降解菌筛选

降解菌筛选（精选10篇）

降解菌筛选 篇1

氯苯作为一种重要的化工原料, 广泛应用于农药、医药和化工领域[1], 因此存在于多种工业废水中。氯苯的性质十分稳定, 因此对环境危害也特别严重[2]。利用微生物来降解氯苯类化合物在国内外已有很多报道[3,4,5], 但对氯苯降解菌株的选育研究报道相对较少, 本文对氯苯降解菌的驯化筛选作了大量研究, 筛选到1株具有降解氯苯能力的菌株。并且确立了此菌株降解氯苯最佳条件, 为氯苯的生物降解提供了一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源:

吉化集团污水处理车间污水处理曝气池中活性污泥。

1.1.2 培养基组成:

无机盐氯苯培养基各成分质量分数:KH2PO4 0.05%, K2HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.02%, CaCl2 0.01%, NaCl 0.02%及适量氯苯 (按实验要求配置不同浓度) , pH 7.0。牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.3%, 蛋白胨 1%, NaCl 0.5%, pH 7.2～7.4。

1.2 实验方法

1.2.1菌株的驯化和筛选

取活性污泥2 mL, 接种于100 mL无机盐氯苯液体培养基 (氯苯质量浓度为20 mg·L-1) 中, 30℃、120 r·min-1摇床振荡培养5 d。从中吸取1 mL 转接至100 mL无机盐氯苯液体培养基 (氯苯质量浓度应逐次递增, 增加梯度为10 mg·L-1) , 连续富集, 转接5次。然后用稀释平板分离法, 在牛肉膏蛋白胨培养基上分离, 以得到单菌落, 重新将单菌落挑接至无机盐氯苯固体培养基 (氯苯质量浓度为50 mg·L-1) 上, 以生长与否验证菌株是否具有氯苯降解能力。

1.2.2 菌株的观察与鉴定

将分离得到的菌株分别编号, 观察记录菌株生长情况、菌落特征、菌体形态结构、染色反应及生理生化反应, 依据参考文献[6,7]进行。

1.2.3氯苯降解率的测定

将菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化, 37℃振荡培养24 h, 活化后的菌液转移至无菌离心管中3500 r·min-1离心10 min, 倾去上清液, 再用无菌磷酸盐缓冲液反复清洗离心3次, 最后使微生物悬浮于缓冲液中制成菌悬液, 使菌悬液的细菌浓度约为每毫升1×109个细胞。无菌条件下将菌悬液接种于氯苯无机盐培养基中。适当温度下振荡培养。培养结束后采用紫外分光光度法[8]测定氯苯残余量, 计算氯苯降解率。

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选和鉴定

经过反复驯化、富集培养和划线分离纯化, 分离得到12株具有降解氯苯能力的菌株, 其中JH02菌株的降解效率最高, 故对其进行进一步研究。

菌株JH02的菌落为圆形, 隆起, 颜色为微红色。边缘整齐, 菌落透明。显微观察菌体为球状, 呈链状排列。革兰氏染色阳性, 无芽孢, 无鞭毛。能够利用乳糖、葡萄糖、山梨醇、明胶、淀粉和油脂, 不能利用阿拉伯糖。吲哚实验、VP实验以及硫化氢实验阴性, MR实验阳性。通过对菌落形态、菌体形态的观察和生理生化特征的测定, 依据Bergey (1994) 分类系统初步鉴定菌株JH02属于链球菌属 (Streptococcus) 。

2.2 菌株JH02降解氯苯条件的考察

2.2.1 氯苯质量浓度对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量为体积分数2%, 培养温度为37℃, 转速120 r·min-1, pH 8.0, 培养时间为24 h时, 氯苯质量浓度对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图1 所示。

从图1不难看出, 氯苯质量浓度的变化对菌株的降解性能有很大的影响。随着氯苯质量浓度的提高, 降解率呈现下降趋势, 但即使氯苯质量浓度达到70 mg·L-1时菌株JH02对氯苯的降解率仍在75%以上, 可见菌株JH02完全适合较高质量浓度的氯苯废水的处理。氯苯质量浓度在50 mg·L-1时, 降解率可在90%以上, 因此后续的实验中, 氯苯质量浓度设定为50 mg·L-1。

