活性筛选（共9篇）
活性筛选 篇1
随着近年食品中抗生素残留问题的日益突出, 对安全、无残留、高效的天然防腐剂或微生态制剂的需求逐渐增加。细菌素是解决这一问题的重要途径。现已有许多细菌素被发现和研究, 但在食品中应用较多的细菌只有Nisin和纳他霉素 (Natamycin) , 其他细菌素的应用研究较少。各国对纳豆菌不断深入的研究表明纳豆菌有较强的抗菌作用[1,2,3,4,5,6,7], 能用于工业生产, 而优良菌株的选育是影响其产品质量的关键。因此, 选育抗菌活性高、产生抗菌物质稳定的菌株有十分重要的意义。
本试验采用紫外线和NTG这2种高效诱变剂[8]对纳豆芽孢杆菌进行复合诱变, 以建立一套适合纳豆芽孢杆菌的高效筛选方法, 从而筛选出具有较高抗菌活性的纳豆芽孢杆菌菌株, 为今后继研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种。
纳豆芽孢杆菌菌粉[高桥祐藏公司 (G) 、日本成濑酰酵化学研究所 (L) 、长春市今泉宫城野纳豆有限公司 (C) 、江大力通有限公司 (J) ] (后文中不同公司菌种分别用括号中相应大写字母代替) 。指示菌:金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus subsp.) (试验室保存) 。
1.1.2 主要试剂。
亚硝基胍 (NTG日本东京TCR株式会社生产) 。
1.1.3 培养基及试剂的配制。
豆芽汁培养基:豆芽汁1 000m L, 蔗糖5%, p H值为自然条件。LB培养基:蛋白胨10 g, 酵母浸提物5 g, 氯化钠10 g, p H值7.2。肉汤培养基:蛋白胨5 g, 牛肉膏3 g, 氯化钠5 g, 蒸馏水1 000 m L调p H值至7.0。管碟法检测抗菌物抑菌作用时加琼脂0.75%。肉汤豆芽汁混合培养基:蛋白胨5 g, 牛肉膏3 g, 氯化钠5 g, 蒸馏水1 000 m L, 豆芽汁2%~10%调p H值至7.0。
1.2 试验方法
1.2.1 菌悬液制备。
将保存的4种纳豆芽孢杆菌菌种移接到新鲜的豆芽汁培养基中, 150 r/min、35℃摇床培养12 h。将菌液5 000 r/min离心5 min, 弃去上清液, 再用无菌生理盐水洗涤2次, 制成均匀的细菌悬液。
1.2.2 紫外线照射法诱变纳豆芽孢杆菌。
选择功率为20 W的紫外灯, 照射距离30 cm, 照射前20 min开启预热使紫外线强度稳定。将纳豆芽孢杆菌悬液3 m L分别照射20、40、60、80、100、120 s, 照射时间结束盖上皿盖用黑袋包裹待用[9]。同时以相同的操作取未经诱变处理的菌液稀释涂布平板避光培养相同时间作为对照。致死率的计算公式:
1.2.3 亚硝基胍诱变纳豆芽孢杆菌。
先将浓度为1 mg/m L的NTG母液溶液与一定体积的菌悬液混合, 使NTG终浓度为0.1~0.5 mg/m L。反应15 min后用生理盐水稀释50倍, 离心洗涤, 重复3次, 除去NTG。加入种子培养基, 冰水浴2 h, 离心除去培养基, 用无菌生理盐水使沉淀悬浮待用[10]。同时以相同的操作, 取未经诱变处理的菌液稀释涂布平板作为对照, 计算致死率, 致死率公式同上。
1.2.4 筛选培养基的选择。
将0.1 m L金黄色葡萄球菌和稀释105倍的纳豆芽孢杆菌液50μL用涂棒均匀涂于豆芽汁培养基、LB培养基、肉汤培养基、肉汤豆芽汁混合培养基上35℃培养12 h[11]后取出, 观察结果。选择金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均可良好生长的培养基作为初筛的培养基。
1.2.5 纳豆芽孢杆菌复合诱变。
选取最佳的紫外线诱变时间和NTG浓度对纳豆芽孢杆菌进行复合诱变。诱变先用紫外线诱变再用NTG诱变, 方法同上[12,13,14]。
1.2.6 抗菌物质高产纳豆菌的初筛。
将诱变处理后的纳豆芽孢杆菌50μL均匀涂于已涂布指示菌的培养基上, 35℃培养12 h后从平板上挑取能抑制指示菌生长的纳豆芽孢杆菌, 培养后点种在涂有指示菌的培养基上, 35℃培养24 h, 用游标卡尺测量产生的抑菌圈直径与菌落直径, 挑取透明圈直径与菌落直径比较大者转接到发酵培养基中进一步复筛[15]。
1.2.7 抗菌物质高产纳豆芽孢杆菌的复筛。
将初筛出的纳豆芽孢杆菌接种至合成培养基中, 在35℃、150 r/min摇床振荡培养, 于24 h取上清, 过滤后制成抗菌物质粗提液, 用管碟法对制取抗菌物质粗提液进行抗菌活性检测[16]。
1.2.8 遗传稳定性试验。
将复筛所得到的突变株进行连续10次转接斜面传代活化, 分别取2、3、6、8、10次的传代菌体进行摇瓶发酵, 检测抗菌活性, 检验遗传稳定性。筛选遗传稳定的菌株。
2 结果与分析
2.1 纳豆芽孢杆菌和指示菌共同生长情况
纳豆芽孢杆菌和指示菌在不同培养基上共同培养后, 试验结果见表1。可以看出, 纳豆芽孢杆菌和指示菌在肉汤豆芽汁混合培养基中都可良好生长, 故选择肉汤豆芽汁混合培养基可作为筛选用培养基。
注:“-”代表不生长, “+”代表生长较弱, “++”代表生长一般, “+++”代表生长良好。
2.2 不同紫外照射时间对纳豆芽孢杆菌的致死率
紫外线不同辐照时间对纳豆芽孢杆菌的致死率见图1。可以看出, 当紫外线照射时间为80 s时, 这时的致死率为83%。据文献报道, 采用紫外线诱变一般在致死率80%产生正突变的几率较高, 有利于突变株的进一步筛选, 因此本试验确定80 s为最佳诱变时间。
2.3 不同NTG浓度对纳豆芽孢杆菌的致死率
不同NTG浓度对纳豆芽孢杆菌的致死率见图2。可以看出, 当NTG诱变剂量采用0.4 mg/m L时, 这时的致死率为87%。据文献报道, 采用NTG诱变一般在致死率80%产生正突变的几率较高, 有利于突变株的进一步筛选, 因此本试验确定0.4 mg/m L为最佳诱变剂量。
2.4 抗菌物质高产纳豆芽孢杆菌的初筛结果
按上述确定的诱变条件进行紫外线、NTG复合诱变纳豆芽孢杆菌, 以菌体生长的快慢、菌落直径的大小以及抑菌圈的直径作为初筛标准, 初筛确定了60株抑菌效果较好的菌株 (图3) 。
2.5 抗菌物质高产纳豆芽孢杆菌的复筛结果
