趋化因子受体

趋化因子受体（共7篇）

趋化因子受体 篇1

趋化因子受体(Chemokine receptor)属于鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)耦联的7次跨膜蛋白受体家族。根据结合配体的不同,趋化因子受体可分为4类:1)CXC趋化因子受体(CX-CR);2)CC趋化因子受体(CCR);3)CX3C趋化因子受体(CX3CR);4)XC趋化因子受体(XCR)[1]。趋化因子与趋化因子受体结合在某种程度上促进了各种炎症性疾病以及各种自身免疫性疾病的发生和发展。因此,通过抑制趋化因子及其受体结合可以在一定程度上抑制相关疾病的发生[2],这为趋化因子受体5(CCR5)颉颃剂的开发提供了理论依据。

CCR5是细胞内β趋化因子RANTES、MIP-1α、MIP-1β的受体,具有调控T细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫功能,主要于记忆性的静止期T淋巴细胞、单核细胞、未成熟的树突状细胞等的细胞膜上表达。因此,CCR5多与炎症反应,且与免疫缺陷性疾病有关。随着对其不断的了解,CCR5已被证实作为辅助受体参与艾滋病病毒(HIV-1)入侵机体免疫细胞的过程[3,4],为研究CCR5与病毒病的关系提供了模型。研究发现,CCR5还参与糖尿病并发症、风湿性关节炎、免疫排斥反应、肿瘤、癌(如食管上皮癌、乳腺癌等)、阿尔茨海默病(AD)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等各种疾病的发生[2,5,6,7,8,9,10,11,12]。姜培娟等[13]研究显示,CD4+T细胞上CCR3、CCR5和CXCR3的表达异常可能在自然流产的发病中起作用。朱莉等[14]认为,人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中CCR5参与β淀粉样蛋白(Aβ)引起的T淋巴细胞的跨内皮迁移。

CCR5正逐渐成为人们的研究热点,但有关猪CCR5的研究则很少。王艳伟[15]研究显示,猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)能够诱发产生大量RAN-TES,说明CCR5可能在猪呼吸与繁殖综合征(PRRS)疾病中发挥作用。因此,试验选取猪CCR5基因作为研究对象,利用PCR、DNA重组等技术克隆CCR5,不仅有助于研究猪CCR5分子结构与生物学功能,而且可以在此基础上进一步研究CCR5颉颃剂抵抗病毒传染的特性,为治疗PRRS寻找新的先导化合物。

1 材料

1.1 质粒、菌株及组织

真核表达载体p Easy-T3和pc DNA3.1、大肠杆菌DH5α感受态细胞,均由扬州大学兽医学院保存;新鲜猪肉,市购。

1.2 主要试剂及仪器

DNA提取试剂盒,北京全式金生物科技有限公司生产;T4 DNA连接酶、XbaⅠ内切酶、HindⅢ内切酶,美国Promega公司生产;Axy Prep质粒小提试剂盒、Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒,杭州Axygen公司生产;电热压力蒸汽消毒器(型号为2000W),上海华线医用核子仪器有限公司生产;电泳仪(型号为EPS-300)、凝胶成像仪(型号为Tanon-2500),北京天能公司生产;台式高速离心机(型号为5810R),Themo公司生产;PCR仪(型号为AB-2720),Applied Bios公司生产;隔水式恒温培养箱(型号为GNP-9160BS-Ⅲ),北京新苗有限公司生产;超净台(型号为SW-CJ-1F),苏州净化有限公司生产。

2 方法

2.1 引物设计

根据NCBI递交的猪CCR5基因序列(Gen Bank号为AB119272.1),编码CCR5蛋白的CDS序列为连续的外显子,全长为1 059 bp。引物序列:上游引物5'-CCCAAGCTTATGGATTATCAAACGACGAGTC CCTTC-3',下游引物5'-GCTCTAGAGCCAGGTCA-CAAGCCGACAGAGATTTC-3'。“AAGCTT”为HindⅢ酶切位点,“GGATCC”为XbaⅠ酶切位点,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2 猪CCR5基因的扩增及回收

按照DNA提取试剂盒的方法提取猪基因组DNA,并以其为模板,进行PCR扩增。反应条件:95℃2 min;95℃1 min,56℃1 min,72℃90 s,共35个循环;72℃10 min。产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。按照凝胶回收试剂盒说明书进行纯化、回收,做好标记后于-20℃保存,备用。

2.3 CCR5-T3载体的构建

连接体系:取回收的CCR5基因4.0μL,p EasyT3载体1.0μL,置于37℃水浴15 min。连接产物按照p Easy-T3试剂盒方法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于含2μL/m L氨苄青霉素(Amp)的LB平板上,倒置于37℃培养箱中过夜培养。

2.3.1 CCR5-p Easy-T3重组质粒的提取

从LB平板上挑取单个菌落分别接种于含Amp的LB液体5.0 m L试管中,37℃、220 r/min振荡培养约14 h,然后按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒,做好标记后于-20℃保存,备用。

2.3.2 猪CCR5基因的回收

酶切体系(20μL):灭菌dd H2O 7.8μL,RE Buffer 2.0μL,胎牛血清(BSA)0.2μL,CCR5-T3 8.0μL,HindⅢ1.0μL,XbaⅠ1.0μL。37℃水浴3.5 h,用1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。按照凝胶回收试剂盒说明书进行纯化、回收,做好标记后于-20℃保存,备用。

2.4 CCR5-pc DNA3.1(+)载体的构建

2.4.1 CCR5基因与pc DNA3.1(+)载体的连接

连接体系(20μL):dd H2O 2.0μL,5×T4 Buffer4.0μL,pc DNA3.1(+)2.0μL,CCR5基因10.0μL,T4 DNA连接酶2.0μL。16℃水浴过夜,次日转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于含Amp的LB平板上,倒置于37℃培养箱中过夜培养。

2.4.2 CCR5-pc DNA3.1(+)重组质粒的提取

从LB平板上挑取4个单个菌落分别接种于5 m L LB液体试管中(已加Amp 10μL),37℃、220 r/min振荡培养约14 h至液体浑浊,然后按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒,并进行下一步鉴定。

2.4.3 CCR5-pc DNA3.1(+)的鉴定

双酶切鉴定体系(20μL):dd H2O 7.8μL,RE Buffer 2.0μL,BSA0.2μL,CCR5-pc DNA3.1(+)8.0μL,HindⅢ1.0μL,XbaⅠ1.0μL。37℃水浴3.5 h后,进行1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。

PCR鉴定体系(50μL):dd H2O 18.0μL,T3-载体4.0μL,Sen P 2.0μL,Ant P 2.0μL,Mix 24.0μL。进行1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶成像仪(型号为Tanon-2500)拍照记录。

基因测序鉴定:经PCR和双酶切鉴定均为阳性的CCR5-pc DNA3.1(+)送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

3 结果与分析

3.1 CCR5基因的PCR扩增(结果见图1)

由图1可知,猪CCR5基因的PCR扩增产物泳带大小与预期片段大小(1 059 bp)相符,结果表明,扩增片段正确,可以进行回收试验。

3.2 猪CCR5-p EASY-T3的酶切(结果见图2)

由图2可知,试验构建的CCR5-p EASY-T3样品经双酶切出现3 000 bp和1 000 bp以上2个条带,泳带大小与预期的CCR5(1 036 bp)和p EASY-T3载体(3 036 bp)相符,结果表明,CCR5基因已成功连接到p EASY-T3载体上。