2.2.2培养时间对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量体积分数为2%, 培养温度为37℃, 转速120 r·min-1, pH 8.0, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1时, 培养时间对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图2 所示。

由图2可知, 菌株JH02对氯苯的降解率随着培养时间的增加而提高, 氯苯降解最快时期发生在培养6～24 h阶段;在培养时间达到24 h后降解率基本稳定, 不再有显著提高。

2.2.3培养温度对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量体积分数为2%, 摇床转速120 r·min-1, pH 8.0, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1, 培养时间为24 h时, 培养温度对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图3所示。

由图3可见, 在10～35℃之间, 菌株JH02对氯苯的降解率随温度显著升高;在35～37℃之间降解率变化不大, 在当温度超过37℃后, 降解率开始下降。室温条件 (25℃) 下, 降解率也可在75%左右, 这对于工业生产中的实际应用十分重要。

2.2.4 pH值对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量为体积分数2%, 培养温度为37℃, 摇床转速120 r·min-1, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1, 培养时间为24 h时, pH值对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图4所示。

图4说明, JH02菌株在降解氯苯的行为中受pH的影响较小, pH在4～10范围时, 菌株的降解能力变化不大, 但在中性偏碱条件下 (pH=8) 相对更适合降解行为。

2.2.5 菌悬液接种量对菌株降解性能的影响

考察培养温度为37℃, 摇床转速120 r·min-1, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1, pH8.0, 培养时间为24 h时, 菌悬液接种量对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图5所示。

图5说明, 菌悬液接种量对菌株的降解有一定影响, 接种量较小时, 随接种量增加, 降解率也增加。接种量达到4%以后再继续增加接种量对菌株的降解影响不大, 没有降解率的明显增加。

2.2.6 摇床转速对菌株降解性能的影响

测定氯苯质量浓度为50 mg·L-1, 温度为37℃, 菌悬液接种量体积分数为2%, pH8.0, 培养时间为24 h时, 不同摇床转速对菌株JH02降解性能的影响, 如图6所示。

摇床转速间接反应溶解氧的含量, 同时影响微生物絮体的生长情况。图6说明菌株JH02在摇床转速为140 r·min-1时, 对氯苯降解效果最好。

3 结论

综上, 菌株Streptococcus JH02对氯苯的最适降解条件为:氯苯质量浓度50 mg·L-1, 温度为37℃, 菌悬液接种量为体积分数4%, pH8.0, 培养时间24 h, 摇床转速140 r·min-1, 此条件下氯苯的降解率可达94.7%。

参考文献

[1]金相灿.有毒有机物污染化学[M].北京:清华大学出版社1990:250~265

[2]翟福平, 张晓健, 何苗.氯苯驯化活性污泥对同类有机物的好氧降解性比较研究[J].环境科学, 1996, 16 (3) :309

[3]陈明, 张维, 徐玉泉, 等.氯代芳香族污染物降解菌株的分离及其降解质粒的初步研究[J].高技术通讯, 2000, 2, 21~23

[4]HBettmann et al.Degradation of phenol by polymer en-trapped microorganism.Appl.Microbiol.Biotechnol., 1985, 20:285~290

[5]陆军, 王菊思, 赵丽辉.苯系化合物好氧降解菌的驯化和筛选[J].环境科学, 1996, 17 (6) :1~4

[6]东秀珠, 蔡妙莫, 等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社, 2001

[7]John G Holt, Nolel R Krieg, et al.Bergey's manual ofdeterminative bacteriology (ninth edition) [M].Batimorephiadelphia honking London munich Sydney tolyo.Wil-iams&Wilkins, 1994

[8]王战勇, 苏婷婷, 张洪林.氯苯降解菌株的选育[J].抚顺石油学院学报, 2002, 22 (4) :20~22

降解菌筛选 篇2

烯唑醇降解菌的分离筛选及降解特性研究

从生产烯唑醇的农药厂废水处理池的活性污泥中驯化、分离得到6株能以烯唑醇为唯一碳源生长的`细菌,分别命名为1#、2#、3#、4#、5#、6#.实验结果表明,这六种菌都是好氧菌种,对烯唑醇降解率大于30%的有1#、3#、4#、6#,其中1#为优势菌种.该优势菌降解烯唑醇的最适温度为30～35 ℃,最适pH值为7.0,投加0.404 mg/L的菌株母液量为10%,烯唑醇的最佳初始浓度为30 mg/L.该菌在上述最适条件下,150 r/min摇床培养6d,对烯唑醇的降解率可达78.14%;优势菌1#单菌对烯唑醇的降解要比复合菌对其降解的效果好.