复筛通过摇瓶发酵管碟法测定抑菌圈直径大小, 结果如图4、表2所示。可以看出, 菌株L-23抑菌圈直径为27 mm, 菌株C-8抑菌圈直径为23 mm, 故选抑菌效果最好的菌株L-23、C-8进行遗传稳定性试验。
2.6 抗菌物质高产纳豆芽孢杆菌遗传稳定性试验结果
对菌株L-23、C-8在有指示菌的肉汤豆芽汁混合培养基上进行传代培养, 传代培养10次后抑菌圈达到5%的显著变化, 这充分说明该菌株L-23的遗传特性是相对稳定的。因此, 可认为突变菌株L-23是一株遗传上较稳定的高产抗菌物质的优良菌种。
3 结论与讨论
用紫外线与亚硝基胍复合诱变高抗菌活性纳豆芽孢杆菌的结果发现诱变筛选出的纳豆芽孢杆菌抑菌活性得到明显提高, 抑菌圈直径达到27 mm, 且遗传稳定性良好。用紫外线与亚硝基胍复合诱变具有较好的诱变效果的可能原因是2种诱变方法机理不同, 紫外线作为诱变剂当照射微生物时, 它能引起DNA形成嘧啶二聚体, 这是紫外线引起诱变的主要原因。而亚硝基胍属烷化剂具有1个或多个活性烷基, 它们易取代DNA分子中活泼的氢原子, 使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化, DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变, 2种诱变作用共同作用于诱变菌种, 对目标菌DNA造成多重突变, 不易发生突变的恢复。
活性筛选 篇2
从热带太平洋的生物、海水、沉积物样品中分离到细菌、酵母和霉菌共475株.选择8个指示菌并采用圆形纸片法对分离菌株的发酵液进行抗菌和抗肿瘤活性筛选,获得20个具有抗菌和/或抗肿瘤活性的微生物菌株.细菌、酵母和霉菌活性菌株的筛选得率都比较低,分别为5.4%、2.2%和3.4%,其原因可能与纸片的发酵液的添加量较少和菌株发酵条件的.控制有关.同时采用分子生物学方法鉴定了活性菌株,除4株未有结果外,其余菌株分归为9个属,其中芽孢杆菌属7株、占活性菌株的35%,盐单胞菌属2株、占10%,其它菌属各1株、占5%.抑菌谱分析表明,大多数活性菌株对革兰氏阳性细菌具有抑制作用,而来源于鱼体的菌株抑菌谱较广,对细菌、真菌均有拮抗作用,另外还发现一株酵母(Rhodosporidium toruloides)可抑制金黄色葡萄球菌.作者提出“活性指示(activity index)”参数,对活性菌株的抗菌谱和活性强度进行综合评估,也表明源于鱼体的菌株的活性指示值较高.这4株芽孢杆菌尤其是DY-Y-11A1A菌株,具有潜在的后续开发价值.
作 者：王祥敏 李明 骆祝华 孙佳 黄翔玲 叶德赞 WANG Xiang-min LI Ming LUO Zhu-hua SUN Jia HUANG Xiang-ling YE De-zan 作者单位：王祥敏,WANG Xiang-min(厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005;国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室,福建,厦门,361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建,厦门,361005)
李明,骆祝华,孙佳,黄翔玲,叶德赞,LI Ming,LUO Zhu-hua,SUN Jia,HUANG Xiang-ling,YE De-zan(国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室,福建,厦门,361005;国家海洋局第三海洋研究所,福建,厦门,361005)
活性筛选 篇3
近年来, 生物农药由于其对人畜的毒性较小、不污染环境以及病虫不易产生抗药性等优点而得到各国政府的重视, 并逐渐应用于病害防治[2]。而放线菌是生物农药的重要来源, 也是生物防治的物质基础和重要手段。放线菌的代谢产物众多, 作用机理复杂, 作用位点多样, 能够有效抑制病原物抗药性的发展。目前, 已从放线菌中筛选出许多制剂运用于生产实践, 如井冈霉素 (jingangmycin) 、南昌霉素A (nanchangmycin A) 、梅岭霉素 (meilingmycin) 和海南霉素 (hainanmycin) 等[3]。
该试验针对4种危害较严重的病原菌, 对所分离到的放线菌的发酵液进行抗菌活性筛选, 将筛选出的具有较好抗菌活性的菌株经形态鉴定、化学鉴定和16S rDNA序列分析鉴定到种, 以为放线菌在生物防治上的应用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 试验材料
菌株2-7和9-12均从西双版纳的土壤样品中分离获得;油菜菌核病菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]、小麦赤枯[Gibberella zeae (schw.) Petch]、苹果轮纹 (Macrophoma kuwatsukai Hara) 、苹果炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides Penz.) 均由西南林业大学提供。
1.2 抗菌活性测定
1.2.1 培养基。
病原真菌采用PDA培养基。菌株液体培养采用黄豆粉玉米浆发酵培养液。
1.2.2 抗菌活性测定方法。
采用抑制菌丝生长速率法 (也称琼脂块法) 测定放线菌发酵液的抑制病原真菌活性[4,5,6,7,8]。取供试发酵原液1 mL与9 mL融化的PDA培养基混合, 倒入无菌的9 cm培养皿中, 制成带药培养基平板, 待培养基凝固后, 在每个带药培养基平板中, 接入供试病原真菌的菌饼 (直径6 mm) , 菌饼带有菌丝的一面贴在培养基表面, 每个处理3个重复。同时, 以加蒸馏水的不带药培养基为对照, 于28℃下恒温培养72 h后, 用十字交叉法测量供试病原真菌菌落的生长直径, 并用下列公式计算抑制率:
1.3 菌株鉴定方法
1.3.1 形态观察。
用酵母浸汁—麦芽浸汁琼脂和甘油天门冬酰胺琼脂埋片, 28℃下培养7、14、21、28 d后, 取埋片[9], 用光学显微镜观察形态。按Shirling和Gottlieb[10]方法观察并记录培养特征。
