活性因子（精选8篇）
活性因子 篇1
如今,网络已成为人们生活中不可缺少的一部分,每天都有数以亿万计的网民享受着网络带来的开放、快捷、方便和乐趣,他们或发E-mail、聊天互通有无,或自建博客、微博(论坛),张贴“文帖”展示自我,或参与BBS进行讨论,或下载、上传资料共享资源。在虚拟环境里的这些活动中,网民呈现出各种思维意识活动,就是网络心理。分析网络心理对我们研究网络繁荣的内在原因、构建作文教学新策略具有重大的启发意义。
作为语文素养重要组成部分之一的作文教学,应该更多地关注、比较、研究网络心理,从中汲取有益的“活性因子”,注入作文教学的“主动脉”,使作文教学焕发蓬勃生机,使学生的写作素养得到显著提升。
一、网络心理透视
在网络平台强大功能和丰富内容的支撑下,网络平台呈现出开放性、灵活性、创造性、无差别性等特征,从而促成了网络心理多样化的表现形态,主要有:
自由心态。网络是一种虚拟环境,在这种环境中,人比较放松,心理无压抑感,容易发泄、排解心中的郁闷情绪,不自觉地将自己的各种思想、心情甚至习惯暴露出来。
平等心理。正因为网络平台的无差别性,导致网民产生一种优越感,他们通常不会考虑其他网民的地位、身份、年龄等,崇尚“人人平等”,这在很大程度上促进了网民之间和谐的沟通交流。
冲动心理。在网上图文并茂的内容的刺激下,网民往往会产生兴奋、激动情绪,促成了网上的许多“疯狂”行为。为了满足自己的表现欲、挖掘自己的幽默感、和其他网民“较劲”,他们往往盲从冲动,被“网”所困,不能自拔。
创新心理。网民更愿意接受新鲜的事物和具有刺激性的挑战。受某种需要的驱动,一部分网民会开掘潜在的创新意识,在一次次“片断式”的活动中大胆地求新求变,勇于创造,获得成功的喜悦。他们积极地倡导崭新的网络文化,采用独特的网络语言,设计网络软件,制作独具匠心的网络作品。在他们的成果中,不乏大量的富有创意的文学作品、广告语和动画。
猎奇心理。人类认识世界是按照由现象到本质的规律进行的。网民更遵从这个规律,他们在浩如烟海的信息库中不断地汲取丰富的营养,随着积累的增多,他们逐渐不满足于现状,要求猎取更深层次的信息,他们利用网络搜索大量的相关信息,整理成“大全”式的一整套信息集合,满足他们的猎奇心理。
趣味心理。网络传递信息的手段是多种多样的,它采用图、文、声、像等多种渠道交错刺激网民的感觉器官,具有极大的趣味性,驱使他们在虚拟世界里不断探索,广征博览。
直白心理。这主要体现在网络语言的风格上,网民在网上聊天、讨论、创作过程中逐渐形成了一种语言风格,不拐弯抹角,崇尚“单刀直入”,直截了当。通过网民长期坚持不懈的努力,致使网络语言言简意赅,而且鲜明生动,极具表现力和感染力。
竞争心理。网民在许多网站之间点击徘徊,容易产生比较,形成评价;他们在网上活动时挖空心思,争做“第一个”,不做“第二个”;甚至黑客群体的反常行为也是竞争心理的一种表现。网民有一种共识:网络每时每刻都存在着竞争,网民自觉不自觉地被训练出争强好胜的积极心态,并在不断创新中满足自己的竞争心理。
二、网络心理在作文教学中的应用
网络如此繁荣的原因之一是它对人的心理发生了作用。而作文教学却普遍存在着倒挂现象,先进行写作知识的传授和方法的指导,再强调学生的生活体验、悟性启迪和心理作用,这必然会造成学生的心理障碍与作文的枯萎。如何在新时期适应作文教学发展的需要,构建全新的作文教学理念,网络心理具有极大的启发意义。这具体表现在“外”与“内”两个方面:“外”通过写作形式的变化影响学生写作;“内”通过网络心理的呈现形态在作文教学中的渗透,对学生写作心理和训练方法发生作用。用这个内外结合的规律来促进作文教学理念的创新,建立一整套现代作文教学训练体系。
1. 张扬自由心态。
我们应该重视排除学生写作过程中的心理障碍,破除紧张、厌倦情绪,创设自由的写作环境,还学生轻松的心态。作文教学首先要“开放”,“开”学生的心境,“放”学生的手脚。我们需要扮演心理医生的角色,将作文课变为心理咨询室、聊天室,与学生在轻松自由的气氛中剖析写作心理,使学生认识到写作时有紧张、厌倦情绪只是一种心理障碍,只要稍作调整便可排除,逐渐放松学生的身心,将重点放在审题上,调动自己的积累,提倡“口无遮拦”,在自选材料的基础上,任意组合,充分发挥想象力,整合成佳作。
2. 建立平等心理。
我们要坚定不移地确立师生、生生平等的观念,突出学生的主体作用。每一位学生,不管是优等生,还是暂时后进生,都一视同仁,写作面前“人人平等”;教师也可以和学生一起活动,建立师生之间和谐平等的人际关系,缩短师生之间的心理距离。促进写作知识的传授和思路的讨论。它与自由心态一起,对治疗写作心理疾病、培养学生写作的积极性和主动性具有不可低估的作用。
3. 促成竞争心理。
作文不单是学生心迹的自由表白,更是学生生活的反映。因此,为了使学生的作文能够反映当代学生的精神面貌,我们应该模仿网上的“跟帖”活动,积极引入竞争机制,在作文教学中营造竞争氛围,培养学生精益求精的写作品质,刺激其“写作虚荣心”,促进良性竞争心理的养成,这不仅对驱动学生写作内因有着重要的作用,而且也有利于学生作文的“百家争鸣,百花齐放”。
4. 培养猎奇心理。
如果学生已经形成良好的写作习惯,并且具有一定的积累,那么,教师应该将重点放在培养猎奇心理上,重视写作知识的传授和写作方法的指导,使学生自主领悟写作的奥秘。教师需要注意的是对学生每一步的探索都给予肯定和点拨,保证学生在“猎奇”过程中有的放矢,持之以恒。总之,我们要使学生在勤奋写作中不断“刻意”追求写作的规律。
5. 培育冲动心理。
于漪曾说:“学习写作,技能技巧固然重要,但最为重要的莫过于写作的热情,写作的冲动感。”内因起了变化,形成思绪,写作才能“文如泉涌”。“写作的根源是发表的欲望,正如同说话一样,胸中有所积蓄,不吐不快。”(叶圣陶语)要使学生具备写作的热情与冲动,就必须广泛地接触现实社会,体验生活,感悟自然、人生、文学、艺术,关注科技,积累认知,充分调动学生深入生活的积极性,用“善于发现美的眼睛”观察事物,广泛搜罗信息,培养良好的心理品质和写作热情。
6. 激发趣味心理。
挖掘学生趣味心理的作用是巨大的。首先,我们应该紧密结合佳作赏析和阅读,使学生对祖国语言产生浓厚的兴趣,并感知大量优秀文学作品,在熏陶感染之际,激发其写作的兴趣;其次,在组织作文训练中,模仿网络中的话题讨论,并有机地将命题“趣化”或“简化”,使学生有兴趣或信心写作,不致因为厌烦某一方面而无话可说。如写自我介绍,可变换题目为:“唉,我这个人!”“我的喜怒哀乐”“神奇小子”等;又如话题作文“感悟生活”,体味生活中的酸、甜、苦、辣,我们可以将此题分成一些范围较小的题目,如《品味苦咖啡》《生活的“重量”》等,就某一方面的感悟详加叙述。方法的运用使学生顿生灵感,起引导点拨作用。
7. 倡导创新心理。
作文教学中最重要的是写作思维能力的培养,而其中创新思维能力的挖掘,需充分利用学生的创新心理。在写作中,我们应该尽量避免学生墨守成规或满足于原来的思路,积极培养学生的反对精神、质疑品质,引导学生摆脱传统思维的束缚,鼓励他们另辟蹊径,标新立异,力求有新的突破。即使这个突破是零碎的、片断式的,也必须给予充分的肯定。同时,我们可以通过“片断式”的写作训练来培养创新思维,这些训练应该包罗万象,能反映学生对现实社会的看法,提升认知水平,形成创新的原动力。
8. 强化语言训练。
我们应该加强写作语言的基础训练,但要抛开单纯意义上的基础训练,而应该通过固定的训练模式,如同网上的主题活动,在训练中使学生逐渐形成自己的语言表达风格。首先,这些训练应该结合一系列主题训练活动(类似于网络聊天室),使学生在小范围活动中循序渐进地建立自己的语言表述方式。并强调文从字顺、表情达意准确生动等要求。其次,训练学生运用好叙述、描写、议论等表达方式,以适应文章反映现实生活的需要,使学生面对各种情况都能从容应对,体现出当代学生的生动而不铺陈、凝练而不朦胧、富有表现力和感染力的语言风格。
总之,我们应该将网络心理的精髓融入作文教学之中,把握其内在规律,突破传统的作文教学体系,改变固有模式,使学生真正找到“活水源头”,从根本上促进写作现状的改观,全面提高学生的写作水平。
活性因子 篇2
关键词：土壤；碳矿化；活性有机碳；影响因子
中图分类号： S153.6+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0004-03
收稿日期：2014-01-24
基金项目：国家自然科学基金（编号：41301314、41201559）；江苏省自然科学基金（编号：BK2011412）。
作者简介：徐洪文（1979—），男，黑龙江齐齐哈尔人，博士，副教授，主要研究方向为环境生态。E-mail：hongwen_xu@163.com。