作 者：张凤霞 李学德 花日茂 吴祥为 唐俊 汤锋 操海群 作者单位：安徽农业大学资源与环境学院,安徽省农产品安全重点实验室,安徽,合肥,230036刊 名：激光生物学报 ISTIC英文刊名：ACTA LASER BIOLOGY SINICA年，卷(期)：18(5)分类号：X506 X172关键词：烯唑醇 微生物降解菌 分离筛选 降解特性

对氯硝基苯高效降解菌株的筛选 篇3

[关键词]对氯硝基苯 均匀设计 枯草芽孢杆菌

氯代硝基苯是一类含氯含硝基芳香烃化合物,广泛用作染料、农药、医药生产的中间体。据不完全统计,2000年全国的对氯硝基苯(4CNB,4-氯硝基苯)总产量约为12万吨[1]。在生产氯代硝基苯废水中,因含有氯代硝基苯、硝基酚、氯苯、硫酸、硝酸等多种污染物,特别是氯代硝基苯类毒性大、难处理,导致排放水中严重超标,一旦大量进入土壤及地下水中将会造成难以修复的环境危害。由于氯代硝基苯引起的毒性包括血液毒性、脾毒性、肝脏毒性、免疫毒性,同时还会造成对肾脏的损害、对神经系统的伤害等,甚至导致变异和致癌。因此欧共体早已将氯代硝基苯列为一种有害的且在环境中难以降解的有机污染物[2],因此在污水中筛选和驯化降解对氯硝基苯的高效菌株具有重要的理论和实际意义。

均匀设计法是我国科学家方开泰教授和王元教授在正交设计基础上,将数论和多元统计相结合创造出的一种新的试验设计方法。其特点是大大减少了实验次数,它可以自动将各实验因素分类为重要与次要,并将因素按重要性排序,通过分析软件对结果与因素条件进行界定与预报,进而控制各因素[3～4]。本研究从污水处理厂的活性污泥中驯化能够以4CNB为生长基质的混合菌种,采用均匀设计法优化4CNB的降解条件,确定降解4CNB最佳的工艺来提高降解率、缩短降解周期,为环境污染物的降解条件奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

活性污泥,哈尔滨市文昌污水处理厂提供。

1.2 仪器及试剂

实验仪器:HDL震荡培养箱型号HZQ-F19(哈尔滨东联电子有限公司);Angilent6890气相色谱-电子捕获检测器(美国安捷伦公司);DPS统计软件(北京中农博思科技发展公司)。

实验试剂:对氯硝基苯(百灵威化学技术有限公司,标准品、纯度100%);苯(天津市化学试剂研究所,色谱纯、纯度98%)。

培养基(MSB) 组成:每升含磷酸氢二钠1g,磷酸二氢钾0.5g,MgSO4·7H2 O 0.03g,微量元素溶液[9]5mL,对氯硝基苯1.27mmol,pH 7.0。固体培养基中加入15g/L的琼脂。

1.3 分析方法

样品处理方法:取降解后4CNB溶液10mL于试样瓶中加入10mL苯色谱淋洗液振荡萃取3次,合并萃取液,采用GC-ECD方法测定4CNB的含量。

GC-ECD测定条件[5]:HP-5 (30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱,柱温135℃ ;进样量:0.2μL;分流比:50:1;进样温度:230℃;载气流速:0.8mL/min;63Ni电子捕获检测器;柱温300℃。

1.4 菌种的驯化

生物降解试验是将环境中微生物接种于含有4CNB的无机盐培养基中降解4CNB的试验,故取污水处理厂的活性污泥进行培养和驯化[6]。

(1)将2mL活性污泥接种于50mL的20mg/L的4CNB无机盐溶液中,在35℃、135rpm的摇床培养箱中培养5天。

(2)取(1)中驯化好的菌种2mL接种于50mL的40mL的4CNB无机盐溶液中,在35℃、135rpm的摇床培养箱中培养5天。

(3)重复上述步骤在60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L的培养基中驯化。最后将驯化后的菌种接种于液体培养中扩培。

