细胞外因子（共9篇）
细胞外因子 篇1
Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达增多是矽肺纤维化形成的重要环节之一。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族重要成员,近年来发现磷酸化ERK1/2可促进成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白[1,2]。转化生长因子 -β1(transforming growth factro-β1,TGFβ1)在矽肺肺组织中表达增高,且具有强烈的促胶原蛋白合成能力[3,4]。然而,TGF-β1是否可通过诱导ERK1/2磷酸化来促进胶原蛋白合成,目前并不清楚。 最新研究显示,活性氧(reactive oxygen specie,ROS) 参与细胞内多条信号传导通路的激活[5];而Peroxiredoxin-1(Prx-1)是一种新型过氧化物酶,可有效、 迅速地清除细胞内产生的ROS[6]。因此,本研究利用特异性Prx-1 si RNA转染人肺成纤维细胞,观察其对TGF-β1刺激的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达、ERK1/2磷酸化及ROS水平的影响,以探讨TGF-β1是否可通过ROS来激活ERK1/2通路,促进肺成纤维细胞合成胶原蛋白及Prx-1对其是否有抑制作用,为Prx-1成为矽肺治疗的新靶点提供一些实验依据。
1材料与方法
1.1材料
人胚胎肺成纤维细胞MRC-5(中国科学院细胞库),Prx-1 si RNA、引物(上海吉玛公司合成),M-MLV逆转录试剂盒、SYBR+Tap混合剂 (美国invitrogen公司),TGF-β1(美国Peprotech公司),Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体和 β-actin抗体(武汉博士德生物有限公司),ERK1/2抗体(美国Cell Signaling公司),Prx-1抗体(美国Abcam公司)。
1.2实验分组
MRC-5细胞随机分为4组:对照组(0.4%血清)、 TGF-β1组(5μg/L)、阴性转染组(TGF-β1+ 阴性对照组si RNA)和Prx-1 si RNA转染组(TGF-β1+Prx-1 si RNA),每组样本数为5。阴性转染组和Prx-1 si RNA转染组利用脂质体LipofectamineTM2000将阴性对照si RNA和Prx-1 si RNA转染到MRC-5细胞,培养48 h后用于实验。各组细胞用0.4%血清培养12 h,使其同步化。
1.3实时定量逆转录-聚合酶链反应检测siRNA转染后Prx-1表达
阴性对照si RNA和Prx-1 si RNA转染MRC-5细胞48 h后,弃培养液,利用Trizol提取细胞总RNA,定量后取0.5μg RNA进行逆转录。取1μl c DNA进行实时定量逆转录 - 聚合酶链反应(realtime PCR,RT-PCR)扩增,扩增体系如下:SYRB+Taq混合剂10μl,Prx-1或甘油醛 -3- 磷酸脱氢 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 正、反向引物各0.5μl,c DNA 1μl,双蒸水8μl;扩增条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火30 s, 72℃延伸30 s,共40个循环。Prx-1正向引物:5'-C CCCACGGAGATCATTGCTT-3',反向引物:5'-CGAG ATGCCTTCATCAGCCT-3';GAPDH正向引物:5'-AT GAATGGGCAGCCGTTAGG-3',反向引物:5'-TGGAT TTGCCATGGGTGGA-3'。
1.4Westernblot检测Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、Prx-1、磷酸化ERK1/2表达
各组细胞按照实验设计干预后,TGF-β1刺激48 h检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白;3 h检测Prx-1蛋白或0.5 h后检测磷酸化ERK1/2,收集细胞总蛋白,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium saltpolyacrylamide,SDS-PAGE)并转膜。转膜后,5%牛血清白蛋白封闭1 h,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体(1∶500稀释),Prx-1抗体(1∶1 000稀释),总ERK1/2抗体 (1∶1 000稀释),磷酸化ERK1/2抗体(p-ERK1/2) (1∶1 000稀释),4℃孵育过夜。Ⅱ抗(1∶3 000稀释)室温孵育2 h,5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - 磷酸盐 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,BCIP)/ 氯化硝基四氮唑蓝(p-nitro-blue tetrazolium chloride, NBT)(1∶50稀释)显色3 min。以Image J软件对蛋白表达条带进行灰度扫描及定量分析。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和 β-actin的灰度比值作为Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达结果,Prx-1和 β-actin的灰度比值作为Prx-1表达结果,p-ERK1/2和总ERK1/2抗体的灰度比值作为p-ERK1/2表达结果 。
1.5 2,7- 二氯荧光素二乙酸检测ROS水平
2,7- 二氯荧光素二乙酸(2,7-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)没有荧光,能自由穿过细胞膜, 进入细胞后被酯酶水解生成二氯荧光黄(dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH),DCFH不能通过细胞膜,但能被细胞内的ROS氧化生成7- 二氯荧光素 (7-dichlorofluorescein,DCF),DCF可发出荧光。因此DCF的荧光量可以反映细胞内ROS水平。本实验中, 各组细胞按照设计干预后,TGF-β1刺激24 h, 0.25%胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液,加入DCFHDA,终浓度为10μmol/L,37℃孵育20min后,磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered salines,PBS)洗3次, 去掉未进入细胞内的DCFH-DA,计数10 000个细胞,荧光酶标仪测定激发波长488 nm和发射波长525 nm处的荧光强度。
1.6统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,行t检验和单因素方差分析,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1Prx-1siRNA转染肺成纤维细胞对Prx-1mRNA表达的影响
为下调肺成纤维细胞Prx-1 m RNA水平,本研究设计3个不同靶基因位点的特异性Prx-1 si RNA [Prx-1 si RNA (209)、Prx-1 si RNA (289) 和Prx-1 si RNA(453)],分别转染细胞。RT-PCR结果显示,未转染组(单一用脂质体处理)和阴性转染组(阴性对照si RNA)的Prx-1 m RNA的表达水平比较,差异无统计学意义。与阴性转染组比较,3种Prx-1 si RNA转染后,肺成纤维细胞内Prx-1 m RNA的表达均不同程度地下降,其对Prx-1 m RNA的抑制率分别为83%、77%和92%。依据抑制率将Prx-1 si RNA(453) 用于最终实验。见附表。
注:1)与未转染组比较,P >0.05;2)与阴性转染组比较,P <0.05
2.2Prx-1siRNA转染对TGF-β1诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响
