降糖中药的筛选

降糖中药的筛选（共7篇）

降糖中药的筛选 篇1

摘要：目的 筛选苦参和西洋参中有效部位苦参总碱和西洋参总皂苷的剂量配比。方法 应用均匀设计法,结合耐缺氧实验和心律失常两种药理学模型,对中药有效部位群组方的剂量配比进行筛选。结果 苦参总碱和西洋参皂苷组合物小鼠的有效剂量为73∶65.5 mg/kg,大鼠有效剂量为51∶46 mg/kg。结论 中药有效部位群的最佳比例为1.1∶1.0。

关键词：均匀设计,中药有效部位群组方,耐缺氧实验,心律失常模型

中药配伍理论是我国传统医学的精华。利用现代医学理论和新技术深入挖掘传统医学辨证施治的科学内涵,研制开发创新药物是我们的任务和职责。多年来笔者致力于临床发病率较高的心血管疾病的创新新药研究,开展了从中药大复方的作用物质基础研究到中药有效部位研究再到中药单体化合物的研究等多项课题的研究。利用中药有效部位群开发的创新药物,精简了复杂的中药成分,使药效物质基础更加明确,有利于深入探讨其药效作用机制,同时也体现了中药复方在临床上辨证施治的特点。多年来笔者通过大量的前期工作和临床的经验,针对病毒性心肌炎,筛选出两味中药:苦参和西洋参,提取分离纯化其有效部位:苦参总碱和西洋参总皂苷,组合成抗病毒性心肌炎的有效组分群的新配方—KX组合物。为了确定两个有效部位的组合比例,采用了均匀设计法[1],其方法即可以减少试验次数,又增加试验准确性。本文则应用均匀设计法对两个有效部位优选了组方最佳配比比例。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

ICR小鼠,二级,19～21 g或26～30 g;Wistar大鼠,体重200～250 g,所有动物均购自吉林大学基础医学院动物实验中心,许可证号:SCXK-(吉)2003-0001。

1.1.2 药物

苦参总碱,西洋参总苷,批号:20040401,由吉林省中医药科学院提供。

1.1.3 试剂

氯仿(分析纯),北京化试剂厂生产,批号:20001104。氯化钡,开原化学试剂厂,批号:9401002。

1.2 方法

1.2.1 均匀设计表的选定

根据文献报道及大量的前期工作,初步确定苦参总碱、西洋参总苷的剂量范围均为250～25 mg(设6个试验点),选择U6*(64)的均匀设计表,其中列1为苦参总碱(Xa),列3为西洋参总苷(Xb)。对应因素的6水平及具体剂量为250∶150、200∶25、150∶200、100∶20、50∶250、25∶100。1.2.2尾静脉注射空气对小鼠耐缺氧能力的影响取70只小鼠,随机分为7组,分别为空白对照组和250∶150 mg/kg、20025 mg/kg、150∶200 mg/kg、100∶50 mg/kg、50∶250 mg/kg、25100 mg/kg 6个剂量给药组。每组10只动物。每日灌胃给药1次,连续给药5 d,末次给药后1 h,尾静脉注射空气1 mL,开始计时,观察动物死亡的时间。

1.2.3 对氯仿致小鼠心律失常的影响

取92只小鼠,随机分为7组,分别为空白对照组和250∶150 mg/kg、200∶25 mg/kg、150∶200 mg/kg、100∶50 mg/kg、50∶250 mg/kg、25∶100mg/kg 6个剂量给药组。每日给药1次,连续5 d,末次给药1 h后,将动物置于装有3 mL氯仿溶液的密闭烧瓶中,待动物呼吸停止时,立即取出动物,解剖胸腔,肉眼观察动物室颤的发生率。1.2.4对氯化钡致大鼠心律失常的影响取大鼠49只,随机分为5组,分别为空白对照组、荣心丸7.35 g/kg给药组、苦参总碱与西洋参总苷剂量比为51∶46 mg/kg、25.5∶23 mg/kg、12.711.5 mg/kg 3个剂量组,每日灌胃给药1次,连续给药5 d,末次给药1 h后,将大鼠以300 mg/kg的水合氯醛麻醉,测定正常Ⅱ导联ECG,然后舌下静脉注射4 mg/kg氯化钡,测定给药即刻、3、5、10、15、20、25、30 min不同时间点的心电图。根据心电图计算30 min内心电图恢复窦性心律的动物数。

2 结果

2.1 应用均匀设计表筛选药物剂量

2.1.1 应用均匀设计法结合小鼠耐缺氧能力试验模型筛选配比剂量

将小鼠耐缺氧试验所得的试验结果输入均匀设计的计算程序,得到回归方程为:Y=0.000513×Xa2+59.08242×Xa+(-2.0345)×Xb2+55.74313×Xb+(-4.014835)×Xa×Xb+(-354.31)。根据回归方程,在当前剂量范围内Xa=25,Xb=25时预期药效最强,扩展剂量范围为Xa=12.5125,Xb=12.5125时,预期药效最强;Xa和Xb剂量增倍时,药效下降较多,Xa和Xb剂量减半时,药效下降较少,从安全考虑可减少剂量。小鼠耐缺氧试验结果见表1。

2.1.2 应用均匀设计法结合氯仿致小鼠心律失常模型筛选配比剂量

将不同组合比例药物对氯仿致小鼠心律失常模型的试验结果输入均匀设计的计算程序,得到回归方程为:Y=-0.00216×Xa2+59.0824×Xa+(-2.0342)×Xb2+55.7431×Xb+(-4.014835)×Xa×Xb+(-354.31)。根据回归方程,在当前剂量范围内Xa=150,Xb=150时预期药效最强,扩展剂量范围为Xa=145.65627,Xb=131.128时,预期药效最强;Xa和Xb剂量增倍时,药效下降较多,从药效考虑不宜增量,Xa和Xb剂量减半时,药效下降较少,从安全考虑可减少剂量。氯仿致小鼠心律失常模型结果见表2。

2.2 配比剂量的确定

根据初筛结果表明,在耐缺氧试验中,组合药物的最佳有效剂量为25∶25 mg/kg,在抗心律失常试验中组合药物的最佳剂量配比146∶131 mg/kg。因此选用146∶131 mg/kg和25∶25 mg/kg两个剂量及折半剂量73∶65.5 mg/kg、12.5∶12.5 mg/kg,再次进行了小鼠耐缺氧能力的影响和氯仿致小鼠心律失常模型的研究。结果见表3、4。146∶131 mg/kg、73∶65.5 mg/kg两个剂量组不仅能明显增强小鼠的耐缺氧能力,也能明显抑制动物室颤的发生。综合药物用量、安全性及制剂多方面因素,初步确定苦参总碱和西洋参总苷的配比比例为73∶65.5 mg/kg(小鼠)。