1.3.2 细胞壁化学组成分析。
全细胞水解液化学组分分析按Hasegawa[11]和王平[12]改进的TLC方法进行。
1.3.3 16S rDNA序列分析。
总DNA的提取采用徐平等[13]的方法。PCR扩增使用TaKaRa公司合成的引物:Primer1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和Primer 2:5’-AAGGAGG TGATCCAGCCGCA-3’进行PCR扩增。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物经纯化后, 送由中国农科院作物科学研究所测序。测序结果用BLAST软件与GenBank中相关属种的16S rDNA序列进行比对, 用DANMAN5.1软件中的Multiple Sequence Alighment进行同源性分析。
2 结果与分析
2.1 抗菌活性测定结果
通过抗菌活性筛选, 发现菌株2-7和9-12的抗菌效果显著, 特别是菌株9-12的发酵液对油菜菌核和苹果轮纹2种病菌的抑制率达到了100%, 对小麦赤枯病菌也具有较强的抑制效果 (表1) 。
(%)
2.2 菌株鉴定
2.2.1 菌株形态和培养特征。
菌株2-7生长迅速, 培养2 d开始产孢, 3 d即可产生大量孢子, 之后气生菌丝由白色逐渐变为浅灰褐色, 有白斑。基内菌丝体无色。在显微镜下观察, 气生菌丝发达, 基内菌丝无横隔, 不断裂;气丝上都有孢子形成, 孢子丝3～6圈松敞螺旋形。
菌株9-12生长状况良好, 培养3 d开始大量产孢, 之后气生菌丝由白色变为灰褐色, 基内菌丝体无色。在显微镜下观察, 气生菌丝发达, 基内菌丝无横隔, 不断裂;气丝上都有孢子形成, 孢子丝长, 松散螺旋形。
2.2.2 胞壁分析。
经细胞壁成分分析, 菌株2-7和9-12的细胞壁均含有L, L-DAP, 属胞壁Ⅰ型。
Lechevalier (1976) 根据放线菌细胞壁的化学组成 (DAP及氨基酸) , 将放线菌归纳为9个主要类群, 其中含有L, L-DAP的放线菌, 属细胞壁Ⅰ型, 共有11个属, 代表属为链霉菌属。结合形态和培养特征, 可初步将菌株判定为链霉菌。2.2.3 16S r DNA序列分析。菌株DNA提取后, 在琼脂糖凝胶上进行20 min电泳, 虽然有一定的拖带现象, 但仍可以清晰看到DNA条带, 且亮度高, 说明提取的DNA量较多, 可以用来进行PCR引物扩增。
菌株基因组DNA经PCR引物扩增后得到的16S rDNA条带, 在琼脂糖凝胶电泳上, 虽然各株菌的亮度有所差异, 但PCR扩增带均与Marker的1 500 bp位点十分接近, 可判定供试各菌株的16S rDNA的序列长度约为1 500 bp。
经序列测定, 发现菌株2-7和9-12的16S rDNA核苷酸序列长度分别为1 465 bp和1 497 bp, 与数据库中已报道的链霉菌16S rDNA核苷酸序列进行比对, 结果发现菌株2-7与Streptomyces albulussubsp (小白链霉菌) , 菌株9-12与Streptomyces albogriseus (白灰链霉菌) 最为接近, 其相似度分别为99%和100%。
3 结论与讨论
从Cohn (1872) 发现放线菌至今, 己经报道了69个属1 687个种。用于植物病害生物防治的主要是链霉菌属 (Streptomyces) 及小单孢菌属 (Micromonospora) 。放线菌一般通过2种途径对靶标致病菌发挥生防作用, 它能够在寄主体外通过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用, 降低病原菌的致病性、侵染效率以及接种体密度, 导致病原菌群体密度以及致病性下降;放线菌也可以在寄主植物组织内, 诱发其产生抗性或者产生抑菌物质, 影响病原菌的繁殖、生长, 最后导致靶标致病菌死亡[14]。
目前, 已有许多利用拮抗放线菌防治土传病害的成功事例, 如1953年从我国陕西省径阳县的苜蓿根土中分离获得细黄链霉菌 (S.microflavus) , 用其制成的“5406”抗生菌进行拌种, 具有防病、保苗和增产的效应[15]。世界上已广泛应用的另一种放线菌的活体制剂Mycostop, 是由芬兰的Kemira (1989) 从泥煤中分离到的灰绿链霉菌 (S.griseovidis) 的孢子和菌丝制成的制剂。主要用来防治一些常见的土传病原菌, 如腐霉菌 (Pythium spp) 、镰刀菌 (Fusarium spp) 、疫霉菌 (Phytophthora spp) 和丝核菌 (Rhizoctonia spp) 等。它还可用于控制温室中的观赏植物和蔬菜上的一些常见病害, 如由链格孢 (Alternaria spp) 、拟茎点霉 (Phomopsis spp) 和灰葡萄孢 (Botrytis spp) 等引起的病害。Mycostop主要是通过种子处理、土壤喷洒或灌药等措施处理作物, 它在植物根部定殖、生长和繁殖, 从而阻止病原物侵入, 还可以产生激素促进寄主植物生长, 从而提高作物产量且对植物没有任何毒性[16]。
摘要：从云南西双版纳采集的土壤样品中分离到2株对油菜菌核病菌、小麦赤枯、苹果轮纹均具有较强抗菌活性的放线菌2-7和9-12。通过对其进行包括形态、细胞壁化学组分分析以及16S rDNA序列测定等多相分类研究, 确定其为Streptomyces albulussubsp (小白链霉菌2-7) 和Streptomyces albogriseus (白灰链霉菌9-12) 。
活性筛选 篇4
目的: 运用DNA家族改组方法提高水蛭素的抗凝血酶活性.方法: 将水蛭素HV1、HV2、HV3基因等量混合, 用DNase I消化, 回收50 bp左右的`片段, 再经无引物和有引物PCR扩增获得与原基因大小相同的改组分子, 构建噬菌体展示的水蛭素改组文库, 经凝血酶亲和淘选, ELISA筛选高活性的水蛭素变异体.结果: 经过DNA改组和噬菌体亲和筛选, 成功获得抗凝血酶活性提高的水蛭素变异体HV2-N47K.结论: 用DNA家族改组及亲和淘选技术能够筛选出高活性的水蛭素变异体蛋白, 这为其他分子的改组提供了借鉴.
