,蔗糖水偏好显著减少,表明大鼠快感缺乏; 自发行为实验中大鼠的活动总路程、总时间、直立次数均明显减少,表明大鼠的活动度和对外界新鲜环境的好奇度明显下降; 游泳时间和挣扎时间明显减少,不动时间增加,表明大鼠具有绝望行为。以上大鼠产生快感缺乏,活动能力下降,产生绝望行为与抑郁症的核心症状( 心情低落、兴趣缺乏等) 有一定程度的相似性,类似抑郁症患者的症状,因此可以判定大鼠在急性心肌梗死后产生了抑郁行为。

目前心肌梗死后抑郁的发生机制尚未明确,有研究表明,心肌梗死与炎症反应密切相关。心肌局部及全身的炎症反应,影响心肌梗死的病理及预后,并最终导致心肌重塑和疤痕形成。心肌梗死后,由免疫导致的炎症反应,包括补体激活、细胞因子释放、炎症和免疫细胞趋化和浸润,可加重心肌损伤和扩大心肌梗死的范围。前炎症细胞因子的释放与心梗后抑郁的发病病理有关［18-19］。与心肌组织细胞因子浓度升高相平行的是,心梗后脑组织当中细胞因子的浓度也急剧增加［20］。因此本研究可以提出假设在急性心梗使得前炎症细胞因子( 如IL-1β、TNF-α) 被激活并释放入血,随血液循环透过血脑屏障进入脑组织,刺激脑内神经元,小胶质细胞和血管内皮细胞进一步释放前炎症细胞因子如TNF-α 和IL-1β 等,引起脑内炎症从而诱发抑郁的产生。根据上述实验结果,模型组大鼠与假手术组大鼠和正常组大鼠相比,其血浆内和脑内IL-1β 浓度和TNF-α 浓度均明显升高,从而可印证本研究提出的假设。

PTX是甲基黄嘌呤衍生物,是一种非特异性磷酸二酯酶抑制剂,具有抗炎抗纤维化特性,可通过c AMP依赖机制降低促炎细胞因子循环水平,如TNF-α、IL-1β 等［21］。有研究证明PTX可能通过改变促炎细胞因子水平从而衰减抑郁行为。据报道促炎细胞因子可诱发抑郁样行为和细胞凋亡。例如: IL-1β 可提高HPA活性［22］,并且诱发抑郁行为［23-25］,而IL1-β 在抑郁症患者循环浓度升高,且IL-1β 拮抗剂可抑制IL-1β 活性,由此可以认为PTX可减少炎性细胞因子。本实验研究数据表明,PTX可通过抑制炎症因子循环水平而缓解心梗后抑郁的症状,从而印证炎症反应可能是心梗后抑郁发生的可能机制这一猜想。

本研究采用冠状动脉前降支结扎方法建立大鼠急性心肌梗死模型,并通过行为学实验和组织学检测研究表明大鼠在心肌梗死后出现快感缺乏,活动度低下,绝望行为等抑郁行为,且模型组大鼠血浆内和脑内炎症因子IL-1β 和TNF-α 浓度明显升高。并采用PTX予以治疗。结果表明PTX组大鼠与模型组大鼠相比,不但血浆内和脑内炎症因子IL-1β和TNF-α 循环水平浓度降低,且包括蔗糖水偏好显著升高; 活动总路程、总时间、直立次数和直立时间均明显升高,游泳时间和挣扎时间明显升高,不动时间显著减少在内的抑郁行为显著减轻,提示炎症反应可能是心梗后抑郁发生的可能机制。

本实验研究急性心肌梗死后产生的炎症因子通过血液循环进入脑组织从而引起脑内炎症而产生抑郁,但目前研关于炎症因子如何改变血脑屏障通透性的机制仍尚未明确,希望通过建立更详细的实验来研究心梗后抑郁的炎症机制。

摘要：目的 观察心肌梗死后抑郁大鼠行为学及前炎症因子的表达规律,揭示心肌梗死后抑郁发生的机制,为心肌梗死后抑郁的治疗提供药物作用的靶点。方法 采用手术法结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支制作大鼠心肌梗死模型,术后用前炎症细胞抑制剂己酮可可碱腹腔注射进行治疗,采用蔗糖水消耗实验,自发行为实验,强迫游泳实验观察大鼠行为学变化,并检测大鼠血清和脑中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的含量变化。结果 大鼠急性心肌梗死后2周,与假手术组相比,模型组大鼠的蔗糖水消耗量,及活动总路程、站立时间、活动总时间、游泳时间和挣扎时间减少,不动时间增多,炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β均明显增多(P<0.05,或P<0.01)。结论 心肌梗死后大鼠出现活动度下降,快感缺乏,产生绝望行为以及血浆内和脑内炎症因子升高,在使用己酮可可碱后其行为活动度升高及绝望行为减缓,血浆内和脑内炎症因子下降,提示阻断炎症反应过程,可以改善大鼠心肌梗死后的抑郁状态,提示炎症反应可能是心梗后抑郁发生的可能机制。