2.3 药物剂量配比的验证

为了最终确定药物剂量的配比,笔者选用氯化钡致大鼠心律失常动物模型考察此配比剂量效果。结果可见,苦参总碱和西洋参总苷的剂量比为51∶46 mg/kg(由小鼠有效剂量73∶65.5 mg/kg折算到大鼠)时,能明显抑制氯化钡致大鼠心律失常的发生。见表5。

注:与空白对照组比较,△△P<0.01,△△△P<0.001

注:与空白对照组比较,△P<0.05

注:与空白对照组比较,*P<0.05

2.4 筛选结果

根据回归方程的提示及耐缺氧试验和抗心律失常试验的不断考证,得到苦参总碱和西洋参皂苷的最佳剂量配比为73∶65.5 mg/kg(小鼠),折算到大鼠为51∶46 mg/kg,进而确定有效部位群的组合最佳配比为1.1∶1.0,通过此配比比例组合而成的创新药物命名为KX组合物。

3 讨论

近年来,随着现代药学理论的进展和新技术的不断应用,加强了对中药复方、中药复方中有效部位群、有效组分的作用机制的探索,产生了多种组合中药[2]。为了有效地筛选组合中药的配伍剂量,人们开始重视数学理论在药理学中的应用,均匀设计是我国学者方开泰和王元将数学理论和多元统计相结合,在正交基础上创造出的一种新的统计方法,它的特点是实验次数与水平数相等,将有关实验的实验点数均匀分散在实验范围内,减少了实验次数,而且实验结果可以应用计算机进行处理,增加了试验的准确性,故被广泛的应用在中药提取工艺、中药复方配伍剂量的筛选等多项研究[3]。

笔者针对病毒性心肌炎的发病特点,借鉴临床上的治疗经验,精选了具有抗病毒、抗心肌缺血、抗心律失常的中药-苦参[4,5],提取分离纯化得到苦参总碱;同时根据相须相使的中医治疗原则,选用了西洋参总皂苷[6,7],充分发挥其抗心肌缺血、保护心肌细胞之功效,研制开发了抗病毒性心肌炎的创新中药。通过均匀设计法进行筛选,优选出两个有效部位群配比的最佳比例。

通过上述实验,最终确定苦参总碱和西洋参总苷的最佳配比为1.1∶1.0,有效剂量为73∶65.5 mg/kg(小鼠),折算到大鼠为51∶46 mg/kg,通过此配比比例组合制成治疗病毒性心肌炎的创新中药原料。这一研究过程为我们摸索和探索有效部位群组成的创新中药进行了有意义的尝试。

参考文献

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[3]胡占嵩,乔卫,金桂红,等.均匀设计法优选酸枣仁合欢方抗抑郁作用的最佳配伍[J].中药材,2010,33(4):603-606.

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[5]战渤玉,李东霞,高明.苦参的现代研究进展[J].中医药信息,2009,26(1):23-25.

[6]丁涛,尚智,温富春,等.西洋参茎叶总皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能作用的研究[J].长春中医药大学学报,2007,23(6):14-15.

[7]王蕾,王英平,许世泉,等.西洋参化学成分及药理活性研究进展[J].特产研究,2007,(3):73-77.

降糖中药的筛选 篇2

1 材料与方法

1.1 中草药

金银花、蒲公英、连翘、黄芩、黄连、紫花地丁、瓜蒌、黄答、黄柏、红花、鱼腥草、大青叶, 均购自齐齐哈尔市中草药大药房。

1.2 主要仪器

陶瓷煎药锅, 购自潮州市枫溪区臻艺陶瓷门市部;生化培养箱, 购自苏州江东精密仪器有限公司;超净工作台, 购自苏州佳宝净化工程设备有限公司;高压灭菌锅, 购自广州康迈医疗器械有限公司;流通蒸气灭菌器、紫外-可见分光光度计, 购自上海科晓科学仪器有限公司。

1.3 培养基

营养肉汤培养基、THB肉汤培养基、营养琼脂培养基, 均由黑龙江省兽医科学研究所自制。

1.4 菌种

金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌, 均由黑龙江省兽医科学研究所分离鉴定。

1.5 药液的制备

取中草药100 g (每味中草药单独制备) , 加入20倍水, 浸泡30 min;武火加热至煮沸后再改用文火, 保持微沸状态30 min, 用双层纱布过滤;然后再加入10倍水, 武火加热至煮沸后再改用文火, 保持微沸状态30 min, 用双层纱布过滤;将2次滤液混合, 加热浓缩至100 m L, 生药浓度为1 g/m L, 编号, 121℃高压灭菌, 备用。

1.6 菌液的制备

按照不同菌种的培养条件进行接种, 置37℃培养箱中培养24 h;用紫外-可见分光光度计比色, 在625 nm波长处稀释菌液浓度, 使其吸光度值为0.08~0.1 (含细菌数为1×108~2×108个/m L) , 备用。

1.7 单味中药抑菌试验

采用试管二倍稀释法测定每味中草药对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌的抑菌程度。取5 m L灭菌试管108支, 分12组 (与12味清热解毒中草药相对应, 每味1组) , 每组9支。将各组试管依次排列, 编号, 每支试管各加入营养肉汤培养基1 m L, 各组第1支试管中加入相应的中药浓缩液1 m L混匀, 吸取1 m L加入第2支试管中混匀, 从第2支试管中吸取1 m L加入第3支试管, 依此类推, 直至第8支试管 (将吸取的1 m L弃去) ;第9支试管不加中药浓缩液, 作为对照管。在上述各试管中加入制备的金黄色葡萄球菌菌液0.05 m L, 置37℃恒温箱中培养24 h, 观察各管细菌生长情况。有细菌生成, 试管内浑浊, 用“+”表示;无细菌生成, 试管内澄清, 用“-”表示。重复3次, 取平均值。无乳链球菌、大肠杆菌的抑菌试验参照金黄色葡萄球菌。

1.8 抗菌中药组方的筛选试验

按照中兽医理论和治疗原则, 选择抑菌效果最好、对细菌抑菌浓度最小的前7味中药, 应用正交试验法进行组方 (以7味不同中药为7个试验因素, 每个因素有2个水平, 共8个水平组合, 正交表为L8 (27) , 见表1;各味中药剂量按照最小抑菌浓度确定, 制剂的最终浓度为1 g/m L;采用挖洞注药法进行药物平板抑菌试验, 测定每组中药对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌的抑菌程度。具体操作如下:将金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌分别接种于营养琼脂培养基, 均匀挖洞, 将中药药液注满洞孔 (采用试管二倍稀释法确定注入中药药液的浓度梯度, 将药液浓度依次稀释为1∶2, 1∶4, …, 1∶256, 分别测定不同浓度中药制剂对各种细菌的抑菌程度) , 做好标记, 在4℃条件下放置2 h, 然后置37℃恒温箱中培养24 h, 观察其生长情况, 用游标卡尺测量中药对该细菌的抑菌圈直径, 以确定中药对细菌的作用效果。同时设空白对照, 每组重复3次, 取平均值, 结果采用极差分析法进行统计。抑菌程度的判定标准:抑菌圈直径≥16 mm为极度敏感、≥11 mm~<16 mm为高度敏感、≥8 mm~<11 mm为敏感、抑菌圈直径<8 mm为不敏感。