3.3 CCR5-pc DNA3.1(+)的鉴定(结果见图3、图4)

由图3可知,试验构建的CCR5-pc DNA3.1(+)样品经过双酶切出现5 000 bp和1 000 bp以上2个泳带,与预期的pc DNA3.1(+)质粒(5 428 bp)和CCR5(1 036 bp)大小相符,初步判定CCR5-pc D-NA 3.1(+)真核表达载体构建成功。

由图4可知,CCR5-pc DNA3.1(+)样品经过PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳出现1 000 bp以上的泳带,与预期的CCR5(1 036 bp)大小相符,初步判定真核表达载体CCR5-pc DNA 3.1(+)构建成功。

根据英潍捷基(上海)贸易有限公司返回的测序结果,经DNA Star,Editseq和Megalign软件分析,结果显示,所构建的目的基因序列与NCBI数据库序列完全相同,认为猪CCR5基因真核表达载体CCR5-pc DNA3.1(+)构建成功。

4 讨论

CCR5作为G蛋白耦联因子超家族(GPCR)成员的细胞膜蛋白,是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,因此利用颉颃竞争的方法使CCR5颉颃剂成为阻断HIV-1感染细胞的途径[16],可使被感染的细胞数目大大减少。除了作为HIV-1早期侵染所必需的辅助受体外,还具有调控T细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫的功能。张远浩[17]研究显示,CCR5还对增长期同种异体移植存活率具有重要作用,CCR5颉颃剂还可以有效治疗一些临床疾病,包括器官移植、哮喘[18]、风湿性关节炎、多发性硬化症与糖尿病等。

王东霞等[19]研究发现,IFN-α作为一类很好的免疫调节、抗病毒生物制剂,不同剂量在一定范围内会对细胞CCR5的表达有显著影响,这为临床治疗相关疾病提供新的依据和途径。卫艳萍等[20]利用双黄连、黄芩等药物实现了对人CCR5的调控。

试验利用分子生物学手段成功克隆了猪CCR5目的基因,并构建了猪真核表达载体CCR5-pc D-NA3.1(+),不仅有助于猪CCR5分子结构与生物学功能的研究,还可以在此基础上为进一步研究利用CCR5颉颃剂抵抗病毒传染的特性奠定基础,有利于研发新的抗病毒药物。

趋化因子受体 篇2

关键词：乳腺癌,CXCR4,免疫组织化学,表达

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤,是女性癌症相关死亡的主要原因。女性乳腺癌在我国的发病率不断上升,且有年轻化的趋势。目前乳腺癌的诊断、治疗都取得了重大的进展,但仍有约42%的患者因复发、转移而死亡。研究表明趋化因子及其受体在乳腺癌的进展、转移过程中起关键作用[1,2]。本研究通过应用免疫组化方法,研究趋化因子受体4(chemokine receptor,CXCR4)在乳腺癌中的表达及其临床意义。

1材料与方法

1.1材料收集于2011年9月至2014年9月手术切除并经病理科确诊的乳腺癌标本65例。年龄35~71岁,平均年龄53.6岁;绝经与否:未绝经35例,绝经30例;雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progestrone receptor,PR)阳性43例,阴性22例;淋巴结转移42例,未转移23例:按TNM分期:Ⅰ-Ⅱ期23例、Ⅲ-Ⅳ期42例。所有患者术前均未行放化疗。另取25例正常乳腺组织标本作对照研究。所有患者均知情同意参与本研究,并签署知情同意书。

1.2试剂CXCR4多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司,MaxV ision TM试剂盒购于福州迈新生物有限公司。

1.3方法脱蜡后的石蜡切片行SP(streptavidin-perosidase)免疫组化法染色,阳性对照采用已知阳性片为标准,阴性对照采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗为标准,其余步骤相同。

1.4结果判断CXCR4主要表达于细胞膜,以棕黄色表达为阳性。以细胞染色强度及阳性细胞的百分比分别计分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫组化阳性,否则为免疫组化阴性。

1.5统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据统计分析,计数资料以率表示,采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

CXCR4主要在细胞膜表达,CXCR4在65例乳腺癌患者中的阳性表达率为75.4%(49/65),在25例正常对照组中无表达,二者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。CXCR4的阳性表达与患者年龄、绝经与否ER、PR是否阳性无关(P>0.05),与患者的TNM分期、淋巴结是否转移有关(P<0.05)。见表1。

3讨论

趋化因子是小分子细胞因子家族蛋白的一种,与其受体结合后,才能发挥作用。趋化因子及其受体结构的不同,从而决定了其生物学活性的不同。研究表明在细胞的生长、分化过程中趋化因子发挥至关重要作用。CX-CR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1(chemokine stromal cell derived factor-1,CXCL12)的特异受体之一。CXCL12通过与CXCR4结合后能使细胞发生强烈的趋化运动。研究发现CXCR4在多种肿瘤组织中高表达,且肿瘤细胞的增殖、侵袭受CXCL12/CXCR4轴的调节[3],在正常组织中CXCR4不表达。本研究发现乳腺癌组织中CXCR4的阳性表达率达75.4%(49/65),而在正常乳腺组织中未见表达。肿瘤的转移、复发是肿瘤的重要生物学特性,也是影响患者预后的重要因素。研究发现在人乳腺癌细胞系中CXCR4明显高表达,而CXCL12在乳腺癌最常见的转移部位也高表达,并且CXCL12可调节乳腺癌细胞的迁移,利用siRNA阻断CXCR4的表达后,可明显抑制乳腺癌向局部淋巴结、肝脏、肺的转移[4]。有研究表明,乳腺癌临床分期与CXCR4阳性表达率呈正相关,即乳腺癌分期越晚,CXCR4阳性表达越显著[5]。本研究中CXCR4的表达与患者的TNM分期及淋巴结是否转移有一定关系。乳腺癌治疗取得重大进展,患者常常因发生复发或远处转移而遭受痛苦。若发现一种能更准确判断患者预后的新标志物,必定会对乳腺患者的治疗做出巨大贡献。CXCR4在乳腺癌组织中高表达,并且其高表达与乳腺癌的侵袭、转移密切相关,监测乳腺癌患者的CXCR4阳性表达率,并阻断CXCL12/CXCR4轴有望成为判断乳腺癌预后及靶向治疗研究的新方向。

参考文献

[1]吴唯,钱立元,戴荆,等.乳腺癌组织中趋化因子CXCL12及其受体CXCR4、CXCR7的表达及临床意义[J].中国普通外科杂志,2015,24(11):1577-1582.

[2]周玉丽,徐金锋,刘莹莹.趋化因子CCL5及其受体CCR5在乳腺癌中作用的研究进展[J].肿瘤,2015,35(8):920-925.

[3]王振,杨德林,辛明明,等.CXCL12/CXCR4生物学轴与膀胱肿瘤关系的研究进展[J].医学综述,2012,18(6):843-846.

[4]崔立群,王晓蕊,姜忠敏,等.CXCL12诱导乳腺癌细胞CXCR4表达并促进癌细胞骨转移[J].肿瘤,2013,32(6):497-501.

