黏附因子（精选6篇）
黏附因子 篇1
肝硬化(hepafic cirrhosis)是我国常见疾病和主要死亡病因之一,本试验对肝硬化患者血清可溶性血管细胞黏附分子-1(soluble vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)、可溶性细胞间黏附分子-1(soluble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1)、及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的浓度进行测定,并探讨其临床意义,旨在揭示黏附分子及肿瘤坏死因子在肝硬化发病机制中的作用。
1 资料与方法
1.1 病例选择
随机选取我院2008—01～2008—10消化内科住院病人,其病史、临床症状、体征、及辅助检查符合诊断标准的肝硬化患者54例,其中男44例,女10例,平均年龄(58.94±11.28)岁。采用child-pugh分级(A级≤6分,B级7～9分,C级≥10分),A级18例,其中男14例,女4例,平均年龄(54.83±10.95)岁;B级19例,其中男16例,女3例,平均年龄(60.21±11.48)岁;C级17例,其中男14例,女3例,平均年龄(61.88±10.76)岁。正常对照组21例,选自门诊体检健康者,其中男16例,女6例,平均年龄(56.86±10.18)岁。所有入选者均无肿瘤、无自身免疫疾病史,近期无重大外伤史,手术史。
1.2 检测方法
肝硬化患者于入院第二天晨起空腹采血,门诊体检者在门诊采血。离心取血清,血清标本保存于-30℃冰箱待测。sVCAM-1、sICAM-1测定采用酶联免疫吸附法(ELISA),TNF-α测定采用放射免疫分析法,试剂盒购自哈尔滨博远分子生物仪器有限公司,操作严格按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学处理
所有资料采用SPSS10.0统计软件处理,数据以均数±标准差undefined表示,进行正态性检验、T检验、方差分析、相关分析。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1
与正常对照组相比,肝硬化组血清sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α水平显著升高(P<0.01);不同肝功能组血清sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α水平与对照组比较,显示不同肝功能组血清sVCAM-1、sICAM-1、 TNF-α水平随肝功能减退而明显升高。见表1。
注:*与对照组相比P<0.01。
2.2 两因素相关性分析
血清TNF-α与血清sVCAM-1呈正相关(r=0.398,P<0.01);血清TNF-α与血清sICAM-1呈正相关(r=0.436,P<0.01)。
3 讨论
血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)均是免疫球蛋白超家族成员。sVCAM-1、sICAM-1分别是VCAM-1及ICAM-1的可溶形式,二者共同参与白细胞或淋巴细胞与其他细胞间的相互作用,引导白细胞或淋巴细胞穿过血管壁进入组织,发挥炎症性损伤作用。在炎症状态下,VCAM-1及ICAM-1参与白细胞与肝窦内皮细胞的黏附,完成其跨膜迁移、黏附并损伤肝细胞等病理生理过程,随着肝细胞炎症活动的发展,肝纤维化程度也进行性提高。研究发现,前炎症细胞因子及内毒素可诱导培养正常肝细胞表达sVCAM-1、sICAM-1增加,进而促进单核细胞及T淋巴细胞浸入到肝脏实质,与肝细胞损害程度及细胞免疫密切相关。肝硬化患者sVCAM-1、sICAM-1水平明显高于正常对照组,且随肝功能障碍的加重而逐渐升高,这均说明血清sVCAM-1、sICAM-1的升高与肝细胞损伤、肝功能障碍关系密切,其水平的高低可反映肝硬化病变的严重程度。血清sVCAM-1、sICAM-1水平与Child分级亦相关。对判断疾病的预后有一定的帮助,血清sVCAM-1、sICAM-1水平监测可作为临床观察肝硬化患者病变活动的重要免疫学指标[1,2,3]。
TNF-α是一类重要的细胞因子,由活化的巨噬细胞和T细胞产生,在炎症反应、细胞免疫应答、肿瘤免疫中发挥关键作用。细菌、病毒感染、免疫复合物等因素可导致枯否细胞大量释放TNF-α参与肝损伤过程,是介导肝损伤的主要和终末介质。TNF-α与肝组织炎症坏死及肝纤维化程度密切相关,在肝硬化的发生发展中参与肝脏的损伤-修复循环,最终引起肝脏大量细胞外基质的合成和沉积,从而导致肝纤维化或肝硬化。Aslanidis等[4]认为TNF-α似乎通过刺激凋亡途径来参与肝纤维化的发生。肝纤维化程度越明显,肝组织内TNF-α和阳性细胞数越多,而正常肝组织中则无或仅有少量。
本研究表明肝硬化组患者血清sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α水平较正常对照组明显升高。提示在肝硬化的发病过程中,存在着由sVCAM-1 、sICAM-1、TNF-α介导的免疫炎性反应。另外血清sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α水平与肝功能 Child—pugh分级变化呈正相关,即随着肝功能Child—pugh分级增加,sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α水平逐渐增高,在肝功能分组中呈现Child C组>Child B组>Child A组。提示了肝功能越差,sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α水平升高越明显,sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α水平能较好反映肝功能状况,同时sVCAM-1与TNF-α呈正相关,sICAM-1与TNF-α呈正相关,说明在一定浓度范围内,TNF-α可能使血管内皮细胞sVCAM-1、sICAM-1表达上调,其诱导作用呈浓度依赖性增强。sVCAM-1、sICAM-1、TNF-α在肝硬化进程中起重要作用。随着病理生理和生化的研究进展,更重视减少肝硬化患者致炎性细胞因子的生成,从而减少间质的炎性反应和肝纤维化,进而可能延缓肝硬化的进展。
参考文献
[1]王若伦,晓光.重组生长激素与人血清白蛋白治疗肝硬化低蛋白血症的疗效比较[J].广州医学院学报,2001,29(3):10-11
[2]庄明明,问奕欣,洪晓鹏,等.肝硬化患者治疗前后可溶性细胞间黏附分子-1水平变化及其临床意义[J].国外医学放射医学核医学分册,2005,29(3):118-120
[3]王丽莉,孙晓辉,王德荣.肝硬化病人血清sVCAM-1检测的临床意义[J].世界感染杂志,2004,4(5):478-479
[4]Aslanidis S,Vassiliadis T,Pyrpasopoulou A,et a1.Inhibition ofTNFalpha does not induce viral reactivation in patients withchronic hepatitis C infection:two cases[J].Clin Rheumatol,2007,26(2):261-264
黏附因子 篇2
1 材料与方法
1.1 主要试剂
胎牛血清(Gibco,美国),磷酸盐缓冲液(Hy Clone,美国),PDGF-AB、TGF-β1、VEGF(Peprotech,美国),CCK-8(Dojindo,日本)。
1.2 大鼠脂肪干细胞的分离培养