肿瘤坏死因子受体1 篇4

牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)属于小整合素结合配体N端联接糖蛋白家族(small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein family,SIBLING)[4]。最早在牙本质和骨组织中被发现,近期发现DMP1表达广泛,在颌下腺组织和肿瘤组织中均有表达[5,6]。近期研究发现,DMP1可以通过激活其伴侣基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)降解基底膜的Ⅳ型胶原和黏着连接的组成成分血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin),该过程可能会导致通透性的增高。而近期有研究显示TNF-α可以促进MMP9的表达[7],因而推测TNF-α和DMP1可能在HFRS患者通透性增高过程中发挥联合作用。

本研究的目的是,通过免疫细胞化学技术检测DMP1在HTNV感染的脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的表达情况,以及TNF-α对其表达量的影响。并通过Transwell单层细胞模型系统检测DMP1及TNF-α对HTNV感染的HUVEC通透性的影响。为阐明HFRS发病过程中通透性增高的机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

原代HUVEC购自上海澳赛尔斯公司,采用该公司的内皮细胞完全培养基培养,内含内皮基础培养液,10%的胎牛血清和2%的生长因子添加剂(含表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、环磷酸腺苷、肝素、醋酸氢化可的松、青霉素、链霉素、两性霉素B溶液等)。细胞培养瓶提前用0.25%的明胶(美国Sigma公司)包被以保证细胞能均匀生长。所有实验均保证细胞控制在p3到p5代内使用。非洲绿猴肾细胞(African green monkey kidney cell,VERO)和汉滩病毒国际标准株HTNV 76-118由第四军医大学唐都医院感染科王平忠教授惠赠。采用免疫荧光化学方法鉴定病毒在细胞的复制情况,并采用Reed-Muench法测定病毒滴度。

1.2 间接免疫荧光检测病毒感染情况

VERO细胞在24孔板培养,待细胞融合至50%~60%时弃去培养基,加入HTNV悬液37℃培养2 h后弃去病毒悬液加入新鲜培养基继续培养,病毒感染3 d后采用间接免疫荧光方法进行检测。首先,用4%的多聚甲醛4℃固定20 min,然后采用0.5%的Triton X-100室温通透10 min,5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭30 min,然后加入鼠抗人HTNV 1A8抗体(第四军医大学唐都医院感染科王平忠教授惠赠,1∶1 000稀释)4℃过夜。然后加入羊抗鼠异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,Ig G)(中国北京中杉金桥生物公司)37℃孵育1 h。每一步结束后均用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗3次,每次5 min。最后在荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)上观察。

1.3 免疫细胞化学法检测DMP1在HUVEC的表达

将HUVEC爬片后用HTNV(感染复数=1)感染,3 d后加入TNF-α刺激30 min,PBS冲洗后加入4%的多聚甲醛4℃固定20 min,加入0.5%的Triton X-100室温通透10 min,PBS冲洗3×5 min,除去PBS,每张玻片加50μl内源性过氧化物酶阻断剂,室温下孵育10 min,PBS冲洗3×5 min,除去PBS,每张玻片加入50μl二抗动物非免疫血清,室温下孵育15 min;甩干玻片上的血清,每张盖玻片上滴加鼠抗人DMP1一抗(美国Santa Cruz公司,1∶100稀释)4℃过夜,PBS冲洗3×5 min,除去PBS,每张玻片加50μl生物素标记的羊抗鼠二抗(福州迈新生物技术开发有限公司),37℃放置1 h,PBS冲洗3×5 min;除去PBS,每张玻片滴加50μl链霉素抗生物素过氧化物酶溶液,室温下孵育10 min,PBS冲洗3×5 min;除去PBS,每张玻片滴加一滴新鲜配制的二氨基联苯胺显色液,室温下显色2~10 min,在显微镜下控制染色时间;将染色液冲洗干净,干燥后中性树胶封片,将样品置于显微镜下观察。阴性对照组用PBS代替一抗进行反应。图像半定量分析:显微镜观察,每组随机取15个视野,Image-Pro Plus 6.0分析各视野下平均光密度值(average optical density,AOD)。AOD为阳性目标光密度和阳性面积比(IOD/area),代表待测抗原的量。