通信作者：卢妍，黑龙江齐齐哈尔人，博士，副教授，主要研究方向为环境变化与物质循环。E-mail：yanyan0451_0451@163.com。随着气候变暖成为与社会经济可持续发展以及资源和环境保护密切相关的全球性重大问题[1]，土壤有机碳的动态变化也已经成为近年来陆地生态系统碳循环和全球气候变化研究中的热点[2-3]。土壤有机碳库的矿化是土壤中重要的生物化学过程，直接关系到土壤中养分元素的释放、温室气体的形成以及土壤质量的保持等，同时影响到土壤碳向大气的排放量，进而与全球气候变化密切相关[4-5]。另外，由于土壤活性有机碳周转较快，对干扰的反应比较敏感，故土壤活性有机碳也常作为评价土壤碳库微小变化的有效指标。开展有机碳矿化和活性有机碳的影响因子研究，对于深入了解土壤碳循环对环境变化响应机理具有重要的现实意义。
1土壤碳矿化影响因子研究进展
随着陆地碳循环机制及其对全球气候变化的影响逐渐受到科学界的重视，土壤有机碳矿化影响因子已成为研究热点，相关研究主要集中在土壤水分、温度、养分输入、土壤耕作制度等方面。 第一，温湿条件。土壤含水量是土壤有机碳矿化的主要影响因子之一。土壤含水量适度提高不仅可以提高微生物的活性，也可以增加土壤微生物的数量，从而加快土壤有机碳的矿化速度。土壤有机碳的矿化同样明显受到土壤温度的影响[6-8]，白洁冰等研究发现温度对高寒草甸和高寒湿地土壤碳矿化影响显著，而高寒草原土壤碳矿化速率与温度间未呈现明显的函数关系，但不同温度间的土壤碳矿化速率存在显著差异[9]。第二，耕作制度。免耕、少耕对土壤碳库变化的影响一直是国内外研究的热点问题。Hernanz等认为经过长期耕作后，免耕处理的土壤有机碳含量明显高于传统翻耕[10]，而Al-Kaisi等则认为免耕和翻耕处理土壤有机碳储量差异不显著[11]。由此可见，不同环境条件下土壤-植物根际体系中碳素特征会有很大变化，所以还需要进一步探讨土壤-植物根际体系中碳素循环的内在机理以及在外界影响下的变化规律[12]。第三，养分输入。有机肥的施入可以显著提高土壤微生物量碳含量[13]，而且还能提高土壤中水溶性有机碳的生物有效性。低剂量的氮素输入没有对高寒湿地和高寒草甸土壤碳矿化产生影响，但是显著增加了高寒草原土壤的碳矿化。说明氮素输入对土壤碳矿化的影响存在生态系统类型间的差异[9]。第四，丛枝菌根。菌根真菌不仅吸收利用植物光合固定的碳源，同时也是将碳源从植物传输到土壤的重要载体[14-16]。菌根真菌以生物量形式固定的碳源在自然生态系统中起到了重要的碳汇功能。另外，菌根真菌还具有降解有机碳的功能，在营养匮乏或光合能力减弱的环境条件下，丛枝菌根真菌能够采取降解土壤有机质作为自身生长营养需求的生存策略[17-18]。因此，菌根真菌在土壤碳代谢中的任何变化都将对土壤碳平衡产生重大影响。
2土壤活性碳影响因子研究进展
土壤活性有机碳库是指在一定的时空条件下，受植物、微生物影响强烈，对植物、微生物来说活性比较高的那一部分土壤碳素。其含量高低直接影响土壤微生物的活性，进而影响温室气体的排放。水溶性有机碳、微生物量碳、土壤易矿化碳等均属于土壤活性有机碳的表征形态。
2.1易氧化有机碳
易氧化有机碳是土壤中易被氧化且活性较高的有机碳，对土壤碳库平衡和土壤化学、生物学稳定性维持具有重要的意义。目前国内外关于土壤易氧化有机碳影响因子的研究报道较少，主要集中在施肥、土地利用和土壤湿度等方面。研究表明长期施用有机肥和氮磷钾配施都能够提高土壤中易氧化有机碳的含量。施用氮磷或氮磷钾肥可以显著提高潮棕壤土易氧化有机碳含量[19]，施用化肥（氮、氮磷和氮磷钾）同样可以显著增加棕壤土耕作层易氧化有机碳的含量。
可通过改变地表凋落物和根系分泌物的数量及化学组成性质而影响土壤易氧化碳含量的变化。在林地利用方面，王国兵等研究发现，土地利用变化显著影响了土壤易氧化碳的空间分布特征，但对土壤易氧化碳的季节波动没有显著影响[20]。刘正刚等发现由天然林土地利用类型到人工土地利用类型，土壤有机碳和易氧化态碳的含量明显下降[21]。除此之外，随着间伐强度的增大，林地土壤易氧化碳含量也会显著提高[22]。在农田利用方面，在西部黄土高原黄绵土区，采用免耕结合秸秆覆盖的保护性耕作措施有利于土壤总有机碳和易氧化有机碳含量的提高[23-24]。王莹等则认为土壤易氧化碳含量表现出春夏季节大于冬季[25]，这归因于春夏季节植物进入生长期，为土壤微生物提供了足够的易分解的新鲜有机质。
土壤湿度较高的环境有利于活性有机碳的累积。高湿度环境能够抑制土壤中大部分微生物的活性，从而提高土壤中易氧化碳的积累，且间接对植物根系和耗氧微生物的活动产生抑制，降低土壤有机碳的分解速率，使得更多的活性碳积聚在土壤中[26]。
2.2微生物量碳
施用化肥、秸秆还田及有机肥化肥配合施用可以显著提高土壤微生物量碳的含量[27]。马晓霞等研究发现施肥处理可以不同程度提高土壤微生物量碳的含量[28]，可能因为施用有机物质能为微生物提供充足的碳源，促进微生物的大量生长。而任卫东等指明了平衡施肥的重要性，长期平衡施肥能有效增加植物根际和非根际土壤微生物量碳的含量，但不平衡施肥对土壤微生物量碳含量无明显作用[29]。董博等认为单施有机肥，尤以农家肥对土壤微生物量碳的影响最大[30]，且随着有机肥用量的增加土壤微生物量碳含量增加[31]。而有机肥与其他肥料的配合施用也逐渐受到人们的广泛关注。有机肥与化肥配合施用不仅有利于植物的生长，增加微生物量碳的含量，而且还能改善土壤结构[32]，混施对提高土壤中微生物量碳的作用较单纯施用化肥更为显著[33-34]，鸡粪与有机肥配施同样能够提高土壤微生物量碳的含量[35]。
除气候和土壤等环境因素外，土地利用方式是影响土壤微生物量碳的重要因子之一。赵先丽等研究发现，土地利用方式对土壤微生物量有显著影响，其中土壤微生物量碳依次为森林>湿地>稻田>旱地>果园>草地[36]。也有研究表明：不同土地利用方式下土壤微生物量碳表现为果园、林地高于农田和草地，这可能是由于林地和果园每年地表有大量的凋落物，为微生物提供了丰富的碳源，同时也保持了表层土壤水分含量，更有利于土壤微生物的生长[37]。从不同农业用地方式来看，微生物量碳含量差异显著，具体表现为：粮田>菜地>林地[38]。董博等研究发现短期免耕对土壤微生物量碳含量有明显增加的现象[39]。陈英等研究发现秸秆覆盖耕翻土壤微生量碳含量高于常规耕翻[40]，这是由于作物秸秆为微生物增殖提供大量碳源，微生物利用碳源物质进行自我繁殖，将有机秸秆中的碳同化为微生物量碳[41]。
除此之外，土壤温度和含水量均对土壤微生物量碳累积产生一定的影响，但已有研究发现不同生态系统及地区土壤微生物量碳和温度及含量的相关性并不一致[42]。
2.3水溶性有机碳
土壤水溶性有机碳主要包括溶解在土壤溶液中不同种类的低分子量有机质，以及以胶体状悬浮于土壤溶液中的大分子有机质。施肥对土壤水溶性有机碳的含量有很大影响。盛卫星等的研究结果表明，施用化肥特别是超量施用化肥显著增加板栗（Castanea mollissima） 林土壤水溶性有机碳的含量[43]。李永夫等也发现了化肥显著提高毛竹林土壤水溶性有机碳含量的规律[44-45]。温度主要通过影响微生物活性进而对土壤水溶性有机碳的分解起调节作用，随着土壤温度升高，水溶性有机碳的含量也不断提高，所以夏季土壤中水溶性有机碳的含量高于冬季，而且这种现象在实验室可控条件下更为明显。冻融作用由于能够增加土壤水溶性有机碳的淋溶损失，所以同样可以提高土壤中水溶性有机碳的含量[46]。
土壤可溶性有机碳作为土壤中最活跃的组分之一，对土地利用及其变化的响应更为迅速和敏感。王明慧等发现土地利用方式对土壤水溶性有机碳的影响并未达到显著水平[47]。张金波等则认为土地开垦耕作是导致土壤水溶性有机碳含量降低的主要原因，并且也会降低土壤水溶性有机碳的质量[48]。昌维贵等通过分析认为农耕地土壤水溶性有机碳含量最低的原因，可能是由于土地的经常翻耕使土壤通透性增加，有机质渗透进入地下水中大量流失，加上作物季节性被收割走，归还量较少所致[49]。可见人为干扰是导致不同土地利用类型土壤水溶性有机碳含量差异的重要原因。
3展望
土壤有机碳矿化受土壤温度、水分、养分输入、耕作模式及丛枝菌根等因素的影响。目前关于土壤有机碳矿化速率的影响因子开展了广泛的研究；但多侧重于单个或少数几个影响因子的研究，关于多个因子综合作用对土壤有机碳的影响研究不多，而土壤碳矿化过程是土壤生物活性的综合体现，所以国内外关于有机碳矿化与环境因子的关系研究结论不尽一致。同时全球气候变化也会极大地影响土壤碳代谢环境影响机制研究。例如随着二氧化碳的增加，菌根真菌会促进土壤有机碳的积累，但同时也会加速土壤中有机碳的分解，由此可见全球变暖使得丛枝菌根对土壤有机碳的影响愈加复杂。另外，由于环境因子对于土壤碳矿化的影响依赖于生态系统类型。因此，开展不同生态系统、不同生境土壤碳矿化途径及其季节转换机制研究，以及不同环境因子在驱动土壤碳矿化过程中可能存在的协同或拮抗作用等值得进一步研究。