无菌切取大鼠腹股沟处的脂肪组织,采用酶消化法原代培养SD大鼠ADSCs,待细胞融合至80%时,按1∶3传代培养,取第3代ADSCs用于实验。
1.3 ADSCs的鉴定
采用多向诱导分化的方法鉴定ADSCs。具体方法参见文献[3]。取第3代ADSCs,按每孔1×104(成骨诱导)或每孔2.1×104(成脂诱导)的密度接种于6孔板中,24 h后换为成骨或成脂诱导培养基。每3 d换液1次,培养3周后茜素红和油红O染色。
1.4 PRF膜的制备
用无菌真空采血管负压抽取志愿者10 ml血液,即刻3 000 r/min离心10 min。具体方法参见文献[3]。用无菌纱布将PRF挤压成膜状,制备成5 mm×5 mm大小待用。
1.5 增殖实验
96孔板中每孔加入2×103个ADSCs,向实验组孔中加入含有PRF膜或不同浓度TGF-β1(0、0.5、1、2、5、10 ng/ml)、PDGF-AB(0、0.1、1、10 ng/ml)、VEGF(0、5、10、20、30、40 ng/ml)的α-MEM培养液,阳性对照组为含10%FBSα-MEM培养基,阴性对照组为不含10%FBSα-MEM培养液。每组设5个重复孔,分别置于培养箱中培养1、3、5、7 d。每次检测时,加入含有10%CCK-8的等量新鲜培养液置于培养箱中培养2h,然后酶标仪450 nm测定吸光度值(A值)。
1.6 黏附实验
预处理24孔板。24孔板中每孔加入1×105个AD-SCs,向实验组孔中加入含有PRF膜或不同浓度三因子的α-MEM培养液,阳性对照组为含10%FBSα-MEM培养基,阴性对照组为含2%FBSα-MEM培养基。放置细胞培养箱中孵育2 h。每组选取2个实验孔,经4%多聚甲醛固定后,1%甲苯胺蓝染色,镜下观察细胞的黏附形态,剩余3孔常规消化后细胞计数。
1.7 统计学分析
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据用±s表示,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ADSCs的鉴定结果
第3代的ADSCs经成骨诱导21 d后茜素红染色,可见明显的红色团块形成即钙结节形成(图1A);成脂诱导21 d后油红O染色,胞质内出现大量红染的脂滴(图1B)。
A:成骨诱导(茜素红染色);B:成脂诱导(油红O染色)A:Osteogenic induction(alizarin red staining);B:Adipogenic induction(oil red O staining)
2.2 PRF对ADSCs的增殖的影响
CCK8结果显示,第1、3、5、7天PRF组递增的A值均显著高于阴性对照组(P<0.05),与阳性对照组递增的A值相近(图2)。
2.3 PRF所含因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF对AD-SCs增殖的影响
CCK8实验结果显示,ADSCs在不同浓度PDGF-AB的作用下,各浓度组随着时间的递增,浓度的增加,A值均显著增高,其中10 ng/ml PDGF-AB A值明显高于阴性对照组(P<0.05);ADSCs在不同浓度VEGF的作用下,在不同的时间点(1、3、5、7 d)各浓度组的A值均高于阴性对照组,其中10 ng/ml VEGF明显高于阴性对照组(P<0.05);ADSCs在不同浓度TGF-β1的作用下,各浓度组随时间的递增,A值均低于阴性对照组;AD-SCs分别在2 ng/ml TGF-β1、10 ng/ml PDGF-AB、10 ng/ml VEGF的作用下,在不同的时间点(1、3、5、7 d),10ng/ml PDGF-AB的A值均高于10 ng/ml VEGF,2 ng/ml TGF-β1 A值均低于阴性对照组,组间差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。
2.4 PRF对ADSCs黏附的影响
镜下可见阴性对照组的黏附细胞较少,细胞大多皱缩似球形,有少量的细胞呈伸展状态,伸出的伪足少而短(图3A)。PRF组ADSCs黏附呈密集状且伸展状态较好,大多呈梭形或倒三角形,少量状似球形,ADSCs伸出了大量的伪足与邻近的ADSCs呈拉网样接触(图3B)。镜下计数可见,PRF组黏附细胞数显著高于阴性对照组(P<0.05);与阳性对照组黏附细胞数相近(图3C)。
2.5 PRF所含因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF对AD-SCs黏附的影响
在不同浓度TGF-β1的作用下,随着浓度的增加细胞黏附形态逐渐由球形向梭形过渡,ADSCs伸出的伪足数量逐渐增多并与邻近的ADSCs逐渐呈拉网样接触(图3D);黏附细胞的数目亦不同,与阴性对照组相比TGF-β1各浓度组的黏附细胞数均高于此对照组且随着浓度的增加黏附细胞数增多,组内差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。在不同浓度PDGF-AB的作用下,ADSCs大多皱缩似球形,有少量的细胞呈伸展状态且伸出的伪足短而少(图3E);与阴性对照组相比PDGF-AB各浓度组的黏附细胞数均显著低于对照组,组内差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。在不同浓度VEGF的作用下,细胞黏附形态与PRF组最为接近(图3F);黏附细胞的数目亦不同,与阴性对照组相比VEGF各浓度组的黏附细胞数均高于对照组且在10 ng/ml VEGF组作用下,黏附细胞数最多,组内差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。ADSCs分别在2 ng/ml TGF-β1组、10 ng/ml PDGF-AB组、10 ng/ml VEGF组的作用下,10 ng/ml VEGF组黏附细胞数高于2 ng/ml TGF-β1组,显著高于10 ng/ml PDGF-AB组,组间差异有统计学意义(P<0.05)。
A:阴性对照组;B:PRF组;C:阳性组对照组;D:2 ng/ml TGF-β1组;E:10 ng/ml PDGF-AB组;F:10 ng/ml VEGF组A:Negative control group;B:PRF group;C:Positive control group;D:2 ng/ml TGF-β1 group;E:10 ng/ml PDGF-AB group;F:10 ng/ml VEGF group
3 讨论
内源性骨组织的再生依赖于成体干细胞在局部特有的微环境的下发生归巢、黏附、增殖和分化,进而促进组织的再生修复。Dohan等[4]的研究发现PRF膜经制备后的血小板缓慢地被激活,α-颗粒亦非集中的脱颗粒,PRF所含因子一部分被包绕于纤维蛋白支架,另一部分与纤维蛋白多聚体形成稳定的化学结合,其可持续释放至少达1周的时间。研究显示,作为因子综合体的PRF能够促进骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞和牙周膜干细胞的增殖。故PRF膜及其所含的因子可均衡而又持久的贯穿细胞增殖的整个过程。然而在大鼠ADSCs的增殖过程中PRF所含三因子的作用尚未明确,故本实验采用CCK8法检测PRF及其所含因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF对ADSCs增殖的影响。结果显示PRF组中ADSCs的增殖活性随着时间的延长逐渐增高。PDGF-AB各浓度组在同一时间点以及组内的不同时间点(P<0.05),PDGF-AB组中ADSCs的增殖活性随着时间的递增、浓度的增加而逐渐增加,尤以10 ng/ml PDGF-AB对ADSCs的增殖活性的影响最为突出。此结果的出现可能与血小板源性生长因子能够促使细胞周期从G0/G1期向S期的转换,上调cyclin D1的表达和Rb的磷酸化有关[5]。TGF-β1各浓度组在同一时间点以及组内的不同时间点,A值均低于阴性对照组,提示TGF-β1可能抑制ADSCs的增殖。这恰与Lee等[6]认为TGF-β1抑制细胞的生长的结论一致。VEGF各浓度组在同一时间点以及组内的不同时间点(P<0.05),低浓度组的增殖活性不断提高待浓度达10 ng/ml时的增殖活性达顶峰,再增加其浓度增殖活性不再增加。以10ng/ml PDGF-AB,10 ng/ml VEGF进行比较(P<0.05),PDGF-AB促增殖活性作用优于VEGF。
脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞,其与载体的黏附是基础,决定性的影响了后续发生的增殖和成骨分化。黏附实验除了比较同一时间内黏附细胞数目上的差异,细胞于材料表面铺展的形态学差异亦是反映细胞早期黏附能力的强弱的重要指标。结果显示PRF组黏附细胞数与阴性对照组相比(P<0.05)和结合形态学观察,提示PRF能够显著促进ADSCs的黏附。不同浓度的PDGF-AB组黏附细胞数均低于阴性对照组,组内比较(P>0.05)和结合形态学观察,提示PDGF-AB不能够促进ADSCs的黏附。该结果的出现与PDGF通过减慢黏着斑的组装进程和抑制应力纤维带形成,抑制了paxillin的酪氨酸磷酸化,从而抑制了平滑肌细胞的黏附这理论一致[7]。不同浓度的TGF-β1组黏附细胞数随着浓度的升高而不断增加,组内比较(P<0.05)和结合形态学观察,提示TGF-β1能够促进ADSCs的黏附。有研究表明,TGF-β1通过刺激整合素连接激酶、PINCH蛋白以及桩蛋白等的表达来增加整合素β1及黏着斑激酶活性,来促进细胞的黏附[8]。不同浓度的VEGF组黏附细胞数与阴性对照组相比(P<0.05)结合形态学观察,提示VEGF促进了ADSCs的黏附。这可能与VEGF能够促进FAK和paxillin的酪氨酸磷酸化,募集磷酸化的黏着斑蛋白至新生的黏着斑处,促进黏着斑的组装,加快了细胞黏附的进程有关[9]。以2 ng/ml TGF-β1组,10ng/ml VEGF组进行组间比较(P<0.05)和结合形态学观察,提示VEGF促黏附作用优于TGF-β1。
综上所述,PRF所含因子TGF-β1、VEGF在AD-SCs的黏附过程中发挥重要作用,而PRF所含因子PDGF-AB、VEGF在ADSCs的增殖过程中发挥重要作用,由此可见作为因子综合体的PRF有潜在的临床应用价值,但对于PRF所含因子所参与的ADSCs黏附和增殖的信号通路有待进一步的研究。
摘要：目的:研究富血小板纤维蛋白(PRF)及其所含三因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF分别对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)增殖和黏附的影响。方法:将ADSCs培养在含有PRF膜和不同浓度的PDFG-AB、TGF-β1、BEGF中,细胞黏附实验检测培养2 h后细胞黏附能力,CCK-8法检测培养1~7 d细胞增殖。结果:黏附实验显示,PRF组的黏附细胞数显著高于阴性对照组(P<0.05);不同浓度的PDGF-AB组内黏附细胞数的差异无统计学意义(P>0.05);不同浓度的TGF-β1、VEGF组内黏附细胞数的差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8实验表明,PRF组的细胞增殖在各个时间点(1、3、5、7 d)显著高于阴性对照组(P<0.05);不同浓度的PDGF-AB、VEGF组内细胞的增殖差异有显著性(P<0.05);不同浓度的TGF-β1组细胞增殖的差异无显著性(P>0.05)。结论:PRF能提高ADSCs的增殖和黏附的能力。PDGF-AB和VEGF可促进ADSCs的增殖;TGF-β1和VEGF均可促进ADSCs的黏附,并呈一定的量效正相关。
关键词：富血小板纤维蛋白(PRF),脂肪干细胞(ADSCs),细胞增殖,细胞黏附,转化生长因子(TGF-β1),血小板源性生长因子-AB(PDGF-AB),血管内皮生长因子(BEGF)
参考文献
[1]Lee CH,Cook JL,Mendelson A,et al.Regeneration of the articular surface of the rabbit synovial joint by cell homing:A proof of concept study[J].Lancet,2010,376(9739):440-448.
[2]Mendelson A,Frank E,Allred C,et al.Chondrogenesis by chemotactic homing of synovium,bone marrow,and adipose stem cells in vitro[J].FASEB J,2011,25(10):3496-3504.
[3]杨世茂,王明国,李静.富血小板纤维蛋白与富血小板血浆体外释放生长因子的比较及其对脂肪干细胞增殖分化的影响[J].华西口腔医学杂志,2012,30(6):641-644.
[4]Dohan Ehrenfest DM,de Peppo GM,Doglioli P,et al.Slow release of growth factors and thrombospondin-1 in Choukroun's platelet-rich fibrin(PRF):A gold standard to achieve for all surgical platelet concentrates technologies[J].Growth Factors,2009,27(1):63-69.
[5]Kang YJ,Jeon ES,Song HY,et al.Role of c-Jun N-terminal kinase in the PDGF-induced proliferation and migration of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].J Cell Biochem,2005,95(6):1135-1145.
[6]Lee MS,Kim YB,Lee SY,et al.Integrin signaling and cell spreading mediated by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment[J].J Cell Biochem,2006,99(1):88-95.
[7]Berrou E,Bryckaert M.Platelet-derived growth factor inhibits smooth muscle cell adhesion to fibronectin by ERK-dependent and ERK-independent pathways[J].J Biol Chem,2001,276(42):39303-39309.
[8]Hallab NJ,Bundy KJ,O'Connor K,et al.Evaluation of metallic and polymeric biomaterial surface energy and surface roughness characteristics for directed cell adhesion[J].Tissue Eng,2001,7(1):55-71.