趋化因子受体 篇3

关键词：CXCR4,基因,CXCL12,基因,克隆,真核表达载体

趋化因子系统指的是一些小分子炎症因子及其受体，参与调节感染、炎症以及组织修复相关的免疫反应，并且可以在胚胎形成阶段调控多种细胞的迁移。目前已经发现50多种趋化因子和19种趋化因子受体。CXCR4是一个由353个氨基酸构成的视紫红质样GPCR。目前认为基质衍生因子 (stroma-derived factor1, SDF-1) ，亦称CXCL12，是该受体的唯一配体[1]。基质细胞衍生因子-1 (stromal cell-derived factor1, SDF-1) 及其趋化因子受体 (CXCR4) 作为一个α趋化因子家族的新成员，在调节造血过程中发挥重要的作用。近来研究表明SDF-1/CXCR4不仅具有趋化作用，而且是造血干/祖细胞和白血病细胞的生长因子;又有研究表明，SDF-1/CXCR4作为T淋巴细胞的共刺激分子，通过免疫调节作用，参与局部抗炎症及抗肿瘤[2,3,4,5];有研究表明，人的CXCR4为HIV病毒的辅助受体[6,7]。因此，随着对SDF-1/CXCR4研究的不断发展，人们愈来愈关注其在多种生物学效应中的重要作用。本试验中克隆了猪CXCL12和CXCR4基因，并构建其真核表达载体，为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株、载体与组织

大肠杆菌DH5a、表达载体pc DNA3.1/V5HisA均由山东农业大学细胞免疫学实验室保存。杜洛克猪脾脏由山东农业大学姜运良老师惠赠。

1.1.2 主要试剂

T4 DNA连接酶、EcoRI和Bam HⅠ酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂购自TakaRa大连宝生物公司。Trizol试剂、Easy TapDNA聚合酶购自TRANSGEN公司。胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生物工程公司。

1.1.3 引物

应用DNASTAR基因分析软件，参照GenBank发表的CXCL12基因和CXCR4基因序列设计2对引物，对编码区核苷酸序列分析后，将其全长c DNA删除终止密码子，并且在上游中加入Bam HⅠ酶切位点，下游引物中加入EcoRⅠ酶切位点，引物由上海生工合成。

CXCR4上游引物：CGGGATCCATGGACGGGTTCCG TATATT，下游引物：CGGAATTCGCTGGAGTGAAAAC TCG;CXCL12上游引物：CGGGATCCATGGGTGTCAAGG TCC，下游引物：CGGAATTCGCTCCTGCTGGTGATG。

1.2 试验方法

1.2.1 组织RNA的提取

用Trizol法提取总RNA。向100mg剪碎的脾脏组织中加入1ml Trizol, 用移液器反复吹吸, 室温孵育5min, 加氯仿0.2ml, 剧烈振荡混匀后室温放置5min。12 000r/min4℃离心15min吸取上层水相, 移置另一离心管, 加入0.5ml异丙醇, 颠倒混匀, 室温静置10min, 4℃, 12 000r/min离心15min, 弃上层液相。加冰冻75%乙醇1ml, 充分洗涤沉淀, 4℃12 000r/min离心10min。弃上清, 置空气中干燥 (15～20min) , 沉淀溶于无Rnase的DEPC水中, 立即进行反转录, 或置-80℃冰箱中保存。

1.2.2 RT-PCR

各取2μg的RNA用AMV反转录酶反转录成猪CXCL12和CXCR4的cDNA, 并以此为模板, 进行PCR扩增CXCL12和CXCR4基因。反应体系:10×buffer 2.5μl, Mg CL2 2.0μl, 2.5mmol/L dNTP0.5μl, 引物各0.5μl, 5U/μl Taq酶0.2μl, ddH2O18.3μl, 模板0.5μl, 计25μl反应体系。扩增条件:94℃预变性10min, 94℃30s变性, 58℃30s退火, 72℃1min延伸;循环30次;最后72℃延伸10min。PCR扩增产物电泳后, 回收目的片段。

1.2.3 pc DNA3.1-CXCL12和pc DNA3.1-CXCR4重组质粒的构建与鉴定

用Bam HⅠ和EcoRⅠ分别酶切pc DNA3.1/V5His A和CXCL12、CXCR4基因片段，DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将回收片段按目的基因和载体浓度3:1，反应体系10μl，在T4连接酶作用下4℃连接12h，转化DH5α感受态菌。经氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆菌落，摇菌提取质粒，进行Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定酶切鉴定正确的克隆送上海生工进行DNA测序，将完全正确的质粒分别命名为pc DNA3.1-CXCL12和pc DNA3.1-CXCR4。

2 结果

2.1 CXCL12、CXCR4基因的RT-PCR扩增

从杜洛克猪脾提取细胞总RNA，然后分别利用特异引物进行RT-PCR技术扩增产物，取PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以Marker DL2000为对照，可见在500～750 bp有1条特异性亮带，与预期的364bp和1075bp相符(图1、2)。

M:M:DL 2000 PLUS DNA Marker 1:CXCL12

M:DL 2000 PLUS DNA Marker 2:CXCR4

M:DL 2000 PLUS DNA Marker 1:重组质粒pcDNA3.1-CXCL12经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切2:重组质粒pcDNA3.1-CXCR4经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切

2.2 重组质粒pc DNA3.1-CXCL12和pc DNA3.1-CXCR4的构建与鉴定

重组质粒pc DNA3.1-CXCL12和pc DNA-CXCR4经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切后，出现2条片段，即354bp和1065bp，酶切片段大小与预期值相符 (图3) 。DNA测序结果亦显示，已成功将CXCL12、CXCR4基因片段插入pc DNA3.1/V5HisA质粒中，其中CXCR4编码序列与GenBank的猪CXCL12基因的序列有一个碱基的差异，第24位由A变为G，但氨基酸没有改变。

3 讨论

近年来研究表明CXCL12、CXCR4反应轴在机体的生理和病理过程中发挥了重要的作用，不仅在免疫细胞、造血细胞的迁移及归巢中发挥重要的调节作用，而且参与神经系统的发育、血管发生、组织损伤修复和再生等[8]。

CXCL12是一种炎症趋化因子，CXCR4是其特异性受体。趋化因子是一类能够吸引免疫细胞到特定部位的细胞因子，在免疫调节和免疫病理反应中发挥重要作用。趋化因子CXCL12可调控DC在淋巴结或炎症部位的迁移。CXCR4 Th1/Th2两者共同表达CXCR4, CXCR4配基-CXC L12/SD1表达的下调可能是CD4、CD25调节性T细胞动员至外周血的重要机制。

本试验中利用分子生物学手段成功克隆了猪CXCL12、CXCR4全长基因，并构建了猪CXCL12、CXCR4的真核表达载体，为进一步研究其相互作用及其在猪免疫应答中的作用奠定了基础。

参考文献

[1]李昂, 杨谨, 来宝长等.人乳头瘤病毒18型L12E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应[J].细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20 (6) :760–763.

[2]Horuk R.Chemokine receptors.Cytokine and Growth Factor Reviews, 2001, 12 (4) :313-335.

[3]Muller A, Homey B, Soto H, et al.Involvement of chemokine receptors in breast metastasis cancer.Nature, 2001, 410 (6824) :50-56.

[4]Scotton C J, Wilson J L, Scott K, et al.Human ovarian cancer:Multiple actions of the chemokine CXCL12on epithelial tumor cells in human ovarian cancer.Cancer Res, 2002, 62 (20) :5930~5938.

[5]Hideshima T, Chauhan D, Hayashi T, etal.Biological sequelae ofstromal cell-derived factor-1αin multiple myeloma.Mol Cancer Ther, 2002, 1 (7) :539-544.

[6]FengY, Broder CC, Kennedy PE, etal.HIV-1entry cofactor;Founctio-nal cDNA cloning of a seven transmembrane.G protein-coupled receptor[J].Science, 1996, 272 (526) ;872-877.

[7]Nagasawa T, Tachibana K, Kawabate K.A CXC chemokine SDF-1/PBSE:a ligand for a HIV receptor, CXCR4[J].Adv Immunol, 1999, 71:211-228.