注:中药所对应列中的1表示有该味中药, 2表示无该味中药。

2 结果与分析

2.1 中药的敏感性测定 (结果见表2)

mg·m L-1

由表2可知, 所选的各味中药对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌的生长均有不同程度的抑制作用, 综合分析, 金银花、蒲公英、连翘、黄芩、紫花地丁、瓜蒌、鱼腥草等抑制效果较好。

2.2 抗菌中药组方的筛选 (结果见表3)

注:A为金黄色葡萄球菌, B为无乳链球菌, C为大肠杆菌, K1表示各因素1水平之和, K2表示各因素2水平之和, R为极差。

由表3可知, 由抗金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的正交试验结果表明, 金银花、蒲公英、黄芩、紫花地丁起主要的抑菌作用, 优化组合为a1b1c2d1e1f2g2, 即因素金银花、蒲公英、黄芩、紫花地丁取1水平, 因素连翘、瓜蒌、鱼腥草取2水平, 该组方对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌均高度敏感, 有较好抑制作用。

3 讨论

虽然对细菌生长能够起抑制作用的中药种类很多, 但是这些中药并不是对所有细菌都有相同作用。有的中药对这种细菌抑制作用较强, 对其他细菌抑制作用较弱;有的中药对这种细菌抑制作用较弱, 对其他细菌抑制作用较强, 因此应用时要有选择性。本试验中, 所选的中药对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的生长都有抑制作用, 相比较而言, 对金黄色葡萄球菌的敏感性较强、对无乳链球菌次之、对大肠杆菌较弱, 其中金银花、蒲公英、连翘、黄芩、紫花地丁、瓜蒌、鱼腥草等抑制作用最强。

各味中药之间有的存在协同作用、有的颉颃作用, 因此本试验选用单味抑菌作用较强的中药进行组方, 并采用正交试验方法, 同时研究各味中药相互作用的影响及各因素中最佳水平, 结果金银花、蒲公英、黄芩、紫花地丁具有协同作用, 对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌均高度敏感, 与瓜蒌、鱼腥草、连翘存在颉颃作用, 不宜配伍, 因此优化筛选出了以金银花、蒲公英、黄芩和紫花地丁为组合的奶牛乳房炎抗菌中药组方, 减少了试验次数, 取得了最佳效果。

本试验用从当地乳房炎奶牛体内分离的主要病原菌作为单味中药敏感试验和组方筛选试验的试验菌株, 针对性强, 实用效果好;所选中药价格低廉、来源广泛, 有利于临床开发使用。

参考文献

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降糖中药的筛选 篇3

为了避免因化药残留对人体造成的危害, 减少球虫病给养鸡业造成的经济损失。我们在总结国内外有关中药防治球虫病研究资料的基础上, 根据鸡球虫病的特点, 用中药对球虫卵囊进行孢子化抑制试验, 从而选出对球虫卵囊孢子化抑制效果较好的药物作为主药, 根据中兽医辨证论治原则组成三个方剂, 用于研究人工感染柔嫩艾美耳球虫试验。

1 试验材料

1日龄健康的罗曼蛋用雏鸡300只 (由北京正大蛋业有限公司提供) , 分笼饲养, 按NRC (1994) 禽的营养标准, 自配无抗球虫药的饲料, 让鸡只自由采食、饮水。

青蒿、白头翁、黄柏、甘草、仙鹤草、黄芩、常山、柴胡、黄连、肉桂等中药 (购于河北安国市药材市场) , 各味中药为药厂代加工, 粉碎过40目筛按组方混合均匀。

重铬酸钾 (南京化学试剂有限公司, 批号:140201) , 离心机 (北京雷勃尔离心机有限公司) , 生物显微镜 (XS-213型, 江南光学仪器厂) , 恒温振荡器, 电热恒温培养箱 (DH-250, 北京科伟永兴仪器有限公司) ;全球 (0.5%的地克珠利, 购于河北北方牧业科技有限公司, 批号:20131226) ;柔嫩艾美尔球虫卵囊 (由中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所提供) , 试验前人工感染无球虫鸡继代1次, 获得试验用卵囊, 29℃孢子化, 4℃保存备用。

2 试验方法

2.1 药物分组

依据中药的有效成分和精简高效的原则选用了10味中药, 组成三个中药方剂, 通过观察治疗球虫病的临床效果, 进行抗球虫方剂的筛选试验。见表1。

2.2 动物处理及分组

在雏鸡13日龄时, 选取体重相近 (体重差别不超过±5g) 并经前期临床观察确认为健康的雏鸡240只, 随机分为12组 (Ⅰ一Ⅻ) , 每组20只。Ⅰ一Ⅸ组为中药组 (三个方剂的三个浓度:1.5%、2%、3%) , Ⅹ组为地克珠利 (全球) 对照组 (1%添加量) , Ⅺ组为感染不给药对照组, Ⅻ组为不感染不给药对照组。分组当天在对应组饲料中添加药物, 并于15日龄时对I-Ⅻ组雏鸡经口感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊4.0×105个/只, 感染后第8天将鸡全部捕杀剖检。

2.3 临床观察

接种球虫后观察和记录各组鸡的发病情况, 临床症状。感染后第4天开始每天检查粪便, 记录血粪情况, 直至扑杀。第4~8天进行克粪卵囊计数, 并对所有死亡鸡剖检, 重点检查盲肠病变。统计成活率、增重率、病变值、卵囊值等, 计算抗球虫指数。

2.4 疗效考核指标

相对增重率 (%) =感染投药组的平均增重/不感染不投药组的平均增重×100%。

存活率 (%) =[ (组内总鸡数一每组因感染球虫死亡的鸡数) /组内总鸡数]×100%。

血便记分。接种卵囊后第4、5、6、7、8天, 参照Morehouse和Baron的标准记分。0分:100%粪便不带血;1分:1%~25%粪便带血;2分:26%~50%粪便带血;3分:51%~75%粪便带斑;4分:76%~100%粪便带血。

病变记分。参照Johnson和Reid的标准, 根据剖检后肠道病变的严重程度记分。0分:无肉眼病变;1分:盲肠壁有很少散在的瘀点, 肠壁不增厚, 内容物正常;2分:病变数量较多, 盲肠内容物明显带血, 盲肠壁稍增厚, 内容物正常;3分:盲肠内有多量血液和肠芯, 血凝块可见灰白色干酪样的香蕉型块状物, 盲肠壁明显增厚盲肠中粪便含量少;4分:盲肠中充满大量的血液和肠芯, 盲肠肿大, 肠芯中含有粪渣或不舍;因球虫感染死亡鸡也记为4分。病变值=每组平均病变记分×10。