1.4 Transwell单层细胞模型系统检测HUVEC的通透性变化

HUVEC接种于基质胶(10μg/ml)包被的Costar Transwell单层细胞模型系统(孔径3μm),HUVEC生长在内皮细胞完全培养基,细胞密度是3×104个;HTNV感染transwell系统中的HUVEC 3 d后,细胞密度接近100%,长成均匀致密单层,HUVEC在内皮基础培养基中饥饿过夜;FITC标记的葡聚糖(FITC-dextran,0.5 mg/ml)加入Transwell的上室,在相应组加入TNF-α(10 ng/ml),DMP1(100 nmol/L),一式3份。反应30 min后,从每个transwell的下室吸取100μl样品,样品中葡聚糖的含量在荧光酶标仪(490 nm处激发,530 nm处发射)中检测,以检测样本中的相对荧光强度来反映TNF-α,DMP1与HTNV对HUVEC通透性的影响。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism 5.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,免疫组织化学AOD值及transwell的相对荧光强度分别用单因素方差分析(one way-ANOVA),两两比较采用LSD检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VERO细胞及原代脐静脉内皮细胞生长状态良好

(见图1)

2.2 HTNV感染的VERO和HUVEC鉴定及病毒滴度测定

HTNV感染72 h后几乎所有的VERO细胞均被感染,HUVEC在HTNV感染72 h后也被感染,阴性对照组均无荧光。Reed-Muench法测定病毒的TCID 50为6.31×106/ml。

2.3 DMP1在HUVEC的表达情况

免疫细胞化学检测显示DMP1可以表达在HUVEC;HTNV感染可以导致其表达的轻微上升;感染细胞加入TNF-α后DMP1的表达量显著升高(P=0.009);单独TNF-α刺激对DMP1的表达量无显著性影响,见图2和表1。

2.4 DMP1、TNF-α对HTNV感染的HUVEC的通透性影响

DMP1和TNF-α均可显著提高HTNV感染的HUVEC的通透性(见图3A,3B),且两者联合作用后,感染HUVEC的通透性进一步增加,与单独作用比较差异有统计学意义(见图3C,3D)。而DMP1,TNF-α单独作用对于通透性的影响明显低于HT-NV感染组(见图3A,3B)。如表2所示,HTNV单独作用并不能提高HUVEC的通透性。

A:生长良好的VERO细胞;B:原代脐静脉内皮细胞;C、D分别是其放大图

确定DMP1可以表达在HTNV感染的HUVEC后,笔者进一步检测DMP1和TNF-α对HTNV感染的HUVEC通透性的影响。结果显示,DMP1和TNF-α均可显著提高HTNV感染的HUVEC的通透性(P=0.000),且两者联合作用后感染HUVEC的通透性进一步增加,与单独作用比较差异有统计学意义(与HTNV+TNF-α组比较,P=0.002,与HT-NV+DMP1组比较,P=0.000)。而DMP1,TNF-α单独作用对于通透性的影响远远低于HTNV感染组分别为(P=0.033和0.000)。HTNV单独作用并不能提高HUVEC的通透性。见图3和表2。

A、B:1)与2)比较,差异无统计学意义;1)与3)比较,通透性显著增加,P<0.05;1)与4)比较;2)与4)比较;3)与4)比较,通透性显著增加,P<0.01;C、D:1)与2)比较,差异无统计学意义;1)与3)比较;1)与4)比较;2)与3)比较;2)与4)比较,均为通透性显著增加,P<0.01;3)与4)比较,通透性显著增加,P<0.01

3 讨论

HTNV的主要靶细胞是血管内皮细胞和单核巨噬细胞,在病毒侵入人体后不久,机体产生细胞和体液免疫应答,参与HFRS的发病过程。TNF-α是主要由单核巨噬细胞和血管内皮细胞等产生的一种调节机体免疫和代谢过程的多功能细胞因子,是机体免疫防御、炎症损伤和休克等发生的重要介质。TNF-α在体内维持一定浓度对机体发挥生理功能有重要作用,但血中浓度过高,则可能会对机体造成损害,已有研究证实,HFRS患者中的TNF-α的水平增高且与疾病进程密切相关[3]。HFRS基本的病理生理改变为全身微血管损伤,通透性增加,而TNF-α又可进一步增加血管的通透性。然而TNF-α引起通透性增高的具体机制鲜有报道。