趋化因子受体 篇4

趋化因子是一类能趋化细胞定向移动的小分子分泌蛋白,包括CXC、CC、C和CX3C 4个亚型。趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的G蛋白偶连受体,通常表达于免疫细胞及内皮细胞。大量研究显示: 趋化因子及其受体在清除病原体、炎症反应、创伤修复及免疫排斥等多种病理生理过程中发挥重要作用[3]。CXCR2是CXC型趋化因子受体之一,能够与多个CXC型趋化因子结合,是CX-C型趋化因子促血管生成的主要功能受体[4]。近年来大量研究证实CXCR2参与肺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的侵袭及转移过程[5,6,7,8],但其是否参与HNSCC的侵袭转移机制目前仍不清楚。本课题旨在明确CXCR2与HNSCC侵袭转移的关系并探讨其可能机制。

1材料与方法

1.1主要试剂

人颊部鳞癌细胞株KB、下咽癌细胞株Fa Du、喉鳞癌细胞株Hep-2及Phenix细胞均为我院实验中心留存; SABC免疫组化及免疫荧光染色试剂盒( 福州迈新) ; Matrigel胶、DMEM培养液( Gibco) ; FBS( 胎牛血清,HYCLONE) ; 感受态大肠杆菌DH5α( 北京天根) ; 鼠抗人CXCR2单克隆抗体( PROTEIN TECH) 。

1.2临床病例

课题中HNSCC标本均来自于2010-01 ~ 20012-12南昌大学第一附属医院住院病例,共计105例。其中: 口腔癌57例,下咽癌17例,喉癌31例; 男性74例,女性31例; 年龄最大78岁,最小27岁,平均年龄53. 4岁; 经病理证实存在颈部淋巴结转移的58例,无颈淋巴结转移的47例。

1.3免疫组化及细胞免疫荧光染色

免疫组织化学及细胞免疫荧光染色分别采用SABC免疫组化检测试剂盒,具体操作严格遵循试剂盒使用说明操作。PBS代替一抗作为空白对照。着色细胞超过10% 的标本视为CXCR2表达阳性。

1.4细胞培养

KB、Fa Du及Hep-2细胞在37 ℃ 、5% CO2、饱和湿度条件下,以含有10% FBS、100 U/ml青霉素和0. 1 mg / ml链霉素的DMEM培养液培养,细胞生长至约90% 汇合时,0. 25% 胰酶消化传代。

1.5CXCR2基因敲除稳定转染细胞株的建立

1. 5. 1CXCR2 siRNA的设计及合成根据CXCR2基因序列( NC_000002. 11) ,应用Ambion生物技术公司提供的siRNA设计软件设计靶向沉默CXCR-2基因的siRNA序列,由上海生工合成。CXCR2 siRNA: 正义链,5'-GGGGCAACAATACAGCAAACTAGCCTACGTAGCG-TCAGTTTGCTGTATTGTTGCCCCCTTTTTG-3';反义链,5'-AATTCAAAAAGGGGGCAACAATACAG-CAAACTGACGCTACG TAGGCTAGTTTGCTGTATTGTTGCCCC-3'。另外设计1对不针对任何基因的无关序列作为阴性对照: 正义链,5'-TCGAGCACATTTCAAAC GTAGTAGAAGAG2TACTGCTACTA CGTTTGAATGTGT TTTT-3'; 反义链,5'-CTA2GAAAAACACATTTCAAACG TAGTAGCAG TACTCTTCTACTACG2TTTGAAATGTGC-3'。

1. 5. 2重组逆转录病毒载体的构建将设计的单链引物退火形成双链,再将其与Sal I、Xba I酶切的p B-ABE / U6 / Neomycin回收片段 连接,p BABE-CXCR2 shRNA连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,培养克隆,提取质粒后酶切鉴定。

1. 5. 3重组逆转录病毒载体的包装及感染靶细胞取10 μg p BABE-CXCR2 shRNA质粒,氯化钙法转染Phenix细胞,48 h后收集病毒上清。将KB、Hep-2及Fa Du细胞制成细胞悬液,按5 × 105/ 孔接种于6孔板, 24 h后观察细胞约70% 汇合,病毒上清感染细胞,24 h后更换培养液,48 h后加入G418( 新霉素) 进行筛选; 1周后收集细胞提取蛋白,Western Blot验证沉默效率。感染后细胞分别标记为: KB Control、KB CXCR2i、 Hep-2 Control、Hep-2 CXCR2i、Fa Du Control和Fa Du CXCR2i。

1. 6 Western Blot

收集细胞,提取蛋白后依次经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、一抗及二抗孵育、化学增强发光系统 ( ECL) 显色。设GAPDH为内参。

1.7划痕试验

收集对数生长期的细胞,按1. 0 × 106/ 孔种植于6孔板; 约90% 汇合时,以10 μl枪头作划痕,PBS轻洗3次以去除脱落细胞; 再以5% FBS的DMEM培养48 h后观察结果并拍照。

1.8细胞体外侵袭试验

细胞体外侵袭试验采用Transwell法,具体方法如下所述。Matrigel 4 ℃ 溶胶过夜,并预冷枪头; 将液化之Matrigel与无血清DMEM按1∶5稀释,吸取50 μl稀释液铺于24孔板之Transwell小室( 上室) ,37 ℃ 孵育4 h后以无血清DMEM水化上室内凝胶30 min; 收集细胞后以无 血清DMEM洗涤3次; 以5% FBS的DMEM制成浓度为5 × 105/ ml的细胞悬液,Transwell上室中加200 μl细胞悬液; 下室中加20% FBS的DMEM 600 μl,培养48 h后从小室取出各组Transwell,拭净小室上面的细胞及Matrigel,PBS轻洗2次, 4% 多聚甲醛固定10 min,1% 结晶紫染色30 min; 镜下观察及拍照,10倍物镜下任选5个视野,计数穿膜细胞。

1.9统计分析

实验数据以± s表示,组间比较用SPSS 13. 0进行t检验,P≤0. 05为具有统计学意义。

2结果

2.1免疫组化染色

105例HNSCC中有54例CXCR2表达阳性,阳性率为51. 43% ( 图1) ; 合并颈部淋巴结转移的58例中,有39例呈阳性表达,阳性率为67. 24% ; 在无转移组,CXCR2阳性率为31. 91% ; 颈淋巴结转移组与无转移组之间存在统计学差异( P < 0. 05) 。

A: 舌癌; B: 下咽癌; C: 喉癌 1 CXCR2 在 HNSCC 中的表达 ( SABC,× 200) A: Tongue cancer; B: Hypopharyngeal cancer; C: Laryngeal cancer Fig 1 Expression of CXCR2 in HNSCC ( SABC, × 200)

2.2免疫荧光染色

免疫荧光细胞化学染色显示: 在体外培养的3种HNSCC细胞株中存在CXCR2的表达,但表达强度稍有差别; CXCR2主要表达于细胞膜和细胞质( 图2) , 呈绿色( 染蓝色者为细胞核) ; 3种细胞中KB细胞表达最强,Hep-2和Fa Du细胞稍弱。

2.3CXCR2基因沉默稳定表达细胞株的建立

本研究采用构建逆转录病毒载体后转染靶细胞, 以建立CXCR2基因沉默的HNSCC稳定表达细胞株。 经抗性筛选后,Western Blot检测验证沉默效率。结果显示: 设计的siRNA序列沉默效率满意,3种细胞中, Fa Du细胞敲除效果最佳( 图3) 。

A: KB 细胞; B: Hep-2 细胞; C: Fa Du 细胞 2 CXCR2 在 HNSCC 细胞株中的表达 ( 荧光显微镜,× 400) A: KB; B: Hep-2; C: Fa Du Fig 2 Expression of CXCR2 in HNSCC cell lines ( Fluoresence microscope, × 400)