在球虫感染后第4天至第8天收集粪便, 按照Mc Master’S法计算克粪便卵囊数。方法:将收集的粪便搅匀后, 称取2g, 加适量饱和食盐水搅匀, 用60目网筛充分过滤。将滤液稀释至60ml, 然后用麦氏计数板记数, 最后求其平均值。如果卵囊的数量太多, 则按照梯度稀释, 然后计数, 再乘以稀释倍数 (抗球虫指数 (ACI) 采用默克公司的标准计算抗球虫指数) 。

抗球虫指数 (ACI) = (相对增重率+存活率) 一 (病变值+卵囊值)

药效判定标准为:ACI小于120, 判疗效差;ACI为120~160, 判疗效中等;ACI为160~180, 判疗效良好;ACI大于180, 判疗效优秀。

3 试验结果

接种球虫后第4天, 球虫感染组鸡只均不同程度出现临床症状, 如精神状况差、沉郁、嗜睡、采食量减少等。感染后第5、6天, 感染不给药鸡排出大最的血便, 中药组和地克珠利组血便记分均低于感染不给药组, 第7天血便减少, 其中, 中药组与化学药物对照组的血便记分最低 (见表2) 。

在接种后的第4天晚上, 第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ组分别有1只鸡死亡, 第5~8天试验组均有鸡只死亡, 其中6、7天死亡最严重, 中药组和地克珠利组的鸡只死亡率均低于感染不给药组, 其中中药Ⅲ组的死亡率最低, 比阳性对照组低25个百分点 (见表3) 。

在球虫感染后第8天, 剖杀试验鸡, 取出盲肠内容物, 按照Mc Master’s法计数克粪便卵囊数 (OPG) 。根据盲肠内容物的OPG值, 即每1g粪便中的卵囊数 (柔嫩×106) , 按角田清方法换算卵囊值。当OPG值为0~0.1时, 卵囊值为0;当OPG值为0.11~1.时, 卵囊值为1;当OPG值为1.1~1.9时, 卵囊值为10;当OPG值为2.0~5.9时, 卵囊值为20;当OPG值为6.0~10.9时, 卵囊值为20;当OPG值≥11.0时, 卵囊值为40。通过盲肠内容物中卵囊数量的检查发现, 不感染不给药组未见有卵囊, 所有球虫感染给药组盲肠内容物中的卵囊数量均低于感染不给药组, 其中以中药Ⅲ组卵囊数量最低, 仅为0.315×106个/g粪便。

试验表明, 三个方剂都有一定的抗球虫效果, 而以方剂一和方剂二高浓度 (3%添加量) 的抗球虫效果为良好;其他浓度的抗球虫效果均为中等;方剂一3%添加量的抗球虫指数为170.8, 较地克珠利组高出34.5个百分点, 比感染不给组高出102.9个百分点。详细结果见表4。

4 讨论与小结

试验表明, 3个中药方剂都有一定的抗球虫作用。接种球虫给中药能够降低球虫感染鸡的死亡率, 减少粪便中球虫卵囊的排出量, 提高鸡只的增重率。在抗球虫指数方面, 三个方剂中, 方剂一和方剂二高浓度的抗球虫效果为良好, 方剂三高浓度的抗球虫效果为中等, 其他浓度抗球虫效果均为中等, 其中以方剂一3%添加量的抗球虫指数为170.8, 方剂三低浓度 (1.5%添加量) 的抗球虫效果虽然较差, 但也有一定的抗球虫作用。

方剂二和三中只有一种抗球虫病的草药, 并以消炎止泻为主, 抗球虫效果不是很明显。由于中药药物繁多, 要筛选抗球虫作用良好的中药方剂还需要在不断总结经验的基础上进行更广泛试验研究。

本试验中感染不给药组的存活率为65%, 相对增重率为50.2%, 卵囊值为10, 病变值达21, ACI仅为84.2。说明本试验所用的球虫卵囊有较强的侵袭能力和致病力。

地克珠利的抗球虫指数偏低, 可能因为此类药用的较多, 已经出现耐药性, 再加之加工工艺的差异等方面的原因。

参考文献

[1]宁长申, 张龙现, 祁小乐.人工合成青蒿素对鸡柔嫩艾美尔球虫病的预防试验[J].河南农业科学, 2001, (12) :29-30.

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降糖中药的筛选 篇4

1 生物色谱技术应用于中药活性成分筛选的意义

中药成分十分复杂, 在筛选过程的分离阶段, 无法在一张色谱图的大量色谱峰中区分有效成分和杂质成分的色谱峰, 这给中药活性成分的筛选工作造成很大的困难, 是制约整个过程的瓶颈阶段。生物色谱法将能与中药活性成分结合的活性生物大分子、活性细胞膜、活细胞等固着在色谱载体上, 用这种新型的固定相分离中药活性成分, 由于固定相能够特异性、选择性地与中药活性成分结合, 可以使色谱选择性地保留活性成分, 从而排除了杂质成分的干扰。

2 生物色谱法的优点及困难

在重要领域进行中药成分的研究中, 使用生物色谱法将能够有效的提高对重要活性成分筛选的研究能力及准确性。但是在实际应用中, 该方法的优点与应用困难是并存的。

2.1 该方法与目前的优点

a.细胞膜色谱法是一种新型的亲和色谱法, 将其用于新药研究中, 具有筛选速度快, 效率高, 可反映药物分子与蛋白受体作用特性的优点;b.直接与一些药理学参数如活性或结合强度相关, 具有一定的药理学意义;c.快速简单, 可将中药的提取液直接进样, 无需预处理、纯化等多个分离步骤, 因此分析速度快;d.生物聚合体稳定, 排除了主要的实验误差;e.能很快获得一组有代表性的药物的可比性资料;f.可获得大量的没有各自异构体的对映体的资料。尤其适合于天然药物效应物质基础的研究。

2.2 推广和应用方面却存在一些困难

2.2.1 中药内部的组成成分不同, 所以其内部的活性成分也各不相同, 在生物中发挥作用的时候他们所作用的靶点也就存在差异, 所以, 在进行重要生物活性固定相材料的选择中, 选择的范围是多样性的, 在作用的载体上也存在差异与不同, 由于生物材料的固定相受到时间的限制, 当超过一定时间段之后就会导致生物材相失效, 所以在现实额定生物色谱固定相的制备中存在较大的困难, 在商品化的道路上任重而道远。

2.2.2 在进行柱压、柱温等研究方面, 需要在兼顾色谱分离条件的基础之上同时应用生物色谱固定相, 这种方式主要是为了保持生物的活性, 使其能够正常的生存, 但是这种方式往往在研究中存在困难, 这就造成了在生物色谱柱的使用中一般不能够长时间的使用, 造成了其短命问题的出现。

2.2.3 在使用生物色谱法进行中药活性成分的筛选过程中, 我们不得不面临的另一个问题就是生物色谱柱的特异性在进行中药活性成分的保留中, 一般都十分的少, 或者说相对于检测的标准较少, 这就导致了在进行标本收集的过程中, 难以找到能够满足制备要求的、足量的中药量去为分子结构鉴定提供保障。