黏附因子 篇3
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
2 F Fogarty导管(美国Baxter health corporation);倒置显微镜(日本Olymp-US);手动轮转切片机(德国Lecia RM 2235 Lecia);医学图像照相系统(日本Olympus BX51);医学图像分析系统(日本Olympus DP2-BSW);手术器材:剪刀、血管夹、止血钳、手术缝针及缝线、注射器等;小型台式离心机(美国Sigma,1-13);紫外分光光度计(日本UV-3R000);实时荧光定量PCR扩增仪(美国ABI PRISM R7500Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems);转染试剂FuGene 6(瑞士Roche公司);Egr-1兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司);ICAM-1兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司);decoy ODNs(大连宝生物工程有限公司);总RT-PCR提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司);RT-PCR逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司);RT-PCR引物(大连宝生物工程有限公司);健康雄性Wistar大白鼠,体质量350～400 g,由北京维通利华实验动物中心提供,合格证号:SCXK(京)2006-0009。
1.2 方法
1.2.1 大鼠颈动脉损伤模型的复制
健康雄性Wistar大鼠96只,体质量350～400 g。10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后,颈正中切开,暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,用血管夹暂时阻断左颈总动脉和颈内动脉,用2 F导管从颈外动脉插入向前推进至主动脉弓,推入生理盐水充盈气囊,沿颈总动脉全长回撤,然后抽瘪气囊。这个过程重复3次,且每次回撤时导管旋转90°。造成左颈总动脉内膜损伤。术后结扎颈外动脉,恢复血流,缝合颈部创口。局部使用青霉素以预防感染,喂食标准饲料,自由饮水。
1.2.2 分组及处理
96只雄性Wistar大鼠随机分为4组,每组24只。假手术组(Sham-group):只进行颈动脉结扎,不插入导管,即不造成动脉内膜损伤。单纯损伤组(injury-only-group):球囊拉伤左颈总动脉。诱骗寡核苷酸组(SCR-group):球囊拉伤左颈总动脉后局部注入200μL含有500μg SCR ODN、30μL转染试剂FuGene 6的1 mmol Mg Cl2液。诱骗寡核苷酸组(decoy ODNs-group):球囊拉伤左颈总动脉后,应用微量注射器局部释放200μL含有500μg FITC标记的decoy ODNs、30μL转染试剂FuGene 6的1 mmol Mg Cl2溶液,使其在局部作用20 min。
1.2.3 Egr-1诱骗及诱骗对照寡脱氧核苷酸(decoy ODNs和decoy ODNs SCR)的设计合成
Egr-1的诱骗寡脱氧核苷酸(decoy ODNs)基因序列:上游5'-TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG-3',下游:3'-A GCGGGGGCGGGGGCGAT-TCCC-5'。Egr-1的诱骗对照寡脱氧核苷酸(decoy ODNs SCR)基因序列:同诱骗序列类似的错配双链寡脱氧核苷酸,上游5'-A GCCGCACCGGCCTGCCT-CGTC-3',下游3'-TCGGC GTGGCCGGACGGAGCAG-5'。经聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化并冻干保存,在其3'-和5'-端进行硫代修饰,部分寡核苷酸的5'-端用FITC标记,以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。
1.2.4 在体decoy ODNs转染
室温下分别将500μg decoy ODNs与30μL转染试剂FuGene 6充分混合成复合物后溶于170μL的1 mmol Mg Cl2液中,在制作血管球囊损伤模型的同时,从颈外动脉将混合液局部注入至损伤的血管节段内。在荧光显微镜下观察转染情况。于转染24 h后处死大鼠2只,立即取治疗的局部血管放入液氮罐中,经制成冷冻切片(片厚5μm)后,避光于荧光显微镜下观察。1.2.5取材与血管标本制作手术后不同时间点,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉动物后,无菌条件下游离左颈总动脉,血管夹暂时阻断左颈总动脉近心、远心端血流,迅速取下血管,用肝素盐水冲洗血管,部分血管用10%中性甲醛固定用于病理学检查,另一部分迅速放入液氮中冷冻,-70℃保存,用于总RNA的提取和组织蛋白的检测。
1.2.6 血管标本的病理学检查
各组血管用石蜡包埋后,从每段血管的横截面随机切下3张切片(片厚5μm),HE染色,光镜显微镜下观察血管内膜增生情况,并应用计算机图像分析软件进行图象分析,每个标本间隔取3张切片,用计算机图像分析软件测量,计算出内膜面积、中膜面积、管腔面积和内膜与中膜(I/M)的面积比。图像分析由操作熟练但不知情者操作。
1.2.7 Real time RT-PCR法检测血管壁组织的Egr-1和ICAM-1 m RNA表达
采用Trizol一步法提取血管组织总RNA,取各组总RNA 3μL逆转录合成c DNA,逆转录反应根据逆转录试剂盒要求的标准进行,反应总体积为20μL,反应条件为37℃15 min,85℃5 s,4℃7 min。以2μg c DNA为模板进行PCR扩增,总反应体系为20μL,2μL的c DNA,10μL的SYBRRPremix Ex TaqTM,0.4μL的引物和7.2μL的超纯水。主要的循环参数如下:1个循环的预变性(95℃30 s),40个循环的退火(95℃5 s)和延伸(60℃34 s)。Egr-1上游引物:5'-CC-CAAACTGGAGGAGATGA-3',下游引物:5'-GAGGC AGAGGAAGACGATG-3'。ICAM-1上游引物:5'-AC CAGACCCTGGAGATGGAGA-3',下游引物:5'-ACC GTGGGCTTCACACTTC-A-3';β-actin上游引物:5'-CGTGCGTGACATTAAAGAG-3',下游引物:5'-TTG CCGATAGTGATGACCT-3'。β-actin作为每个样品的内参。每个目的基因的CT平均值减去对应模板的内参照基因的CT平均值,得到△CT,根据公式:△CT(样本)=目的组基因CT-对照基因内参CT;△CT(对照)=对照组基因CT-对照基因内参CT;△△CT=△CT(样本)-△CT(对照);样本目的基因的相对表达量=2-△△CT[11],实验重复3次。
1.2.8 Western blotting法检测血管壁组织的Egr-1和ICAM-1的蛋白表达
提取各组动脉总蛋白,将含有50μg总蛋白的样品用SDSPAGE分离,并转移到PVDF膜上。脱脂奶粉封闭过夜,用TBS液清洗2遍,然后加入1︰400稀释的一抗(Egr-1和ICAM-1)中室温下孵育2 h。辣根过氧化物酶标记一抗,化学发光试剂增强反应,凝胶成像分析系统测定条带的平均积分光密度值,记录结果。以β-actin蛋白表达为内参照,目的蛋白和β-actin条带平均积分光密度比值表示目的蛋白的相对含量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析,所有的检测数据以均数±标准差(x±s)表示,用单因素方差分析进行数据分析,组间比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 在体转染效果观察
转染24 h后,收集血管标本,然后在470～490nm的荧光显微镜下观察,以确定转染效率。转染Egr-1 decoy ODNs基因24 h后,可见血管内膜和中膜有大量绿色荧光分布,证明转染成功(见图1)。
2.2 血管病理形态学检测结果
假手术组,血管内膜由一层完整的内皮细胞覆盖,无内膜增生,管腔无狭窄;大鼠颈总动脉拉伤后3 d,可见内皮剥脱,无新生内膜增生,管腔无狭窄,说明球囊拉伤动脉模型成功;SCR组和单纯损伤组7 d时可见内膜增生,管腔狭窄,14 d和21 d时内膜增生更明显,内膜及中膜层有大量的增生细胞,排列紊乱,内弹力板模糊,管腔明显狭窄。Decoy ODNs组与同一时间点SCR组和单纯损伤组相比,内膜增生受到抑制,差异有统计学意义(P<0.01,见附表和图2)。
2.3 血管壁Egr-1和ICAM-1 mRNA表达结果
假手术组大鼠动脉Egr-1和ICAM-1 m RNA的表达微弱,血管球囊损伤后Egr-1和ICAM-1 m RNA的表达增加,Egr-1的表达高峰在21 d,单纯损伤组和SCR组表达分别是假手术组的(18.05±1.22)倍和(18.38±1.57)倍,ICAM-1 m RNA的高峰在7 d,在单纯损伤组和SCR组的表达分别是假手术组的(6.52±0.46)倍和(6.20±0.59)倍,经decoy ODNs治疗后,在各个时间点Egr-1和ICAM-1 m RNA的表达明显减少,与单纯损伤组和SCR组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。见图3。