土壤活性有机碳能够灵敏、准确地反映土壤质量和肥力的变化，所以是评价土壤碳库平衡的重要指标。就目前国内外开展的研究而言，关于不同植被类型对土壤活性碳组分的影响研究相对较少，而活性有机碳占总有机碳比例的高低对不同群落下植被对土壤碳行为的影响非常敏感，尤其是易氧化有机碳占总有机碳比例在不同植被群落下有显著差异。所以需要进一步深入研究植被类型对土壤活性碳库循环转化的影响，探讨植被类型与碳平衡之间的相互作用机制。另外，作为土壤活性有机碳的影响因子，土壤微生物数量和微生物活性对于土壤的温湿条件甚为敏感，所以开展不同环境条件下土壤活性碳库与土壤微生物及土壤酶活性的关系研究，对于准确迅速地评估其对温室气体排放的影响具有一定的理论和实践意义。
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活性因子 篇3
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物
昆明种健康、雄性小白鼠, 体重 (22.0±0.5) g, 由山东省实验动物中心提供, 医学实验动物合格证号:动管质字 (2008) 第0179号。
1.1.2细胞株
H22肝癌瘤细胞、S180肉瘤细胞瘤株, 由山东省医学科学院药物研究所细胞室提供。
1.1.3药品
5-氟尿嘧啶 (5-FU) , 50 mg/片, 由上海第一药厂生产, 批号:070816。 水蛭素活性因子, 由山东省医科院基础医学研究所提供。
1.1.4仪器
超净工作台, 江苏南京科技器材开发公司生产; HK-Ⅱ型扭力天平, 江苏无锡净化设备厂生产。
1.2方法
1.2.1水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞的影响
1.2.1.1肿瘤接种造模选择腹腔接种H22肝癌实体瘤株后6~9 d、生长良好的H22肝癌小鼠, 放置于超净工作台, 腹部皮肤消毒后打开小鼠腹腔, 抽取乳白色瘤液, 用生理盐水配制成含瘤细胞2×106/mL的细胞悬液。选取48只小鼠, 每只小鼠左前腋下皮肤消毒后, 接种H22肝癌瘤细胞悬液0.2 mL, 次日开始给药。
1.2.1.2动物分组与用药将接种瘤细胞后的48只小鼠, 随机法分成4组, 每组12只:模型对照组、5-FU组、 水蛭素活性因子大、小剂量组。模型对照组给予同体积的生理盐水;5-FU组给予5-FU 0.15 g/kg;水蛭素大、 小剂量组分别给予水蛭素活性因子2.60、1.30 g/kg。 48只小鼠每日灌胃1次, 每次0.5 mL, 连续给药14 d, 于第15天脱颈椎处死小鼠, 剥离瘤块, 将瘤块置扭力天平上称瘤重, 计算抑瘤率: (C-T) /C×100% (C为模型对照组平均瘤重, T为给药组平均瘤重) ;比较各组肿瘤生长情况;在实验过程中严密观察小鼠的精神状态、活动、毛发、饮食等。
1.2.2水蛭素活性因子对S180肉瘤的影响
1.2.2.1肿瘤接种造模选择腹腔接种S180肉瘤瘤株后6~9 d、生长良好的S180肉瘤小鼠, 放置于超净工作台, 腹部皮肤消毒后打开小鼠腹腔, 抽取乳白色瘤液, 用生理盐水配制成含瘤细胞2×106/mL的细胞悬液。 选取44只小鼠, 每只小鼠左前腋下皮肤消毒后, 接种S180肉瘤细胞悬液0.2 mL, 次日开始给药。
1.2.2.2动物分组与用药将接种瘤细胞后的44只小鼠, 随机法分成4组, 每组11只:模型对照组、5-FU组、 水蛭素活性因子大、小剂量组。模型对照组给予同体积的生理盐水;5-FU组给予5-FU 0.15 g/kg;水蛭素大、 小剂量组分别给予水蛭素活性因子2.60、1.30 g/kg。 44只小鼠每日灌胃1次, 每次0.5 mL, 连续给药14 d, 于第15天脱颈椎处死小鼠, 剥离瘤块, 将瘤块置扭力天平上称瘤重, 计算抑瘤率: (C-T) /C×100% (C为模型对照组平均瘤重, T为给药组平均瘤重) ;比较各组肿瘤生长情况;在实验过程中严密观察小鼠的精神状态、活动、毛发、饮食等。
1.3统计学方法
采用SPSS 12.0计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞的影响
各用药组瘤重与模型对照组比较, 差异均有统计学意义 (P < 0.05) 。5-FU组、水蛭素活性因子大、小剂量组对H22肝癌抑瘤率分别为58.73%、47.62%、 39.15% (P < 0.01或P < 0.05) , 其中, 水蛭素活性因子大剂量组明显优于小剂量组, 呈现一定的量效关系。 见表1。
注:与模型对照组比较, *P < 0.05, **P < 0.01;与水蛭素活性因子小剂量组比较, #P < 0.05;5-FU:5-氟尿嘧啶; “-”表示无数据
2.2水蛭素活性因子对S180肉瘤的影响
各用药组瘤重与模型对照组比较, 差异均有统计学意义 (P < 0.05) 。5-FU组、水蛭素活性因子大、小剂量组对S180肉瘤抑瘤率分别为54.67%、43.33%、 40.67% (P < 0.01或P < 0.05) , 其中, 大、小剂量水蛭素活性因子组相比较, 差异无统计学意义 (P > 0.05) 。 见表2。
注:与模型对照组比较, *P < 0.05, **P < 0.01;与水蛭素活性因子小剂量组比较, #P < 0.05;5-FU:5-氟尿嘧啶;“-”表示无数据
2.3肿瘤外观及小鼠表现
接种H22肝癌瘤细胞和接种S180肉瘤细胞的小鼠, 给予水蛭素活性因子治疗后, 其瘤块颜色苍白, 与周围组织粘连较少, 剥离较易, 出血少;模型对照组的小鼠瘤块颜色紫暗, 与周围组织粘连较多, 剥离困难, 出血较多。5-FU组的抑瘤率虽然高于水蛭素活性因子大、小剂量组, 但在给药的第9天小鼠开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等, 而水蛭素活性因子大、小剂量组小鼠未发生此现象。
3讨论
近年来, 随着对中药水蛭素研究的深入, 水蛭素被发现可治疗多系统的肿瘤。 黄光武等[8]通过实验发现, 水蛭对体外血小板聚集的抑制效果良好, 对血小板聚集功能亢进的头颈部恶性肿瘤的转移可能有抑制作用。 成军等[9]研究发现, 水蛭素可通过降低TRm- RNA在胰腺癌细胞中的表达量而降低实验性肿瘤的转移。 王杰等[10]用复方水蛭素治疗小鼠异体移植的W256肿瘤、胃癌靶细胞 (NKM) , 结果显示复方水蛭素对W256肿瘤和胃癌靶细胞都有明显的抑制作用。 贺彬等[11]研究显示, 水蛭素对人舌鳞癌细胞株TCA8113细胞生长呈抑制作用。 谭祥华等[12]研究显示, 活血化瘀法对肿瘤作用机制为全方位、多靶点作用, 活血化瘀类中药可通过改善血液流变学, 降低血液黏度, 调节癌基因及其信号传递, 抑制血管生成以及诱导肿瘤细胞发生凋亡等方式来抑制肿瘤细胞生长, 阻断肿瘤发生转移。水蛭素是从活血化瘀代表药水蛭中提取的有效物质, 它对上述多系统肿瘤的作用, 也证实了其全方位、多靶点作用。目前, 临床上西医治疗肿瘤副作用大, 给肿瘤的治疗带来了局限性, 而中药由于疗效好、 副作用少而在临床肿瘤治疗方面占有一定优势。 本研究结果也显示, 水蛭素活性因子能显著抑制小鼠H22肝癌实体瘤和S180肉瘤, 且未发现明显的副作用;而5-FU组在给药的第9天小鼠开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等副作用。因此, 水蛭素作为新的抗肿瘤药物, 因其抗肿瘤作用强、副作用少而在临床治疗肿瘤方面将发挥更大的作用。
摘要：目的 观察水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞、S180肉瘤的抑制作用, 为临床用药提供理论依据。方法 取小鼠48只, 每只小鼠左前腋下接种H22肝癌瘤细胞0.2 mL, 随机分为4组, 每组12只, 分成模型对照组、5-FU组、水蛭素活性因子大剂量组 (水蛭素活性因子2.6 g/kg) 和水蛭素活性因子小剂量组 (水蛭素活性因子1.3 g/kg) ;另取小鼠44只, 每只小鼠左前腋下接种S180肉瘤细胞0.2 mL, 随机分为4组, 每组11只, 分成模型对照组、5-FU组、水蛭素活性因子大剂量组 (水蛭素活性因子2.6 g/kg) 和水蛭素活性因子小剂量组 (水蛭素活性因子1.3 g/kg) ;连续给药14 d, 比较各组肿瘤生长情况, 并计算抑瘤率。结果 ①水蛭素活性因子对H22肝癌实体瘤的影响:5-FU组[瘤重 (0.78±0.41) g]、水蛭素活性因子大剂量组[瘤重 (0.99±0.48) g]、水蛭素活性因子小剂量组[瘤重 (1.15±0.50) g]对H22肝癌抑瘤率分别为58.73%、47.62%、39.15%, 与模型对照组相比, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) , 其中水蛭素活性因子大、小剂量组比较, 大剂量组抑瘤作用明显优于小剂量组 (P<0.05) , 呈现一定的量效关系。②水蛭素活性因子对S180肉瘤的影响:5-FU组[瘤重 (0.68±0.30) g]、水蛭素活性因子大剂量组[瘤重 (0.85±0.44) g]、水蛭素活性因子小剂量组[瘤重 (0.89±0.47) g]对S180肉瘤抑瘤率分别为54.67%、43.33%、40.67%, 与模型对照组相比, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) , 其中水蛭素活性因子大、小剂量组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。③所有5-FU组小鼠在给药第9天开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等, 而水蛭素活性因子组小鼠未发生此现象。结论 水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞和S180肉瘤均有较好的抑制作用, 且水蛭素因子无明显副作用。