1.54CNB的培养条件的优化及验证

根据预实验得知,菌种生长对其影响因素主要有pH值、温度、耗氧量(摇床转速控制)、底物浓度,如表1水平因素。本试验用DPS统计软件U9(94)均匀设计法试验[7]对降解4CNB条件进行优选,按5%接菌量发酵培养。

验证试验:在已灭菌的无机盐溶液中加入4CNB溶液,以4CNB做为唯一碳,底物浓度、pH值、温度、摇床转速为均匀设计优化后的最佳数值,加入经过驯化的接种物,放入恒温振荡培养箱中培养,并设不加接种物的对照试验,分别于4 、8、12、24、36、48和72h取样1mL,随行补足,按样品处理方法制备样品溶液,精密吸取一定量样品溶液稀释至测定线性范围内,加入气相色谱中采用外标一点法测定4CNB含量[8]。

1.64CNB单一菌株的分离纯化及DNA提取

菌种分离:污泥样品按10 %的接入量接种于培养基中,于30℃、130rpm的摇床上振荡培养一周左右,取样测定对氯硝基苯降解情况,待对氯硝基苯的浓度降低后,再按1%的接入量转接到新的培养基中培养一周左右,如此重复3 次。然后在琼脂平板上划线分离,直至得到纯的单菌落。

DNA提取:采用CTAB/NaCl法。

1.7 16S rDNA 扩增和序列测定及建立系统进化树。

用于16S rDNA扩增的PCR反应的引物为一对通用引物[7]。正向引物Pf:5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′;反向引物Pr:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反应体系(50μL)为:10×buffer 5μL、25mmol/L MgCl2 3μL 、10mmol/L dNTP 4μL、20μmolPL引物各1μL、模板DNA 4μL、ddH2O 31μL、Taq DNA 酶1μL。PCR 反应条件为: 94℃3min;94℃1min,56℃2min,72℃3min,29个循环;72℃10min。

PCR产物的纯化和测序由大连宝生物科技有限公司完成。将测得的序列列在NCBI数据库中进行相似性搜索,选出其中相似性较高的序列以邻接法构建系统进化树,所用程序为MEGA4。

1.8 DNA质量检测

(1)制备凝胶:用电泳缓冲液配制0.7%(m/v)的琼脂糖在微波炉中融化,加入4μl溴化乙锭,冷却至50℃,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。

(2)DNA10μl与2μl点样缓冲液充分混匀,放入点样孔。以λDNA/HindⅢ Marker为分子量标记。

(3)38V恒压电泳。

(4)150min后,关闭电源,凝胶成像仪上照相。

2 结果与讨论

2.1标准曲线的绘制及线性范围

将4CNB溶于苯色谱纯中分别配制成0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9mg/L不同浓度的4CNB标准溶液,自动进样0.2μL气相色谱,以对氯硝基苯的浓度(C)为横坐标,积分面积(AUS)值为纵坐标,得标准曲线Y=73924X+3000000,R=0.9991,结果表明4CNB在25～900μg/L范围内呈良好的线性关系。

2.2 4CNB降解试验结果分析及验证

采用U9(94)均匀设计,加菌量为5%、经过72h的周期降解、GC-ECD测定4CNB的含量,以降解率为评价指标,筛选出4CNB最佳的降解条件。结果如表1所示。

表1均匀设计法优化降解4CNB试验结果U9(94)

用DPS统计软件处理数据,求的10余个逐步回归方程,根据各回归方程的回归系数、F值及其显著性检验,结果试验原理和经验,选出优化方程为[9]: Y=167.1272854-0.13592543532X1-16.827199439X2-0.17309862421X4-0.05696075831X32 -0.005518965308X1X3+0.9281076659X2X3-0.012210725124X3X4,最高指标时各因素组合:X1=139.31;X2=9.00;X3=31.95;X4=129.47,显著水平p=0.0357,统计量值F=463.8292,相关系数R=0.9998,调整后相关系数Ra=0.9988,表明方程拟合度良好,因素显著。根据上述数据得到4CNB降解的最佳条件是:底物浓度139mg/L,pH为9,温度32℃,摇床转速130 rpm/min。

最佳降解条件的验证试验:按上述筛选的4CNB最佳降解条件进行验证:当底物浓度140mg/L,pH为9,温度32℃,摇床转速130 rpm/min,在加菌量为5%,降解实验结果如图1。