作 者：龙铟 刘家云 刘莉 王宗仁 LONG Yin LIU Jia-yun LIU Li WANG Zong-ren 作者单位：龙铟,王宗仁,LONG Yin,WANG Zong-ren(第四军医大学西京医院中医科,陕西,西安,710032)
刘家云,LIU Jia-yun(第四军医大学西京医院检验科,陕西,西安,710032)
刘莉,LIU Li(第四军医大学药学系药理学教研室,陕西,西安,710032)
活性筛选 篇5
1 生物色谱技术应用于中药活性成分筛选的意义
中药成分十分复杂, 在筛选过程的分离阶段, 无法在一张色谱图的大量色谱峰中区分有效成分和杂质成分的色谱峰, 这给中药活性成分的筛选工作造成很大的困难, 是制约整个过程的瓶颈阶段。生物色谱法将能与中药活性成分结合的活性生物大分子、活性细胞膜、活细胞等固着在色谱载体上, 用这种新型的固定相分离中药活性成分, 由于固定相能够特异性、选择性地与中药活性成分结合, 可以使色谱选择性地保留活性成分, 从而排除了杂质成分的干扰。
2 生物色谱法的优点及困难
在重要领域进行中药成分的研究中, 使用生物色谱法将能够有效的提高对重要活性成分筛选的研究能力及准确性。但是在实际应用中, 该方法的优点与应用困难是并存的。
2.1 该方法与目前的优点
a.细胞膜色谱法是一种新型的亲和色谱法, 将其用于新药研究中, 具有筛选速度快, 效率高, 可反映药物分子与蛋白受体作用特性的优点;b.直接与一些药理学参数如活性或结合强度相关, 具有一定的药理学意义;c.快速简单, 可将中药的提取液直接进样, 无需预处理、纯化等多个分离步骤, 因此分析速度快;d.生物聚合体稳定, 排除了主要的实验误差;e.能很快获得一组有代表性的药物的可比性资料;f.可获得大量的没有各自异构体的对映体的资料。尤其适合于天然药物效应物质基础的研究。
2.2 推广和应用方面却存在一些困难
2.2.1 中药内部的组成成分不同, 所以其内部的活性成分也各不相同, 在生物中发挥作用的时候他们所作用的靶点也就存在差异, 所以, 在进行重要生物活性固定相材料的选择中, 选择的范围是多样性的, 在作用的载体上也存在差异与不同, 由于生物材料的固定相受到时间的限制, 当超过一定时间段之后就会导致生物材相失效, 所以在现实额定生物色谱固定相的制备中存在较大的困难, 在商品化的道路上任重而道远。
2.2.2 在进行柱压、柱温等研究方面, 需要在兼顾色谱分离条件的基础之上同时应用生物色谱固定相, 这种方式主要是为了保持生物的活性, 使其能够正常的生存, 但是这种方式往往在研究中存在困难, 这就造成了在生物色谱柱的使用中一般不能够长时间的使用, 造成了其短命问题的出现。
2.2.3 在使用生物色谱法进行中药活性成分的筛选过程中, 我们不得不面临的另一个问题就是生物色谱柱的特异性在进行中药活性成分的保留中, 一般都十分的少, 或者说相对于检测的标准较少, 这就导致了在进行标本收集的过程中, 难以找到能够满足制备要求的、足量的中药量去为分子结构鉴定提供保障。
3 生物色谱法的种类及其应用
在当前中药活性成分的研究中, 在生物色谱法的研究中, 一般主要使用活性生物大分子、活性细胞膜等将其固定在色谱载体之上, 所以, 在研究中应该首先对固定相进行研究, 在进行生物色谱法的研究中一般所涉及的种类主要有分子生物色谱法、生物膜色谱法等相应的方法。在进行实际的研究中, 主要有以下几点应用典型。
孔亮等以人血清白蛋白和酸性糖蛋白这两种载体蛋白为固定相, 对常用中药当归、川芎、茵陈、黄芪、赤芍、银杏叶、丹参等进行了分析, 得到了这些中药的分子生物色谱指纹图谱。
通过使用这些图谱, 在进行中药材料的鉴别中, 我们就可以对其种类以及产地和真伪进行辨认。在进行筛选重要活性成分的时候, 使用分子生物色谱指纹图谱的方式就能够起到主要的作用, 这是因为它能够在使用的时候将重要中血浆结合率高的色谱峰给予良好的表示, 在进行研究中, 使用色谱峰所显示出来的成分是可以代表药效学以及药动学的研究特征的。
贺浪冲等将兔红细胞膜和心肌细胞膜固着在硅胶载体上, 用此固定相研究药物与膜受体相互作用的特异性和立体选择性, 并正在将该法用于筛选当归中有效成分。
在当代中药的研究中, 我国中药大学在发展过程中已经逐渐的建设了一套完整的实验室, 并为红细胞膜固相色谱技术建设了一套完整的实验室, 通过实践研究在进行中药研究中, 通过使用色谱法成功的对一些中药进行了技术分离。使用这种方法的主要特点是, 在进行色谱分离之前, 需要将红细胞膜与选用的药材药液进行温育, 保证在进行研究的时候, 红细胞能够成功的作用在靶点的活性接触成分之上, 之后, 通过进行PH缓冲液的制备, 使用这种缓冲液进行对药物的冲洗, 将红细胞中结合的药物成分冲出来, 然后在进行常规的生物色谱法分离。
4 生物色谱法面临的问题及对策
4.1 当中药活性成分在生物体内的靶组织上面起到作用的时候, 我们不应该认为作用的成分就是中药当中的活性成分的原型, 这种形态的中药活性成分极有可能是经过人体消化吸收之后的代谢产物, 所以, 在进行中药活性成分的筛选中, 虽然生物色谱法可以直接进行靶组织活性受体的检测, 但是我们不能够就认定他就是中药内部的原材料, 因为他还极有可能是人体消化吸收中药之后在人体内部的代谢产物。
4.2 在生物色谱法的分离中, 生物色谱柱的固定相载体也可能对中药成分的分离起一定作用。生物色谱法中通常采用硅胶作固定相载体, 通过硅胶的吸附作用, 将生物活性材料固定在其表面。如果生物活性材料对硅胶包裹不全, 则生物色谱柱可能还有吸附性, 从而干扰对中药活性成分的分离。生物色谱法中也可采用凝胶颗粒作固定相载体。例如, 用衍生化的丙烯酰胺单体合成为带正电荷配位体的凝胶, 用作固定相载体, 可使红细胞固着在凝胶颗粒中。采用凝胶作载体固着红细胞, 有以下好处:由于凝胶表面积大, 涂布的红细胞多;凝胶可依靠其电荷、孔状结构等性质结合红细胞;凝胶色谱可用等渗磷酸盐缓冲液作流动相, 并加入三磷酸腺苷等, 以利红细胞存活。在采用凝胶作生物色谱固定相载体时, 要注意根据所分离的中药活性成分分子量, 选用有适当孔隙大小的凝胶品种, 这样, 可以利用凝胶色谱的分离特点, 除去一些大分子的杂质成分;此外, 柱子应粗而短, 流速应低, 以避免柱内高压影响红细胞存活。
结束语
综上所述, 本文对中药活性成分筛选中生物色谱法的应用进行了简要的分析, 就使用该技术进行重要活性成分的使用方法、使用优点等进行了详细的分析, 该技术在使用中必然能够提高中药的应用价值, 使其在新药领域的发展中得到更为有效的利用。