活性因子 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康Wistar大鼠48只,雌雄各半,体重180~250 g,由沈阳医学院动物实验中心提供。室温下喂养,除建立模型前24 h禁食外,各组自由饮食、饮水。
1.2 药品与试剂
BRA由沈阳医学院化学教研室张辉教授惠赠。雷尼替丁片(海华源长富药业集团辽宁制药有限责任公司,批号070101),用时加蒸馏水配成混悬液。超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、一氧化氮(NO)检测试剂盒及丙二醛(MDA)检测试剂盒,均由南京建成生物工程研究所提供,严格按照说明书操作。
1.3 方法
1.3.1 动物分组
取Wistar大鼠48只,按完全随机设计法共分6组,每组8只,分别为:(1)空白对照组,不进行手术,以适量生理盐水灌胃;(2)胃溃疡模型对照组,手术后以适量生理盐水灌胃;(3)~(5)组为BRA三个剂量组(28、14、7 mg/kg);(6)雷尼替丁已知药对照组(27 mg/kg)。
1.3.2 造模与给药
参照文献方法[2],空白对照组8只除外,其余40只大鼠均手术造乙酸烧灼型胃溃疡大鼠模型。造模前大鼠禁食不禁水24 h,1%戊巴比妥钠3 ml/kg(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,约10 min后,大鼠麻醉,将其仰卧固定于手术台上,腹部剪毛,碘伏消毒、铺巾,于胸骨剑突下沿腹中线稍左分层切开腹壁肌2~3 cm,自肝脏后找出胃,小心托起胃并移出腹腔,在胃前壁窦体交界近幽门处浆膜面上避开血管,用直径为5 mm的圆形滤纸蘸100%的冰醋酸贴30 s取下,再换一滤纸重复贴30 s后弃去滤纸,换干净滤纸吸去胃壁表面的乙酸,乙酸贴面处用网膜覆盖,将胃送入腹腔,逐层缝合切口,切口处用碘伏消毒保护切口。麻醉大鼠均在2~3 h内逐渐苏醒,造模周期为3 d。于造模后第3天开始按各分组剂量灌胃给药,灌胃容积0.2 ml/10 g,每天上午1次,连续治疗15 d。空白对照组与模型对照组分别给予生理盐水20 ml/kg。
1.3.3 取血
大鼠连续灌胃给药15 d,于末次给药后禁食24 h,自由饮水,第16天将大鼠断颈处死,迅速打开腹腔,腹主动脉取血约5 ml,3 000 r/min离心10 min,分离血浆,-20℃冰箱保存备用。
1.3.4 生化指标检测
各项检测指标均严格按试剂盒说明书进行,UV-2000型紫外可见分光光度计比色。血清中NO、MDA和SOD含量分别采用硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法测定,结果见表1~3。
1.4 统计学方法
本实验所有数据均用均数±标准差(±s)表示,并使用SPSS 10.0软件包进行统计学分析,组间差异比较采用两样本均数比较的t检验,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 BRA对乙酸烧灼型胃溃疡大鼠血清NO水平的影响
见表1。
与空白对照组比较,*P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.01,##P<0.05
由表1可见,与模型对照组相比,BRA中、高剂量组血清NO水平显著增高(P<0.01);与空白对照组比较,BRA血清NO水平低,但无显著性差异(P>0.05)。
2.2 BRA对乙酸烧灼型胃溃疡大鼠血清MDA含量的影响
见表2。
与空白对照组比较,*P<0.01,**P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.01,##P<0.05
由表2可见,空白对照组与模型对照组及BRA高剂量组MDA比较有非常显著性差异(P<0.01),空白对照组与BRA小剂量组比较有显著性差异(P<0.05),模型对照组与雷尼替丁组及BRA各剂量组比较有显著性差异(P<0.05)。结果表明,BRA能降低乙酸烧灼型胃溃疡大鼠血清中MDA的含量。
2.3 BRA对乙酸烧灼型胃溃疡大鼠血清SOD含量的影响
见表3。
与空白对照组比较,*P<0.0l,**P<0.05
由表3可见,空白对照组与模型对照组及雷尼替丁组比较有非常显著性差异(P<0.01),空白对照组与BRA中、小剂量组比较有显著性差异(P<0.05)。结果表明,BRA能提高乙酸烧灼型胃溃疡大鼠血清SOD的含量。
3 讨论
消化性溃疡(PU)主要以上腹部反复疼痛、消化道黏膜、肌层和(或)浆膜层受到损害为特征,包括胃溃疡(GU)和十二指肠溃疡(DU),发病机制较为复杂,一般认为与黏膜的防御因子(胃黏液-黏膜屏障、内源性前列腺素、黏膜血流等)和攻击因子(胃酸、胃蛋白酶、Hp感染、药物)失衡有关。当防护因子减少时,必然使胃黏膜对各种损伤因子的易感性大大增加,加快、加重了胃黏膜的损伤,并使其难以修复。
NO是一种内源性血管舒张剂和神经调节剂,它通过扩张黏膜血管,增加血流量,改善其微循环,增加局部供血、供氧起到保护作用[3],正常、适当的NO含量对调节胃动力和胃黏膜血流、维持胃黏膜的防御功能起着重要的作用。作为一种内源性血管舒张因子,NO可间接反映胃黏膜的血流量。NO还能抑制胃酸分泌,相对提高碳酸氢盐浓度,是细胞保护递质之一。本实验结果可见,模型对照组在胃溃疡发生时,血清中NO含量明显降低,与空白对照组比较有非常显著性差异(P<0.01),表明在乙酸烧灼刺激下机体NO产生量降低,由此引起胃黏膜局部血供减少,体内氧自由基产生增多,导致溃疡形成。经BRA治疗后,BRA各剂量组均能使血清NO含量升高,与模型对照组比较,差异有非常显著性(P<0.01),说明BRA可通过提高内源性NO含量发挥其胃黏膜保护作用,本实验中BRA提高血清及胃组织中NO含量,可能是其促进溃疡愈合的机制之一。
MDA是胃黏膜的攻击因子之一,它的含量反映机体脂质过氧化的速率及强度,可间接反映组织受自由基损伤的程度[4]。SOD是一种重要的抗氧化酶,可以清除超氧阴离子自由基,保护生物体免受自由基的攻击,对机体的氧化及抗氧化平衡起着至关重要的作用,因此,SOD是胃黏膜的保护因子之一,其活力的高低间接反映机体清除自由基的能力。SOD和MDA可间接反应自由基代谢水平[5]。当胃黏膜损伤时,表现为SOD的活性降低,MDA的含量升高。降低自由基清除能力,如增加SOD浓度,降低MDA含量,对胃黏膜可起到保护作用。本实验结果显示,BRA能提高乙酸性胃溃疡大鼠胃组织中SOD的含量,降低MDA水平,从而消除氧自由基,消减过量的超氧阴离子对胃黏膜的损伤,提示该药可提高机体抗氧化和清除自由基的能力,抑制脂质过氧化反应,改善自由基代谢,能有效地对乙酸诱发胃溃疡大鼠黏膜起到促进愈合的作用,对于胃溃疡病也是一种有效的制剂,这些结果为其用于治疗消化性溃疡提供了理论依据。
摘要：目的:观察BRA对乙酸烧灼型溃疡大鼠血清中活性成分的影响,探讨该药对实验性溃疡大鼠溃疡的治疗作用。方法:采用冰醋酸烧灼法制备胃溃疡模型,连续药物治疗15d后取血,检测生化指标NO、MDA和SOD含量。结果:BRA各剂量组均能使血清NO含量升高,并提高血清SOD的含量,降低MDA水平,与模型对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:BRA通过提高血清NO和SOD含量,降低MDA含量,减少溃疡黏膜损伤,促进溃疡愈合,对实验性胃溃疡有保护性治疗作用。
关键词：BRA,胃溃疡,NO,MDA,SOD