图1最佳条件下活性污泥对4CNB的降解

从图1上可以看出,在培养48h时4CNB的降解率达到98.84%,72h时完全降解。说明验证结果与均匀设计实验预测结果比较接近,表明本实验筛选的降解条件比较稳定、可行。

2.2 rDNA-ITS序列解析

2.2.1 DNA的提取和扩增后的质量检测结果

DNA提取和扩增后的基因组凝胶电泳成像,结果如图2,图3。

A

图3 PCR产物电泳谱图

2.2.3系统进化树重建结果

将所测得序列在NCBI数据库中进行相似性搜索(BLAST),选取其中已经发表的,相似性较高的序列,与菌株A序列以邻接法构建系统进化树,所用程序为MEGA4,分析进行1000次重复。结果如图4。

图4菌株A基于rDNA-ITS区序列重建的系统进化树

2.2.3 鉴定结果

采用通用引物对菌株的基因DNA扩增获得了片段大小为549bp的ITS片段,对上述PCR扩增产物进行序列测定,该菌株的保守序列在NCBI网站上进行同源性比较,发现与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的高度相似,相似性达到100%。说明两者有特别近的亲缘关系。获得GenBank登录号为GQ899186。

3 分析

(1) 均匀设计法是一种多因素多水平实验的设计方法,通过减少实验次数,定量的预测优化条件和结果,具有方便、适用、预测性好的特点,是筛选优化实验条件一个非常有利的工具。

(2) 本实验通过活性污泥降解对氯硝基苯条件的筛选,获得最佳实验条件为:底物浓度139mg/L,pH为9,温度32℃,摇床转速130 rpm/min,确定了对氯硝基苯的降解率和各种影响因素间的关联关系。在此降解条件下,48h时4CNB的降解率达到98.84%,72h时完全降解,缩短了降解的周期,为4CNB的降解条件奠定了理论依据。

(3)对氯硝基苯高效菌株的筛选和驯化研究对污水处理具有重要的理论和实际意义。

参考资料:

[1] 吴建峰、沈锡辉、周宇光等,“一株降解对氯硝基苯的Comamonas sp.CNB1的分离鉴定及其降解特性”[J],微生物学报,2004,2(44):8~11。.

[2] Zhong-qi He and JIM C. SPAIN,A Novel 2-Aminomuconate Deaminase in the Nitrobenzene Degradation Pathway of Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45,Journal of Bacteriology,May 1998,p.2502~2505

[3] 张超、李文兰、南莉莉等“均匀设计法优化八珍汤总苷类部位的提取工艺”[J],哈尔滨商业大学学报,2009,2(25):135~139。

[4] 金小江,周建平,“环糊精包合特性及包合常数的测定和预测”[J],药学进展, 2005, 29(11): 491~495.

[5] 盛杰、谢丽、翟桂明等,“液液萃取-气相色谱法测定硝基苯及其降解产物影响因素研究”[J],净水技术,2007,3(26):69~72。

[6] 张晶、王战勇、苏婷婷,“氯苯降解菌的筛选机降解条件”[J],辽宁石油化工大学学报,2005,3:37~39。

[7] 程冀、季宇彬、李文兰等,“均匀设计法优化制备复方天麻滴丸的最佳工艺”[J],食品与药品,2009,11(01):18~20。

[8] 李文兰、杨玉楠、季宇彬等,“驯化活性污泥降解环境激素邻苯二甲酸丁基苄酯的研究”[J],环境科学,2004,25(1):7~13。

降解菌筛选 篇4

氮杂环化合物广泛存在于焦化、医药、染料、食品加工和农药等工业废水中,在焦化废水中占40%左右,而且大都是有毒且难降解的有机物,不易受代谢过程的破坏,对生态系统和人类健康会产生潜在的长期危害[1,2,3,4]。吡啶是目前氮杂环化合物中开发与应用范围最广的化合物之一,是重要的工业原料,对神经有致毒作用,水溶性和扩散性好。由于其毒性大,具有致畸、致癌和难生物降解等特点,致使传统生物处理方法对其降解效果不佳[5],因此筛选高效稳定的专属降解菌成为国内外研究的热点[6,7,8,9]。