DMP1是一种非胶原蛋白,近年来发现其表达十分广泛,在肾、脑、肿瘤组织等均有表达[8]。有研究证实,DMP1能通过激活其伴侣MMP9降解基底膜的IV胶原等成分,基底膜是一种特化的细胞外基质,是细胞间物质转移的物理屏障[9]。本文证实,DMP1可以表达在HTNV感染的血管内皮细胞,这说明DMP1可能在HFRS的发病中扮演一定角色。HTNV单独作用于HUVEC并不能引起通透性增高,病毒感染细胞加入TNF-α之后,DMP1的表达量显著增加。DMP1可以活化重组人基质金属蛋白酶前体-9并增强MMP-9酶解活性,通过破坏局部组织结构降解基底膜屏障,改建细胞外基质,使通透性增加[9]。故笔者推测在HFRS的发病过程中,TNF-α通过促进DMP1表达增加促使通透性增高。

进一步的实验证实,DMP1和TNF-α均可使体外HTNV感染的单层血管内皮细胞的通透性增加,且两者联合作用对通透性的增高作用明显高于各自独立作用,差异有统计学意义。TNF-α可以促进血管内皮钙黏蛋白VE-cadherin的磷酸化、内化,并可以促进血管内皮生长因子VEGF和MMP-9的表达[10]。血管内皮钙黏蛋白是内皮细胞间黏着连接的主要成分[11],钙黏蛋白的内化会导致黏着连接的解体,细胞间隙增大,这可能是TNF-α引起通透性增高的一方面原因。另一方面,TNF-α可以促进MMP-9的表达[10],而DMP1可以激活MMP-9,两者可能联合参与了降解基底膜的过程从而使通透性大大增加,实验结果中DMP1和TNF-α的共同作用使HTNV感染的HUVEC通透性增加明显,显著高于单独作用组,也支持这一推断。

综上所述,本文通过免疫细胞化学技术实验证明DMP1可以表达在HTNV感染的HUVEC,且进一步实验证明TNF-α和DMP1在可以促进HTNV感染的血管内皮细胞通透性增加,且两者存在联合作用,该结果为阐明TNF-α引起通透性增高的机制提供实验数据支持,MMP-9在HFRS中的直接作用将在接下来的实验中进行研究。

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肿瘤坏死因子受体1 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料选取我院2014 年1 月~2015 年1 月期间2型糖尿病患者136 例, 纳入标准:符合2 型糖尿病的诊断标准[2], 病程≤3 年, 排除标准:合并糖尿病酮症酸中毒, 高渗状态, 合并感染性疾病, 合并肝肾、甲状腺、垂体、肾上腺疾病, 合并心脑血管疾病, 具有胰岛素和抗氧化药物应用史, 根据颈动脉内膜中层厚度 (IMT) 分组, 其中IMT≤0.9mm的2 型糖尿病患者作为对照组, IMT>0.9mm的2 型糖尿病患者作为研究组。 研究组:66 例, 其中男30 例, 女36 例, 年龄40~75 (59.24±6.01) 岁, 体质量指数 (BMI) 24.92±3.01kg/m2, 对照组:70 例, 其中男31 例, 女39 例, 年龄42~74 (60.18±5.98) 岁, BMI25.12±3.18kg/m2, 两组患者在性别、年龄和体质量指数等一般资料间的比较差异无显著性 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 检测方法 (1) 颈动脉B超检查:采用ACUSON128XP/10 超声诊断仪器, 探头频率8~15Hz, 由两位专业医师操作, 检查部位为颈总动脉及其分叉前后壁, 于颈动脉远端分叉2.5cm处, 舒张末期测定颈总动脉IMT, 取三次测量平均值作为最后结果。 (2) 采用酶联免疫吸附测定 (ELISΑ) 检测细胞间粘附分子1 (ICAM-1) 、肿瘤坏死因子 α (TNF-α) 水平, 清晨空腹采集静脉血液8ml, 血液凝固后4000r/min离心操作10min, 分离血清, 低温-80℃保存待测, 严格按照血清ICAM-1 (南京凯基生物科技公司) 和TNF-α 试剂盒 (安迪生物技术上海有限公司) 说明书操作, 酶标仪 (HT-IR, 日本) 检测OD值, 以OD值为纵坐标, 标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 计算血清ICAM-1、TNF-α 水平。

1.3 统计学分析采用SPSS 18.0 软件包对所得的数据进行统计学分析, 计量资料采用±s表示, 组间比较采用t检验, 计数资料采用率表示, χ2检验, 检验标准 α=0.05, P<0.05 则具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清ICAM-1、TNF-α 水平比较研究组血清ICAM-1、TNF-α 水平明显高于对照组, 两组比较差异具有统计学意义 (P<0.05) 。 见附表。