参考文献
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活性因子 篇5
1 材料与方法
1.1 主要材料
MTS试剂盒 (Cell T iter96®Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay) Promega公司产品。MIP-1α、MIP-1β及RANTES, 英国Pepm Tech EC公司产品;RPML1640培养液和胎牛血清, Gibco公司;聚碳酸脂微孔滤膜 (Polycarbonate membranes 10μm pore) 和48孔标准趋化小室 (Standard 48Well Chemotaxis Chamber) Neuro Probe Inc公司。
1.2 CCR5模拟肽 (HDTCSSHFPYSQ) 的制备[4]
用噬菌体展示技术, 以CCR5单克隆抗体作为筛选靶标, 通过筛选噬菌体随机12肽库与CCR5单抗特异结合的肽段。经鉴定的30个阳性噬菌体克隆通过DNA测序, 获得CCR5单抗模拟抗原表位的10个多肽序列。获得的核心序列HY-TC-SS-XX-P/FYS-X, 与CCR5的一级序列ECL2具有一定的同源, 选择出现频率最多 (9次) 的序列短肽 (HDTCSSHFPYSQ) , 交由上海生工生物工程技术服务公司采用固相法合成模拟肽, 合成肽用高效液相色谱HPLC纯化, 并经质谱确认, 短肽 (HDTCSSHFPYSQ) 溶解于DMSO中配成100mg/mL, 稀释用pH 7.4的PBS溶液。
1.3外周血单个核细胞 (PBMCs) 的分离
取健康人新鲜血液 (购于广州市金域体检中心) , 用PBS稀释血液1.5倍;将聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液放入离心管中, 沿试管壁徐徐加入稀释血液至分层液面上1cm处, 以2000r/min离心20min, 离心后, 在分层液与血浆交界处用毛细管吸取细胞层, 获得单个核细胞 (PBMCs) 。37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养在含10%胎牛血清 (FCS) 、双抗青霉素100μg/mL和链霉素100μg/mL的RPMI1640培养液中。
1.4 MTS法检测PBMCs增殖实验[5]
新鲜分离的PBMCs制成单细胞悬液, 用RPMI 1640培养液调节细胞浓度为4×104个/mL, 加入PHA 5μg/mL, 每孔按0.1mL细胞悬液的量入至96孔细胞培养板, 每组为3个重复孔, 空白对照孔不加细胞。常规培养24h;试验组中每孔各加入0.05mL模拟肽样品, 设不加入样品的阴性对照孔, 培养48h;每孔各加入0.02mL MTS/PMS溶液, 继续培养1～4h, 测定OD490值。抑制率 (CI) = (对照组OD490-样品组OD490) ×100%÷对照组OD490, 计算值等于或超过30%为抑制效果显著。
1.5检测模拟肽对PBMCs对MIP-1α、RANTES及MIP-1β趋化活性的影响
48孔趋化小室上下室之间用Ⅳ型胶原包被的聚碳酸脂滤膜和乳胶隔垫隔开。下室每室加入29μL无血清RPML1640培养基, 调整收获的PBMCs悬液, 浓度为每毫升1×106细胞, 加细胞悬液至上室, 每室45μL, 3个重复样孔, 孵育5h。取出微孔滤膜, 刮膜器刮除干净滤膜上面的细胞, 下层粘附的穿膜细胞以瑞氏染液固定、染色15min。显微镜下随机取上、下、左、右、中心5个视野, 计数穿膜细胞数, 取5个视野的总数表示单核细胞的趋化能力, 平行实验进行2次。
2 结果
2.1 模拟肽对人外周血单核细胞增殖的影响
采用不同浓度的模拟肽作用于PBMCs, 如表1所示, 当短肽的浓度为20mg/L时, 对PHA诱导的PBMCs增殖表现了明显的抑制效应 (P<0.05) , 对PBMCs抑制率为30.2%;浓度为100mg/L时, 对PBMCs抑制率达到了72.1%。
2.2 模拟肽对人外周血单核细胞趋化的影响
用模拟肽0.5mg/mL作用于PBMCs 4h, 取下游离的聚碳酸脂膜, 在显微镜下计数穿膜的细胞数, 模拟肽组穿膜细胞数为 (20±6) 个, 与对照组 (18±5) 相比, 穿膜细胞数相差无几, 说明短肽对PBMCs没有趋化作用 (P>0.05) , 而与RANTES组比较 (73±10) 穿膜细胞数相差明显 (P<0.05) ;而预先经短肽处理2h的PBMCs (短肽+RANTES组) 其穿膜细胞数 (26±9) , 则显著少于RANTES组 (P<0.05) , 说明短肽能够抑制PBMCs对RANTES的趋化效应。短肽预处理的短肽+MIP-1α组和短肽+MIP-1β组分别与MIP-1α、MIP-1β组比较, 结果发现该模拟肽不能影响MIP-1α和MIP-1β对外周血单核细胞的趋化作用 (表2) 。
a与对照组比较;b与RANTES组比较
3 讨论
RANTES和MIP-1α、MIP-1β等CC类趋化因子则主要趋化单核细胞和淋巴细胞。趋化因子通过和相应受体的高亲和结合产生生物学功能。由于G蛋白耦联受体有很高的易操作性, 被认为是进行免疫学治疗阻断趋化性细胞因子在许多疾病中所起作用的可靠靶点。本研究对CCR5模拟短肽 (HDTCSSHFPYSQ) 进行活性分析, 我们采用MTS/PMS比色分析法, 测定了活化后的增殖, 发现该模拟肽能抑制PHA对PMBCs的活化增殖作用, 20mg/mL时, 抑制率达到30.2%;且能抑制PBMCs对RANTES的趋化作用, 而该模拟肽不能影响MIP-1α和MIP-1β对外周血单核细胞的趋化作用。推测趋化因子受体CCR5模拟短肽 (HDTCSSHFPYSQ) 可作为CCR5的拮抗剂为进一步研究打下基础。趋化性细胞因子受体选择性拮抗剂的发展, 为进一步了解免疫系统的生物学机制提供了有力工具, 也为我们治疗自身免疫性疾病、艾滋病等顽症提供了一种新的思路。
摘要：目的 探讨趋化因子受体CCR5模拟短肽 (HDTCSSHFPYSQ) 的生物学作用。方法 用MTS法检测模拟肽对淋巴细胞的增殖抑制作用。趋化性实验观察短肽分别对MIP-1α、MIP-1β及RANTES趋化作用的影响。结果 通过对CCR5模拟短肽 (HDTCSSHFPYSQ) 的活性分析, 发现该短肽能抑制PHA对PMBCs的活化增殖作用, 20mg/mL时, 抑制率达到30.2%;且能抑制PBMCs对RANTES的趋化作用。结论 模拟肽能够抑制PHA诱导的PBMCs的活化和增殖并且能抑制单核细胞对RANTES的趋化, 初步认为该模拟肽可作为CCR5的拮抗剂而受到进一步研究。
关键词：CCR5模拟肽,趋化因子,MTS法,趋化作用
参考文献
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活性因子 篇6
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
p GL3-Basic质粒、海肾荧光素酶表达质粒p RL-SV40、DNA纯化试剂盒和荧光素酶双报道试剂盒均为Promega公司产品;质粒提取试剂盒、基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen;高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于Takara公司;胶回收试剂盒为Dongsheng Biotech公司产品;限制性内切酶Kpn I、HindⅢ购自NEB公司;脂质体Lipofectine 2000为Invitrogen公司产品;DMEM、胎牛血清购自Gibco;细胞系OVCAR3、SKOV3、ES-2来源于ATCC;HO-8910购于中国科学院细胞库, 均为本实验组保存, 培养于含有10%FBS的DMEM培养基中, PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
1.2 实验方法
1.2.1 C-MET启动子序列扩增及纯化
按Qiagen试剂盒说明书提取卵巢癌细胞系OVCAR3细胞基因组DNA, 经核酸定量仪定量后置于-20℃备用。根据C-MET基因序列AF046925 (Gen Bank) , 设计2条扩增C-MET启动子核心区域 (-223~+60) 的引物, 上游:CGGGGTACCCAGACTGCCTGAGCTGGGG GA;下游:CCCAAGCTTGCGACCAGACTGAGGCGCT C, 上游引物包含Kpn I酶切位点, 下游引物包含HindⅢ酶切位点, 划线部分为酶切位点。扩增片段全长283 bp, 包括转录起始点上游223 bp和下游60 bp。以基因组DNA为模板, 采用25μL反应体系进行PCR扩增, 循环参数为:94℃5 min, 94℃30 s, 62℃30 s, 72℃30 s, 30个循环, 72℃5 min。取5μL PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 并对目的条带进行胶回收。