Western blot结果显示,对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达微弱,表达值分别为(0.18±0.03)和(0.20± 0.02)。与对照组比较,TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达增强,表达值分别为(0.44±0.06)和(0.38± 0.04),是对照组2.44和1.85倍,差异有统计学意义 (P =0.000)。与TGF-β1组比较,阴性转染组的Ⅰ、 Ⅲ型胶原蛋白表达值为(0.41±0.06)和(0.38±0.05), 差异无统计学意义 (P =0.432和0.783),但Prx-1 si RNA转染进一步增强Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,分别为(0.57±0.07)和(0.52±0.05),差异有统计学意义(P =0.008和0.002)。见图1。
2.3Prx-1siRNA转染对TGF-β1诱导的Prx-1蛋白表达的影响
Western blot结果显示,对照组Prx-1蛋白表达值为(0.17±0.04)。与对照组比较,TGF-β1组的Prx-1蛋白表达明显增高,表达值为(0.42±0.06), 差异有统计学意义(P =0.000)。与TGF-β1组比较, 阴性转染组Prx-1蛋白表达水平为(0.47±0.09),差异无统计学意义(P =0.338),但Prx-1 si RNA转染组为(0.02±0.00),表达明显下降,差异有统计学意义 (P =0.000)。见图2。
2.4Prx-1siRNA转染对TGF-β1诱导的ROS水平的影响
对照组的荧光强度为(87.47±6.32),与对照组比较,TGFβ 1组的荧光强度增强为(122.50 ± 8.18),差异有统计学意义(P =0.000) 。 与TGFβ 1组比较,阴性转染组的荧光强度为(116.72 ± 10.37),差异无统计学意义 (P =0.310),但Prx-1 si RNA转染组为 (145.92 ± 11.56),差异有统计学意义(P =0.000) 。
2.5 Prx-1 si RNA转染对TGFβ 1诱导的pERK1/2表达的影响
总ERK1/2在各组的表达差异无统计学意义(P > 0.05)。对照组p-ERK1/2的表达很弱,表达值为(0.25± 0.03)。TGF-β1刺激后p-ERK1/2表达增强,表达值为(0.84±0.07),为对照组的3.36倍,差异有统计学意义(P =0.000)。与TGF-β1组比较,阴性转染组的p-ERK1/2表达值为(0.80±0.08),差异无统计学意义(P =0.458),但Prx-1 si RNA转染组p-ERK1/2的表达水平明显上升,表达值为(1.26±0.09),差异有统计学意义(P =0.000)。见图3。
3讨论
矽肺是我国最常见的职业病之一,其发病机制是吸入的二氧化硅粉尘颗粒在肺组织内激活肺泡巨噬细胞,使其释放多种细胞因子,该细胞因子作用于肺成纤维细胞,引起细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成增加,导致肺组织纤维化。在分泌的众多细胞因子中,TGF-β1致纤维化作用很强。研究表明,TGF-β 首先与细胞表面的TGF-β1受体结合,将信号传递到细胞内,然后在细胞内通过激活细胞内信号传导通路来调节细胞的生物学活性[4]。
本研究中笔者发现,TGF-β1刺激肺成纤维细胞48 h后,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达明显高于对照组,说明TGF-β1可诱导肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白;同时TGF-β1组的p-ERK1/2表达也较对照组增高,提示ERK1/2通路的激活在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白中发挥重要作用。ZHANG等[7]报道在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中,纤溶酶原激活抑制剂在抑制ERK1/2通路激活后,肺组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达也明显下降。HUANG等[1]最近报道,利用女性压力性尿失禁患者的原代阴道成纤维细胞抑制ERK1/2通路后,阴道成纤维细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的能力也明显下降。
研究发现,ROS是细胞内传导通路的重要成员之一[5],而且进一步研究显示,ROS是MAPK家族激活强有力的诱导剂[8,9],分析该作用可能与ROS抑制MAPK磷酸酶的活化有关,通过抑制MAPK磷酸酶来延长激活的MAPK存在的时间[10]。作为一种新型的过氧化物酶,Prx-1能够很强地清除细胞内ROS的能力。Prx-1含有2个保守的有还原活性的过氧化半胱氨酸和可溶性半胱氨酸,过氧化半胱氨酸攻击双氧水H2O2,失去质子同时被氧化成半胱氨酸次磺酸,半胱氨酸次磺酸与可溶性半胱氨酸缩合形成二硫键,细胞中的二硫键还原酶将半胱氨酸次磺酸还原成过氧化半胱氨酸,从而完成还原反应,降低H2O2浓度[11]。
本研究中,TGF-β1刺激肺成纤维细胞24 h后, 细胞内ROS水平明显高于对照组,说明TGF-β1可刺激肺成纤维细胞生成ROS。但当Prx-1 si RNA干预后,TGF-β1诱导的prx-1蛋白表达被明显抑制, 同时ROS水平、磷酸化ERK1/2及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显升高。说明Prx-1 si RNA通过提高ROS水平进一步激活ERK1/2通路,从而促进TGFβ1诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成,也进一步证实在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的过程中,ROS激活的ERK1/2通路发挥重要的促进作用。
综上所述,TGF-β1可通过ROS激活ERK1/2通路,诱导肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,而低表达Prx-1可通过提高ROS水平进一步加强TGFβ1的这种作用,说明Prx-1可通过削弱ROS来抑制ERK1/2介导的TGF-β1作用。
细胞外因子 篇2
三氧化二砷(As2O3,ATO)是一种新发现的有效治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的药物.研究发现,该药物在体外诱导细胞分化的能力不如体内明显.以此为基础,最近我们意外地发现模拟低氧化合物和中度低氧环境能够直接在体外诱导急性髓系白血病细胞分化,也选择性地加强三氧化二砷诱导的APL细胞分化.进一步地,间歇性低氧能够显著延长移植的`白血病小鼠生存时间,并且抑制白血病细胞浸润并诱导其分化.以这些工作为基础,我们就低氧诱导白血病细胞分化的分子机制进行了深入研究.本文将就相关工作作一综述,并讨论有待进一步研究的问题.
作 者：陈国强 彭镇刚 刘玮 宋利平蒋益 黄莺 赵倩 CHEN Guo-Qiang PENG Zhen-Gang LIU Wei SONG Li-Ping JIANG Yi HUANG Ying ZHAO Qian 作者单位：陈国强,CHEN Guo-Qiang(上海交通大学医学院病理生理学教研室,细胞分化与凋亡教育部重点实验室,上海,200025;中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所,上海,200025)彭镇刚,宋利平,赵倩,PENG Zhen-Gang,SONG Li-Ping,ZHAO Qian(中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所,上海,200025)
细胞外因子 篇3
关键词：烟雾病,肝细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,血管源性生长因子
侧支循环是近年来国内外研究的热点问题[1,2],通过侧支循环,可以维持病变血管的远端血液供应,从而避免出现脑梗死,当侧支循环好时,预后较好。故其在缺血性脑血管病的发生、发展、治疗、预后中都起到了十分关键的作用,更为重要方面其还是一条可干预的途径[3]。因此需要加强侧支循环建立的基础和临床方面的研究,从而为缺血性脑血管病的治疗开启新的方向。烟雾病是一种以双侧颈内动脉末端及大脑前、中动脉起始部狭窄或闭塞,并在颅底有异常增生血管网的脑血管病[4],其突出特征之一便是出现颅外向颅内代偿的侧支循环和新生的毛细血管网,其分别代表次级及三级侧支循环。随着病情的发展,新生的毛细血管网会发生不断地变化,呈现出增生、旺盛及衰减的过程,而次级侧支循环也会逐渐建立并起主要代偿供血作用,是目前研究侧支循环变化最好的途径[5]。目前很多国内外研究已提示多种细胞因子在烟雾病患者中表达明显增加[6,7,8,9],其中,肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)及血管源性生长因子(VEGF)最具有代表性[10],但烟雾病毛细血管网的增生、旺盛和衰减的具体过程及次级侧支循环变化与上述细胞因子的相关性尚不清楚,本研究探讨HGF、b-FGF、VEGF)在成人烟雾病不同阶段的变化,现报道如下:
1 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析2013年11月~2014年12月江西省人民医院(以下简称“我院”)神经内科住院的行全脑血管造影检查确诊为烟雾病的41例患者临床资料,其中男15例,女26例,平均年龄为(51.34±8.71)岁,上述患者行相关检查排除相关疾病,同时行全脑血管造影检查确诊为烟雾病,影像学评判标准选择Suzuki分期,2位神经内科医师分别单独进行判定,8例患者为早期(Suzuki分期1~2期),17例为中期(Suzuki分期3~4期),16例为晚期(Suzuki分期5~6期)。同时选择在我院诊治40例脑动脉粥样硬化患者为阳性对照,另选择我院20例健康体检者为正常对照。所选健康对照人员均为血象、血生化、常规心电图、胸片、腹部B超、经颅多普勒超声检查等上述检查项目正常的健康成人。
烟雾病诊断标准:①颈内动脉(internal carotid artery,ICA)末端和/或大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)、大脑前动脉(anterior cerebral artery,ACA)起始端狭窄或闭塞;②其颅底可见烟雾状异常血管网;③病变为双侧性。
脑动脉粥样硬化诊断标准:①全脑血管检查发现血管管腔有狭窄;②排外肌纤维发育不良等其他原因所致血管管腔变化。
烟雾病Suzuki分期的标准[11]:第1期,双侧颈内动脉末端分叉处狭窄。第2期,颈内动脉末端分叉处狭窄,ACA和MCA起始部狭窄并分支扩张,颅底有烟雾血管形成,但无颅外至颅内侧支循环形成。第3期,ACA和MCA主要分支闭塞,烟雾血管非常明显,形成烟雾血管团,但大脑后动脉(PCA)或后交通不受影响,仍无颅外至颅内侧支循环形成。第4期,颅底烟雾状血管开始减少,ICA闭塞已经发展到与后交通动脉的联合处。从颅外到颅内的侧支循环逐渐形成,或有异常增生的新生血管吻合支。第5期,从ICA发出的全部主要动脉完全闭塞,烟雾血管比第4期更少,从颅外到颅内的侧支供血进一步增多。第6期,烟雾状血管完全消失,ICA主干闭塞,仅见到从颅外进入颅内的侧支循环。
1.2 检测方法
烟雾病和动脉粥样硬化组在入院后第2天,正常对照组在当天即采取空腹静脉血6 m L,常温放置30 min,以3000 r/min离心15 min,取血清并将其置于-70℃冰箱备检。各组血清中HGF、b-FGF及VEGF浓度均采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测。检测试剂盒采用武汉博士德生物工程有限公司,检测步骤严格按操作说明书进行。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者、健康人一般资料比较
烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者、健康人的一般资料,烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者危险因素比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
注:“-”表示无
2.2 烟雾病患者、动脉粥样硬化患者、健康人血清中HGF、b-FGF、VEGF比较
烟雾病早期、中期、晚期患者的HGF与动脉粥样硬化患者、健康人比较,差异有统计学意义(P<0.05),烟雾病早期、中期、晚期患者之间HGF相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾病晚期患者b-FGF与其他各组比较,表达最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组间b-FGF差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾病早期患者VEGF与其它各组比较,表达最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
3 讨论
根据国内外相关研究报道[6,7,8,9],HGF、b-FGF、VEGF均在烟雾病患者病变处的颈内动脉颅内段及其分支血管中层和增厚的内膜中广泛表达,另外在患者脑脊液中检测含量明显增高,而正常对照组则未发现,表明这些相关病变组织中含有上述细胞因子,提示与烟雾病的发生发展有关。
烟雾病的病变血管不同于动脉粥样硬化病变,其以内膜增厚为主要表现,从而造成了血管管腔变细、狭窄,直至闭塞,同时周围逐渐出现新生毛细血管网,上述病理过程均与血管内皮细胞增生有相关性[12]。随着病程的进展,新生毛细血管会逐渐衰减,而次级侧支循环则起主要代偿供血作用,根据这些影像学变化可行Suzuki分期,8例早期,17例中期,16例晚期,分别代表了不同的次级和三级侧支循环变化阶段。
HGF是一种很强的促血管再生因子[13,14],它不仅促进血管的生成,而且可调节内皮细胞的生长、运动。本实验揭示血清中HGF浓度在烟雾病各个阶段均有明显的升高,既使烟雾病后期毛细血管网减少时,HGF浓度仍未下降,提示其从始至终一直参与新生毛细血管网及次级侧支循环的形成,可能是一种主要的促侧支循环开放的细胞因子。
b-FGF在体内分布很广,可诱导内皮细胞的迁移和增殖,并促进内皮细胞的黏附和形成血管腔[15],临床试验也进一步证明其具有强大的血管再生作用[16]。本研究发现烟雾病晚期患者血清中b-FGF含量明显增加,此时烟雾病变的血管闭塞达到最高峰,而新生毛细血管网已处于衰减期,但第二级侧支循环逐渐出现并起主要作用,故推测其在烟雾病侧支循环变化的后期病变中发挥了重要作用。
VEGF是一种血管生长因子,主要作用不但可刺激血管内皮细胞增生,调节细胞的生长,而且还可促进血管形成[17,18,19],临床试验显示通过特异性VEGF纳米抗体能抑制血管的生长,反证其具有促进血管再生作用[20]。本研究提示烟雾病早期组血清中VEGF含量明显增加,此时烟雾病患者病变血管尚处于病变早期,新生毛细血管处于增生期,推测其在烟雾病的侧支循环早期的变化发挥了重要作用。
细胞外因子 篇4
早期研究使用的成纤维细胞生长因子(FGFs)主要来自牛脑和脑垂体的提取液，是大约150个氨基酸结构的酸性或碱性成纤维细胞生长因子(aFGF：FGF1或bFGF：FGF2)。其后分离的癌基因产物的细胞增殖因子与上述FGFs结构类似，也被分类在FGFs家族，并依次命名为FGF3~9〔1〕。目前已发现23种FGFs。现主要就多能FGFs结构和相关功能机制的研究进展进行综述。?
1发现和鉴定新的FGFs结构?
FGFs作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。FGFs是由约150~200氨基酸组成的多肽，相互之间的氨基酸序列有20%~50%是相同的〔2,3〕。其中心区域有大约120个氨基酸序列存在高度的同源性(30%~70%)。利用该区域的同源性，以人、小鼠或大鼠cDNA和基因组DNA为模板、采用同源序列PCR法进行新FGFs基因检测。当然，还可以采用T7噬菌体?cDNA显示法鉴定新FGFs。FGFs受体(FGFRs)是典型的膜结合酪氨酸激酶型受体。将FGFRs的胞外结构域在杆状病毒群(baculovirus)表达株表达，制成重组的细胞外结构域(可溶性FGF受体)。进而利用可溶性FGFRs与配体结合的特性，通过T7噬菌体cDNA显示法对互补cDNA文库进行筛选。?
通过同源序列PCR法，已经发现了6种新的FGFs基因(FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21)〔4〕。虽然T7噬菌体cDNA显示法能获得较多的阳性克隆，但不能确认是新发现的FGFs。随着人类基因组结构的解析及其DNA数据库被公开，通过基因检索进而又发现3种新的FGFs基因(FGF19、FGF22、FGF23)〔5,6〕，并发现FGF-22mRNA选择性表达于皮肤毛囊的内毛根鞘〔7〕。加上在探索视网膜特异性表达基因的过程中所发现的4种新的FGFs基因(即FGF11、FGF12、FGF13和FGF14)〔1〕，以及McWhirter等〔8〕在探索嵌合体同源结构域癌蛋白(chimerichomeodomainoncoprotein)E2A-Pbx1下游目标过程中发现的FGF15，迄今共鉴定出23种人或鼠FGFs。但是人FGF15和小鼠FGF19尚未被证实。人FGF19与小鼠FGF15显示很高的同源性(约50%)，且这两种基因都跟FGF3、FGF4基因的染色体邻接〔3〕，由此推断人FGF19是小鼠FGF15的相同体。由于人与小鼠其他FGFs结构之间的同源性达90%以上，因而除非FGF15和FGF19在进化过程中意外地发