2.4 Western blotting检测血管壁Egr-1和ICAM-1蛋白表达结果
假手术组无Egr-1和ICAM-1表达,血管球囊损伤后Egr-1和ICAM-1的表达同其m RNA的表达类似。Egr-1的表达随着时间的延长,表达逐渐增强,在21 d,免疫印迹带达到最强;而ICAM-1免疫印迹带的最强度为7 d,decoy ODNs治疗组蛋白表达较SCR组和单纯损伤组相比显著减弱(见图4)。
注:LA为管腔面积,I为新生内膜面积,M为中膜面积,I/M为内膜面积与中膜面积比值。覮与同一时间点的单纯损伤组和SCR组比较,P<0.01
I为新生内膜,M为中膜,IEL为内弹力板。血管损伤后21 d,单纯损伤组和SCR组内膜增厚明显,管腔重度狭窄(A和B),经decoy ODNs治疗后内膜增生减轻,管腔增加(C)
覮decoy ODNs组在各个时间点与单纯损伤组和SCR组相比,P<0.001
A:Sham组;B:单纯损伤组;C:SCR组;D:decoy ODNs组
3 讨论
PCI是目前公认的治疗冠状动脉狭窄的有效方法,然而PCI术后的再狭窄严重影响其远期疗效。PCI术中不可避免地造成内皮的损伤和剥脱,而内皮损伤是再狭窄发生的始动因素,在由损伤刺激所激活的多种转录因子(如:Egr-1)、生长因子、细胞因子等共同作用下,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型发生转化向内膜下迁移、增殖,并进一步分泌大量的ECM,从而形成新生内膜,导致管腔狭窄[12,13]。阻断这些因子的表达,以抑制VSMC的迁移和增殖,减轻内膜的增生,能够达到防治再狭窄的目的。
Egr-1是一种含锌指状结构的TF,为即刻早期基因家族中的一员,通过与基因启动子中富含GC的序列相互作用调节基因的转录。以Egr-1作为防治血管再狭窄的靶基因基于如下考虑:(1)Egr-1在正常动脉中表达很低,但是在急性机械性损伤或其他血管应激后被激活。(2)Egr-1控制着许多与血管损伤后促进内膜增生相关的多种基因的表达[14]。(3)除了损伤外,Egr-1还被许多外部刺激(如细胞因子等)激活,这可能是导致动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的发病机制。(4)在人类动脉粥样硬化病变处发现了Egr-1和大量Egr-1支配的基因。因此干预Egr-1转录因子基因表达,以抑制VSMC增殖,减轻内膜增生,可能为再狭窄防治策略的制定提供新的思路和选择。
TF诱骗策略是一种针对TF的在核转录水平的基因沉默治疗方法。Decoy ODNs是一种顺式作用元件,它与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似,在与转录因子的内源顺式DNA序列元件竞争时,诱骗转录因子与它结合,下调转录因子所调控的基因表达[15]。首先报道的应用诱骗技术调控基因表达的实验是将E2F decoy ODNs转导入球囊损伤的大鼠颈动脉,结果显著抑制了球囊损伤后2周内的新生内膜形成[16]。随后有人利用NF-κB decoy ODNs也显著减轻了球囊损伤后鼠颈动脉新生内膜的生成[17]。国内韩伟等[18]研究表明Egr-1 decoy ODNs抑制10%FBS诱导的体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖,此作用与其抑制PCNA、cyclin D1、CDK4表达,阻止细胞周期由G0/G1期向S期转换,抑制S期细胞合成有关。
近年来大量的研究表明,动脉壁的炎症反应在再狭窄发展过程中起着重要的作用[19,20]。各种病理因素致内皮功能紊乱或直接损伤内皮后,单核/巨噬细胞以及内皮细胞、平滑肌细胞均可分泌多种黏附分子如E-selectin、细胞黏附分子、血管细胞黏附分子和单核细胞趋化蛋白因子等炎症因子。在这些因素中,细胞黏附分子-1(ICAM-1)在炎症过程中起着重要作用。ICAM-1是黏附分子中免疫球蛋白超家族的一名成员,是一个高糖基化的细胞表面蛋白,在内皮细胞、血管平滑肌细胞和循环白细胞中表达,通过同LFA-1(CD18/CD11a)或者Mac-1(CD18/CD11b)结合介导单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞与内皮细胞黏附,促进炎症的发生和发展。已知应用中和ICAM-1的抗体可以抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生[21]。SHIMIZU等[22]研究发现,猪前降支血管成形术后在损伤动脉处新生内膜中ICAM-1表达明显增多,炎症明显,与再狭窄相关,这种现象在支架植入术组比单纯球囊扩张组更为明显。因此,抑制ICAM-1的表达已经成为针对性抑制再狭窄的一项策略。笔者的研究结果表明,在正常的、未损伤的血管中没有ICAM-1的表达,血管损伤后I-CAM-1的表达上调,7 d后达高峰,笔者合成了针对Egr-1mRNA的decoy ODNs,局部转染到球囊损伤后的大鼠颈总动脉,探讨其抑制内膜增生的作用机制。为了提高转染效率,使decoy ODNs在细胞内与靶基因的m RNA结合发挥作用,本研究采用了转染试剂FuGene,为增加它在细胞核内的稳定性,防止核酸酶的降解,又对其两端进行了硫代修饰。结果decoy ODNs治疗明显降低了ICAM-1的表达,并显著减轻了新生内膜的增生。表明decoy ODNs是一种新型的RNA水平上的强效基因灭活因子,通过抑制Egr-1的表达,在某种程度上也抑制了ICAM-1的转录和表达,从而抑制动脉损伤后新生内膜的增生。
黏附因子 篇4
1 VEGF与骨肉瘤
1.1 VEGF的来源,结构及功能
1989年,Ferrara等从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中分离提取出来血管内皮细胞生长因子.VEGF属于糖基化分泌性多肽因子,分子量在35-40Kb之间,早期也称作血管通透因子VPF,是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子,能够在体内诱导血管新生。VEGF具有高度的保守性,是由二条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成同源二聚体糖蛋白。在人类,VEGF基因定位于第六对染色体P21.3,全长14Kb,其基因组由8个外显子和7个内含子构成[3]。VEGF与血管内皮细胞受体结合,使细胞内钙离子浓度升高以及激活细胞内基因使细胞表达水解酶、蛋白酶和相应的组织因子等,从而使血管内皮细胞增殖、分化,形成新的血管。此外,VEGF还可以通过增加血管增加细胞外基质促进血管生成。
1.2 VEGF与骨肉瘤的关系
从骨肉瘤的临床表现中浅静脉怒张可以看出骨肉瘤的血运丰富,而VEGF是血管形成的重要因素,因此,VEGF是骨肉瘤形成的重要因素。2000年,Kaya等利用免疫组化的方法发现,27例原发恶性骨肿瘤中有17例阳性,阳性率为62.9%,明显高于VEGF染色阴性的标本组织切片。说明了VEGF与骨肉瘤存在密切联系。而且还发现,VEGF与骨肉瘤的肺转移明显相关。2002年Sulzbacher等对57例骨肉瘤利用免疫组化法染色,结论是骨肉瘤组织中,骨桥蛋白的表达与VEGF相关,而且,VEGF高表达的患者预后不良。2003年,Tsunemi等应用动物的骨肉瘤模型研究骨肉瘤原发灶切除后肺转移的发生情况,结论是原发骨肉瘤切除后,机体系统性血管生成活性增加,促使骨肉瘤发生肺转移,而应用抗血管生成剂可以阻止骨肉瘤术后肺转移的进程。2009年,Bajpai J等通过对经过新型辅助化疗后的31个患者(平均年龄17岁,男女比例25:6)手术切除后的骨肉瘤标本进行免疫组化分析。经过三个疗程的化疗后,手术切除肿瘤,通过Huvos分级对肿瘤组织进行分级,免疫组化对肿瘤标本进行分析。得出结论,肿瘤组织的分级越高,VEGF表达越明显。由此,可以通过分析VEGF的表达,来决定对肿瘤组织实行的何种手术治疗方案。
1.3 VEGF与骨肉瘤的临床治疗
随着对VEGF诱导骨肉瘤生长、侵来达到治疗骨肉瘤的目的。早在1995年,Asano等在BALB/c裸鼠身上接种HT-1080细胞,并通过静脉注射MV303(能够与VEGF的受体结合),每只小鼠的注射剂量为100μg,发现MV303成功免疫VEGF/VPF后,有效的抑制原位肿瘤以及转移的肿瘤的生长,而且没有明显的副作用.2001年,Gordon等向晚期肿瘤患者静脉输注rhuMAb VEGF,发现肿瘤组织得到有效的抑制。
2 CD15与骨肉瘤
2.1 CD15的结构及功能
CD15抗原又叫粒细胞相关抗原,或Lewis抗原,由半乳糖、岩藻糖和Y&乙酰葡萄糖胺组成,是一种表达在肿瘤组织细胞表面糖酯和糖蛋白上的含有寡聚糖的一组碳水化合物抗原,是癌细胞表面异常表达的九碳糖。为选择素所识别的比较确定的一个配基,是细胞黏附分子E-选择素的配体,主要表达在粒细胞和某些肿瘤细胞表面,与E-选择素特异性结合以帮助癌细胞穿过内皮细胞的基底膜,与恶性肿瘤的恶化和转移呈现正相关。CD15表达随癌细胞分化程度下降,淋巴结转移和临床分期增高而明显增高.