1.2.2 荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定
PCR产物和p GL3-Basic质粒均以Kpn I和HindⅢ双酶切, 对目的条带采用胶回收并进行纯化。纯化过的DNA片段和质粒按3︰2的比例, 在T4DNA连接酶作用下连接2 h, 得到重组质粒p GL3-C-MET-Promoter。将重组质粒转化DH5α细菌, 于含氨苄青霉素的LB培养基平皿上进行选择培养。挑取其中3个克隆扩增并经KpnⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定。测序工作由北京华大公司完成。
1.2.3 细胞转染及荧光素酶转录活性测定
将处于对数生长期的OVCAR3、SKOV3、ES-2、HO-8910细胞经胰酶消化后重悬, 细胞密度为1.5×105个/m L, 各取200 m L/孔接种于48孔板内, 置于37℃、5%二氧化碳 (CO2) 孵育箱中培养。细胞汇合度为80%左右时, 将重组质粒p GL3-C-MET-Promoter转染各组细胞, 为校正孔间转染效率, 各组均用表达海肾荧光素酶报告基因质粒p RL-SV40同时进行转染。转染采用脂质体法:首先形成Lipofectine-DNA复合物, 室温静置20 min后, 将Lipofectine-DNA复合物加入细胞培养液中, 培养6 h后更换成含10%血清的培养基继续培养24 h。细胞裂解后测定荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性, 以二者比值为校正后的结果, 实验重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析, 所有数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用单因素ANOVA分析, 检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 C-MET启动子序列的PCR扩增
以提取的卵巢癌细胞中基因组DNA为模版进行PCR扩增, 取扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下可见一条明显的DNA条带位于250 bp附近, 与所需扩增片段大小相符, 且无非特异性扩增片段, 此条带即为设计扩增的目的片段 (见图1) 。
2.2 C-MET启动子与p GL3-Basic质粒连接及鉴定
PCR产物与质粒均经酶切后连接, 重组质粒转染大肠杆菌克隆、培养, 随机挑取3个单菌落中的少许菌体为模板进行扩增并经Kpn I和HindⅢ双酶切鉴定, 结果见图2, 得到大小为5 kb左右的p GL3质粒片段和含C-MET启动子区的目的条带。1号克隆送公司测序分析, 其测序结果与Gen Bank中的C-MET基因启动子序列比对后完全一致, 证实重组质粒载体构建成功。
2.3 荧光素酶报告基因转录活性
将重组质粒p GL3-C-MET-Promoter及p RL-SV40共转染卵巢癌细胞株, 24 h后进行荧光素酶活性检测发现, C-MET启动子在OVCAR3、SKOV3、ES-2、HO-8910细胞中的相对转录活性为 (31.4±2.5) 、 (20.1±2.6) 、 (14.5±1.9) 和 (3.6±1.5) (见图3) , 各组之间比较均有统计学意义 (P<0.05) 。
M:DL2000 DNA Marker;1:PCR扩增产物
M1:1 kb DNA Ladder Marker;1和2:分别为C-MET-3的质粒与酶切后产物;3和4:分别为C-MET-2的质粒与酶切后产物;5和6:分别为C-MET-1的质粒与酶切后产物;M2:DL2000 DNA Marker
1:OVCAR3;2:SKOV3;3:ES-2;4:HO-8910
3 讨论
卵巢癌为最常见的妇科恶性肿瘤之一, 是引起妇女死亡的第5大原因。由于起病隐匿和缺乏有效的早期筛查手段, 75%的患者就诊时已为卵巢癌晚期[5]。手术治疗及化疗药物为当前治疗卵巢癌的主要手段, 但不能有效地预防或延迟肿瘤的转移播散, 肿瘤转移仍为治疗卵巢癌的主要挑战。因此, 更好地了解肿瘤侵袭转移的机制是开发有效药物的关键, 从而提高卵巢癌患者的生存率及完全治愈率。C-MET为肝细胞生长因子受体, 在卵巢癌等多种肿瘤中高表达, 促进肿瘤的侵袭和转移。刘等[6]研究发现, 与对应的正常食管组织相比, 部分食管鳞癌组织中C-MET呈高表达, 且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期显著相关。最近有学者报道[7], C-MET在胃癌形成过程中起着重要的作用, 其表达的高低可作为肠上皮化生发展到非典型增生的癌前病变的一个预测指标。对卵巢癌的研究表明[8], 在具有遗传性卵巢癌综合征的妇女中存在HGF/C-MET的自分泌调节环, 从而增加了该类妇女患卵巢癌的易感性。卵巢癌组织中C-MET水平上调与肿瘤分期有关, 且C-MET高表达的ⅢC卵巢癌患者更容易形成腹主动脉旁淋巴结转移, 具有更差的总体生存率, 由此推测C-MET表达水平可能为晚期卵巢癌患者潜在的预后因子。应用小分子干扰RAN沉默C-MET后, 可明显减轻卵巢癌动物模型的肿瘤负荷、减少腹水形成及腹膜植入的数量, 也可抑制腹膜播散和侵袭[9,10,11]。卵巢癌细胞株SKOV3、OVCAR3、HO-8910均为上皮性卵巢腺癌患者腹水中提取的细胞, ES-2为卵巢透明癌细胞。既往研究证明, OVCAR3细胞具有较强的体外侵袭转移能力。对C-MET基因启动子区域研究分析显示, -223~+60片段为转录调控的核心区域, 为正性调控原件。本研究通过PCR技术获取含C-MET核心调控区域的启动子片段, 并应用基因重组技术构建含该启动子片段的荧光素酶报告基因质粒, 经酶切及测序鉴定证实重组质粒构建成功。将重组质粒瞬时转染卵巢癌细胞株发现, 转移能力强的OVCAR3细胞中荧光素酶的活性最高。由此推测, C-MET活性的高低可能与细胞的侵袭转移能力相关, 转录因子在转录水平对C-MET进行激活, 从而引起HGF/C-MET通路活化, 导致肿瘤发生、发展。本质粒的构建为更好地研究C-MET的结构及生物学功能, 以及为研究卵巢癌的侵袭转移机制提供有力的证据。
参考文献
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活性因子 篇7
关键词：创伤性深静脉血栓形成,PDI,组织因子
近年来,血栓性疾病因其高发病、高危害和治疗的高花费越来越受到人们的重视,它遍布临床各个科室,是临床医师比较棘手的疾病之一,而由于手术、外伤等创伤性原因造成的创伤性深静脉血栓形成的发病率更是逐年增高。现代凝血理论已经证实TF是生理性凝血级联反应的主要启动因子[1],但是其活化的具体分子学机制尚未明确。Ruf等研究发现:暴露于细胞便表面的TF的促凝活性其实是很低的,其表面含有一个暴露的二硫键,只有当这一个二硫键转变为巯基以后才能形成完全有活性的TF,进而发挥其外源性凝血途径启动子的作用[2]。PDI蛋白是一种广泛存在于真核细胞的氧化还原蛋白家族,具有氧化还原酶、异构酶及分子伴侣的作用,能够催化二硫键与巯基之间的互变反应。因而本实验利用PDI单抗作用于大鼠创伤性深静脉血栓模型,观察PDI单抗对大鼠创伤性深静脉血栓形成的影响,初步探讨PDI蛋白在TF活化过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SD大鼠40只,均为雌性,体质量300g左右,山西医科大学实验动物中心提供;PDI单抗,美国BD公司产品;大鼠组织因子ELISA试剂盒,山西博士德公司提供;大鼠组织因子发色底物试剂盒,法国HYPHEN Bio Med公司产品,大鼠D-二聚体ELISA试剂盒购自上海裕平生物科技有限公司。
1.2 方法