细胞外因子 篇5
1 CIK细胞的生物学特性
1.1 CIK细胞的来源
通过对CIK细胞的表面标志研究发现, CIK细胞为CD3CD56双阳性细胞群, 主要来源于C D3+C D5 6-的T淋巴细胞, 而非CD3-CD56+的NK细胞;另一重要来源是CD4-CD8+T淋巴细胞群。由于CD4-CD8-T细胞经过1个月的细胞因子诱导培养后, 有56%的T细胞可同时表达C D 3 CD 5 6, 说明C D 4-C D8-T细胞也是C I K细胞的重要来源。
1.2 C I K细胞的增殖
从人外周血分离制备的单个核细胞, 用IFN-γ100U/ml培养24h后加入重组白细胞介素2 (r IL-2) 3 0 0 U/ml、重组白细胞介素1α (r IL-1) 1 0 0 U/ml、抗CD3单克隆抗体50ng/ml, 细胞开始迅速增殖, 以后每3天更换新鲜培养液和r IL-2, 即可制备出C I K细胞, 在培养的第21~28天细胞数可增长1000倍以上, 达到高峰。刺激细胞增殖的主要原因是抗CD3单抗的作用, IFN-γ、r I L-2、r I L-1有增加C I K细胞毒力的作用, I F N-γ比r I L-2早2 4 h加入培养体系及联合应用r I L-1可提高细胞毒性。CIK细胞的高增殖活性解决了体外扩增效应细胞所获细胞数目少的难题[1]。
1.3 与其他过继免疫细胞比较
淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK细胞) 亦由外周血单个核细胞诱导而来, 主要起杀伤作用的是r IL-2活化的CD 3-CD56+NK细胞, 对靶细胞的杀伤无MH C限制性, 但LAK细胞的体外扩增能力较低、体内杀瘤活性不高, 需要大剂量的r IL-2来维持且毒副作用明显, 临床应用受限。肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL细胞) 是从肿瘤组织中分离出来的具有杀伤肿瘤细胞特性的淋巴细胞, 杀伤活性较LAK细胞强, 但对肿瘤的杀伤作用有MHC限制性, 杀瘤谱窄, 在分离过程中容易变异且体外扩增较困难, 难以广泛用于临床。CIK细胞杀伤活性明显较与肿瘤细胞直接接触才能增殖, 易于大量获得, 杀瘤谱广, 杀瘤活性不受CSA、FK50 6等免疫抑制药的影响, 对多重耐药肿瘤细胞同样敏感, 且对正常骨髓造血前体细胞毒性很小, 可以保存75%以上的粒系-巨系造血祖细胞集落 (CFU-GM) , 充分弥补了因放化疗引起肿瘤患者骨髓抑制的不足。因此, C IK细胞比LAK细胞、T IL细胞更适于肿瘤的生物治疗。
2 CIK细胞抗肿瘤作用机制
2.1 对肿瘤细胞直接杀伤作用
目前认为, C I K细胞可被淋巴细胞功能相关抗原有关识别结构激活, 导致胞浆毒性颗粒释放而杀伤肿瘤细胞, 也可因表面CD3受体被激活, 导致胞浆毒性颗粒释放而产生溶瘤作用。
2.2 间接杀瘤作用
K o r n a c k e r M等[2]在用C I K细胞治疗慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 的研究中发现, CIK细胞分泌的IFN-γ能促使C LL细胞上的ICAM-1的表达, 还能分泌I L-2、I L-6、人粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子 (GM-C SF) 、TN F-α等细胞因子, 可增强细胞毒作用。Linn YC等[3]研究证实, 培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子, 如IL-1 0、IL-4、IFN-γ等, 不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用, 还可通过调节抗体免疫系统反应间接杀伤肿瘤细胞。
2.3 诱导肿瘤细胞凋亡
C IK细胞能活化肿瘤细胞凋亡基因, 使得FLIP、B cl-2、B cl-XL、DAD1、Sur vivin基因表达上调[4]。CIK细胞在培养过程中表达Fas L, 能抵抗Fas L+肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-Fas L凋亡, 又可诱导Fas+肿瘤细胞凋亡, 发挥持久抗肿瘤作用[5]。Sun S等[6]在CIK细胞对MGC-803胃癌杀伤作用的研究中指出, C I K细胞早期诱导肿瘤细胞凋亡, 晚期则通过对P 5 3、C-m y c和B c l-2的下调及B a x的上调来诱导肿瘤细胞坏死。岑溪南等[7]通过实验证实, CIK细胞也可诱导Bcla b l阳性的K 5 6 2细胞凋亡。
2.4 促进T细胞增殖活化
任欢等[8]研究认为, C IK细胞体内抗肿瘤作用可能与促进宿主体内T细胞增殖活化有关, CIK细胞输入体内后在宿主机体状态或肿瘤抗原刺激下转变成具有杀瘤活性的细胞毒性T细胞而发挥抗
3 CIK细胞临床应用
3.1 血液系统恶性肿瘤
In tron a M等[9]研究发现, CIK细胞对白血病及T细胞、B细胞淋巴瘤有广泛的杀瘤作用。Alvar n as J C等[10]发现在GM-C SF动员下, 将自体移植患者外周血的造血祖细胞用CIK细胞培养方法进行扩增后, T细胞总数明显上升, CD3+CD56+细胞扩增, 具有明显杀伤B2细胞淋巴瘤和髓系白血病细胞的作用。国内研究观察C IK细胞与r IL-2联合治疗儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的疗效, 显示CIK细胞治疗具有明显清除微小残留白血病细胞、防止复发的作用且输注安全, 但临床疗效与患者体内的白血病负荷大小有关。
3.2 实体肿瘤
J i a n g J等[11]应用C I K细胞治疗晚期胃癌患者, 发现患者血清中的肿瘤标志物下降, 免疫功能、生活质量提高, 接受化疗及CIK细胞治疗者2年生存率比单独接受化疗者有较大的提高;Zhou QM等[12]在85名接受过微创治疗的肝细胞癌患者中观察CIK细胞的疗效, 发现经微创技术治疗后再用CIK细胞治疗能提高肝癌患者的免疫力, 减少复发。陈复兴等[13]报道了应用CIK细胞治疗63例肿瘤患者的近期疗效, 结果部分缓解加微效共28例, 有效率达44.4 6%, C D3、C D4、C D8 T细胞绝对值增加45%, 食欲体力改善者95%, 疼痛减轻者72%, 睡眠改善者51%, 体重回升者32%。鲍锋等[14]通过系统观察和分析CIK细胞过继免疫疗法对多种中晚期恶性肿瘤的临床疗效, 发现在256例接受CIK细胞治疗患者中总缓解率80.86%, 随诊1年生存率为96.09%, 2年为9 2.9 6%, 3年为8 8.2 8%, 说明C I K细胞对多种中晚期恶性肿瘤细胞具有广谱、高效杀瘤作用, 能明显提高患者免疫功能, 减轻症状, 提高生活质量, 延长生存期。
3.3 耐药肿瘤
多药耐药是造成化疗失败的一个重要原因。CIK细胞对表达P糖蛋白 (Pgp) 的肿瘤细胞具备有效的杀伤作用, 甚至在阿霉素耐药的K562细胞系比其亲代细胞对CIK细胞更敏感[15]。Schmidt-Wolf IG等[16]研究证实, 对柔红霉素耐药的K562细胞对CIK细胞较敏感, 证明CIK细胞对恶性克隆形成的抑制作用与多药耐药基因的表达无关。CIK细胞的这一特性使其在耐药肿瘤的治疗上具有明显的优势。
4 CIK细胞治疗的不良反应
多组临床应用CIK细胞的报道显示, 患者可有不同程度的发热, 体温在38℃左右, 多数可自行缓解, 必要时给予解热镇痛药退热[17]。目前认为, 生物治疗过程中患者出现的中度发热是机体免疫功能正常反应的结果, 对治疗有益。其他少见副作用有疲乏、胸闷、恶心, 尚未出现过敏、肝衰竭、肾衰竭等不良反应。
5 展望
国内外多年来临床研究表明, CIK细胞可以有效地杀伤直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞, 提高肿瘤患者自身的细胞免疫功能, 对于清除手术、化疗、放疗后体内残留的肿瘤细胞及微小转移灶有明显疗效, 是目前国内外已确认并进入临床阶段的有效肿瘤生物治疗方法之一。进一步研究CIK细胞抗肿瘤作用的机制、获得足够数量的CIK细胞以满足临床需要, 以及寻找与手术、放疗、化疗联合应用的最佳组合等是我们今后需要解决的问题。
(参考文献略, 如有需要请与编辑部联系)
(收稿:2010-04-30) (发稿编辑:杨海陆)
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细胞外因子 篇6
1资料与方法
1.1研究对象
选取普外科2010年5月 -2012年12月收治的胰腺肿瘤患者共30例。其中男18例,女12例,年龄40~70岁。全部患者都是胰腺肿瘤确诊病例,全部病例按国际抗肿瘤联盟(UICC)标准给予分期(TNM分期),Ⅰ~Ⅱ期9例,Ⅲ期12名,Ⅳ期9例。全部患者卡氏评分≥60分,心、肾、肝脏功能均正常。所有均是根 治手术后 患者 , 术后给予 采自自身 的DC-CIK细胞输注,全部患者在输注DC-CIK细胞前, 医生都与家属及患者本人进行沟通,本人及家属均表示同意,并签字。