摘要：社会的建设发展, 为人们的生活环境创造了一个新的天地。在当代社会的研究中, 借助着先进的科学技术医学领域的发展状况十分的喜人。在进行医学的发展过程中, 中药领域的应用价值一直是我国医学领域所重视的。所以, 为了更好的进行中药活性成分的研究, 在进行研究实验的过程中使用生物色谱法, 将对中药活性成分的筛选具有重要的意义。
关键词：中药,活性成分,生物色谱法
参考文献
活性筛选 篇6
关键词：短果茴芹,提取物,抗氧化,O.-2清除率,.OH清除率,H2O2损伤
短果茴芹[Pimpinella brachycarpa (Komar) Nakai]又名大叶芹、山芹菜、假茴芹, 为伞形科 (Umbelliferae) 多年生草本植物, 主要分布在我国的东北部和俄罗斯远东地区[1]。短果茴芹为吉林省Ⅲ级重点保护植物[2], 是东北地区大宗出口山野菜, 在国际市场深受欢迎[3]。研究认为短果茴芹可入药, 具有活血降压、清热解毒、利湿、止痛等功效[4]。目前, 短果茴芹的保健作用研究仅见菜籽精油化学组成分析和全草的营养成分分析[5,6,7], 而其具体的保健作用机制及其活性成分研究未见报道, 本文主要对短果茴芹抗氧化活性成分进行提取并对提取物的抗氧化能力进行考察, 为短果茴芹山野菜资源开发及保健食品研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
短果茴芹为吉林省长白山区野生山野菜, 阴干后粉碎成粉末 (40～60目) 备用。
1.2 仪器和试剂
全自动酶标仪 (RT-6000) 、分析天平 (1/10 000, HZK 210) 、8道微量移液器 (Finnpipette) 、粉粹机 (F2102) 、电热恒温水浴锅 (HH-8) 、旋转蒸发仪 (RE-52A) 、CO2培养箱;二甲亚砜 (DMSO) 、噻唑蓝 (MTT) 为美国Sigma产品, PRM 1640为GIBCO产品, 小牛血清为杭州四季青, 其他试剂均为国产分析纯。人肝癌细胞株BEL-7404购自中科院上海细胞库。
1.3 抗氧化活性成分提取
将短果茴芹按m ∶V=1 ∶7的比例加入90%乙醇回流提取3次, 每次2 h, 将提取液合并浓缩, 得浸膏。向浸膏中加入蒸馏水混悬, 按1 ∶1的体积比加入石油醚萃取3次, 回收石油醚, 获得石油醚层提取物;按1 ∶1的体积比加入乙酸乙酯萃取3次, 回收乙酸乙酯, 获得乙酸乙酯层提取物:按1 ∶1体积比加入水饱和正丁醇萃取3次, 回收正丁醇, 获得正丁醇层提取物;减压回收水溶液, 得水层提取物。将各提取物干燥, 研成粉末备用。
1.4 具有O清除能力的活性成分筛选
参考文献[8]的方法, 采用邻苯三酚自氧化体系产生Oundefined, 对4种提取物清除Oundefined的能力进行观察。以0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液 (pH=8.2) 、去离子水和10 mmol/L邻苯三酚组成自氧化体系, 受试物组以不同浓度受试物代替去离子水, 25 ℃反应20 min, 测定不同受试物在405 nm处的吸光度值, 计算抑制率。抑制率 (%) =k0-k1/k0×100%, k0为自氧化体系吸光度值, k1为去除了本底值的受试物吸光度值。
1.5 具有清除·OH能力的活性成分筛选
参考文献[9]的方法, 采用Fenton反应体系产生·OH, 了解4种提取物清除·OH能力。以6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L水杨酸、6 mmol/LH2O2和去离子水为自氧化体系, 受试物组加入不同浓度受试物代替去离子水, 测量520 nm处的吸光度值, 计数抑制率。抑制率 (%) =k0-k1/k0×100%, k0为自氧化体系吸光度值, k1为去除了本底值的受试物吸光度值。
1.6受试物体外抗H2O2氧化损伤的能力
参考文献[10]的方法, 采用50 mmol/L H2O2诱导的氧化损伤模型, 观察提取物对人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤的保护效果。BEL-7404以3×105/ml接种于96孔版, 受试物处理23 h后, 加入1 mmol/L H2O2处理1 h, 去上清, 每孔加入MTT (0.2 mg/ml) 共同孵育4 h, 去上清, 每孔加入150 μl DMSO, 测定492 nm处的吸光度值。
2 结果
2.1 具有O清除能力的活性成分筛选undefinedundefined
邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化, 生成有色中间产物和O-·2;该有色中间产物的含量可以反映O-·2的含量。本实验通过测定各提取物对反应体系有色物质的含量的影响了解清除O-·2的能力, 结果见图1。
由图1可以看出, 石油醚层提取物、乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物对反应体系中的Oundefined均有清除作用, 且与剂量呈正相关。其中石油醚层提取物、乙酸乙酯层提取物作用最强, 在0.675 mg/ml浓度时, 其作用与同浓度维生素C相似;正丁醇层提取物在>0.375 mg/ml浓度时才有清除Oundefined的作用;水层提取物只有微弱的Oundefined清除能力。
2.2 具有·OH清除能力的活性成分筛选
在Feton体系中H2O2+Fe2+※H2O+·OH+Fe3+, 水杨酸捕捉·OH后产生有色物质, 该有色物质的含量可以反映·OH的含量。本实验通过测定各提取物对反应体系有色物质的含量的影响, 了解·OH清除能力, 结果见图2
由图2可以看出, 石油醚层、乙酸乙酯层和水层提取物均具有较强的·OH清除作用, 且与剂量呈正相关。正丁醇层提取物在>0.375 mg/ml 浓度时才有清除·OH作用, 4种提取物清除·OH的能力, 均强于同等浓度的甘露醇。
2.3 提取物对H2O2诱导的氧化损伤的保护作用
H2O2是一种强氧化剂, 可造成机体的氧化损伤, 为探讨H2O2对人肝癌细胞BEL-7404所致氧化损伤的合适浓度和作用时间, 我们首先对H2O2的浓度进行了筛选, 结果发现50和100mmol/LH2O2作用1h能使人肝癌细胞BEL-7404的增殖分别抑制48%和57%, 见图3。因此, 选择50mmol/LH2O2为氧化损伤剂量各提取物对H2O2诱导的氧化损伤的保护效果见图4。