2.4划痕试验

划痕试验结果显示: CXCR2基因沉默后,3种细胞的迁移能力均受到一定程度的抑制,其中,Fa Du的抑制效果最为明显( 图4) 。

2.5细胞侵袭试验

明确了CXCR2基因沉默可显著抑制HNSCC细胞的体外迁移能力后,我们又采用了Transwell法观察CXCR2基因沉默对HNSCC细胞侵袭能力的影响,结果显示: KB、Hep-2和Fa Du 3种细胞的侵袭能力均不同程度的受到抑制,CXCR2沉默细胞与对照组细胞之间存在统计学差异( P < 0. 05) ( 图5A ~ G) 。3种细胞中,Fa Du细胞侵袭能力的抑制最为明显。

3讨论

趋化因子( Chemokines) 是一类趋化细胞定向运动的小分子分泌蛋白,由70 ~ 100个氨基酸组成。在趋化因子的分子中都有4个保守的半胱氨酸( C) 。根据靠近分子氨基端的前2个C间是否插入其它氨基酸,将它们分为4个亚型 : CXC型、CC型、CX3C型和C型。趋化因子受体是一类通过与趋化因子相结合,介导趋化因子行使功能的G蛋白偶联受体,通常表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上[9]。趋化因子及其受体在免疫系统功能行使中居于关键地位,在病原体的清除、炎症反应、病原体感染、细胞及器官的发育、创伤的修复、移植免疫排斥以及肿瘤的形成及其侵袭转移等病理生理过程中都起着重要作用[10,11]。CXC型趋化因子本质上是一种肝素结合蛋白,与血管形成密切相关。在CXC型趋化因子成员中,CXCL1、CXCL2、 CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7和CXCL8均具有促进新生血管形成的活性,而CXCR-2正是这几种趋化因子的共用受体[12]。鉴于血管形成是肿瘤发生、发展及侵袭转移过程中的重要分子事件,CXCR2近年来成为研究恶性肿瘤侵袭转移机制的重要靶点。

图4 CXCR2 基因沉默对 HNSCC 细胞体外迁移能力的影响 ( × 100) Fig 4 Effect of CXCR2 silencing on HNSCC cell migration in vitro ( × 100)

图5 CXCR2 基因沉默对 HNSCC 细胞体外侵袭能力的影响 ( × 100) Fig 5 Effect of CXCR2 silencing on HNSCC cell invasion in vitro ( × 100)

CXCR2基因于1991年被Murphy等克隆成功,定位于染色体2q35,属G蛋白偶联受体家族成员,为只含1条肽链的糖蛋白,长约350个氨基酸,具有7个富含疏水氨基酸的跨膜区结构[13]。CXCR2主要表达于内皮细胞、T细胞、单核细胞、黑色素瘤细胞及中性粒细胞等细胞表面。CXCR2可激活许多细胞内信号传导通路,导致一些转录因子的活化,比如NF-κB,而NF-κB的持续活化又可促进内源性的趋化因子及其受体的表达,从而导致肿瘤血管生成因子及凋亡抑制因子表达增加[14]。而CXCR2参与肿瘤侵袭转移的研究近年来日益增多,如: Singh等发现敲除CX-CR1 /CXCR2的A375-SM人黑素瘤细胞在体内的增殖能力减弱,迁移力和侵袭力明显下降[15]。Saintigny等发现在肺腺癌中,CXCR2能够促进肿瘤的侵袭和转移,其表达水平与肿瘤的预后密切相关[16]。而Lee等报道CXCR2及其配体CXCL8 ( 即白介素8 ) 能够在肿瘤微环境中促进结肠癌的生长、发展和转移[17]。

相对于在肺癌、结肠癌等肿瘤中的深入研究,CXCR2在HNSCC中的作用还没有得到广泛重视。在外文文献中仅Romanini等报道: CXCR2可能参与口腔鳞癌的增殖 及凋亡机 制,应用其选 择性抑制 剂SB225002可明显抑制口腔鳞癌细胞的增殖,并促进其凋亡[18]。国内仅有徐文华等报道在口腔鳞癌中存在CXCR2的表达,其表达水平与肿瘤的临床分期及淋巴结转移相关,并认为CXCR2可作为评估口腔肿瘤生物学特性和预后的参考指标[19]。本研究中发现: CXCR2在包括口腔癌在内的HNSCC中亦存在表达,阳性率为51. 43% ,稍低于徐文华等所报道的61. 4% ,但在合并颈部淋巴结转移的病例中,CXCR2的阳性率则上升到67. 24% ,明显高于 无颈部淋 巴结转移 的病例 ( 31. 91% ) ; 此结果与徐文华等的研究结果基本一致。 在明确CXCR2与HNSCC的颈淋巴结转移存在相关性后,我们进一步通过免疫荧光染色的方法检测了CXCR2在多种HNSCC细胞株中的表达情况,结果显示: 在KB、Hep-2及Fa Du等3种HNSCC细胞株中均不同程度地存在CXCR2的表达。因此我们认为应用该3种细胞株,并采用RNAi技术沉默CXCR2的表达以观察在HNSCC侵袭转移机制中的作用是可行的。在成功建立CXCR2基因沉默的HNSCC稳转株后,我们分别进行了划痕试验及细胞侵袭试验,结果显示: CXCR2基因沉默后的3种细胞的迁移和侵袭能力均受到显著抑制。据此结果,我们认为: CXCR2在HNSCC的侵袭转移机制中同样发挥了重要作用。

鉴于本课题的研究仍然仅限于细胞水平,结果仍有待于通过进一步的深入研究进行验证; 但结合国内外的大量文献及研究成果,我们仍然有理由期望,随着研究的深入,CXCR2将成为头颈部鳞癌侵袭转移机制研究及预防和治疗的新靶点。

摘要：目的:观察及探讨趋化因子受体CXCR2在头颈部鳞癌(HNSCC)侵袭转移过程中的作用机制。方法:免疫组化检测105例HNSCC中CXCR2的表达水平,分析CXCR2表达与颈淋巴结转移的相关性;用RNAi技术,建立CXCR2基因沉默稳定表达的HNSCC细胞株,体外细胞迁移及侵袭试验观察CXCR2基因沉默对细胞迁移及侵袭能力的影响。结果:CXCR2在HNSCC中的阳性表达率为51.43%;其中,颈部淋巴结转移组为67.24%,无颈部淋巴结转移组为31.91%(P<0.05)。划痕试验及体外侵袭试验结果显示:CXCR2基因沉默的HNSCC细胞株体外迁移及侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论:CXCR2可能在HNSCC的侵袭转移机制中发挥重要作用。

趋化因子受体 篇5

1 资料和方法

1.1 研究对象

20例进行期寻常型银屑病进行期患者,系我院皮肤科门诊2007年3~12月就诊患者,均经临床与组织病理确诊,其中男性12例,女性8例,男女比例3∶2,年龄15~62岁,平均(33.12±12.23)岁,病程2月~15年,平均病程(5.15±3.45)年;10例对照,均为无器质性疾病的正常人皮肤,平均(31.26±6.36)岁。银屑病患者的皮损面积和严重程度按PASI评分为7.38~14.36,平均(10.71±0.42)。所有患者近3个月内未系统服用维A酸、类固醇激素、免疫抑制剂等药物,4周内未使用任何外用药物。另取10例正常人皮肤及外周血做为对照组,均为健康献血者,无免疫性疾病及系统性疾病,无银屑病家族史。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