3 生物色谱法的种类及其应用

在当前中药活性成分的研究中, 在生物色谱法的研究中, 一般主要使用活性生物大分子、活性细胞膜等将其固定在色谱载体之上, 所以, 在研究中应该首先对固定相进行研究, 在进行生物色谱法的研究中一般所涉及的种类主要有分子生物色谱法、生物膜色谱法等相应的方法。在进行实际的研究中, 主要有以下几点应用典型。

孔亮等以人血清白蛋白和酸性糖蛋白这两种载体蛋白为固定相, 对常用中药当归、川芎、茵陈、黄芪、赤芍、银杏叶、丹参等进行了分析, 得到了这些中药的分子生物色谱指纹图谱。

通过使用这些图谱, 在进行中药材料的鉴别中, 我们就可以对其种类以及产地和真伪进行辨认。在进行筛选重要活性成分的时候, 使用分子生物色谱指纹图谱的方式就能够起到主要的作用, 这是因为它能够在使用的时候将重要中血浆结合率高的色谱峰给予良好的表示, 在进行研究中, 使用色谱峰所显示出来的成分是可以代表药效学以及药动学的研究特征的。

贺浪冲等将兔红细胞膜和心肌细胞膜固着在硅胶载体上, 用此固定相研究药物与膜受体相互作用的特异性和立体选择性, 并正在将该法用于筛选当归中有效成分。

在当代中药的研究中, 我国中药大学在发展过程中已经逐渐的建设了一套完整的实验室, 并为红细胞膜固相色谱技术建设了一套完整的实验室, 通过实践研究在进行中药研究中, 通过使用色谱法成功的对一些中药进行了技术分离。使用这种方法的主要特点是, 在进行色谱分离之前, 需要将红细胞膜与选用的药材药液进行温育, 保证在进行研究的时候, 红细胞能够成功的作用在靶点的活性接触成分之上, 之后, 通过进行PH缓冲液的制备, 使用这种缓冲液进行对药物的冲洗, 将红细胞中结合的药物成分冲出来, 然后在进行常规的生物色谱法分离。

4 生物色谱法面临的问题及对策

4.1 当中药活性成分在生物体内的靶组织上面起到作用的时候, 我们不应该认为作用的成分就是中药当中的活性成分的原型, 这种形态的中药活性成分极有可能是经过人体消化吸收之后的代谢产物, 所以, 在进行中药活性成分的筛选中, 虽然生物色谱法可以直接进行靶组织活性受体的检测, 但是我们不能够就认定他就是中药内部的原材料, 因为他还极有可能是人体消化吸收中药之后在人体内部的代谢产物。

4.2 在生物色谱法的分离中, 生物色谱柱的固定相载体也可能对中药成分的分离起一定作用。生物色谱法中通常采用硅胶作固定相载体, 通过硅胶的吸附作用, 将生物活性材料固定在其表面。如果生物活性材料对硅胶包裹不全, 则生物色谱柱可能还有吸附性, 从而干扰对中药活性成分的分离。生物色谱法中也可采用凝胶颗粒作固定相载体。例如, 用衍生化的丙烯酰胺单体合成为带正电荷配位体的凝胶, 用作固定相载体, 可使红细胞固着在凝胶颗粒中。采用凝胶作载体固着红细胞, 有以下好处:由于凝胶表面积大, 涂布的红细胞多;凝胶可依靠其电荷、孔状结构等性质结合红细胞;凝胶色谱可用等渗磷酸盐缓冲液作流动相, 并加入三磷酸腺苷等, 以利红细胞存活。在采用凝胶作生物色谱固定相载体时, 要注意根据所分离的中药活性成分分子量, 选用有适当孔隙大小的凝胶品种, 这样, 可以利用凝胶色谱的分离特点, 除去一些大分子的杂质成分;此外, 柱子应粗而短, 流速应低, 以避免柱内高压影响红细胞存活。

结束语

综上所述, 本文对中药活性成分筛选中生物色谱法的应用进行了简要的分析, 就使用该技术进行重要活性成分的使用方法、使用优点等进行了详细的分析, 该技术在使用中必然能够提高中药的应用价值, 使其在新药领域的发展中得到更为有效的利用。

摘要：社会的建设发展, 为人们的生活环境创造了一个新的天地。在当代社会的研究中, 借助着先进的科学技术医学领域的发展状况十分的喜人。在进行医学的发展过程中, 中药领域的应用价值一直是我国医学领域所重视的。所以, 为了更好的进行中药活性成分的研究, 在进行研究实验的过程中使用生物色谱法, 将对中药活性成分的筛选具有重要的意义。

关键词：中药,活性成分,生物色谱法

参考文献

降糖中药的筛选 篇5

1 中医对糖尿病视网膜病变的认识

1.1 病因病机

糖尿病视网膜病变 (DR) 属中医学的“视瞻昏渺”、“云雾移晴”、“暴盲”等范畴。早在明代戴元礼《证治要诀》中就指出精血亏损是糖尿病致盲的主要病机。由于历史条件限制, 古代医家仅根据临床表现等进行治疗, 而未形成系统的理论体系。近年随着对DR的深入研究, 对其病因病机有了进一步认识。一般来说, 糖尿病视网膜病变的病变部位在目, 根本病机是由消渴导致。消渴日久致体内燥热, 燥热伤气致气阴两虚, 阴虚血滞致血瘀, 使精气无法上注于目。本病以气阴亏虚为本, 气滞血瘀为标, 贯穿于糖尿病视网膜病变发生发展的全过程。

1.2 辩证分型

中医中的“证”, 是对机体在疾病过程中某一阶段的病理概括。中医治疗讲究辩证论治, 查阅文献发现, 中药治疗DR的辩证分型方法繁多。李志英等[4]分3型论治:阴虚火旺型、气阴两虚型、阴阳两虚型;王重农等[5]分4型论治:肝肾亏虚型、气阴两虚型、血瘀型、痰湿型。此外, 张懿先等[6]分5型论治, 董彦敏[7]分6型论治。针对各种分型进行诊治, 均取得较好的疗效。

2 中药治疗糖尿病视网膜病变的文献研究

中药治疗DR的研究已取得了很大进展, 为进一步探讨中药治疗DR的用药规律, 以便更好的认识DR的病因, 用以指导临床用药并提高疗效。本文从文献研究入手, 以中国期刊全文数据库 (CNKI) 和维普数据库为主要检索工具, 检索了1980至2010年30年间关于中药治疗糖尿病视网膜病变的相关文献116篇[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17]。

检索发现, 1985年之前对治疗糖尿病视网膜病变的中药研究甚少, 85年之后研究逐年增多且以2006至2009年研究最多, 可见人们对此研究日益关注。文献中总结中药方剂共156个 (包括古方、经验方、上市制剂) , 涉及中药181味, 使用中药频次共1486次。其中相对使用频率1%以上的有30味, 使用频次45次以上的有丹参、黄芪、生地黄、三七、葛根、枸杞、当归, 其中以益气养阴药和活血化瘀药为主, 见表1。