1.2主要试剂
rh INF-γ 购自上海克隆生物技术公司,抗人CD3单克隆抗体购自e Bioscience公司,人rh IL-4、rh IL-2、 rh IL-1a、rh GM-CSF购自Pepro Tech公司,Ficoll液、 人无血清培养基AIM-V购自美国GIB-CO公司, FITC标记鼠抗人CD3、CD127单克隆抗体、PE标记鼠抗人CD8、CD4、CD56单克隆抗体、PE-Cy5标记鼠抗人CD25单克隆抗体和同型对照Ig Gα1购自美国BD公司,人IFN-γ、IL-4酶联免疫吸附试验 (ELISA)试剂盒购自晶美生物工程有限公司,rh GMCSF(注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子)购自厦门特宝生物工程股份有限公司。
1.3实验方法
1.3.1树突状细胞的制备所有操作严格遵守标准程序。采集患者外周血2×109~3×109个单个核细胞及血浆80 ml(Kabi Fresenius,German)。经Ficoll Hypaque(Gibco,USA)分离单个核细胞后,离心洗涤重悬,调整细胞浓度为2×106~4×106个 /ml铺入6孔板,培养箱中孵育2 h后,收集悬浮细胞至另一个50 ml离心管继续培养;第3天补加树突状细胞 (dendritic cells,DC)培养液;第5天加入肿瘤特异性抗原(终浓度为20~80μg/ml),诱导后12~16 h加入肿瘤坏死因子(TNF-α,500 U/ml);第8天收集细胞,离心,洗涤,用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬,总体积为100 ml,静脉回输患者,共4次,回输时间选择在2次DC回输之间。
1.3.2细胞因子诱导的杀伤细胞制备将经Ficoll Hypaque(Gibco,USA)分离的单个核细胞重悬于含10% FBS的RPMI 1640培养液中,以2×106个 /ml铺入培养瓶,补加 γ- 干扰素(INF-γ,1 000 U/ml), 置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育;次日补加CD3单抗(0.5μg/ml)及白细胞介素 -2(IL-2,1 000 U/ml) 继续培养;第3天用10%FBS的RPMI-1640培养液进行补液;第11~12天收集细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)细胞,离心, 生理盐水洗涤3次。用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬,总体积为100 ml,经静脉回输患者,共4次,回输时间选择在2次DC回输之间。
1.3.3 DC-CIK回输后效果分析如果输入DC-CIK后患者有发热等不舒服的感觉,各项化验有一定的改变,且对患者的生活有严重的影响,这些是评价的指标。
1.3.4患者血液中免疫指标细胞对采集及分析在回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液,并于输注DC -CIK细胞后14 d再次抽取血液,经过处理后,分别加入管中,小管中加入血液及相应的抗体,血液加100μl,抗体量为10μl,抗体分别是CD3-FITC、 CD127-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、CD25PE-Cy5,用Ig Gα1做相应的对照,2者经过反应后, 时间是15 min,反应后再次经过处理,上仪器检测, 检测后行记录数据分析总结。
1.3.5检测Th1/Th2按前述回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液,并于输注DC-CIK细胞后14 d再次抽取血液,经过离心等处理后,留取患者血清,置入冰箱低温冷冻备用。取ELISA试剂盒,按操作程序测定IFN-γ 与IL-4血清中的含量,操作务求规范严密。
1.4统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,实验设计为自体配对均数的t检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1效果及副反应
总体上,DC-CIK注入人体后,多数患者状态有明显改善,进食增加、精力恢复、乏力倦怠症状消失, 其中有个例患者有暂时的体温升高现象,均未超过39℃,时间较短,应用药物后,体温下降至正常,并没有反复,全部患者无皮疹瘙痒等不良症状,各项化验指标也未见显著变化。
2.2患者免疫指标评价
DC-CIK注入人体后,患者CD3+、CD4+百分比增加,CD8+百分比下降,CD4+/CD8+数值提高;标志CD3+CD56+细胞数量提升;标志CD127low Treg CD25+CD4+细胞比例下降,相比注入CIK-DC细胞前,差异有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。见表1。
2.3细胞因子比较
CIK-DC细胞输注组IFN-γ 含量提高,IL-4含量减少,差异有统计学意义(P <0.01)。见表2。
3讨论
胰腺癌是消化道常见肿瘤,恶性程度高,治疗困难,晚期放化疗都难以延长生存期,临床及科研都在多方探索有效的疗法。治疗的主要难度在于复发和转移,手术前治疗重点在局部,术后治疗重点在于全身,近年开展的生物治疗是有希望的全身治疗办法。
自身防御机制在抗肿瘤过程中发挥着不可替代的作用,T细胞在自身防御的过程中发挥着重要作用,癌症之所以能发生、发展,在于机体免疫状态有了问题,导致免疫监视减弱,正常状态下,人体免疫细胞量和功能都协调一致,能够发挥正常的免疫机制,当这种平衡被打破,免疫功能在一定程度上的缺失,至使肿瘤产生免疫逃逸。实验证明,DC-CIK的输注可以改善患者的免疫状态,是一种有效的支持治疗。患者免疫状态的改善对患者的无病生存期及带瘤生存期的延长都有一个良好的预期。DC细胞是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞,当细胞数量达到一定数量后回输给患者,可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应[4]。最新研究显示,DC细胞与CIK细胞共培养后,提高细胞的增殖速度和杀伤活性,且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。对于血液、消化、呼吸等多个系统肿瘤细胞均有杀伤作用。 CIK细胞最初是指在正常人体外周血中只占1%~ 5%的CD3+CD56+的T淋巴细胞,目前国内外制备的用于过继免疫治疗的CIK细胞,实际上是体外扩增以CD3+CD56+、CD3+CD8+为主的异质性细胞群[5]。该细胞群具有广泛的非MHC限制的极强的溶瘤活性。CIK增殖能力强,细胞毒作用强,对肿瘤细胞的识别能力很强,能精确“点射”肿瘤细胞,但不会伤及 “无辜”的正常细胞。能消除残留微小的转移病灶, 对手术后或放化疗后患者效果显著,因此,CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
本文结果表明经过以往的治疗后,机体的免疫力受到不同程度的打击和抑制,有些已不能进行下一步治疗。经过DC-CIK细胞的提取和输注后, CD3+、CD4+含量和CD4+/CD8+数值升高,共表达CD3+CD56+细胞含量显著提高。CIK细胞对肿瘤细胞有直接的杀伤,在体内受某些淋巴因子作用后,CIK细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外,这些颗粒直接破坏瘤细胞,进入体内活化的DC-CIK细胞分泌多种细胞因子,如干扰素 γ、TNF-α 和IL-2等,不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用,而且还可通过调节免疫系统间接杀伤肿瘤细胞。
1995年SAKAGUCHI等人首先提出CD4+CD25+Treg,引起免疫界越来越多的关注。CD4+CD25+Treg细胞可以维持自身免疫耐受,由于肿瘤抗原是自身抗原量或质的改变,因此,可以推测CD4+CD25+Treg细胞可以抑制肿瘤免疫的发生。研究发现无论癌症患者还是肿瘤动物模型,其外周CD4+CD25+Treg细胞数量及功能均不同程度地增高,与患者死亡率增加,存活率降低密切相关。去除CD4+CD25+Treg细胞, 利于诱导对多种肿瘤抗原的免疫应答,证明CD4+CD25+Treg细胞可以抑制体内抗肿瘤免疫反应。因此,CD4+CD25+Treg细胞可能在肿瘤逃逸、促进肿瘤的生长中发挥重要作用,也可能是肿瘤疫苗和免疫增强剂难以奏效的原因。