2.2 CD15与骨肉瘤的关系
CD15是一种细胞粘附分子(CAM),是细胞表面的一种糖蛋白,与许多恶性肿瘤的形成和转移有密切的关系,并被认为是肿瘤预后不良的一种标志。CD15与食管癌,肝癌,大肠癌等有密切的关系。CD15的表达与骨肉瘤的发生与转移的关系尚不清楚,CD15与VEGF是否共同促进了骨肉瘤的形成也不清楚。因此,通过各种途径对CD15、VEGF与骨肉瘤的相关性进行研究,具有很大的临床意义。
2.3 CD15与骨肉瘤的临床诊断与治疗
研究表明,检测甲状腺癌组织中CD15抗原表达,有助于筛选具有转移潜能的肿瘤,可作为一项辅助指标用于甲状腺癌更准确地估测预后,指导治疗。检测膀胱癌的CS15的抗原的表达,有助于帅选转移性的肿瘤,可作为一项辅助指标用于膀胱癌更准确的估测预后,指导治疗。我们可以推断,检测CD15在骨肉瘤中的表达也可以作为估测预后的指标,用于临床指导,但这需要进一步证实。
3 VEGF与CD15可能存在的相互关系及在骨肉瘤中的临床治疗应用前景
VEGF与骨肉瘤的发生密切相关,但与骨肉瘤的转移尚有争论,而CD15与肿瘤的转移有密切关系。而高度恶性的骨肉瘤,特别是已经发生转移的骨肉瘤患者中是否存在VEGF和CD15的高表达,尚待进一步证实。有可能通过针对VEGF与CD15的研究,研发出新的临床药物,以提高高度恶性的骨肉瘤患者的生存率,并对患者的预后作出有效的评估。
参考文献
[1]Cheng SY,Huang H,Nagane M,et al.Suppression of glioblastoma angiogenicity and tumorigenicity by inhibition of endogenous expression of vascular endothelial growth factor.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:8502-8507.
[2]Liu F,Qi HL,Chen HL.Regulation of differentiation and proliferation-inducers on lewis antigens,alpha-fucosyltransferase and metastatic potential in hepatocarcinoma cells[J].Br J Cancer.2001,84(11):1556-1563.
黏附因子 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
健康SD大鼠60只,雌雄兼用,体重200～280g,购自郑州大学实验动物中心。
1.2 试剂
兔抗大鼠IL-5多克隆抗体、兔抗大鼠IL-13多克隆抗体,兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗体、DAB染色试剂盒和浓缩型免疫组化试剂盒均购自武汉博士德公司
1.3 模型建立
致敏方法参照文献[1]中的试验方法。将60只大鼠随机分为3组:A组:卵清蛋白(OVA)致敏组;B组:TP处理组;和C组(SC)空白对照组。OVA致敏组:基础致敏:OVA20mg和Al(OH)3粉剂30mg加生理盐水至1ml,混匀,腹腔内注射,隔日1次,共7次。激发:5%OVA/生理盐水液20～50μl双侧鼻腔滴入,隔日1次,共7次。TP处理组:TP 0.5mg/kg吐温80助溶后,均分为6次,于每次OVA鼻腔激发前30min,腹腔注射和鼻腔滴入,其他处理同OVA致敏组。SC组:使用生理盐水代替OVA,其他处理同OVA致敏组。鼻腔激发后观察模型动物症状,2h后再观察1次,记录评分。
1.4 检测方法
取3组动物鼻黏膜石蜡标本,制备成四五微米厚连续切片,采用石蜡切片HE染色和免疫组织化学SABC法,切片常规脱蜡,梯度乙醇脱水,其后分别用兔抗大鼠IL-5多克隆抗体、兔抗大鼠IL-13多克隆抗体、兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗体为一抗,严格按照SABC法试剂盒的要求进行。阳性对照选已知阳性高表达的AR鼻黏膜组织,以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗做阴性对照。
1.5 结果判定
1.5.1 炎性细胞计数方法
IL-5,IL-13,VCAM-1阳性表达均为胞浆棕色颗粒,400×显微镜下任选5个高倍视野,求出每高倍视野下的均数,结果以均数±标准差作为其阳性细胞数。
1.5.2 阳性血管表达计数方法
以血管平滑肌和血管内皮染色呈棕黄色为阳性血管,200×光学显微镜下任选5个低倍视野,求出每低倍视野下的均数,结果以均数±标准差作为IL-13和VCAM-1的阳性血管表达数。
1.6 统计方法
实验数据采用统计软件包SPSS 11.0,统计学分析采用单因素方差分析(ANOVA)并继以最小显著差(LSD)t检验;相关分析采用直线相关法,以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 鼻黏膜HE镜下观察
OVA致敏组:鼻黏膜肿胀增厚,腺腔及小血管腔扩张,杯状细胞增多。在黏膜及黏膜下层,小血管及腺体周围可见大量灶状浸润的炎性细胞。TP处理组:鼻黏膜轻度肿胀增厚,腺腔及小血管未见明显扩张。在黏膜及黏膜下层,小血管及腺体周围炎性细胞浸润较轻。SC组:鼻黏膜未见异常改变。
2.2 各组IL-5,IL-13,VCAM-1阳性表达结果见表1、表2。
注:与OV组同指标比较,*P<0.01。
3 讨论
TP是从卫矛科雷公藤属植物根部分离出的二萜类化合物,是雷公藤活性成分中最具代表性的成分之一。经过临床使用和实验研究证明具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等作用。已广泛用于哮喘、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肾病等疾病的治疗。在探索TP用于AR的治疗方面,国内已有学者使用雷公藤甲素干预AR动物模型并取得很好的效果。
TP具有广泛的抗炎和免疫抑制作用,可有效减轻变应性鼻炎中炎性细胞的浸润。本试验HE染色发现致敏组大鼠鼻黏膜肿胀增厚,腺腔及小血管腔扩张,杯状细胞增多。在黏膜及黏膜下层,小血管及腺体周围可见大量灶状浸润的炎性细胞。TP处理组鼻黏膜肿胀较轻,腺腔及小血管未见明显扩张,在黏膜及黏膜下层,小血管及腺体周围炎性细胞浸润较轻。