将上述用以治疗DR的高频中药共30味, 参照2010版《中国药典》中药材与饮片部分, 据中药材的功能主治将其归类并进行统计分析。结果显示, 使用最多的三类药物为益气养阴药、清热药、活血化瘀药, 共占了30味中药的80%, 其中益气养阴药居首位, 见表2。上述结果与姜小帆等[18]统计的该病的病性以阴虚、气虚、血瘀、火热、阳虚为主基本对应。因此糖尿病视网膜病变的治疗重在缓解气虚、阴虚、湿热及血瘀症状, 这是中药治疗DR之本。

3 中药治疗糖尿病视网膜病变的实验研究

3.1 糖尿病视网膜病变的发病机制

目前针对DR机制的研究主要集中在以下几点: (1) 多元醇-肌醇代谢异常:视网膜周细胞内过量的葡萄糖在醛糖还原酶 (aldose reductase, AR) 作用下进入葡萄糖代谢的山梨醇通路, 造成周细胞Na+-K+-ATP酶活性降低, 最终导致周细胞死亡。 (2) 蛋白质非酶糖基化产物堆积:高糖状态下葡萄糖与体内蛋白质结合, 形成非酶糖基化终产物 (advanced glycationend products, AGE) , AGE作用于内皮细胞, 促进血液凝固和血栓形成。 (3) 蛋白激酶C (PKC) 的激活:高血糖使组织内二酰甘油含量增加, 进而激活PKC, 促进多种细胞因子表达, 增加新血管生成。 (4) 氧化应激:高血糖状态可促进氧化应激反应, 产生大量的活性氧族 (ROS) , 使细胞内生物大分子受损, 细胞通透性增加, 引起细胞凋亡[19]。 (5) 细胞因子:视网膜内生长和抑制因子不平衡导致细胞增殖和新血管生成。另外, 还有一些炎性因子和血液流变学性质的改变均与糖尿病视网膜病变密切相关。

3.2 中药治疗DR的实验研究

DR的发病机制复杂, 且上述各项发病机制相互依存、互相影响, 它们共同参与了DR发生发展的过程。人们通过大量的实验, 研究了关于中药治疗DR的作用机制及疗效。

3.2.1 单味中药治疗DR的实验研究

研究单味中药治疗DR作用的靶点, 对中药作用机制的阐明意义重大。王秀军等[20]通过测定视网膜组织AR的活性后发现, 黄芩苷能明显抑制视网膜组织中AR的活性且降低Bax、Bcl-2的表达, 延缓DR发展。匡洪宇等[21]研究证明黄芪总黄酮使高糖培养下牛视网膜血管周细胞的氧化应激水平及凋亡率明显降低。李才锐等[22]研究发现银杏叶提取物对糖尿病大鼠视网膜血液循环有调节作用。

3.2.2 中药复方治疗DR的实验研究

近年来对中药复方治疗DR的疗效研究相对较多。李全智等[9]报道, 贞芪胶囊可降低DR大鼠视网膜中AR基因的表达, 对治疗DR有重要作用。邸进[23]发现糖网方能明显降低视网膜MDA含量, 增强SOD、GSH-Px活性, 提高糖尿病大鼠抗氧化能力, 减轻氧自由基损伤。罗丽华等[11]研究表明, 降糖名目汤可抑制糖尿病小鼠视网膜促血管生成因子VEGF和b FGF的表达, 起到治疗DR的目的。但中药复方中成分复杂加上一些配伍可能引起的药物之间的协同效应等, 因而对其机制的研究尚处于初始阶段。

4 中药治疗糖尿病视网膜病变的研究认识与展望

中药治疗糖尿病视网膜病变有其自身的优势和特点。首先, 中药治疗糖尿病视网膜病变主要采用辩证论治, 虽然在辩证分型方面尚未统一, 但经文献调研发现, 使用最多的是益气养阴药、清热药和活血化瘀药, 这与其病因气阴亏虚为本, 气滞血瘀为标相对应, 进行标本兼治从而发挥中药治疗的整体调节优势, 这是西药无法取代的。其次, 中药治疗效果稳定, 还能减少服用西药所带来的不良反应。

即使如此, 中药在对DR的防治上还存在一些不足, 这主要体现在实验研究方面, 目前多采用西医模型进行中药疗效研究, 这不利于阐明中药治疗DR的有效性和合理性, 无法完全体现传统中医理论。此外, 从实验研究结果来看, 尽管单味药提取物、复方等对DR的研究都已取得了一定进展且疗效显著, 但在具体机制的阐明上还有欠缺, 因此还有待于进一步研究。

摘要：目的 归纳中药治疗糖尿病视网膜病变的用药规律及实验研究概况。方法 对中国期刊全文数据库中1980至2010年间治疗糖尿病视网膜病变的方剂进行统计分析。结果 治疗糖尿病视网膜病变的中药以清热药、益气养阴药和活血化瘀药为主, 共占全部用药类型的80%;中药治疗机制还有待于进一步研究。结论 中药治疗糖尿病视网膜病变有其独特的优势。

降糖中药的筛选 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、布拉酵母菌上述菌种均购自重庆力克生物有限公司, 经鉴定为有活力的生物菌种。

1.1.2 中药提取液 由潍坊诺达药业有限公司提供。

1.1.3 培养基

芽孢杆菌种子培养基:牛肉膏5g、大豆蛋白胨10g、氯化钠5g、水1L、p H值7.0、0.1MPa灭菌20min。酵母菌种子培养基 (g/L) :葡萄糖15, 酵母5, Mg SO4·7H2O 0.25, K2HPO4·3H2O 0.5, KH2PO4 0.5。基础培养基:葡萄糖20g、硫酸铵7g、水1L, KH2PO4 0.5g、p H值7.0、0.1MPa灭菌20min。

1.2 方法

1.2.1 发酵用菌种

(1) 种子液的制备:分别将芽孢杆菌和酵母菌从保存的斜面转接于新鲜试管斜面, 于37℃培养18h。取培养好的斜面, 用接种环挑1环接种于, 盛有50ml无菌种子培养基的250ml三角瓶中, 然后置回转式恒温调速摇瓶柜中, 3 7℃振荡培养2 4 h, 转速为120r/min。 (2) 摇瓶培养:分别取种子液, 超净工作台上接入盛有50ml无菌种子培养基的250ml三角瓶中, 接种量为10% (V/V) 。置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 37℃培养30h, 培养结束取样测定活菌数。活菌计数方法:采用倾注法按10倍稀释法制成不同浓度稀释液, 从3种合适的稀释液中分别吸取0.2ml置于无菌培养皿中, 每一稀释度做3个平皿。将事先融化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基, 向每个培养皿中倒入约10ml摇匀, 待凝固后, 37℃倒置培养进行菌落计数。通过菌落计数发现, 种子液中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌, 布拉酵母菌的菌落数分别为8.7×107/ml, 9.1×107/ml, 6.4×107/ml, 5.2×107/ml。 (3) 中药发酵培养基的配置:将制得的中药提取液中代替基础培养基中的水, 并加入尿素, 并调节p H至6.0制成中药基础培养基。葡萄糖20g, 硫酸铵8g, 中药提取液1L, KH2PO4 0.5g, Na HCO3适量。 (4) 菌种筛选:分别将制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌, 布拉酵母菌接种到中药基础培养基中, 接种量为10% (V/V) 。置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 37℃培养30h。培养结束取样测定活菌数。