(1)SD大鼠40只,随机平均分为实验组和对照组,实验组大鼠预先注射PDI单抗(50μg/只)[3],对照组大鼠预先不做任何处理。(2)造模:将大鼠麻妥,固定,消毒后行右腹股沟处内侧切口,长约1cm,暴露出股动、静脉及股神经,显露出长约1.5cm的股静脉,用12.5cm全齿蚊式血管钳钳夹1次,力量为血管钳紧1扣,每次持续3s,用1号丝线全层间断缝合皮肤切口,不放置引流,术后行髋人字石膏固定[4]。(3)造模后立即经大鼠尾静脉取血2mL于两个枸橼酸三钠抗凝管中(各1mL,抗凝剂:全血为1∶9),在室温下以3500r/min离心6min,取上层血清,-80℃条件下冷藏待用。(4)采用ELISA法检测各组大鼠静脉血中组织因子浓度,发色底物法检测各组大鼠静脉血中组织因子促凝活性,均严格按照试剂盒说明书进行。(5)相关文献及我们的预实验都表明,造模后3h开始有血栓形成,25h血栓形成达到高峰,因此,于术后5、10、25h经大鼠尾静脉采血,ELISA法检测两组大鼠体内D-二聚体的含量。(6)25h后解剖大鼠患肢,切除股静脉,观察血栓形成情况。
1.3 统计学方法
应用SPSS 13.0软件,TF浓度和活性比较采用独立样本的t检验,D-二聚体的变化采用重复测量进行比较。数据以均数±标准差(χ—±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠TF含量及浓度变化
对照组大鼠血清中TF含量及活性均高于实验组(P<0.01)。见表1。
2.2 两组大鼠体内D-二聚体含量变化
对照组大鼠体内D-二聚体含量成逐渐增高趋势,实验组大鼠体内D-二聚体含量较低,无明显增高趋势。见图1。
2.3
25h后,解剖大鼠患肢,取出大鼠股静脉,发现实验组大鼠股静脉形成的例数及栓子大小、长度均小于对照组,根据栓子长度,将血栓分为无血栓,原位血栓及蔓延血栓3种情况,无肉眼可见血栓为无血栓,2mm以内的为局部血栓,>2mm的为蔓延血栓。具体结果见表2。
3 讨论
组织因子是一种由263个氨基酸残基组成,相对分子质量为47000的单链跨膜糖蛋白,由血管内皮细胞、单核细胞、平滑肌细胞等多种细胞合成,作为一种膜受体,其细胞外部分是激活凝血系统所必需的。TF是外源性凝血途径的启动因子,当其与FVIIα结合生成复合物激活凝血因子X,从而启动凝血反应,导致病理性血栓的形成[5]。一旦形成血栓,就会同时激活机体的纤溶系统使血栓溶解,产生分子大小、结构不同的降解产物,其中D-二聚体为纤维蛋白原特异性降解终产物。血浆D-二聚体水平的升高,表明体内已有血栓形成,并且已发生了降解[6]。而正常情况下,血管内皮细胞并不表达TF,故健康人血浆中TF含量极低[7]。当血管内皮功能失衡或血管内存在刺激血管内皮细胞表达TF的因素时,就有可能启动凝血过程。我们的预实验也表明损伤大鼠股静脉内皮细胞,造成TF暴露后可导致大鼠创伤性深静脉血栓的形成,故抑制血管内皮细胞表达TF已成为抗血栓形成的主要手段。
PDI蛋白家族是一类在内质网中起作用的巯基-二硫键氧化还原酶。它们通常含有CXXC(Cys-Xaa-Xaa-Cys,CXXC)活性位点,活性位点的两个半胱氨酸残基可催化底物二硫键的形成、异构及还原。所有PDI家族成员包含至少一个约100个氨基酸残基的硫氧还蛋白同源结构域。PDI家族的主要职能是催化内质网中新生肽链的氧化折叠,另外在内质网相关的蛋白质降解途径(ERAD)、蛋白质转运、钙稳态、抗原提呈及病毒入侵等方面也起重要作用[8]。由于PDI蛋白能够催化二硫键与巯基之间的互变反应,且能催化内质网中大部分新生肽链的氧化折叠,因而设想通过一些实验来验证其是否在TF的活化过程中起作用。
本实验结果显示,PDI抗体预先干预的大鼠在血管被损伤后形成血栓的概率或程度明显小于空白对照组大鼠。通过该实验,我们可以认为PDI蛋白参与了TF的活化过程,抑制PDI蛋白就可以抑制TF的促凝活性,减少血栓形成。PDI蛋白可以作为将来新的抗凝药物的研究靶点,为新的抗栓药物的研制提供理论帮助。
参考文献
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活性因子 篇8
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SD大鼠由河北省实验动物中心提供,PDGF购自Oncogene公司,基因芯片购自美国Super Array公司,PCR引物由上海生物工程公司合成。
1.2 实验方法
1.2.1 血管平滑肌细胞培养
5周龄雄性SD大鼠,取胸腹主动脉,按贴块法分离、培养VSMC。运用免疫组化特异性抗鼠α-actin抗体鉴定VSMC。0.25%胰蛋白酶消化传代,选4~8代细胞进行实验。
1.2.2 MMP-2活性的检测
用含明胶的SDS-PAGE检测MMP-2活性。分离胶浓度为8%(含0.2%明胶),浓缩胶浓度为5%。分别取15μg/L PDGF[1]刺激0 min、20 min和6 h的VSMC培养基恒压电泳。电泳结束后,凝胶经2.5%Triton X-100漂洗两次,洗去凝胶中的SDS,使酶蛋白复性。随后加入反应缓冲液37℃孵育9 h。0.5%考马斯亮蓝染色1.5-2 h,脱色液脱色至蓝色背景下显现出清晰的白色条带为止。应用数码成像分析软件对酶图明胶降解区带的信号强度进行相对定量分析。
1.2.3 基因芯片检测
培养的VSMC生长至100%融合时,换成1%FBS培养基培养24 h,使细胞同步于G0期。分别加入15μg/L PDGF作用0 min、20min和6 h。采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从上述时间点的VSMCs中提取总RNA,以此为模板,以Oligo(d T)7为引物,按照Super Array的反转录试剂盒说明书合成c DNA。得到的c DNA经过线性聚合酶反应转录合成反义RNA,同时加入生物素标记的d UTP,合成探针。
按照Super Array说明书进行杂交。将杂交膜沥干后,用X-射线胶片曝光。用扫描仪扫描胶片上的图像。运用Scan Alyze软件(Super Array公司)分析结果。
1.2.4 R T-PCR检测
培养的VSMC生长至100%融合时,细胞同步于G0期后,采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分别从PDGF处理0 min、20min和6 h的VSMC中提取总RNA。以上述RNA为模板,反转录合成c DNA。以c DNA为模板,分别加入大鼠MT1-MMP c DNA上下游引物:上游引物:5'-GTACTACCGCTTCAATGAGG-3';下游引物:5'-C ACTGCCAGTACCAGGAG-3'。MT1-MMP c DNA扩增片段长度354 bp。以大鼠β-actin为内参照。
同样,以c DNA为模板,分别加入大鼠TIMP-2c DNA上下游引物:上游引物:5'-TCTTTCATCATGA GGCAGAGG-3';下游引物:5'-GGAAGGGATGTCAA AGCTGGA-3'。TIMP2 c DNA扩增片段长度442 bp。以大鼠β-actin为内参照。
按照PCR Kit说明书进行PCR。取RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用UVP凝胶图像成像系统拍摄,并用凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析结果。
1.3 统计学分析
采用SPSS 11.5统计软件处理。实验数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,统计结果以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 PDGF显著提高MMP-2的活性
明胶酶谱结果表明:PDGF刺激VSMC 20 min及6 h后与不用PDGF刺激的对照细胞(0 min)比较,培养基中MMP-2的活性呈明显升高趋势。经图像分析系统对酶图进行分析的结果显示:0 min条带灰度为198.7±17.1、20 min为289.2±26.5及6 h为405.3±41.2,分别升高1.46倍、2.04倍(见图1)。
1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的VSMC分泌MMP-2活性情况
2.2 PDGF具有提高MT1-MMP基因表达的作用
PDGF刺激VSMC后,基因芯片筛查发现PDGF促进MT1-MMP的表达(GEArray Analyzer分析显示:0 min处理组为0.04,20 min处理组为0.17,6 h处理组为0.44)。PDGF作用于细胞20 min、6 h后,MT1-MMP基因表达分别是对照组(0 min)的4.25倍和11.0倍(见图2)。
RT-PCR进一步检测MT1-MMP的基因表达。PCR产物电泳后经Gel-Pro Analyzer Version 3.0分析,PDGF作用0 min、20 min和6 h,数据分别为0.14±0.06、0.26±0.08和0.41±0.10。PDGF作用于细胞20 min,基因表达是对照组的1.86倍,6 h是对照组的2.93倍(P<0.05)。证实PDGF具有提高MT1-MMP表达的作用(见图3)。