变应性鼻炎是由易感个体接触致敏变应原后导致的包含IgE介导的炎症介质的释放和多种免疫活性细胞、细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症性疾病[2,3],其中效应细胞和细胞因子在变应性鼻炎发病过程中起到核心作用。T淋巴细胞的分化及其产生的细胞因子直接影响着变应性鼻炎的发展进程。近年来“Thl和Th2失衡学说”与变应性鼻炎的关系越来越受到重视[4,5]。该学说认为变应性鼻炎是一系列细胞间相互作用的结果,当变应性鼻炎患者接触到变应原后,在抗原提呈细胞和主要组织相容(抗原)复合物(MHC-Ⅱ)的协助下,传递给刚从胸腺组织生成并释放的原始T淋巴(ThO)细胞,与其表面上的抗原特异性T细胞受体结合,导致ThO细胞激活后朝Th2方向分化而释放出IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、GM-CSF等细胞因子,进一步促进Th2激活而抑制Thl应答。使Th细胞的分化产生偏移,即由Thl反应偏向Th2反应,成为Th2>Thl反应。这些Th2细胞合成和释放的多种Th2细胞因子如IL-4,IL-5,IL-13等诱导B细胞释放IgE并刺激肥大细胞合成、分泌IgE的能力增强[6],IgE与肥大细胞、巨噬细胞和上皮细胞表面的受体FcεRI结合使该细胞处于致敏状态,当变应原再次进入鼻黏膜后,变应原与细胞表面的临近2个IgE桥联,使其释放多种炎性递质、细胞因子和神经肽类,这些物质作用于鼻黏膜的血管,引起血管扩张、血浆渗出增加、鼻黏膜水肿;作用于胆碱能神经,使腺体分泌旺盛;作用于感觉神经使黏膜敏感性增高,喷嚏发作,产生相应临床症状[7]。在变应性鼻炎的发病机制中,Th2细胞起着重要的作用,由此产生了“变态反应中的Th2假说”,这个假说已得到实验研究和基础研究的支持[8]。本实验结果说明了TP能显著抑制Th2类细胞因子IL-5、IL-13以及粘附因子VCAM-1在AR大鼠模型中的表达,从而抑制变应性鼻炎的发生及发展进程。
雷公藤类药物在AR治疗上很有前景,但雷公藤类药物的毒性很强,能引起全身各系统的不良反应。在消化系统的不良反应主要表现为恶心、纳差、腹胀、腹泻、腹痛及呕吐,镜检为特异性胃肠炎。泌尿系统损害常发生在过量中毒时。心血管系统表现为小剂量雷公藤即可引起灶性心肌肿胀,横纹消失;大剂量可引起心肌溶解灶数量增加,病变范围广泛。对于这样的中药,减毒研究势在必行,事实证明多种治疗手段的结合、中药复方配伍研究、活性单体的筛选、改变剂型或改变给药途径及结合现代生物学技术对于降低雷公藤制剂的毒性具有广阔的前景。总之,雷公藤用于AR临床治疗前景广阔,但仍有很多工作需要科学工作者去完成。
参考文献
[1]安云芳.变应性鼻炎P物质受体的研究.中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33(3):139-141.
[2]周兵,李华斌.变应性鼻炎治疗进展.武警医学,2003,14(6):323-325.
[3]顾之燕,顾瑞金.变应性鼻炎及其相关基础知识的再认识.中华耳鼻喉科杂志,2003,17(2):124-127.
[4]Romagnani S.The role of lymphocytes in allergic disease.J Allergy ClinImmunol,2000,105:399-408.
[5]徐志鸿,杨成章.Th1/Th2失衡与变应性鼻炎.临床耳鼻咽喉科杂志,2004,18(8):510-512.
[6]张罗,周兵,韩德民.变应性鼻炎研究进展(-):发病机制.耳鼻咽喉头颈外科,2003,10(5):316-320.
[7]孔维佳,王斌全.耳鼻咽喉科学.北京:人民卫生出版社,2002:62-63.
黏附因子 篇6
关键词：原发肝细胞性肝癌,NF-κB,TNF-α,ICAM-1,免疫组化
原发肝细胞性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一, 根据最新统计, 全世界每年新发肝癌患者约六十万, 居恶性肿瘤的第五位。目前我国发病人数约占全球的半数以上, 占全球肝癌病人的55.00%, 已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手, 其危险性不容小视[1]。本研究拟用免疫组化S-P检测原发肝细胞性肝癌和非肝癌组织中细胞间黏附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 、核因子-κB (Nuelear factor-kappa B, NF-κB) 和肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor alpha, TNF-α) 蛋白的表达情况, 分析这其表达与原发性肝细胞性肝癌生物学行为的关系, 探讨它们在原发性肝细胞性肝癌中发生、发展及生物学行为, 为临床治疗和预后提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选取2007年1月~2011年12月河北永年县医院原发性肝细胞性肝癌手术标本34例。其中, 男22例, 女12例。年龄38~72岁, 中位年龄57岁;所有原发性肝癌患者术前均未行放、化疗治疗。取癌旁正常肝组织14例作对照 (病理切片证实) 。其中, 男9例, 女5例, 年龄30~73岁, 中位年龄55岁。
1.2 试剂与方法
常规免疫组化试剂盒SP、二硝基联苯胺 (DAB) 显色液及NF-κB、TNF-α和ICAM-1 (北京中杉金桥生物技术有限公司) 。采用SP免疫组化法, 方法操作按试剂盒说明书进行, 主要包括切片脱蜡水化, 微波修复抗原, 山羊血清封闭, 分别滴加NF-κB、TNF-α和ICAM-1工作液37℃1 h, 以生物素标记二抗及辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育, DAB显色, 苏木素衬染, 中性树胶封片, 显微镜观察。取已知切片作为阳性对照, 以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判断
NF-κB、TNF-α和ICAM-1阳性定位于细胞核和细胞质, 以各种抗体在细胞核或质出现棕黄色颗粒为阳性信号。定性观察按细胞有无显色及染色强度记分 (a) :细胞无显色为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。按显色细胞的比例记分 (b) :0分为显色细胞<10%;1分为10%~30%细胞显色;2分为31%~60%显色;3分为≥61%以上显色。每例积分=a×b。按积分高低判定:阴性为积分为0分;阳性为积分≥1分。由2名高年资病理医师逐一观察同一切片以减少人为因素造成的判断误差, 以2人观察结果一致作为最终评定结果。
1.4 统计学分析