1.2.2单因素试验设计筛选发酵条件

通过单因素试验改变发酵条件, 寻找相关因素对芽孢杆菌在中药基础培养基中发酵的影响, 单因素试验设计表如表1所示。按照每一个因素分别进行实验研究。

2 结果

2.1 确定发酵用菌种

测定发酵液中的活菌数, 结果如表2。

(×107/ml)

通过比较发现芽孢杆菌能够在中药发酵液中正常生长, 并不断增值, 而酵母菌不能在中药发酵液中增值, 因此确定以芽孢杆菌作为菌种。

2.2 芽孢杆菌的发酵效率

通过比较发现枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵效率相差不大, 都能够在中药发酵液中长期生长繁殖, 因此, 研究了不同比例的芽孢杆菌对在中药基础培养基中的产率, 接种浓度均为10%, 结果如表3。

(%)

通过结果可以看出, 不同比例的芽孢杆菌发酵后, 产生的芽孢杆菌的数量差异不显著 (P>0.05) , 由于不同的产孢杆菌产生的酶及对中药的代谢, 产生的次生代谢产物不同, 因此, 采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的比例为1:1的混合菌种作为种子液发酵。

2.3 葡萄糖浓度对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净, 灭菌后, 按照单因素实验设计表中葡萄糖的含量配置不同葡萄糖浓度的基础培养基, 其他条件为:硫酸铵8g, 中药提取液1L, KH2PO40.5g, 用适量Na HCO3调节p H值到6.0, 每个锥形瓶中加入基础培养基50ml, 接种量为10% (v/v) , 置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 37℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标, 来考察碳源对芽孢杆菌发酵的影响, 结果如图1。培养基中葡萄糖的浓度在10~15g/L之间时, 就能满足自身的需要, 当葡萄糖的浓度高于15g/L时, 芽孢杆菌的发酵不会随着糖浓度的升高, 芽孢杆菌继续发酵, 此时, 多余的糖分将溶解在发酵液中, 芽孢杆菌产生分解产生的碳源能够满足自身的需求。

2.4 硫酸铵浓度对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净, 灭菌后, 按照单因素实验设计表中硫酸铵的含量配置不同硫酸铵浓度的基础培养基, 其他条件为:葡萄糖20g、中药提取液1L、KH2PO40.5g, 用适量Na HCO3调节p H值到6.0, 每个锥形瓶中加入基础培养基50ml, 接种量为10% (v/v) , 置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 37℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标, 来考察氮源对芽孢杆菌发酵的影响, 结果如图2。当硫酸铵的浓度6g/L时, 芽孢杆菌的生长曲线, 将不会继续上升, 硫酸铵的浓度在8g/L时, 芽孢杆菌的浓度与6g/L相差不明显, 但是当硫酸铵的浓度为4g/L时, 芽孢杆菌的浓度将显著低于6g/L, 因此, 可以推断培养基中硫酸铵的浓度最佳在6g/L左右。

2.5 p H值对芽孢杆菌浓度变化的影响

将5个锥形瓶清洗干净, 灭菌后, 按照单因素实验设计表中发酵液的p H值配置不同酸度浓度的基础培养基, 其他条件为:葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g, 用适量Na HCO3和盐酸调节p H值, 每个锥形瓶中加入基础培养基50ml, 接种量为10% (v/v) , 置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 37℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标, 来考察p H值对芽孢杆菌发酵的影响, 结果如图3。当ph值有小的变动时, 发酵液中芽孢杆菌的浓度也会伴随着较大的变动, 从实验结果来看, 芽孢杆菌的最佳p H值为6.0。

2.5 温度对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净, 灭菌后, 按照葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g, 用适量Na HCO3调节发酵基质的p H值为6.0, 每个锥形瓶中加入基础培养基50ml, 接种量为10% (v/v) , 置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 分别在24、28、32、37℃, 42℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标, 来考察温度对芽孢杆菌发酵的影响, 结果如图4。随着温度的升高, 发酵液中芽孢杆菌的数量不断增加, 当温度在32~37℃芽孢杆菌的数量达到最高值, 当发酵温度是42℃时, 发酵液中的芽孢杆菌浓度呈现下降趋势, 说明温度升高, 芽孢杆菌将停止生长, 形成芽孢度过温度不适的阶段。因此, 芽孢杆菌发酵的温度控制在32~37℃之间。

2.6 接种量对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净, 灭菌后, 按照葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g, 用适量Na HCO3调节发酵基质的p H值为6.0, 每个锥形瓶中加入基础培养基50ml, 接种量按照表2~3设置的浓度分别接种为10%, 置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 分别在37℃, 培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标, 来考察接种量对芽孢杆菌发酵的影响, 结果如图5。发酵液中芽孢杆菌的数量随着接种量的增加而增加, 5%~10%之间时, 芽孢杆菌的数量相差不大, 从图可以看出发酵液的最佳接种量在8%左右, 当接种量大于10%, 会造成部分菌种的浪费, 低于5%, 芽孢杆菌发酵不充分, 其中的部分营养物质不能得到利用。

2.7 发酵时间对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净, 灭菌后, 按照葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g, 用适量Na HCO3调节发酵基质的p H值为6.0, 每个锥形瓶中加入基础培养基50ml, 接种量按照表2~3设置的浓度分别接种为10%, 置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养, 转速为120r/min, 分别在37℃培养28、36、44、52、60h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标, 来考察发酵时间对芽孢杆菌发酵效果的影响, 结果如图6。发酵时间与芽孢杆菌的浓度可以看出, 随着发酵时间的延长, 发酵液中芽孢杆菌的数量会继续增加, 发酵时间达到52h后, 发酵液中芽孢杆菌的数量不再随着时间的延长继续增加, 因此, 最佳的发酵时间为52h。

3 结论

不同比例的芽孢杆菌发酵后, 产生的芽孢杆菌的数量差异不显著 (P>0.05) , 由于不同的产孢杆菌产生的酶及对中药的代谢, 产生的次生代谢产物不同, 因此, 采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的比例为1:1的混合菌种作为种子液发酵。

芽孢杆菌的发酵受碳源, 氮源, 温度, 接种量, 发酵时间, 培养基的ph值等多种因素的影响, 通过实验发现培养基中葡萄糖的浓度在10~15g/L、硫酸铵的浓度在6g/L、p H值6.0、温度32~37℃、发酵液的接种量在8%左右、发酵时间52h为最佳。