1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的MT1-MMP m RNA表达
2.3 PDGF增强TIMP-2 m RNA表达
PDGF刺激VSMC后,基因芯片可检测到TIMP-2m RNA的表达(GEArray Analyzer分析为:0 min处理组为0.14,20 min处理组为0.27,6 h处理组为0.5)。PDGF作用于细胞20 min、6 h后,TIMP-2基因表达分别是对照组(0 min)的1.93倍和3.57倍(见图4)。
1:Marker;2~4:PDGF作用0 min、20 min和6 h的β-actin扩增产物;5~7:PDGF作用0 min、20 min和6 h的MT1-MMP扩增产物
1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的TIMP-2 m RNA表达
相同处理的VSMC中,用RT-PCR也检测到TIMP-2 m RNA的表达(经Gel-Pro Analyzer Version 3.0分析,PDGF作用0 min、20 min和6 h,数据分别为0.34±0.03、0.46±0.04和0.62±0.08),并且跟基因芯片表达趋势一致。PDGF作用于细胞20 min,TIMP-2基因表达量是对照组的1.35倍,6 h是对照组的1.82倍。由此可见,PDGF能显著增强TIMP-2 m RNA表达(P<0.05)(见图5)。
1~3:PDGF作用0 min、20 min和6 h的TIMP-2扩增产物;4~6:PDGF作用0 min、20 min和6 h的β-actin扩增产物;7:Marker
3 讨论
PCI术中由于血管内膜受到机械损伤,血小板被激活、白细胞与血管内皮细胞粘附增强[2],随之启动了一系列炎症反应,促进VSMC向内膜迁移、增殖及分泌ECM,导致了动脉再狭窄的发生。PDGF是一种重要的细胞趋化剂和促细胞分裂剂,可由激活的血小板、损伤部位的巨噬细胞和VSMC产生,其可以刺激VSMC迁移和增殖,尤其对VSMC的迁移有显著影响[3]。VSMC从中膜向内膜的迁移过程中,需要降解细胞周围的ECM,而ECM的降解则依赖于MMPs的活化。其中MMP-2是一个必不可少的因子[4],其为VSMC迁移扫清道路。
从明胶酶谱中可以看到,在PDGF作用VSMC0 min、20 min和6 h,随着作用时间的延长,MMP-2活性逐渐增强。说明在PDGF作用下很短的时间内通过各种机制调节了MMP-2的活性,从而为VSMC的迁移做好准备。
MMP-2活性调节主要有转录水平调节和转录后调节。转录后调节包括酶原形式调节和TIMPs对MMP-2活性调节。酶原形式调节即pro-MMP-2的激活,MMP-2以酶原(pro-MMP-2)的形式分泌,其是无活性的。MT1-MMP(或MMP-14)是激活pro-MMP-2的关键酶[5]。TIMPs对MMP-2活性调节体现在TIMP-2对MMP-2活性的抑制作用,TIMP-2是MMP-2的主要生理性抑制剂。
该实验中,从未经处理的VSMC中,可看到MT1-MMP的表达。与SHOFUDA等[6]使用Northern blotting分析显示MT1-MMP在正常的鼠组织中广泛表达的结果基本一致。说明在正常的鼠VSMCs中,MT1-MMP的表达通过影响MMP-2的活性,从而共同维持血管正常的形态与功能。基因芯片和RT-PCR的结果显示:PDGF作用20 min和6 h后,VSMC中MT1-MMP的表达逐渐增强,分别为对照组的4.25和11倍(基因芯片结果)或1.86和2.93倍(PCR结果)。表明PDGF促进VSMC中MT1-MMP表达,进一步通过转录后调节机制,即高表达的MT1-MMP激活pro-MMP-2来提高MMP-2的活性。
转录后调节机制的另一个重要因素是TIMP-2。正常情况下MMP-2与TIMP-2在组织内保持着相对的平衡,影响细胞基质的降解。本试验中的基因芯片和RT-PCR结果都证实,在PDGF刺激20 min及6 h的VSMC中,TIMP-2 m RNA的表达逐渐提高,分别为对照组的1.92和3.57倍(基因芯片结果)或1.35和1.82倍(PCR结果),表明PDGF也具有促进VSMC中TIMP-2的表达的作用,但低于对MT1-MMP的促进作用。
钟林[7]等将TIMP-2基因转染到培养的VSMC中,发现MMP活性受到抑制。但我们的基因芯片、RT-PCR和明胶酶谱结果显示随着TIMP-2表达的增强,MMP-2的活性不但没有被抑制,反而呈现升高的趋势。分析可能有以下两个原因:一是在正常情况下,MMP-2主要以酶原pro-MMP-2的形式存在,并且储备量很大,当PDGF作用后,pro-MMP-2快速、大量的被激活,同时转录后翻译的速度加快,继续补充pro-MMP-2的数量。HAQUE等[8]研究发现鼠股动脉损伤后,MMP-2活性增加的同时,也伴随着pro-MMP-2的增加;另一方面在PDGF作用下,TIMP-2产生的数量相比MT1-MMP和MMP-2要低。已知TIMP-2可以抑制MT1-MMP自身的降解,并与MT1-MMP形成复合物在细胞表面积聚[9]。MT1-MMP/TIMP-2复合物作为pro-MMP-2的受体,参与pro-MMP-2的激活。当TIMP-2浓度比较低时,随着复合物形成增多,游离的TIMP-2就相对少,那么对MMP-2的抑制作用就减弱;最近研究[10]也表明TIMP-2可以抑制MT1-MMP的活性,当TIMP-2低表达时,MT1-MMP的活性增加。所以,尽管在PDGF刺激下TIMP-2的表达相对增强了,但是从明胶酶谱中仍可看到的MMP-2的活性升高。
综合MT1-MMP和TIMP-2的基因芯片结果及PCR结果可以看出:未经处理的VSMC中TIMP-2基因的相对表达量比MT1-MMP基因高,即TIMP-2/MT1-MMP﹥1,但是在PDGF作用VSMC后,这种比率发生了逆转,虽然TIMP-2有所增加,但是增加的量没有MT1-MMP多并参与了MT1-MMP与TIMP-2受体复合物的形成,削弱了其对MMP-2的抑制作用,最终导致MMP-2的活性,与对照相比,呈明显的增加趋势。ITO等[11]曾报道PDGF通过ERK信号转导途径调节MMP-TIMP之间的平衡,从而促进细胞迁移。那么该实验中PDGF是否也通过此信号通路调节MMP2-TIMP2-MT1-MMP三者之间的平衡,以及这种比率转变的机制以后有待进一步研究。
可见PCI术后,VSMC中MMP-2活性的提高,既有转录水平的调节,又有转录后调节机制的参与,即MT1-MMP与TIMP-2协同作用使MMP-2的活性增强,促进VSMC迁移。从该实验可以看出,在再狭窄发展过程中,若金属蛋白酶抑制剂活性占优势,可以对VSMC的迁移起到一定的抑制作用,这一点可为再狭窄的预防和治疗提供新的思路。
摘要：目的 研究在血小板源性生长因子作用下,大鼠血管平滑肌细胞表达膜型基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制物的变化,同时探讨两者对基质金属蛋白酶-2活性的影响。方法 体外培养的血管平滑肌细胞经血小板源性生长因子处理0 min、20 min和6 h后进行如下检测:利用明胶SDS-PAGE酶谱检测血管平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶-2活性;基因芯片和RT-PCR技术检测血管平滑肌细胞表达膜型基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制物的变化。结果 明胶酶谱测定表明:血小板源性生长因子显著提高血管平滑肌细胞分泌的基质金属蛋白酶-2的活性;基因芯片和RT-PCR结果显示:血小板源性生长因子对血管平滑肌细胞表达膜型基质金属蛋白酶有明显的诱导作用,作用20 min和6 h后的表达是对照组(0 min)的1.86倍和2.93倍(P<0.05);同样血小板源性生长因子显著增强基质金属蛋白酶组织抑制物的表达,作用20 min和6 h后的基因表达是对照组(0 min)的1.35倍和1.82倍(P<0.05)。结论 血小板源性生长因子显著增强了血管平滑肌细胞对膜型基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制物的表达,同时两者的协调作用使MMP-2的活性呈明显的增加趋势。
关键词：血小板源性生长因子,血管平滑肌细胞,基质金属蛋白酶-2,膜型基质金属蛋白酶,基质金属蛋白酶组织抑制物
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