文献显示CD4+CD25+CD127lowTreg是人体自有的,可以识别身体内被激活的T淋巴细胞[6],对Treg尤其可以区别,其特异性在目前发现的细胞标志中可以说是高的,而这种技术的发现,已经在临床中得到应用,效果良好。应用流式细胞术三色标记法检测患者血液里CD4+CD25+CD127lowTreg含量,可以对Treg在血液中的含量反映得更精准。上述研究检测DC-CIK细胞输注前后血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量,可以看出胰腺肿瘤患者输注DC-CIK前血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量较多。DC-CIK细胞输注2星期,患者血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量减少。因而,CIK细胞以减少Treg含量的方式增强患者的免疫功能。
人体的免疫结构中,细胞因子有着重要的地位。 从产生细胞因子和其功能作用的区别,细胞可区分为Th1细胞与Th2细胞。Th1的细胞作用是使人免疫力更强,这类细胞可以分泌诸如IFN-γ、IL-2等因子;Th2细胞分泌诸如IL-4、IL-10等因子,在体液免疫中发挥关键效能。健康状态下,人体处在一个免疫平衡状态,Th1、Th2分别分泌增强免疫和抑制免疫的因子[7],互相制衡。肿瘤患者疾病的开始及进展均有Th1参与的免疫机能伴随。上述通过检测两类细胞因子在血液中的含量,可以看出输注DC-CIK细胞的患者,IFN-γ 含量增加,IL-4含量减少。显示DC-CIK细胞输注在一定程度上影响着Th1/Th2的平衡,保持人体免疫状态的平衡,促进免疫系统对肿瘤的免疫反应。
总之,DC-CIK细胞输注对增强胰腺肿瘤患者T淋巴细胞生理效能,减少患者血液中Treg的含量, 同时使Th1/Th2的比例保守一个相对稳定的水平起到关键作用。但是,上述论述所涉范围有限,DC-CIK细胞对胰腺肿瘤患者更深层次的作用及效果还有待揭示。
摘要：目的 探究树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)细胞输注对胰腺肿瘤患者的影响。方法对30例经病理证实的胰腺肿瘤患者输注自体DC-CIK细胞,每例均在输注前、后抽取血液,应用流式细胞技术测量T细胞亚群和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Treg)的改变;ELISA法测量IFN-γ和IL-4数值的变化。结果 患者输注后外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+T细胞含量增加,CD4+/CD8+含量增加,CD8+T细胞含量减少(P<0.01);CD4+CD25+CD127low Treg减少(P<0.01);Th1细胞因子IFN-γ含量较输注前增加,而Th2细胞因子IL-4含量减少(P<0.01)。结论 DC-CIK细胞输注可以改善胰腺肿瘤患者的免疫机能,加强人体的抗肿瘤免疫应答,是治疗胰腺肿瘤患者的一个方法。
细胞外因子 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞及原液
肝癌细胞HepG2由吉林大学李媛媛老师惠赠, 并由作者单位疫苗一室保存。IL-2、IFN-α2a及GM-CSF由作者单位细胞因子室提供;乙肝疫苗原液由作者单位疫苗一室提供。
1.1.2 试剂及仪器
精制小牛血清购自武汉三利生物技术有限公司;DMEM培养基购自美国GIBCO公司;WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所;倒置显微镜 (IX71-F22PH) 购自日本奥林巴斯公司;CO2孵箱 (MCO175型) 购自日本SANYO公司;酶标仪 (Sunrise) 购自TECAN公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
常规复苏肝癌细胞HepG2, 于含10%小牛血清、1%谷氨酰胺、1%卡那霉素的DMEM培养液, 37℃、5% CO2孵箱中培养, 细胞长成单层后, 0.25%胰蛋白酶消化, 每3～5 d传代1次。
1.2.2 正交试验设计
综合考虑3种细胞因子组合对肝癌细胞生长的影响, 设计3因素3水平正交实验, 见表1, 用L9 (34) 正交表安排实验。
1.2.3 细胞生长抑制试验
采用MTT法。取生长状态良好的HepG2细胞, 消化、适当稀释, 制成细胞悬液计数后, 接种于96孔培养板内, 每孔100μl, 1×103个细胞。隔夜后分别加入药物, 以用PBS稀释的不同浓度细胞因子组合试剂 (含HBsAg 5μg/ml) 作为实验组, 分别于24、48、72和96h加入各孔细胞中, 每组6复孔, 以等量的生理盐水作为阴性对照组。加药96h后, 吸出各孔液体, 每孔加入90μl DMEM及10μl WST-1溶液。37℃、5%CO2孵箱培养2h, 将96孔板置于摇床上振荡1min, 以充分混匀待检测体系。在450nm测定吸光度值, 以加相应量细胞培养液和WST-1溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照, 实验重复3次。计算细胞生长抑制率。
抑制率 (%) = (1-实验组平均A450值/阴性对照组平均A450值) ×100%。
1.2.4 细胞形态学观察
在MTT实验中, 加WST-1溶液之前用倒置相差显微镜观察各组培养孔内细胞形态结构的变化, 并照像。
2 结果与分析
2.1 细胞生长抑制试验
处理96h后, 不同浓度细胞因子组合对HepG2细胞的抑制率见表2。经分析, IFN-α2a、IL-2和GM-CSF对HepG2细胞生长的抑制率影响的主次顺序为IFN-α2a、GM-CSF和IL-2, 并且最佳组合为A1B1C1。3种细胞因子在最佳组合的条件下, 对HepG2细胞的抑制率为64.61%。
2.2 细胞形态学观察
显微镜下观察可见, 3种细胞因子组合试剂处理96 h后, 在体外可明显抑制肝癌细胞HepG2的生长, 细胞逐渐变圆, 胞浆中颗粒增多, 增殖变慢, 细胞间接触不紧密, 细胞周围碎片增多。加无菌生理盐水处理的细胞呈上皮样贴壁生长, 细胞边缘清晰, 细胞间接触紧密, 生长旺盛。见图1。
A: A1B1C1组合试剂;B: 生理盐水对照组。
3 讨论
IL-2既可用于治疗乙型肝炎, 又是很好的免疫佐剂, 其是机体免疫应答核心物质, 系目前首选抗肿瘤生物治疗药物。李文波等[4]在观察重组人白细胞介素2 (rhIL-2) 作为佐剂, 对HBV基因疫苗诱导BALB/c小鼠产生免疫应答的影响中发现, IL-2可明显增强HBV基因疫苗的免疫效应。α-干扰素 (IFN-α) 是一种多功能免疫调节因子, 可诱导细胞产生抗病毒蛋白, 具有独特的抗病毒作用, 对恶性肿瘤也有明显的疗效。杨永峰等[5]通过体外实验证明了干扰素可抑制Hep G2.2.15细胞内乙肝病毒基因的转录和表达。乔世峰等[6]研究也表明, 低剂量的干扰素-α可以直接抑制肝癌细胞株BEL-7402的增殖。Hagelstein 等[7]证明IFN-ω和IFN-α在体外具有相同的抗HBV作用。GM-CSF作为乙型肝炎疫苗的佐剂在国外已有临床报道[8], 费迎明等[9]通过对GM-CSF作为乙肝疫苗佐剂进行免疫效果观察, 结果发现能明显提高易感人群的抗-HBs阳转率, 与对照组比较差异有非常显著意义。本实验将3种细胞因子以适宜比例组合后, 将其作为疫苗佐剂, 有望提高疫苗的免疫原性和机体的免疫应答, 从而在清除体内HBV的过程中起到重要的作用。
本研究结果表明, 3种细胞因子组合试剂处理96 h后, 在体外可明显抑制肝癌细胞HepG2的生长, 最高抑制率达64.61%, 其抗肝癌活性及具体的作用机制可能是诱使肝癌细胞发生凋亡, 有待深入研究。实验中, 3种细胞因子仅设计了3种浓度, 筛选到最佳组合, 是否还有更加合适比例的组合, 还需进一步研究。本实验为后续体内动物实验及最终筛选合适的疫苗佐剂奠定了基础, 也为新型乙肝疫苗及治疗性乙肝疫苗的研究提供了参考。
参考文献
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[2]张琳, 马龙, 刘涛, 等.琐琐葡萄提取物多糖、黄酮对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用[J].新疆医科大学学报, 2009, 32 (5) :529-532.
[3]朱丽红, 刘小东, 谭宇蕙, 等.吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2的生长抑制及诱导凋亡作用[J].中国药理学通报, 2009, 25 (1) :68-71.
[4]李文波, 姚志强, 周永兴, 等.不同剂量白细胞介素2作为乙型肝炎病毒核酸疫苗佐剂的效应[J].免疫学杂志, 2001, 17 (1) :27-29.