由图4可以看出, 50 mmol/L的H2O2可以明显导致人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤;4种提取物中除石油醚层提取物外在浓度0.25～2 mg/ml时, 皆有促进人肝癌细胞BEL-7404增殖的作用, 且与剂量呈正相关, 尤其乙酸乙酯层和正丁醇层提取物作用明显;而石油醚层提取物剂量依赖地抑制人肝癌细胞BEL-7404增殖。除石油醚层提取物外, 其他几种提取物都具有保护H2O2诱导的人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤的作用, 并与剂量呈正相关, 其中乙酸乙酯层提取物作用最明显, 而水层提取物作用最弱。
3 讨论
自由基是一类上层轨道含有未配对电子的原子团或特殊状态的分子, 其中与人体关系最为密切的是氧自由基, 其中以Oundefined形成最早, ·OH作用最强。自由基可引起脂质的过氧化和DNA损伤, 导致细胞膜和体内酶系统的损伤, 从而引起一系列的病理改变[11]。现已证明自由基的氧化损伤与心脑血管疾病、癌症、肿瘤、糖尿病、衰老等密切相关[9], 因此, 从天然植物中提取抗氧化成分的研究已经成为当前的热点[12]。
本实验研究发现, 所获得的4种提取物均具有抗氧化作用, 其中石油醚层和乙酸乙酯层提取物具有最强的Oundefined和·OH清除作用, 正丁醇层提取物具有较强的O-·2和较弱·OH清除作用, 水层提取物只具有较强的·OH清除作用。石油醚层和乙酸乙酯层提取物对Oundefined的清除能力与维生素C相似, 4种提取物对·OH的清除能力尤于甘露醇。除石油醚层提取物外, 其他3种提取物都具有保护H2O2诱导的人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤的作用, 并有剂量依赖性, 其中乙酸乙酯层提取物保护作用最明显, 而水层提取物作用最弱。这可能与乙酸乙酯层提取物既具有较强的Oundefined清除能力, 又具有较强的·OH清除作用有关, 而水层提取物质只具有较强的·OH清除作用。以上结果表明, 短果茴芹含有抗氧化活性成分, 具有较好的抗氧化和保护细胞免受氧化损伤的能力, 具有进一步开发的价值。另外, 石油醚层提取物除具有良好的抗氧化作用外, 还具有抗肿瘤的效果。其研究结果有助于短果茴芹资源的深入研发, 但是4种提取物中抗氧化成分的分离、鉴定及抗氧化机制仍需进一步探讨。
参考文献
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活性筛选 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 牙周炎常见菌。
牙周炎常见致病菌株: (1) 国际标准菌株:卟啉单胞菌 (牙龈卟啉单胞菌、不解糖卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌) 、普氏菌 (中间普氏菌、卢氏普氏菌、躯体普氏菌) 、放线菌 (伴放线杆菌、黏性放线菌、内氏放线菌) 、嗜二氧化碳菌 (牙龈嗜二氧化碳菌、黄褐色嗜二氧化碳菌) 、血链球菌、嗜沫嗜血杆菌、巨核梭形杆菌、韦荣氏球菌; (2) 药敏指示菌:多形类杆菌、脆弱类杆菌; (3) 分离菌株, 主要为从临床上牙周炎患者牙周袋内鉴定、分离的菌株, 包括18株类杆菌、56株放线菌、82株产黑色素菌群、57株梭形杆菌、13株伴放线杆菌、12株嗜沫嗜血杆菌、10株韦荣氏球菌、15株其他厌氧菌。
1.1.2 牙周炎抗菌药物。
本次研究共选用18种牙周炎抗菌药物:四环素类 (强力霉素、二甲胺四环素) 、大环内酯类 (克拉霉素、罗红霉素、红霉素、麦白霉素、阿奇霉素、交沙霉素、乙酰螺旋霉素) 、硝咪唑类 (替硝唑、甲硝唑) 、喹诺酮类 (曲氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星) 、克林霉素。
1.1.3 培养基:
选择放线菌、伴放线放线杆菌、梭形杆菌、产黑色素菌群作为培养基。
1.2 方法
1.2.1 对抗菌药物的筛选。
(1) 配置细菌悬液:在固体CDC培养基上接种上述国际标准菌株, 采取厌氧培养, 并保持温度在37℃, 5 d后即在液体培养基中置于新鲜细菌菌落, 继续进行厌氧培养, 2 d后再把液体CDC培养基稀释到一定浓度留置待用。 (2) 配置药敏培养基:对18种牙周炎抗菌药物进行稀释, 由浓到稀分为13个浓度, 把55℃混有5%羊血的CDC培养基与1 m L药液加14 m L的培养基进行混合, 分置到13个实验器皿中, 并设两个无药培养基以进行对照。 (3) 细菌点种:把稀释好的菌液用点种仪分先后点种到其中一个空白培养基和药敏培养基上, 进行先前对照观察;13个浓度的药敏培养基点种完后, 再把菌液点种到另一个空白培养基上, 进行后对照。将器皿放置到35℃的厌氧环境中进行培养, 5 d后观察最低抑菌浓度 (MIC) 。
1.2.2 对抗菌药物的活性测定:
(1) 用选择培养基对牙周炎患者牙周袋内取下的龈下菌斑进行致病菌株的培养; (2) 用分离的263株致病菌进行细菌悬液的配置; (3) 选用经对抗菌药物筛选试验后的三种效果最好的抗生素进行药敏培养基的配置; (4) 进行细菌点种; (5) 分析观察263株临床分离的菌株对三种抗生素的药物活性。
1.3 结果判断:
针对对抗菌药物的筛选, 平均血药浓度<MIC即为耐药, MIC≤平均血药浓度<MIC的5倍即为中度敏感, 平均血药浓度≥MIC的5倍即为高度敏感;针对对抗菌药物的活性测定, 用平均血药浓度分别与90%抑菌范围、50%抑菌范围、有效抑菌范围 (MIC) 进行比较。
2 结果
通过对牙周炎常见致病菌进行药物的筛选试验后取得了克林霉素、二甲胺四环素、环丙沙星这三种抑菌效果最好的抗生素, 并用临床分离的263株菌株进行了药物活性的测定, 得出了90%抑菌范围、50%抑菌范围、有效抑菌范围 (MIC) 。
其中二甲胺四环素的抑菌效果最好, 除了对产黑色素菌群的有效抑菌范围在0.06~64 mg/L, 对其他菌株的抑菌活性范围 (MIC) 均<0.06~64 mg/L;克林霉素对类杆菌、放线菌、产黑色素菌群、梭形杆菌的有效抑菌范围相同 (<0.06或>256 mg/L) , 对其他菌株的有效抑菌范围则不同;环丙沙星则对类杆菌、韦荣氏球菌的有效抑菌范围相同 (<0.06~16 mg/L) , 对其他菌株的有效抑菌范围都不同。
3 讨论
牙周炎是由特定的可疑致病菌所引起的慢性感染性疾病, 牙龈卟啉单胞菌、伴放线杆菌、福赛类杆菌这三类均属于革兰阴性杆菌、具有多种毒力因子的牙周致病菌已被世界牙周病研讨会所公认[2]。在大部分研究中, 黄褐色嗜二氧化碳菌、伴放线杆菌是导致青少年患上牙周炎的主要致病菌, 其中克林霉素、二甲胺四环素、强力霉素、环丙沙星对它们有较高的敏感性。而中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、巨核梭形杆菌、黏性放线菌则是导致成年人出现牙周病的主要原因, 克林霉素、二甲胺四环素、环丙沙星这三种抗生素对他们的敏感性最高[3]。