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降糖中药的筛选 篇7

1 材料

1.1 药物与试剂

菟丝子、女贞子、莱菔子、苏子、车前子、茺蔚子、枸杞子、决明子、栀子、五味子等组成,购于北京同仁堂唐山连锁药店有限公司,由田春雨副教授鉴定;京尼平苷酸,批号:111828-201102;大黄酚,批号:110796-201319;盐酸水苏碱,批号:110712-201312;甜菜碱,批号:110894-200503;芥子碱硫氰酸盐,批号:111702-201303;特女贞苷,批号:111926-201404;金丝桃苷,批号:111521-201406;栀子苷,批号:110749-201316;五味子醇甲,批号110857-201417,均购于中国食品药品检定研究院;迷迭香酸,批号:20141027,购于上海金德生物科技有限公司。

二肽基肽酶Ⅳ,购于美国sigma公司,批号:Lot#SL-BK3698V;甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺,购于美国sigma公司,批号:Lot#SLBJ8491V;Tris粉末,ST765购买于碧云天生物技术研究所。

1.2 主要仪器

十万分之一精密电子天平SOP:德国SARTORIUS,产品型号:BS224S;旋涡混合器:上海青浦沪西仪器厂,产品型号:XW-80A;数显鼓风干燥箱:上海博讯实业有限公司医疗设备厂,产品型号:GZX-9240;笔型酸碱计:衡欣科技股份有限公司,产品型号:8685;酶标仪:瑞士TECAN,产品型号:M200PRO。

2 方法

2.1 DPP-4抑制剂体外筛选模型的建立与优化

实验分为4组[3,4,5],每组设3个复孔,分别为空白组(缓冲液+底物)、阴性对照组(酶+缓冲液+底物)、阳性对照组(磷酸西格列汀片+酶+缓冲液+底物)、阳性空白组(磷酸西格列汀片+缓冲液+底物),按照药物、酶、缓冲液、底物顺序加入96孔板,对加入量进行反复摸索,37℃孵育30min,于405nm处测定吸光度(OD),每孔反应体积为100μL,对酶及底物浓度,反应体系pH值、反应时间进行优化。设0.002、0.004、0.006、0.008、0.01mmol/L浓度梯度的磷酸西格列汀片对上述反应体系进行验证。DPP-4抑制剂体外筛选体系建立后对该经验方单味中药及其单体成分分别进行筛选,在原分组基础上加干预药物组(干预药物+酶+缓冲液+底物)、干预药物空白组(干预药物+缓冲液+底物),中药设5个浓度,分别为25、50、100、200、400mg/L。单体设5个浓度梯度,分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/L,按上述反应体系进行筛选,测定OD值,计算抑制率,比较IC50差异。

2.3 统计学处理

实验数据应用SPSS 20.0软件及Excel 2007进行分析,实验结果均以均值±标准差(±s)表示。

抑制率计算公式:

3 结果

3.1 DPP-4抑制剂体外筛选模型的优化结果

筛选体系中各成分加入量见表1。

在0.1mmol/L底物浓度,pH=8.2,温度37℃,时间30min的条件下,在1~10U/L的酶浓度范围内有良好的线性关系且显色性明显,最终确定酶浓度为4U/L;在酶浓度确定后,底物浓度在0~0.1mmol/L范围内,吸光度与底物浓度成线性关系,但在0.04mmol/L的底物浓度以下吸光度变化不大,在0.04~0.1mmol/L的浓度范围内线性关系良好,确定底物浓度为0.05mmol/L,与文献记载相符[6];按照文献方法[3,4,5]并经过验证确定反应体系缓冲液pH=8.2,反应时间30min,温度37℃。按上述反应体系测定不同浓度梯度磷酸西格列汀片吸光度,并计算抑制率,抑制率与药物浓度成剂量依赖性见图1,证明本体系稳定,可用于实验。

3.2 十种中药及其单体成分筛选结果

复筛结果见表2,各中药成分IC50分别为:莱菔子(382.554±7.749)mg/L,菟丝子(843.391±135.230)mg/L,栀子(1027.921±104.316)mg/L,女贞子、车前子、决明子、紫苏子、枸杞子、五味子、茺蔚子的DPP-4抑制作用不明显,未得出IC50,见表2。复筛实验结果显示各单体IC50值分别为:栀子苷(0.075±0.004)mmol/L,盐酸水苏碱(2.638±0.715)mmol/L,金丝桃苷(3.135±0.656)mmol/L,芥子碱硫氰酸盐(6.975±1.099)mmol/L,甜菜碱(60.265±29.117)mmol/L。五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、京尼平苷酸、大黄酚、迷迭香酸、特女贞苷达不到半数抑制率,结果见表3。

(±s,n=4)

4 讨论

近年来DPP-4抑制剂已经成为2型糖尿病治疗中的重要药物之一,目前上市的DPP-4抑制剂有西格列汀、维格列汀、沙格列汀、阿格列汀、利拉列汀五种,相比传统口服降糖药物,DPP-4抑制剂可以有效降低2型糖尿病患者血糖水平并且不增加低血糖风险,不增加体重及胃肠道不适等不良反应,具有良好的安全性和耐受性,但其价格昂贵,给患者带来较重经济负担。中药资源广阔,不同中药具有不同作用途径、作用靶点和作用环节,中药配方可起到综合调节糖脂代谢作用,其综合调节中是否有抑制DPP-4的作用靶点越来越受到中医学者的关注,研究发现葫芦巴、鹰嘴豆、石榴皮、水蛭、茯神、密蒙花及黑加仑的提取物BL2和BL5部位具有明显的DPP-4抑制作用[3,4,5],而对中药单体成分或复方的相关研究报道较少。

本实验通过对临床上十味配方中药菟丝子、枸杞子、栀子、车前子、决明子、茺蔚子、莱菔子、女贞子、苏子、五味子及其主要单体成分进行DPP-4抑制作用体外筛选,发现莱菔子、栀子、菟丝子对DPP-4抑制作用相对较强,栀子苷对DPP-4抑制作用显著,除此之外,盐酸水苏碱、金丝桃苷、芥子碱硫氰酸盐、甜菜碱都存在一定的DPP-4抑制作用。

本实验关于栀子苷、金丝桃苷、甜菜碱、盐酸水苏碱、芥子碱硫氰酸盐、特女贞苷DPP-4抑制作用的研究尚未见报道。其中栀子与栀子苷,菟丝子与金丝桃苷,莱菔子与芥子碱硫氰酸盐DPP-4抑制作用可以相互对应,但本实验结果中枸杞子、茺蔚子、女贞子未见明显的DPP-4抑制作用,但其单体成分甜菜碱、盐酸水苏碱、特女贞苷存在一定的DPP-4抑制作用,这可能与中药成分比较复杂,含量不均及提取方法有关。本实验为阐释本配方中药抑制DPP-4作用机制和发挥作用的中药及其单体成分提供了实验依据,对指导中药配方提取工艺及配方优化具有重要意义。

参考文献

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