本研究从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离得到了一株吡啶降解菌,对其进行性能测试和菌株鉴定,并选用四因素三水平L9(34)正交试验对其进行培养条件优化,得到最佳培养条件,为含吡啶废水的生物强化处理提供了新菌株材料及其基本特性参数。

2 材料与方法

2.1 菌源

从处理吗啉废水SBR反应器(进水COD浓度2466mg/L,TN为435mg/L, COD和TN去除率分别稳定于90.12%和76.41%左右)里驯化成熟的活性污泥中筛选出的能以吡啶为唯一碳源、氮源的4株优势菌种。

2.2 培养基

(1)富集培养基:

(NH4)SO4,0.47g/L;KH2PO4,1g/L;FeCl2·4H2O,1.058g/L;CaCl2,0.094g/L;MgSO4,0.489g/L;柠檬酸三钠,5.1g/L;pH值7.0～7.5。

(2)液体测试培养基:

KH2PO4, 2g;MgSO4·7H2O,0.04g;FeCl3.6H2O, 0.004g;10mL相应浓度的吡啶储备液定容至1000mL,调pH值至7.0,121℃高温灭菌20min,待放凉加入10mL浓度为2000mg/L(3000mg/L)的吡啶储备液,此时培养基浓度为20mg/L(30mg/L)。

(3)吡啶储备液:

移取2.00g(3.00g)相对密度为0.98(20℃)的吡啶至1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容。此时吡啶储备液的浓度为2000mg/L(3000mg/L)。

2.3 吡啶降解菌株的富集驯化

取250mL锥形瓶,在无菌操作条件下将实验室已分离出的4株以吡啶为唯一碳源、氮源的优势菌种以10%的接种量接种于150mL吡啶浓度为20mg/L的液体测试培养基中,于30℃ 、180r/min下好氧振荡培养120h,每隔24h测定菌株OD600,确定菌株生长曲线。本周期驯化结束后,将测试培养基中的菌株按10%的接种量接种到富集培养基中培养24h进行富集,再进行新一周期的驯化,持续数周期。然后将底物浓度提高到30mg/L,筛选出适应性较强的菌株继续驯化,通过筛菌过程中对菌株生长曲线的观察以及对吡啶分解利用情况的监测,挑选耐受能力和降解能力最高的菌株作为下一步实验的优势降解菌。

2.4 菌株鉴定

2.4.1 形态及生理生化鉴定

菌株形态观察和生理生化特征实验包括接触酶实验、液化明胶实验、淀粉水解、葡萄糖发酵实验、吲哚试验、乙醇氧化实验、脲酶实验、甲基红实验、V-P实验、温度、pH值实验,操作步骤参照文献[10]。

2.4.2 16SrDNA基因片段分离与序列分析

以TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA作为PCR反应模板,16Sr DNA序列分析采用通用引物[11]:正向引物为27f (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3');反向引物为1492r (5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应体系为模板DNA加2.5μL,上下引物各2.5μL,PCR MasterMix2.5μL,加超纯水至50μL。PCR反应程序:94℃预变性4 min,然后94℃变性30s,52℃退火80s,72℃延伸90s,30个循环。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸8min,使反应产物扩增充分。委托三博远志生物科技有限公司对PCR扩增产物进行测序,测序结果在Gen Bank数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行相似度分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发育树[12,13]。

2.5 正交实验优化菌株吡啶降解性能的方法

在微生物降解过程中,其反应速率限制因素可能包括碳源、DO、pH值、C/N和温度等。李长征等[14]认为影响吡啶降解效果的主要环境因素包括温度、摇床转速、菌种投加量等。孙庆华等[15]利用Shinella Zoogloeoides BC026菌进行吡啶降解实验中指出,初始浓度是影响吡啶降解速率的重要因素。综合考虑前人的研究成果本文选用四因素三水平L9(34)正交表设计实验,L9(34)因素水平表及正交实验结果分别见表1和表3,菌株在各条件下培养96h后测吡啶去除率。

2.6 分析方法

菌体生长吸光度(OD600):采用吸光度法,用721可见分光光度计在光密度为600nm处测吸光度值;