2.2 血清ICAM-1、TNF-α 与IMT的关系Pearson相关性分析显示, 血清ICAM-1 与颈动脉IMT呈明显的正性相关 (r=0.402, P<0.05) , 血清TNF-α 与颈动脉IMT呈明显的正性相关 (r=0.351, P<0.05) 。

3 讨论

中国糖尿病人群约占总人数9.7%, 其中处于糖尿病前期人群高达15.5%[3]。 心血管疾病是糖尿病的严重并发症, 包括冠心病、高血压和动脉粥样硬化等[4]。动脉内皮损伤是糖尿病合并动脉粥样硬化的重要发病原因。 动脉内皮损伤导致血管内皮细胞表面粘附性改变, 表达粘附因子, 促进单核细胞粘附, 是动脉粥样硬化形成的重要环节[5]。 粘附因子以配体-受体相结合形式发挥作用, 增强细胞间或细胞-基质间的粘附作用, 细胞间粘附因子 (ICAM-1) 是免疫球蛋白超家族成员, 主要表达于平滑肌细胞、 血管内皮细胞和单核细胞表面, 当动脉粥样硬化硬化性病变时, 局部炎症细胞因子释放, 血管内皮细胞激活, 促进ICAM-1 表达[6]。TNF-α 是促炎症细胞因子生成和释放的主要炎症介质之一, 具有激活血小板活化因子和促进前列腺素E的释放, 诱导炎症细胞聚集和粘连, 最终导致微血管扩张, 增强血管通透性。 同时, 血管平滑肌细胞和血管内皮细胞均可分泌TNF-α, 可能与动脉粥样硬化形成和发展具有明显的相关性[7]。

本研究结果显示, 糖尿病合并动脉粥样硬化患者血清ICAM-1、TNF-α 水平显著增加, 且明显高于糖尿病未合并动脉粥样硬化患者, 研究揭示了血清ICAM-1、TNF-α 水平在糖尿病合并动脉粥样硬化患者中呈明显增高倾向, 与相关研究结果具有一致性[8]。 同时, 血清ICAM-1、TNF-α 与颈动脉内膜中层厚度呈明显的正性相关。 颈动脉超声检测颈动脉内膜中层厚度是诊断动脉粥样硬化的主要无创性手段之一, 颈动脉内膜中层厚度 (MIT) 直接反应全身动脉粥样硬化程度[9]。 本研究进一步研究证实, 血清ICAM-1、TNF-α 与MIT呈明显的正性相关。提示血清ICAM-1、TNF-α 增加是糖尿病合并动脉粥样硬化发生和发展的重要危险因素。

综上所述, 血清ICAM-1、TNF-α 水平在糖尿病合并动脉粥样硬化患者中显著增高, 且与动脉粥样硬化程度具有明显的关系。

摘要：选取我院2014年1月2015年1月期间2型糖尿病患者136例, 根据颈动脉内膜中层厚度 (IMT) 分组, 其中IMT>0.9mm的2型糖尿病患者作为研究组, IMT≤0.9mm的2型糖尿病患者作为对照组, 采用ELISA方法测定血清ICAM-1、TNF-α水平, 分析两者与IMT的关系。结果研究组血清ICAM-1、TNF-α水平明显高于对照组, 两组比较差异具有统计学意义 (P<0.05) , Pearson相关性分析显示, 血清ICAM-1与IMT呈明显的正性相关 (r=0.402, P<0.05) , 血清TNF-α与IMT呈明显的正性相关 (r=0.351, P<0.05) 。血清ICAM-1、TNF-α水平在糖尿病合并动脉粥样硬化患者中显著增高, 且与动脉粥样硬化程度具有明显的关系。

关键词：细胞间粘附分子1,肿瘤坏死因子α,糖尿病,动脉粥样硬化

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肿瘤坏死因子受体1 篇6

1材料与方法

1. 1实验动物及分组

健康成年白兔40只,体重1. 8 ~ 2. 5 kg,雌雄不限,重量分布均一。采用随机数字表法分为4组,即拔伸松动手法组、注射透明质酸钠组、模型组,正常组。4组经治疗和观察6周后,拔伸松动手法组与注射透明质酸钠组各有2只实验兔死亡,与随机选取的模型组与正常组各8只实验兔进行相关指标检测。