对符合入选标准的患者和正常人详细记录病史资料,签署知情同意书,5 mm环钻孔器取皮损及正常人皮肤组织液氮速冻保存用于总RNA提取,同时抽取静脉血15 mL肝素抗凝,加入等量无菌的PBS稀释混匀,将稀释血液轻轻加入含淋巴细胞分离液的离心管中,血液与淋巴细胞分离液的比例为2∶1。18℃,2 000 r/min,离心20 min,吸取白膜层置另一干燥离心管中,PBS稀释混匀,4℃,2000 r/min,离心10min,连续3次。最后,将分离PBMC细胞冻存于-80℃用于总RNA提取。

1.2.2 RNA的提取

1×107 PBMC或约50 mg组织放入研钵中加入液氮冰上研碎,直至研磨成浆状,加入1 mL Trizol,室温孵育5 min,加入200μL氯仿,剧烈振荡混匀20 s,冰上5 min。4℃13 000 r/min离心15 min,取上清液至新的Eppendorf管,加异丙醇500μL,颠倒混匀,室温放置10 min;4℃13 000r/min离心10 min,弃上清液,保留沉淀;75%乙醇洗涤沉淀2次,4℃7 500 r/min离心5 min,弃乙醇,空气或真空干燥5~10 min,加DEPC处理水溶解RNA,-80℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR

取3μL RNA模板按逆转录试剂盒说明书逆转录为c DNA,进行PCR反应,引物序列:CXCR3(278b):上游引物5'-TGGCCGAGAAAGC AGGG-3',下游引物5'-AGGCGCAAGAGCAGCATC-3';β-actin(530 bp):5'-GCACCACACCTTCTACAA TGAGC-3',下游序列为5'-GGATAGCACAGCCTG GATAGCAAC-3'。扩增条件:94℃预变性5 min,然后94℃变性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸2 min,32个循环,最后72℃延伸10 min。取10μL PCR产物电泳,用数码凝胶影像分析系统作条带密度扫描。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。比较采用t检验(方差齐性时)或校正t检验(方差不齐时)。各组间线性相关性分析采用Earson's积差法。P<0.05被认为有统计学意义。各实验独立重复3次。

2 结果

2.1 CXCR3 mRNA在进行期寻常型银屑病患者皮损中的表达及其和PASI的相关性分析

正常皮肤CXCR3 mRNA表达相对含量为(0.51±0.10);进行期寻常型银屑病皮损CXCR3m RNA表达相对含量最低值为(1.44±0.72)。寻常型银屑病皮损CXCR3 mRNA相对含量高于正常皮肤中的相对含量,经统计学分析显示,F=46.836,P=0.000,差异有统计学意义(图1)。寻常型银屑病皮损CXCR3 mRNA的表达和PASI用直线相关性分析,结果显示:寻常型银屑病皮损组织CXCR3 mRNA表达与PASI之间呈正相关,r=0.663,P<0.05.(图2)

2.2 CXCR3 mRNA在寻常型银屑病患者PBMC中的表达及其和PASI的相关性分析

在正常人PBMC中,CXCR3 mRNA表达相对含量最低值为(0.45±0.09);寻常型银屑病PBMC中CXCR3 mRNA表达相对含量最低值为(1.49±0.10)。寻常型银屑病PBMC中CXCR3 mRNA表达相对含量高于在正常人PBMC的相对含量,经统计学分析显示,F=55.768,P=0.000,差异有统计学意义(图3,4)。寻常型银屑病PBMC中CXCR3 mRNA的表达和PASI的相关性分析用直线相关性分析,结果显示:寻常型银屑病PBMC中CXCR3 mRNA的表达与PASI呈正相关,r=0.466,P<0.05(图4)。

3 讨论

趋化因子是一类在免疫细胞募集过程中发挥关键作用的蛋白质超家族,相对分子质量为8~10Kda,由中性粒细胞、单核细胞等多种细胞分泌产生[3]。根据趋化因子结构上半胱氨酸残基的排列基序,可将趋化因子分为CXC、CC、C及CX3C共4个亚家族。趋化因子通过与靶细胞表面的特异性受体结合,趋化免疫细胞向高浓度刺激物方向定向运动,可造成局部免疫反应的发生。因此,趋化因子对机体免疫系统的调节作用受趋化因子受体的影响和调控。趋化因子受体是具有7次跨膜结构的G蛋白相偶联受体,其信号转导取G蛋白偶联受体介导的途径[4]。根据对趋化因子特异性的不同,相应的趋化因子受体也分为CXCR,CCR,XCR及CX3CR 4型。CXCR3为CXC型趋化因子干扰素诱导的单核因子(Mig)、干扰素诱导蛋白10(IP-10)和干扰素诱导的T细胞α化学趋化因子(I-TAC)的特异性受体[5]。CXCR3选择性的高表达在活化的淋巴细胞上,在静止期的淋巴细胞以及粒细胞上基本不表达[6]。CX-CR3与其配体结合后能诱导活化的效应细胞向特定组织迁移,尤其是到达某些炎症部位,从而在炎症性皮肤病T细胞浸润和聚集中发挥重要作用[7,8]。

皮损局部浸润的淋巴细胞及其产生的细胞因子IL-2,IFN-γ和TNF-α均可诱导角质形成细胞异常增殖活化并分泌IP-10和Mig,从而吸引更多的活化T细胞到皮损中,形成T细胞介导的恶性循环。银屑病皮损部位真皮乳头顶部存在密集的巨噬细胞及T细胞聚集,GOEBELER[9]等的研究显示,趋化因子Mig mRNA在银屑病皮损部位真皮上部高表达,并在真皮乳头顶端呈簇分布。与T细胞的浸润模式相一致,Mig具有活化及趋化T细胞的特性,推测真皮乳头顶端是T细胞外渗继而移入表皮的首选部位。T细胞在进入局部皮损后,仍要进一步活化聚集于局部的T细胞,释放细胞因子,影响表皮的活性状态。同时,T细胞也可被局部微环境的作用而进一步激活,从而导致炎症网络的逐级放大。IP-10是LUSTER等[10]在研究IFN-γ诱发的免疫应答时从U937细胞中克隆到的,其调节细胞信号传导的唯一受体是CXCR3,因其表达由IFN-γ诱导,故被认为是Thl活动标志。SON[11]等人的研究发现,在活动期斑块型银屑病的角质形成细胞和真皮浸润细胞可测到IP-IO,经有效治疗后IP-10表达减少。在体外,角质形成细胞和真皮血管内皮细胞用TNF-a和IFN-γ刺激后,IP-10和Mig mRNA表达均上调,提示这两种细胞是IP-10和Mig的来源[12,13]。Mig和IP-10的特异性受体为CXCR3,CXCR3主要表达于Th1细胞亚群,这与银屑病皮损部位浸润的主要T细胞亚群相一致。有报道,CXCR3在银屑病皮损部位皮肤中升高,主要表达于真皮CD4+T淋巴细胞[14,15]。提示IP-10或MIG/CXCR3信号途径可能参与活化T细胞移向银屑病皮肤,且参与其后T细胞定居在表皮的过程。

本研究结果显示,寻常型银屑病患者皮损内以及外周血单个核细胞CXCR3水平明显高于健康对照组,且与与PASI呈正相关,同文献报道结果基本一致[16]。这些结果提示,CXCR3可能参与了银屑病的发病过程,其表达水平与银屑病的病情严重程度有一定相关性。研究表明,通过阻断趋化因子受体可以阻断效应细胞向靶细胞的定向迁移[17]。银屑病患者皮损处及外周血淋巴细胞CXCR3 mRNA和CX-CR3蛋白的表达均显著升高,提示CXCR3可作为银屑病患者治疗的靶目标。