本次试验中得出的抑菌效果最好的三种抗生素中尤以二甲胺四环素的抗菌效果最好, 它是一种半合成的四环素类抗生素, 与同类其他药物相比, 具有更广的抗菌谱, 抑菌作用更强, 因此可作为临床上治疗牙周炎的首选药物。
参考文献
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[2]张研.克拉霉素治疗重度慢性牙周炎的基础与临床研究[D].天津:天津医科大学, 2012.
活性筛选 篇8
作者以液体石蜡为选择性碳源,运用排油圈法、环法测定表面张力法对有机农药活性污泥进行表面活性剂产生菌的筛选,并对筛得的细菌进行形态学和生理生化试验及16SrDNA测序鉴定,以期为在OPs的环境治理中应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
菌种采自河南某有机农药厂污泥处理池。
1.1.2 培养基
富集培养基[16](g/L):NaNO3 7.0, K2HPO4 1.0, KH2PO4 0.5, KCl 0.1, MgSO4 0.5, GaCl2 0.01, FeSO4·7H2O 0.01, Yeast extract 0.1, 微量元素溶液0.05mL。其中微量元素溶液(g/L):H3BO3 0.25, CuSO4·5H2O 0.5, MnSO4·H2O 0.5, MoNa2O·H2O 0.06, ZnSO4·7H2O 0.7。
平板/斜面培养基(g/L):胰蛋白胨10,葡萄糖20,酵母浸出粉0.1,琼脂粉20。
种子培养基:LB液体培养基。
1.2 方法
1.2.1 菌种的培养与富集
前处理:污泥土样10g置于装有90mL无菌水的250 mL的锥形瓶中振荡20min,静置30min,吸取1mL的土壤悬液,置于9mL的无菌水中,制成10-2g/mL的土壤悬液。
菌种富集:取5mL上述土壤悬液接种于50mL置于加有1%液体石蜡(过滤除菌)的富集培养基中,于恒温空气浴振荡培养箱培养:30℃振荡(200r/min)培养3d～7d;再以2%的液体石蜡含量,以同样方法富集第二次。
1.2.2 菌种的初筛与复筛
将二次富集液做梯度稀释,取10-7、10-8、10-9三个梯度液0.1ml涂抹在筛选培养基上,再覆盖2滴过滤除菌的液体石蜡,各做3个重复。30℃培养1d～2d。其中,筛选培养基为富集培养基加2%的琼脂粉制得。选择形成单菌落较明显的平板做挑菌(长势良好的)划线纯化;纯化若干次,直至为纯菌落为止。
以液体富集培养基加2%的葡萄糖作为复筛培养基对初筛出的单菌落进行复筛发酵实验。30℃、200r/min振荡培养3d～5d,按参考文献[17,18]的方法分别检测各发酵液的排油圈和表面张力,以筛得产表面活性剂的优良菌株,并作斜面保藏。
1.2.3 菌种的鉴定
菌种的形态学和生理生化鉴定:参照进行文献[19,20]进行。
基于16SrDNA的菌种鉴定:参照文献[21]提取筛得细菌的总DNA,并以细菌通用引物(V3区)[16](SRV3-1:5’-CGG(C/T)CCAGACTCCTACGGG-3’;SRV3-2:5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’)进行PCR扩增。反应体系50μl(含1×PCR buffer、2.0mmol/L的MgCl2、200μmol/L的 dNTP混合物、SRV3-1和SRV3-2各0.2μmol/L、模板DNA约100ng、1.25U的Taq酶),按条件(94℃预变性5min,94℃变性1min,62℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环,最后72℃延伸5min)进行PCR扩增。产物进行电泳检测,纯化测序由上海生工技术有限公司完成。最后,将16SrDNA的测序结果上传到GenBank中进行序列比对。将测序结果用BLAST软件与GenBank中16S rDNA基因序列进行同源性比较。由GenBank中得到相关菌株的序列,与实验所测得序列一起输入ClustalX1.81程序进行DNA同源序列排列,经核查后,序列输入Phylip 3.66软件包,以简约法构建进化树并进行系统发育分析。
2 结果与分析
2.1 筛菌结果
氧化塘中运行的活性污泥,虽然因其运行时间的长短,微生物的群落结构也会存在一定程度的波动,但总体上来说,所包含的微生物种类较为单一,且往往会导致微生物种类的一致性或相近性。实验以液体石蜡作为惟一性碳源,对有机农药的活性污泥中的微生物进行富集筛选,并通过平板分离纯化,仅得到4株能以液体石蜡为碳源的微生物。再通过复筛发酵试验,测定发酵液的排油圈和表面张力(见表1),发现其中3株具有较良好地产表面活性剂的能力,均能较为显著地降低发酵液的表面张力。
2.2 菌株的鉴定及系统发育树的构建
菌株T2、W1和W2经基因组DNA提取和细菌通用引物扩增PCR,产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,并可以判断出一条200bp左右的条带。将测序结果的16SrDNA序列提交Genbank(登录号分别为EU024684、EU024683、NC009085.1),并分别用blast软件与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行同源性比较(图2),发现3株细菌中,T2与Acinetobacter sp. ADP1(NC005966.1)相似度最高(93%),W1和W2与Acinetobacter baumannii ATCC 17978(NC009085.1相似度最高(94%))。为此,可以初步判断3株菌都属于不动杆菌属,且很有可能都是实验所发现的新种。
其形态学和生理生化鉴定结果见表2。
1:Acinetobacter baumannii ATCC 17978(NC009085.1);2:Acinetobacter sp. ADP1(NC005966.1);3:Marinobacter sp. ELB17(NZAAXY01000002.1);4:Yersinia enterocolitica(NC008800.1);5:Serratia proteamaculans 568(NZAAUN01000004.1);6:Yersinia pestis biovar(NZABAT01000001.1);7:Yersinia pseudotuberculosis(NZAAKT02000001.1).