1. 2治疗方法

拔伸松动手法组,以拔伸松动手法治疗兔右膝,专人操作,手法、操作步骤及时间固定。手法为按揉法、拔伸松动法; 取穴膝眼、血海、鹤顶、阳陵泉、阴陵泉、足三里、委中,家兔的取穴方法按《实验针灸学》［2］严格取穴。先按揉以上所取诸穴,20秒/ 穴,再施以拔伸松动手法: ( 1) 拔伸法施以患膝10秒后放松; ( 2) 徐徐拔伸患膝,在拔伸下分别以小鱼际固定于膝关节下缘之内侧和外侧,向对侧推按5次( 外侧向内侧,内侧向外侧) ; ( 3) 五指提拿髌骨10次,顺时针和逆时针活动髌骨5次,再上下左右推动髌骨; ( 4) 屈伸患膝关节30次; ( 5) 拔伸患膝10秒,在拔伸过程中作膝关节小幅度内旋和外旋运动。手法治疗每天一次,治疗十天后休息一天,共治疗6周。

注射透明质酸钠组,关节腔内注射透明质酸钠( 山东正大福瑞达公司生产,国药准字H10960136, 产品批号: 2012-01-09 ) 。规格2 ml ∶ 20 mg,按0. 15 ml / kg,每周注射1次,共治疗6周。

模型组,正常组仅给饲料,喂养6周。

1. 3观测指标

测定膝关节液中IL-1β、TNF-α 含量。采用IL- 1β 及TNF-α 试剂盒。 检测按照IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒酶标仪说明书操作。膝关节液采集施行膝关节穿刺,证实刺入关节腔后,注入0. 9% 的生理盐水0. 5 ml,反复回抽、注入3次后,再尽量抽出腔内液体。回收量0. 4 ~ 0. 6 ml,平均0. 5 ml。采集的膝关节冲洗液按说明采用双抗体夹心( ELISA) 法测定。

1. 4统计学处理

数据采用SPSS 17. 0软件进行分析,关节液中IL-1β、TNF-α 浓度水平采用均数 ± 标准差( ± s) 表示,每个指标数据用单因素方差分析做整体分析, 用LSD-t做两两比较。

2结果

4组白兔试验后膝关节液中IL-1β、TNF-α 浓度数据详见表1。

其中各组IL-1β 浓度平均数值为模型组> 正常组> 注射透明质酸钠组> 拔伸松动手法组,统计学上通过方差分析,F = 8. 833,P = 0. 000,P < 0. 05,表明四组兔膝关节液中IL-1β 浓度不全相等。用LSD-t进行两两比较分析,得出正常组与模型组比较P = 0. 001,拔伸松动手法组与模型组比较P = 0. 000,注射透明质酸组与模型组比较P = 0. 001,表明拔伸松动手法组、正常组、注射透明质酸组与模型组差异皆有统计学意义。拔伸松动手法组与正常组比较P = 0. 289,拔伸松动手法组与注射透明质酸组比较P = 0. 575,正常组与注射透明质酸组比较P = 0. 668,表明这三组之间两两比较差异无统计学意义。

各组TNF-α 浓度平均数值为模型组> 拔伸松动手法组> 注射透明质酸钠组> 正常组,统计学上通过方差分析,F = 11. 488,P = 0. 000,P < 0. 05,表明四组兔膝关节液中TNF-α 浓度不全相等。用LSD-t进行两两比较分析,得出正常组与模型组比较P = 0. 000,拔伸松动手法组与模型组比较P = 0. 001,注射透明质酸组与模型组比较P = 0. 000,表明拔伸松动手法组、正常组、注射透明质酸组与模型组差异皆有统计学意义。拔伸松动手法组与正常组比较P = 0. 151,拔伸松动手法组与注射透明质酸组比较P = 0. 230,正常组与注射透明质酸组比较P = 0. 891,表明这三组之间两两比较差异无统计学意义。

说明通过拔伸松动手法治疗和注射透明质酸钠治疗,都能降低膝关节关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度,且两组差异没有统计学意义。表明拔伸松动手法也是一种治疗膝关节骨性关节炎的有效治疗手段。

3讨论

膝关节骨性关节炎是由于关节滑膜退变,软骨破坏引起的以膝关节疼痛、僵硬和活动受限为特征的慢性骨关节病,其中关节软骨退变是OA发病的最直接原因,研究表明膝关节骨性关节炎的发病主要与生物力学因素、生物化学因素、遗传因素、炎症性因素等有关。近年来发现细胞因子IL-1β、TNF-α 是参与骨关节炎进程的重要介质,是炎症反应的重要调节剂,是调节炎症的始动因素,是骨关节炎病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子［3-4］。Hung等［5］将重组人IL- 1β 注入兔膝关节,发现滑膜内有大量白细胞浸润, 滑膜细胞增生,滑膜肥厚,并有关节软骨蛋白多糖合成下降。TNF-α 在关节炎( 包括OA) 的发生过程中对关节软骨起着重要的破坏作用。TNF-α 和IL-1的生物学作用相似,但其生物学活性比IL-1约低100倍,在OA的发病中与IL-lβ 起着协同作用,动物模型研究也表明关节软骨的破坏主要是由IL-1β 激发的,并且在早期和TNF-α 是密切相关的［6-7］。