摘要：目的 研究寻常型银屑病患者皮损及外周血单一核细胞(PBMC)中趋化因子受体CXCR3 mRNA的表达及其临床意义。方法 RT-PCR法测定20例银屑病患者皮损和10例健康正常人皮肤及其PBMC中CXCR3 mRNA的表达;直线相关性分析方法 分析银屑病患者皮损及PBMC中CXCR3的表达水平与银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)之间的关系。结果 银屑病患者皮损及PBMC中CXCR3 mRNA表达相对含量分别为(1.44±0.72)和(1.49±0.10),正常人皮肤及PBMC中CXCR3 mRNA相对含量为(0.51±0.10)和(0.45±0.09)。经统计学分析,银屑病皮损及外周血PBMC中CXCR3的mRNA表达明显高于正常对照组,差异有显著性(P<0.05);银屑病患者CXCR3 mRNA的表达水平与PASI呈正相关(P<0.05)。结论 趋化性因子受体CXCR3可能参与了在银屑病的发病过程。

趋化因子受体 篇6

1 材料与方法

1.1 一般资料

免疫组化方法选择我院耳鼻喉科2009年10月～2011年9月喉鳞癌切除后存档的蜡块,共70例,患者年龄为34～76岁,平均(56.7±6.7)岁,其中男60例,女10例;RT-PCR方法选择2010年7月～2011年9月喉鳞癌切除后的新鲜组织,共30例,患者年龄为36～72岁,平均(55.9±6.2)岁,其中男25例,女5例。以上临床资料均完整,患者术前未接受放化疗。收集10例癌旁正常喉黏膜的新鲜组织做为对照组,一部分石蜡包埋用于免疫组化,另一部分置于灭菌的锡箔纸内,投入液氮罐内,随后放入深低温(-86℃)冰箱中保存,用于RT-PCR技术实验用。

1.2 免疫组织化学方法

CXCR4和MMP-13均以兔抗人多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限责任公司)。实验严格按照试剂盒说明书操作。结果均由两位病理主治医师共同阅片得出。CXCR4和MMP-13蛋白均以细胞浆呈有棕黄色颗粒为阳性,每张切片观察5个具有代表性的高倍镜视野,根据染色部位的染色强度和染色细胞百分率进行评分:基本不着色为0分,着色淡者为1分,着色深者为2分;着色细胞占计数细胞百分率<5%为0分,5%～25%为1分,26%～50%为2分,>50%为3分。将每张切片的着色强度得分和着色细胞百分率得分相乘,为其最后得分。0～1分为阴性(-),≥2分为阳性。

1.3 RT-PCR方法

采用Trizol试剂提取总RNA,引物设计应用primer 5.0软件,序列及合成的产物大小为:CXCR4上游:5′-CGGAA TTCCAGCAGGTAGCAAAGTGACG-3′,下游:5′-GACGCCAAC ATAGACCACCT-3′;扩增长度为561 bp;MMP-13上游:5′-GACTTCACGATGGCATTGCTG-3′,下游:5′-GCATCAACCT-GCTGAGGATGC-3′;扩增长度为491 bp;以GAPDH为内参对照。反应体系均为94℃3 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃90 s 35个循环,72℃5 min;产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,照相并分析。

1.4 统计学方法

应用SAS 6.12进行数据的分析,计量资料数据以均数±标准差表示,比较采用t检验,计数资料采用百分率表示,组间对比采用χ2检验,并进行线性相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 CXCR4及MMP-13在喉鳞癌与正常黏膜中的表达

由表1可见,CXCR4及MMP-13在喉鳞癌中表达的阳性率明显高于正常黏膜组织。CXCR4和MMP-13在喉鳞状细胞癌中表达于肿瘤细胞的细胞质及细胞膜,呈阳性或强阳性,而在正常喉黏膜上皮细胞中呈弱阳性或阴性,见图1～4。

2.1.2 喉鳞癌中CXCR4及MMP-13在不同临床病理特征的表达

由表2可见,喉鳞癌CXCR4蛋白的表达与肿瘤的分期、分化程度及淋巴结转移有关,喉鳞癌MMP-13蛋白的表达与肿瘤的分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05),CXCR4及MMP-13均与年龄和性别无关。

2.1.3 喉鳞癌中CXCR4及MMP-13蛋白表达的相关性分析

对喉鳞癌中CXCR4及MMP-13蛋白的表达进行相关性分析,结果显示二者呈正相关(r=0.45,P=0.012 5)。

2.2 RT-PCR结果

2.2.1 CXCR4与MMP-13在喉鳞癌组与正常黏膜组中mRNA的表达

CXCR4为(1.25±0.28)、(0.55±0.19),鳞癌组与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05);喉鳞癌组与正常黏膜组中MMP-13 mRNA的表达分别为(1.10±0.21)、(0.04±0.01),差异有统计学意义(P<0.05)。CXCR4及MMP-13在喉鳞癌和正常黏膜中mRNA表达情况经逆转录PCR扩增条带结果,见图5～6。

2.2.2 喉鳞癌中CXCR4和MMP-13 mRNA在不同临床病理特征中的表达

喉鳞癌CXCR4和MMP-13 mRNA的表达量与肿瘤的分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05)。见表3。

2.2.3 喉鳞癌中CXCR4及MMP-13 mRNA表达的关系

经线性相关分析,喉鳞癌中CXCR4及MMP-13 mRNA的表达呈正相关(r=0.42,P=0.027 5)。

3 讨论

肿瘤的生长与扩散是重要的生物学行为,而蔓延与远处转移是恶性肿瘤细胞和细胞外基质成分共同参与的一个复杂而有序的过程,细胞外基质的降解及肿瘤细胞的转移是必不可少的过程。CXCR4是一类表达于不同细胞上含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体,SDF-1是CXCR4的唯一配体,研究显示某些肿瘤组织CXCR4有着过量的表达,控制白细胞对肿瘤的浸润,调节肿瘤血管生成,激活宿主对肿瘤细胞的特异性免疫应答,以自分泌或旁分泌的方式刺激肿瘤细胞的增殖,通过SDF-1/CXCR4反应轴控制肿瘤细胞迁徙和靶器官特异性表达[4]。SDF-1/CXCR4生物学轴的活动表现为细胞内储备钙的调动及MAPK(丝裂原结合蛋白酶)的活化,伴其下游信号分子的磷酸化[5]。肿瘤发生发展是一个多步骤、多基因调控的复杂过程,癌细胞从原发病灶脱落后,需突破细胞外基质和基底膜组成的结构屏障,才能向周围组织侵袭或进入脉管中,引发转移[6,7],在此过程中,起作用的有基质金属蛋白酶家族。CXCR4在肿瘤发展过程中可以引起MMPs的磷酸化,使肿瘤细胞分泌更多的MMPs。MMP-13是基质金属蛋白酶家庭的重要成员,是1994年首先从人类乳腺癌细胞中分离出来的,在MMPs激活过程中起关键作用,可激活其他亚型的MMPs,在肿瘤侵袭和转移中具有重要作用[8,9]。如MMP-13在激活其他MMP的过程中还具有催化自身的作用,可促进活性MMP-9的产生,在此过程中MMP-13处于中心地位[10],MMP-13水平的微小改变或活性的增强,都可能放大整个下游的蛋白分解作用,从而降解细胞外基质和基底膜对组织产生破坏。