[5]杨永峰, 谭德明, 谢玉桃, 等.干扰素及拉米夫定抗乙型肝炎病毒的体外实验研究[J].疾病控制杂志, 2004, 8 (3) :209-212.
[6]乔世峰, 王季堃.干扰素-α对人肝癌细胞增殖及侵袭的抑制作用[J].世界华人消化杂志, 2005, 13 (8) :1021-1023.
[7]Hagelstein J, Kist A, Stremmel W, et al.Antiviral potential of inter-feron-omega on hepatitis B virus replication in human hepatoma cells[J].Arzneimittel-Forschung, 1998, 48 (3) :343-347.
[8]Cruciania M, Mengolib C, Serpellonia G, et al.Granulocyte macro-phage colony-stimulating factor as an adjuvant for hepatitis B vaccination:A meta-analysis[J].Vaccine, 2007, 25 (4) :709-718.
细胞外因子 篇8
1 材料与方法
1.1 材料
细胞来源:LO2 细胞购自武汉博士德生物公司。IMDM培养基购自武汉博士德公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司, 骨化三醇购自美国Cayman公司, OA购自天津风船化学试剂科技有限公司, 引物及Trizol试剂盒购自上海生工, K1622 试剂盒购自美国Thetmo公司, SYBR Green试剂盒购自美国Roche公司, 三酰甘油 (TG) 、上清液谷草转氨酶 (AST) 试剂盒购自中生北控生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及分组LO2 细胞用含10%胎牛血清IMDM培养基培养, 在37℃、5% CO2孵育箱中培养, 胰酶-EDTA消化传代, 调细胞密度至5×107/L接种于6孔培养板培养24 h, 更换培养基后加入不同浓度骨化三醇培养24 h, 再加入OA作用24 h。 将细胞分为5组:1对照组:不进行任何干预;2模型组:OA 0.2 mmol/L;3干预组1:OA 0.2 mmol/L+骨化三醇10-8mol/L;4 干预组2:OA 0.2 mmol/L+骨化三醇10-7mol/L;5干预组3:OA 0.2 mmol/L+骨化三醇10-6mol/L。
1.2.2 检测TG、AST含量取干预好的各组细胞和上清液, 按试剂盒说明书要求, 用全自动生化分析仪 (Sysmex Chemix-180) 进行检测。
1.2.3 荧光实时定量PCR检测SOCS-3 m RNA的表达将细胞接种于50 m L培养瓶, 按以上方法进行培养、分组和干预。 收集各组细胞, 按Trizol试剂盒说明提取总RNA, 按K1622 试剂盒说明逆转录成c DNA, 之后进行PCR扩增反应, PCR反应条件按照SYBR Green试剂盒说明书设置。 引物采用primer design软件设计, 由上海生物工程公司合成。 SOCS-3 上游产物:5'-ACCAGCGCCACTTCTTCACA-3', 下游引物:5'-GTGGAGCATCATACTGGTCC-3', PCR产物为450 bp。 人GAPDH上游引物:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'; 下游引物:5'-AGGGGCCATCCACAGTCT TC-3', PCR产物238 bp。 利用实时荧光定量PCR仪自带软件进行相关数据处理, 以人GAPDH为内参基因, 计算Ct值, 采用2-ΔΔCt法计算基因的表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0 软件, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 两独立样本的计量资料采用t检验, 多个样本均数的比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD-t法, 以P < 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组细胞内三酰甘油及细胞上清液谷草转氨酶的含量比较
模型组TG含量为 (362.43±22.20) mg/d L, 较对照组细胞内TG含量[ (175.78±7.69 ) mg/d L]明显增多 (t =15.98, P < 0.01) ; 模型组上清液AST含量为 (5.55±0.46) U/L, 较对照组[ (0.63 ±0.33) U/L] 显著升高 (t =17.26, P < 0.01) 。干预组细胞内TG含量分别为 (286.87±16.01) 、 (257.16±11.73) 、 (209.43±27.79) mg/d L, 较模型组均有所降低; 干预组细胞上清液AST含量分别为 (4.98±0.50) 、 (4.23±0.36) 、 (3.50±0.48) U/L, 较模型组AST含量均有降低;且TG、AST含量随着骨化三醇浓度的增加而降低。 TG的F值为60.72, AST的F值为79.45, 均P < 0.01。 见表1。
注:与对照组比较, aP < 0.01; 与模型组比较, bP < 0.01;TG: 三酰甘油;AST:谷草转氨酶
2.2 各组细胞因子信号转导抑制因子-3 的表达比较
模型组SOCS-3 m RNA表达为 (4.61±0.39) , 较对照组 (1.00±0.00) 明显上升 (t = 8.76, P < 0.01) ;干预组SOCS-3 m RNA表达分别为 (3.71±0.69) 、 (2.67±0.70) 、 (1.31±0.42) , 较模型组SOCS-3 m RNA表达均有所下降 (P < 0.05) , 且随着骨化三醇浓度增加而降低 (F = 22.13, P < 0.01) 。 见表2。
注:与对照组比较, aP < 0.01;与模型组比较, bP < 0.05;SOCS-3:细胞因子信号转导抑制因子-3
3 讨论
NAFLD是目前西方国家最常见的肝病, 我国非酒精性脂肪肝的患病率也在不断升高, 其发病机制尚未完全明了, 且预防与治疗手段有限。近年很多研究表明低骨化三醇水平与很多肝病的严重程度及预后有直接关系, 如原发性胆汁淤积性肝硬化[6]、自身免疫性肝炎[7]、酒精性肝癌[8]和乙型病毒性肝炎[9]等, Barchetta等[3]研究发现低骨化三醇水平和NAFLD存在很强关联, 但其具体作用机制目前尚未明确。
SOCS-3 是一类有抑制Janus类激酶信号转导与转录活化因子 (januskinases-signal transducers and ac-tivators of transcription, JAK-STAT) 作用的调节因子, 包括SOCS1-7 和CIS (细胞因子诱导的含SH2 蛋白) , 其中SOCS-3 与肝脏的关系最为密切, SOCS-3 广泛分布于肝脏、脂肪、胰腺、肾脏等组织器官, 它可以抑制胰岛素合成、 胰岛细胞增殖以及胰岛素信号的转导。 Sachithanandan等[4]研究发现:肝脏SOCS-3 过表达可以导致胰岛素抵抗, 而胰岛素抵抗是目前已知的导致NAFLD发病最重要的一个环节, “二次打击”学说认为首次打击就是胰岛素抵抗导致的脂质代谢紊乱[10], 而Bulgianesi等[11]研究表明胰岛素抵抗不仅参与初次打击还参与二次打击, 所以SOCS -3 在NAFLD的发病中起重要作用。
本实验以OA诱导LO2 细胞脂肪变性为模型, 探讨骨化三醇对脂肪变肝细胞TG代谢及SOCS-3 基因表达的影响。 本实验结果为:随着骨化三醇干预浓度的增高, LO2 细胞内TG、细胞上清液AST含量随之降低。 该结果表明骨化三醇可以抑制LO2 细胞脂肪变, 改善肝功能, 这与李艳芳等[12]通过非酒精性脂肪肝鼠的模型证明骨化三醇可减轻脂肪肝程度、改善肝功能的实验结果相一致。
为探明其可能的作用机制, 本研究用实时荧光定量PCR检测各组细胞SOCS-3 m RNA的表达, 结果表明:随着骨化三醇浓度增高, 各组细胞SOCS-3 m RNA的表达随之降低, 骨化三醇可抑制LO2 细胞中SOCS-3 m RNA的表达。 这与Morales等[5]发现的骨化三醇可抑制骨肉瘤细胞中SOCS-3 表达的结果相一致。
本实验结果提示骨化三醇可抑制LO2 细胞脂肪变, 改善肝功能, 其作用机制可能与骨化三醇抑制SOCS-3 m RNA的表达有关。 该实验结果为非酒精性脂肪肝的预防与治疗提供了新思路。