中医药治疗膝关节骨性关节炎有独特的优势, 其中推拿手法治疗本病的研究已取得可喜的进展。 近年来的研究证实: 手法的作用和关节被动运动可促进滑液向关节软骨的浸透和扩散,改善组织的营养代谢,有助于改善关节周围的血液循环,降低骨内压,促进关节周围组织的自身修复,改善关节软骨的营养和关节的润滑,并能减轻软骨的退变,还可增加股四头肌之肌力,改善关节的活动度［8-9］。 拔伸松动法为云南中医学院第一附属医院推拿科治疗膝关节骨性关节炎的经验手法,该手法将理筋手法与关节松动手法有机结合,包括拔伸下侧向推按法、髌骨松动法、拔伸下微旋法和屈伸法四步,临床研究中发现: 该手法能明显改善膝骨性关节炎患者关节活动度,缓解疼痛［10］。课题组在前期的实验研究中亦发现,拔伸松动法能明显改善兔膝骨性关节模型的关节活动度,修复退变的软骨组织［11］。

本课题将关节腔内注射透明质酸钠设为对照组,研究结果表明: 治疗后拔伸松动手法组关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度与正常兔膝关节液中的浓度无显著差异,较模型组中兔膝关节液中的浓度低; 拔伸松动手法组和注射透明质酸钠组,均能降低膝关节关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度,两组差异没有统计学意义。说明拔伸松动手法可能通过降低兔膝骨性关节炎关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度, 达到抑制膝骨性关节炎软骨基质降解和关节软骨破坏的目的,对软骨损伤的修复有利。

摘要：目的 研究拔伸松动手法对膝骨性关节炎兔膝关节液中白细胞介素1β(interleukin 1beta,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的影响。方法 采用随机数字表法分为4组,即为拔伸松动手法组、注射透明质酸钠组、模型组,正常组。拔伸松动手法组手法治疗,每天一次,治疗十天后休息一天,共治疗6周;注射透明质酸钠组注射治疗,每周一次,共治疗6周;模型组正常喂养、正常组给正常喂养。结果 治疗后各组关节液中IL-1β浓度平均数值为模型组>正常组>注射透明质酸钠组>拔伸松动手法组;TNF-α浓度平均数值为模型组>拔伸松动手法组>注射透明质酸钠组>正常组。用方差分析及LSD-t进行两两比较分析显示,拔伸松动手法组、正常组、注射透明质酸钠组两个指标与模型组比较均为P<0.05,差异有统计学意义;拔伸松动手法组、注射透明质酸钠组、正常组之间两两比较比较,两个指标均为P>0.05,差异无统计学意义。结论 拔伸松动手法和注射透明质酸钠,均能降低膝骨性关节炎兔关节液中IL-1β、TNF-α的浓度,但两种方法之间不能认为有差异。拔伸松动手法可能通过降低膝骨性关节炎兔关节液中的IL-1β、TNF-α浓度,从而抑制膝骨性关节炎软骨基质降解和关节软骨破坏,对软骨损伤的修复有利。

肿瘤坏死因子受体1 篇7

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

实验动物:40只成熟的健康成年新西兰白兔,雌雄均半,体重2.5～3.5 kg,由我院实验动物学部提供。实验主要药品:羊抗兔IL-1β、TNF-α单克隆抗体免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),单克隆抗体IL-1β、TNF-α抗体(R&D Systems)。

1.2 动物模型的制备

将新西兰白兔后膝关节局部脱毛,氯丙嗪1 mg/kg肌内注射,氯胺酮5 mg/kg肌内注射全身麻醉。麻醉成功后,仰卧固定于操作台,常规消毒、铺巾。取膝前内侧切口,依次切开皮肤、皮下筋膜组织,暴露膝关节。按改良Hulth模型法切断膝前交叉韧带、内侧副韧带,切除内侧半月板。冲洗关节腔,缝合皮下筋膜和皮肤。术后饲养于实验动物中心,单笼单只饲养,环境温度20～25℃,湿度50%～60%。青霉素20万U/kg肌内注射,每日1次,连续5 d,每日检查石膏固定情况,并及时进行修复。

1.3 动物分组与治疗方法

造模后2周,把右膝关节设为磁场治疗组(n=20),每日给予低频脉冲磁场治疗,磁场强度30 mW/cm2,频率1.0 MHz,频宽200μs,重复频率1.0 KHz,每次15 min。左膝关节为对照组(n=20),给予假磁场治疗(治疗过程同低频脉冲磁场组,磁场治疗仪不开机,探头无能量输出,为假治疗)。