注:-为阴性反应;+阳性反应。
3 讨论
有机农药(Organic Pesticides,OPs)是一类具有高毒性、持久性、易于在生物体内聚集和长距离迁移与沉淀、对环境和人体有着“三致”严重危害的有机化学污染物[22,23]。从而引起了世界各国的高度重视。然而,OPs极难以在环境中发生化学反应而分解,又多属于亲脂疏水性物质而难以被微生物降解,从而成为环境修复治理的难点[24,25,26]。
生物表面活性剂是一类微生物代谢合成的有机物,由于其分子由亲水性和亲脂性两个基团所构成,所以可增加憎水性有机化合物与水相之间的接触面,从而提高憎水性有机化合物的水溶率,促进微生物对它的吸收和降解。因此,可能提高微生物对OPs的降解,从而促进OPs的环境修复与治理。
活性筛选 篇9
关键词：白刺,降血脂,活性部位
白刺属(Nitraria L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)的一个古老小属,是一个较进化的类群,属第三纪孑遗植物[1]。白刺属植物全世界约有13种,分布于亚洲、欧洲、非洲和澳大利亚的荒漠,其中我国有8种,主要分布于我国西北部及北部各省区[2]。唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)为中国特有种,也是内蒙古地区的优势种,资源十分丰富[3]。白刺是西部蒙、藏、维等少数民族的传统药材,广泛用于多种疾病的治疗,同时具有广谱的营养作用[4]。现代药理学研究表明,白刺具有明显的降血脂作用[5,6],但到目前为止未见关于白刺降血脂成分方面的报道。为系统寻找与其功效相关的有效部位和有效成分,本实验从唐古特白刺果实的不同提取部位着手,选用高脂血症大鼠血清的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)为筛选指标对各部位进行筛选,并对不同提取部位进行药效学比较,为进一步研究唐古特白刺的活性成分提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
唐古特白刺果实于2009年8月采自内蒙古乌海市郊(地理位置为40°12′N,106°28′E,海拔1 096 m)。果实采回后于室外晒干,粉碎,过20目筛备用;Wistar大鼠,清洁级,雌雄各半,体重210±22 g,由内蒙古大学动物中心提供,合格证号:SCXK(蒙):2002-0001;血脂康胶囊:云南白药集团股份有限公司(批号20080720);血清总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒均为中生北控生物科技股份有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 植物材料处理
取唐古特白刺果实粉末 4 kg,用水煎煮,将滤液低温减压浓缩,得白刺果实水提物稠浸膏;再将水提物稠浸膏加适当水稀释,依次用乙醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇反复萃取,分别得到乙醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物,将各提取物低温减压回收溶剂,浓缩,真空干燥后备用。
1.2.2 高脂血症动物模型的建立及分组
取70只大鼠,在实验室用普通饲料适应性喂养1周后,空腹称重,眼底静脉采血测血脂后随机分为7组,每组10只,雌雄各半。组间体重、血脂水平差异无统计学意义。
1.2.3 给药方法
将白刺果实提取物按所确定剂量(给药量均为0.1 g/kg)分别于每日上午给大鼠灌胃,灌胃量控制在4 mL/d内,连续5周。血脂康溶于蒸馏水中配成相应浓度,同样时间给予灌胃5周,分组及处理情况如表1。
1.2.4 血浆脂蛋白的测定
5周后将大鼠禁食12 h,摘除大鼠眼球,从眼底静脉丛取血1.5～2.0 mL,制备血清,进行各项血脂指标的测定。取血时,用肝素抗凝,4 ℃,3 000 r/min离心15 min,取上清液放入冰箱中待测。血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量均按试剂盒说明采用酶法测定。
1.2.5 统计方法
采用SPSS17.0软件处理,实验数据以
2 结果
2.1 唐古特白刺果实不同提取物对高脂模型大鼠血清TC和TG的影响
动物饲喂5周后,模型组血清TC、TG两项均高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.001),提示造模成功。预防给药后,唐古特白刺果实乙醚提取物组和水提取物组大鼠血清TG、TC与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05);正丁醇提取物组和乙酸乙酯提取物组大鼠血清TG、TC较模型组明显降低,差异有统计学意义(P<0.001);阳性对照药(血脂康)组大鼠血清TC、TG也较模型组明显降低,差异有统计学意义(P<0.001),详见表2。
2.2 唐古特白刺果实提取物对高脂模型大鼠血清LDL-C和HDL-C的影响
造模后,高脂模型组与正常对照组比较,LDL-C增加,而HDL-C下降,差异均具有统计学意义(P<0.001)。唐古特白刺果实正丁醇提取物组和乙酸乙酯提取物组能明显扭转这种高脂饲料所引起的变化,与高脂模型组比较,LDL-C显著降低,HDL-C显著升高,差异均有统计学意义;而乙醚提取物组和水提取物组大鼠血清LDL-C和HDL-C与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05),详见表2。
与正常对照组比较:***为P<0.001,**为P<0.01,*为P<0.05;与高脂模型组比较:▽▽▽为P<0.001,▽▽为P<0.01,▽为P<0.05
3 讨论
血清中TC、TG和LDL-C水平已成为动脉粥样硬化病的重要危险因子,血清中这三个指标的升高,意味着动脉粥样硬化病的发生机率大大增加。近年来的研究表明HDL-C是冠心病的负危险因素,其含量越低,则冠心病的发病率越高[7]。本研究结果表明,唐古特白刺果实正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物与白刺果实的药效有关,均能降低血清中TC、TG和LDL-C,升高HDL-C的量,提示正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物具有明显的降血脂功效,对高血脂有一定的预防和治疗作用,对动脉粥样硬化病和冠心病也有一定的预防作用。今后应对上述两个部位的化学成分进行深入的研究。
参考文献
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