摘要：目的 研究骨化三醇对脂肪变肝细胞三酰甘油代谢及细胞因子信号转导抑制因子-3 (SOCS-3) 基因表达的影响。方法 以油酸 (OA) 诱导正常人肝细胞LO2脂肪变为模型, 按加入骨化三醇浓度的不同 (10-8、10-7、10-6 mol/L) 分为三个干预组, 设空白对照组。干预组先加入不同浓度骨化三醇干预24 h, 之后加0.2 mmol/L的OA 24 h。检测细胞内三酰甘油 (TG) 、上清液谷草转氨酶 (AST) 含量, 采用实时荧光定量PCR检测各组细胞SOCS-3 mRNA的表达, 多组间比较采用单因素方差分析进行数据分析。结果 模型组TG[ (362.43±22.20) mg/dL]、AST[ (5.55±0.46) U/L]、SOCS-3 mRNA表达 (4.61±0.39) 均较对照组[ (175.78±7.69) mg/dL、 (0.63±0.33) U/L、 (1.00±0.00) ]明显增高 (P<0.01) ;干预组TG分别为 (286.87±16.01) 、 (257.16±11.73) 、 (209.43±27.79) mg/dL, AST分别为 (4.98±0.50) 、 (4.23±0.36) 、 (3.50±0.48) U/L, SOCS-3 mRNA表达分别为 (3.71±0.69) 、 (2.67±0.70) 、 (1.31±0.42) , 较模型组均有所下降, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。结论 骨化三醇可抑制肝细胞脂肪变, 其作用机制可能与骨化三醇抑制SOCS-3的表达有关。
细胞外因子 篇9
关键词：乙肝患者,流式细胞仪,外周血,T淋巴细胞亚群
乙肝是由乙肝病毒 (HBV) 所引起的, 在世界范围内流行, 我国是HBV感染流行区, 乙肝已是我国最重要的公共卫生问题之一[1]。乙肝病毒不会直接对肝脏造成损害, 而是通过诱发机体免疫反应间接损害。在肝细胞损害中有着决定性作用的是细胞免疫, 通过T细胞对患者抗原激活和识别产生趋化因子和调节因子, 进而影响病程及预后[2]。我们选择流式细胞仪和基因芯片技术对不同亚型的乙肝患者外周血淋巴细胞进行检测, 分析其相关性和正常健康患者的比较, 探求一种科学的检测方法, 为乙肝诊治提供依据。现将有关情况汇报如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2011年7月—2012年3月来我院进行肝病检查治疗的患者120例, 其中慢性乙型肝炎患者 (CHB) 、肝炎肝硬化患者 (LC) 、慢性重型肝炎患者 (SH) 各30例, 正常健康患者30例作为对照组。患者的诊断均符合我国制定的病毒性肝炎诊断和预防标准[3], 肝病患者中, 男42例, 女48例;患者的年龄在17岁~68岁之间, 平均年龄 (38.2±18.5) 岁。对照组中, 男患者17例, 女患者13例;患者的年龄在20岁~72岁之间, 平均年龄 (39.6±20.5) 岁。2组性别、年龄以及病程方面均没有显著性差异 (P>0.05) , 具有可比性。所有患者均在知情且自愿的情况下参与此次研究。
1.2 方法
选择美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪对患者进行外周血淋巴细胞 (主要是CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+) 检测, 采用杭州博赛基因诊断有限公司研制生产的试剂进行HBV基因型别、HBV P区204、552位点、HBV C区1762、1764位点变异的检测, 同时检测白细胞介素、HBV-DNA、抗核抗体、免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M, 转氨酶等实验室指标, 并观察患者以上指标与临床的相关性。
在患者入院后的次日清晨抽取空腹静脉血, 并采用2 m L的EDTA抗凝血进行保存, 选择分层液的密度梯度进行离心, 将制备好淋巴细胞的悬液在6 h内进行分析。在试管中加入120μL抗体及50μL抗凝全血, 3 s振荡摇匀, 在室温下避光放置约20 min后加入1 m L的溶血素, 振荡摇匀后在室温下放置10 min, 避光, 进行4 min离心, 1 200转/min, 弃上清液, 并加入1 m L的PBS, 进行1 200转/min离心, 弃上清液, 并加入400μL的PBS上机进行检测, 分析数据。HBV-DNA的检测采用聚合酶链式反应 (PCR) 进行, 每次设立每毫升浓度为107、106、105、104等4个标准品, 还要设立阴性、强阳性、临界阳性以空管等对照。
1.3 观察指标
用流式细胞仪进行CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+检测, 观察数据, 得出计数, 将其与对照组计数进行比较。乙肝病毒脱氧核糖核酸 (HBV-DNA) 的检测中, 灵敏度100拷贝/m L在1.0×103拷贝/m L以上为阳性, 观察患者与对照组之间的差异。
1.4 统计学方法
使用SPSS15.0统计学软件进行数据统计, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CHB患者外周血T淋巴细胞亚群的比较
CHB患者的T淋巴细胞亚群较对照组而言有所减少, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表1。
2.2 LC患者外周血T淋巴细胞亚群的比较
LC患者的T淋巴细胞亚群低于对照组患者, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表2。
2.3 SH患者外周血T淋巴细胞亚群的比较
SH患者的T淋巴细胞亚群较明显少于对照组患者, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表3。
3 讨论
HBV是一种非细胞毒性的病毒, 其进入机体之后会引起一系列较复杂的免疫反应, 而患者机体会针对HBV编码的各种抗原成分而产生强弱不等的免疫应答, 与感染HBV不同的临床结果之间有密切的关系。在感染HBV和肝脏损伤的过程中, T细胞反应强度将决定病毒在急性的感染后是被清除还是潜伏背景下继续存在, 后者可能会导致患者肝癌的发生。所以, 对患者使用流式细胞术进行检测可以及时了解乙肝感染状况和免疫情况, 为临床诊断治疗提供了很大的帮助。
FCM可以测量患者染色细胞的荧光强度, 是从单细胞分析及分选基础上发展起来的, 对化学、物理等性质进行快速检测, 如密度、大小、DNA、RNA、内部结构、蛋白质等[4]。随着荧光色素化学、单克隆抗体技术的发展, 流式细胞术已成为现代技术杂交体。正常免疫学正在不断涉足其他领域, 相应的流式细胞学以其灵活、定量、快速等特点在免疫学研究中得到广泛的应用, 也在不断地改进和完善[5]。它不仅补充了荧光显微镜的功能, 还兼具二者的优点, 进而在各个方面发挥着重要的作用。在肝病研究中, 它可以动态检测患者辅助诱导性T细胞和抑制杀伤性T细胞比值变化, 进而判定细胞免疫平衡状态;其次, 流式细胞术可以对患者肝组织细胞DNA含量的变化进行检测, 从而对恶性肿瘤进行早期预测;急性重症肝炎患者在早期多伴有T淋巴细胞活化, 对患者T细胞活化状态进行检测, 可以预测肝坏死;对患者不同发病时期的细胞因子分泌状态进行研究检测, 观察患者细胞因子在肝病发展中的变化。在我们的研究中发现, CHB、LC、SH患者的外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+较正常患者而言有明显减少, 差异非常显著。
综上所述, 流失细胞仪具有高准确性、高灵敏度、高重复性等优点, 其操作简单、使用安全、清洁无毒, 对环境不会带来危害, 为疾病诊治提供准确的依据, 值得在临床上推广使用。
参考文献
[1]刘妍, 许智慧, 刘立明, 等.我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点[J].解放军医学杂志, 2012, 37 (6) :539-543.
[2]叶红珍, 李志勇.不同类型HBV感染人群T细胞对HBV抗原蛋白免疫应答的差异分析[J].免疫学杂志, 2013, 29 (11) :984-987.
[3]刘金涛.自身抗体在临床自身免疫性肝病中的作用和诊断意义[J].中国免疫学杂志, 2013, 29 (6) :669-672.
[4]丁宁, 黄丽利, 刘妍, 等.乙肝患者HBV特异性细胞毒T淋巴细胞的分析[J].解放军医学杂志, 2011, 36 (4) :361-364.