1.4 膝关节活动度评价

处死动物后用量角器测量每只兔子的实验侧膝关节的被动活动度。

1.5 IL-1β和TNF-α表达检测

分别于动物模型制备治疗后1、4周深麻醉处死兔。制软骨细胞匀浆,留取上清后用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α含量。

1.6 Outerbridge评分

处死实验动物后大体观察关节液的变化,根据手术显微镜观察所见,采用Outerbridge软骨损伤评分方法进行评分。

1.7 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据统计学处理,计量资料以均数±标准差表示,重复测量的计量资料采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-1β和TNF-α表达变化比较

在同一观察时间点,两组的IL-1β和TNF-α表达量均有差异,治疗组均明显少于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 两组Outerbridge积分比较

在同一观察时间点,治疗组软骨损伤程度较对照组轻微,Outerbridge积分也少于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

2.3 两组关节活动度比较

在同一观察时间点,治疗组的关节活动度均明显大于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

3 讨论

骨关节炎是一种多发于中老年人的慢性进行性骨关节病,属增龄性疾病,其主要病变是关节软骨的破坏及关节边缘的骨赘形成,其致病因素多种多样,除年龄外,肥胖、超负荷运动、遗传、环境、饮食、性别等都可能是发病因素[5]。现代生物医学研究则表明细胞因子、生长因子、免疫因素等都与膝骨关节炎的发生有关[6]。骨性关节炎动物模型较多,分为自发性模型和实验性或诱发性模型,笔者采用改良Hulth骨性关节炎模型,手术切断膝关节前交叉韧带、内侧副韧带并切除内侧半月板,通过改变关节正常的力学轴线促发关节软骨变性,能很好模拟软骨损伤的终末环节,更适用于晚期骨性关节炎的研究[7]。

目前,对于骨关节炎的治疗方法较多,大体可分为手术治疗和非手术治疗。非手术治疗包括合理的休息与功能锻炼、药物治疗、物理治疗、运动疗法、注射疗法以及中医治疗等。物理治疗是指应用各种物理因子来预防和治疗疾病[8]。已有研究证实,低频脉冲在一定频率和电流下,可促进组织重排,细胞软化,激发细胞分化,促进组织新生。脉冲微波同时还有杀菌作用,对局部细菌和真菌性炎症由于吸收的浓度不同,产生不同的杀伤作用,协助抗生素的抗感染作用。同时磁场的振动产生涡电流进入组织,这些电流会产生神经轴突的去极化,并向近端和远端方向输送传递性的神经冲动。而当磁场作用于生物体时,可影响体内电子运动方向和带电离子的分布及浓度、细胞膜电位、神经的兴奋和抑制,并可使细胞膜通透性增强,加速细胞内外物质交换。磁场作用于人体,可以扩张局部血管,促进血液循环和营养物质供应,同时降低了血液黏度,改善血液流变学特性,减弱致痛物质活性和瘀滞,从而缓解疼痛。

本研究通过对各组动物关节活动度与Outerbridge积分检测结果的分析,发现随着时间的延长,治疗组的关节活动度都在不同程度的增大,主效应都是比较明显的,直接提高了受损膝关节的关节活动范围,使得关节腔内炎性积液得以较快吸收消散,使其在关节局部的含量减低。同时Outerbridge积分也逐渐降低,从而加快关节软骨的新陈代谢,间接地提高了关节局部的抗氧化能力[9]。

IL-1β、TNF-α是一种重要的促炎症因子,具有广泛的生物学效应。研究表明,膝关节损伤缺血后IL-1β、TNF-α的释放可促进骨关节实质内白细胞的浸润,进而加重炎症反应;同时,IL-1β、TNF-α能促进IL-2、IL-6、IL-8等细胞因子的合成;此外,IL-1β还可以激活释放细胞因子、自由基等参与炎症反应[10]。本文结果显示,在同一观察时间点,两组的IL-1β和TNF-α表达量都有所差异,治疗组均明显少于对照组(均P<0.05),表明低频脉冲磁场对能有效缓解IL-1β、TNF-α的刺激释放。不过动物模型不能完全模拟人体骨性关节炎的自然病理过程,低频脉冲磁场对人体骨性关节炎的治疗效果仍需进一步的临床试验验证。

总之,低频脉冲磁场治疗骨性关节炎具有简便易行,安全无创等优点,可有效遏制IL-1β、TNF-α的释放,调节分泌作用,从而对骨性关节炎软骨损伤修复具有促进作用。

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