本实验通过采用免疫组织化学方法和RT-PCR方法检测喉鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织中CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表达,免疫组织化学检测结果显示CXCR4及MMP-13在喉鳞癌组织中的蛋白表达率分别为71.43%和74.29%,明显高于正常黏膜组(P<0.01)。结果还表明,CXCR4蛋白表达水平与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关,MMP-13蛋白表达水平与肿瘤分化程度及淋巴结转移有关,但与肿瘤分期无关,本研究结果的出现可能与病例选择或例数较少有关。二者蛋白表达均与肿瘤的分化程度及淋巴结转移密切相关(P<0.05),与患者年龄、性别无关,提示CXCR4和MMP-13可能在喉癌的形成和发展过程中有一定的作用,与喉癌淋巴结的侵袭和转移有关。并通过Rt-PCR结果显示,CXCR4和MMP-13在喉癌组织中mRNA表达明显高于癌旁正常黏膜(P<0.05),在分化程度及淋巴结转移中表达水平有统计学意义(P<0.05),这一结果与免疫组化结果相一致,由于分化程度与淋巴结转移均与患者的预后相关,因此CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA可能有助于判断患者的预后,即CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA高表达患者的预后差,进而通过检测两者的表达来预测喉癌的早期转移和复发。

本研究还通过对CXCR4和MMP-13蛋白的表达进行相关性分析,二者呈正相关(r=0.45,P=0.012 5),同时,CX-CR4和MMP-13 mRNA表达的相关分析与蛋白表达相同(r=0.42,P=0.027 5)。说明在喉鳞癌中CXCR4及MMP-13在蛋白和mRNA水平上都具有协同正向作用,提示二者在喉鳞癌的发生发展中具有明显的促进作用。

综上所述,喉鳞癌组织中CXCR4和MMP-13在蛋白水平及mRNA水平均升高,二者共同促进肿瘤的发生发展,可通过术后联合检测CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表达来评估喉癌的浸润转移、术后复发等,有可能对判断预后有一定价值。

摘要：目的 探讨趋化生长因子受体4(CXCR4)及基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在喉鳞状细胞癌中的表达,并研究其临床意义。方法 采用免疫组织化学方法和RT-PCR方法检测喉鳞状细胞癌组织及远离肿瘤组织的正常喉黏膜组织中CXCR4和MMP-13的蛋白及mRNA表达。结果 CXCR4和MMP-13在喉癌组织中呈过度表达,而自身正常喉黏膜弱表达或不表达;在肿瘤组织中,CXCR4的表达与患者的年龄、性别无关(P>0.05),而与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05);MMP-13的过度表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05)。蛋白表达水平情况与基因表达水平相一致。CXCR4和MMP-13在喉鳞状细胞癌的蛋白及mRNA表达水平呈显著正相关。结论 CXCR4和MMP-13可能参与了喉鳞状细胞癌的发生,在喉鳞癌的侵袭和转移中发挥着重要作用,联合检测CX-CR4和MMP-13有望成为喉鳞状细胞癌早起诊断和预后判断的分子指标之一。

关键词：喉鳞癌,CXCR4,MMP-13,免疫组织化学,RT-PCR

参考文献

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趋化因子受体 篇7

1 资料与方法

1.1 临床资料:

将本院于2014年7月至2015年11月期间收治的66例支气管哮喘患者选为研究对象, 并将66例患者随机分为两组。对照组的33例患者中, 男性患者20例, 女性患者13例, 年龄20~72岁, 平均年龄 (43.1±7.1) 岁, 疾病病程为1.8~12.8年, 平均为 (8.0±1.0) 年, 其中轻中度患者25例, 重度患者8例。观察组的33例患者中, 男性患者19例, 女性患者14例, 年龄20~73岁, 平均年龄 (43.2±6.9) 岁, 疾病病程为1.8~12.9年, 平均为 (8.1±0.8) 年, 其中轻中度患者25例, 重度患者8例。两组支气管哮喘患者的基本统计数据间均无明显差异, P均>0.05。

1.2 方法:

对照组的33例患者按照常规的支气管哮喘治疗方案进行治疗, 主要为给予抗炎和降低气道高反应性治疗。观察组的33例患者则在对照组的治疗基础上加用孟鲁斯特, 以孟鲁斯特10 mg服用, 1次/天。两组均连续治疗8周。然后将两组患者治疗前与治疗后的趋化因子血清水平进行检测, 检测指标为血清RANTES、MCP-1及ECP, 上述指标均采用ELISA (酶联免疫) 法相关试剂盒进行操作检测, 血液标本的采集时间为治疗前和治疗后4周与8周时, 静脉血均为晨起空腹静脉血, 将其离心, 取血清进行上述趋化因子指标的检测。

1.3 统计学分析:

本文中的数据检测选用SAS7.0, 数据检验方式选用两类 (卡方检验和t检验) , α=0.05, P<0.05具有统计学差异。

2 结果

治疗前对照组33例患者的血清RANTES、MCP-1及ECP水平分别为 (33.13±2.65) ng/m L、 (595.65±45.68) ng/L及 (31.58±3.23) µg/L, 观察组33例患者的血清RANTES、MCP-1及ECP水平分别为 (33.20±2.60) ng/m L、 (595.69±45.59) ng/L及 (31.62±3.18) µg/L。

治疗后4周对照组33例患者的血清趋化因子相关指标RANTES、MCP-1及ECP水平分别为 (29.54±2.35) ng/m L、 (523.73±40.18) ng/L及 (28.74±2.99) µg/L, 观察组33例患者的血清RANTES、MCP-1及ECP水平分别为 (22.64±1.84) ng/m L、 (440.37±32.18) ng/L及 (20.26±2.64) µg/L。

治疗后8周对照组33例患者的血清趋化因子相关指标RANTES、MCP-1及ECP水平分别为 (26.20±2.41) ng/m L、 (348.91±24.23) ng/L及 (25.65±2.80) µg/L, 观察组33例患者的血清RANTES、MCP-1及ECP水平分别为 (18.75±1.60) ng/m L、 (221.51±19.72) ng/L及 (15.35±1.96) µg/L。

治疗前两组患者的趋化因子相关指标血清水平均无明显差异, P均>0.05, 而治疗后观察组的趋化因子血清水平均低于对照组, P均<0.05。

3 讨论

支气管哮喘是呼吸道常见的一类疾病, 本病可导致患者出现气促、胸闷、喘息等多种呼吸道情况, 较多研究认为, 此类患者的发病与气道的高反应性及炎性反应等有密切的关系[2], 而与上述反应相关的指标较多, 其中趋化因子均呈现出相对异常的状态, 其中RANTES、MCP-1及ECP作为趋化因子中较为常见的几类指标, 其在支气管哮喘患者的血清中呈现明显高表达的状态, 而对其表达水平的改善需求也较高。

本文中我们就孟鲁斯特对支气管哮喘患者趋化因子的影响情况进行研究及探讨, 将孟鲁斯特应用和未应用的患者进行对照性的研究比较, 结果显示, 孟鲁斯特的应用对于患者的血清RANTES、MCP-1及ECP等指标水平均具有积极的改善作用, 说明其对于患者的炎症状态和气道高反应状态均有积极的改善作用。分析原因, 我们认为与孟鲁斯特对于支气管哮喘患者的免疫应激及机体损伤修复等多方面的作用有关, 同时其对于本病患者发病过程中的炎症状态也有积极的控制作用, 而炎症的控制是近年研究显示本病治疗的重点方面之一, 因此认为孟鲁斯特治疗从多方面对患者的哮喘状态进行了有效控制, 故而疾病治疗效果相对突出。

综上所述, 我们认为孟鲁斯特对支气管哮喘患者趋化因子的改善作用明显, 适用于支气管哮喘患者的治疗, 具有较高的应用价值。

参考文献

[1]徐文鑫, 梅序桥.支气管哮喘患者外周血Th17细胞及相关趋化因子表达水平检测[J].右江民族医学院学报, 2015, 37 (4) :533-535.