应用SPSS 12.0统计软件, 计数资料采用χ2检验。相互关系用等级相关分析, P<0.05为差异有显著性。
2 结果
注:†P<0.05
2.1 NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发性肝细胞性肝癌组织、癌旁正常肝组织中的表达
表1显示:NF-κB在肝癌组织中的阳性表达率为88.24% (30/34) , 正常肝组织中的弱表达, 阳性表达率7.14% (1/14) , 二者比较差异有显著性 (P<0.05) 。14例癌旁正常肝组织中TNF-α阳性表达率为14.29% (2/14) , 34例原发肝细胞性肝癌中的阳性表达率为76.47% (26/34) , 两者比较差异有显著性 (P<0.05) ;14例癌旁正常肝组织中ICAM-1无表达, 34例原发肝细胞性肝癌组织中阳性表达率为85.29% (29/34) , 两者比较差异有显著性 (P<0.05) 。
2.2 NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发肝细胞性肝癌中的表达与临床病理指标的关系
详见表1。
2.3 NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发性肝细胞性肝癌组织中的相关性分析
表2显示:NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发性肝细胞性肝癌组织中的阳性表达呈明显正相关, 表明三者在肿瘤的发生、发展中起到协同作用。
3 讨论
癌症的形成是由关键的调节通路中错误积累所致的一种多步骤多阶段的复杂事件[2], 这个过程可分为, 肿瘤启动、促癌和进展三个阶段。侵袭和转移是进展阶段的主要特征[3]。转移是一个多环节、多阶段的过程, 其中肿瘤细胞本身黏附能力的改变, 促进异源细胞间的相互黏附, 使得不同细胞间的相互效应得以实现, 促进了肿瘤发生的转移。
NF-κB是在成熟B细胞核提取物中存在一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的核蛋白因子, 由Rel家族成员组成的同源或异源二聚体转录因子[4]。静息状态下, NF-κB由p65、Pso与NF-κB的抑制分子IKB形成三聚体以非活化形式存在于细胞质中, 当外界刺激因素使细胞受到刺激后, IKK被激活, IKB分子磷酸化, 泛素化而降解, NF-κB从多聚体上释放, 进入胞核并与特定的κB序列结合行使其功能, 启动或调节早期反应基因的转录, 参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡[5]。研究发现, 许多癌基因和致癌物都可以导致NF-κB激活[6]。本实验结果显示NF-κB蛋白阳性表达主要位于细胞浆核内, 在原发性肝细胞性肝癌组织中呈过度表达, 与癌旁正常肝组织中比较差异有显著性 (P<0.05) ;NF-κB与组织学分化有关 (P<0.05) , 说明在低分化肿瘤中NF-κB表达水平更高有关, 提示NF-κB表达水平高的肿瘤预后差;NF-κB与有无淋巴结转移及有无癌栓有关 (P<0.05) , 说明在肿瘤肝内血管侵犯转移中发挥了重要作用。
TNF-α主要由活化的巨噬细胞分泌产生, 位于第6号染色体HLA-Ⅲ类基因簇内 (6p21.3) , 长约2.76 kb, 由4个外显子和3个内含子组成。TNF-α与其受体TNFR1和TNFR2结合发挥生物学作用, 在炎症过程中, TNF-α对组织损伤和修复都发挥了重要作用, 可诱导病变细胞凋亡, 同时也诱导成纤维母细胞增生, 修复损伤血管时, 诱导多种血管生成因子表达。但是, 在肿瘤发生发展过程中TNF-α表现出矛盾的生物学功能[7,8]。最早人们发现, TNF-α是抗癌活性最强的细胞因子, 高剂量TNF-α局部治疗肿瘤可选择性地破坏肿瘤组织血管, 从而发挥抗肿瘤作用[9]。而在临床研究发现, 乳腺癌、前列腺癌, 膀胱癌、结肠癌、肝癌等肿瘤细胞和基质细胞中都有表达, 其阳性的患者预后较差[10]。肝癌小鼠动物模型研究显示, 致癌物处理肝干细胞, 可诱导细胞增生和TNF-α分泌, 而敲出了其受体基因后小鼠肝肿瘤形成明显降低。炎症细胞分泌的TNF-α可能作为肿瘤促进因子, 参与了肿瘤的发生发展[11]。本研究发现, 在肝癌组织中TNF-α呈阳性表达, 明显高于正常组织 (P<0.05) , 并且其表达与组织的分化程度、淋巴道转移和有癌栓有明显相关性 (P<0.05) , 表明TNF-α在肝癌的发生、发展中起促进作用。
TNF-α促进肿瘤生长的机制虽不是很清楚, 其与受体结合通过多条信号通路发挥生物学功能。对TNF-α与NF-κB在肿瘤发生、发展中的相互关系发现, TNF-α可通过NF-κB途径诱导激活诱导的胞苷脱氨酶 (activation induced cytidine deaminase, AID) 产生, 引起p53和c-myc等基因突变[12]。此外, 还通过NF-κB p65调节人类端粒酶催化亚基 (h TERT) 从胞质易位到核, 促进细胞无限增殖[13]。本研究亦发现, 在肝癌中二者的阳性表达呈正性相关。
ICAM-1属于免疫球蛋白超家族, 是一种单跨膜的单链糖蛋白, 细胞外区有5个免疫球蛋白样结构区, 其中Ⅰ区与LFA-1相结合, Ⅲ区与补体受体-3 (CR3或Mac-1) 相结合, ICAM-1通过与LFA-1和Mac-1结合发挥作用[14]。在人体内ICAM-1广泛存在于白细胞、白细胞、单核细胞、外周血淋巴细胞, 血管内皮细等处[15]。当肿瘤细胞发生浸润、转移时, 淋巴细胞和白细胞分泌如IL-1、TNF等细胞因子杀灭癌细胞, 同时也激活了淋巴管、血管内皮细胞内的NF-κB, NF-κB可激活ICAM-1启动子的部位活化ICAM-1, 使进人血液或淋巴结的癌细胞与淋巴细胞竞争性地与内皮细胞结合, 使癌细胞能在淋巴结或其他脏器中豁附、生长、增殖[16]。此外, ICAM-1过度活化可促使过多可溶性ICAM-1 (s ICAM-1) 进入血液, 竞争性抑制血液循环中ICAM-1/LFA-1依赖的MHC-1类抗原对游离癌细胞的免疫识别作用, 从而使癌细胞逃离免疫监视, 更容易发生侵袭和转移[17]。本研究发现, 在原发肝细胞性肝癌组织中ICAM-1的阳性表达率明显高于癌旁正常组织。此外, ICAM-1的阳性表达与是否有淋巴道转移和癌栓关系密切, 高表达ICAM-1的癌细胞可导致癌细胞间黏附力降低, 从而易于随淋巴细胞的迁移脱落母瘤, 进入血循环, 与淋巴细胞结合的瘤细胞在穿越血管壁时可以免受伤害, 并且在血循环中易于形成栓子, 易于在毛细血管内或淋巴窦滞留和着床, 随之形成转移灶。并且, ICAM-1的阳性表达与NF-κB的阳性表达也呈正性相关。