CODcr:采用美国HACH快速测定仪;

pH值:采用9157BN型Thermo Orion pH计。

吡啶浓度以固相微萃取—顶空气相色谱法测定,仪器型号为VARIAN CP-3800气相色谱仪,色谱柱为WARIAN CP-Wax 58(FFAP)CB极性(酸性)色谱柱。分流比10∶1,升温程序∶初始温度40 ℃,保持2min(升温速率 40℃/ min)至140 ℃,保持5min。检测器采取氢火焰 (FID)检测器,检测器温度280 ℃,气化温度200℃, 各气流速:载气N2为2 mL/ min,H2为40 mL/ min,空气为350 mL/min。

水样预处理及固相微萃取方法:从液体测试培养基中取15mL水样于离心管中,12000r/min高速离心10min,将上清液倾出,用0.22μm的水系滤膜过滤,取清液5mL,置于15mL顶空瓶中,加入1.5g氯化钠,立即用聚四氟乙烯垫和帽密封顶空瓶,轻轻摇匀,待氯化钠溶解后放入水浴温度为58℃水浴中,插入固相微萃取头,插入深度为2.5cm,萃取40min后取出针头进样进行色谱分析,解析5min,每两次萃取过程之间将萃取头在250℃下烘烤12min以去除残留。

3 结果与分析

3.1 菌株的驯化与筛选

4株吡啶降解菌经过不同吡啶浓度的液体培养基驯化后,筛选出1株降解能力最强且能以吡啶为唯一碳源、氮源和能源的菌株,命名为PY6,将PY6按10%的接种量接种到初始浓度为30mg/L的液体测试培养基中,30℃ 、180 r/min的条件下好氧振荡培养,经过96h后对吡啶的降解率达到84.12%,可作为下一步实验的优势降解菌。

3.2 PY6的初步鉴定结果

3.2.1 菌株的形态及生理生化特征

菌株PY6在平板培养基上培养2d后观察,菌株特征为淡黄色、湿润、不透明、隆起、表面光滑、边缘整齐。初步鉴定结果为革兰氏阴性,杆状菌(革兰氏染色后菌株PY6的显微照片见图1)。

菌株生理生化试验结果见表2,从结果可以看出该菌株具有接触酶、明胶酶、淀粉酶,在糖代谢过程可将葡萄糖分解为酸性物,分解蛋白胨中的色氨酸,可生成吲哚,可氧化乙醇。

注 F:发酵型;+:阳性; -:阴性

3.2.2 菌株的分子生物学鉴定结果

对提取的菌株模板DNA进行PCR扩增,电泳图结果如图2所示,从图中可以看出约1500bp处出现荧光条带,且无明显拖尾现象,阴性对照无条带,说明反应体系没有被污染。因此,PCR扩增产物能够满足后续测序的要求,利用Blast软件在Gen Bank数据库中进行序列相似性搜索。结合菌株的形态观察、生理生化以及16S rDNA分子生物学鉴定,初步判断菌株PY6为假单胞菌。

M:DNAMarker 1:PY6

3.3 菌株培养条件的优化

由表3对正交实验结果进行分析,发现9组正交实验中有5组实验吡啶去除率均达到了70%以上,可见该菌株的环境适应性良好,同时以吡啶去除率为指标,计算不同因素下各个水平的去除率,以及反映各因素对指标影响大小的极差R。由表3极差分析可以判断出各因素影响的主次顺序为:振荡速度>初始浓度>温度>pH值,振荡速度是影响去除率的主要因素,转速太低使溶解氧浓度偏低,转速太高菌株会因离心力集中成团,减少与吡啶反应的机率;由K(均值)可以看出,对应理论最优条件为:温度=25℃,pH值=6.5,吡啶初始浓度=40 mg/L,摇床转速=160r/min;而表观最优条件为实验组2:温度=25℃,pH值=7.5,吡啶初始浓度=40mg/L,摇床转速=160r/min。

由于表观最优条件不同于理论最优条件,以表观最优条件作为培养条件,对其进行验证实验,结果理论最优条件下吡啶去除率为90.59%,这与表观最优条件结果基本一致,而两个最优条件只有pH值不同,说明pH值对该菌株影响不大,这也与极差分析的结论pH值的影响最弱一致。pH值是废水处理中不易控制的因素,但是所有因素中pH值的影响最小,证明PY6具有潜在的工程推广应用价值。

3.4 降解性能跟踪实验

为了准确描述该菌株对吡啶的降解性能,在吡啶去除率最优的条件即表观最优条件下,对OD600和吡啶浓度进行跟踪测定,结果如图3所示。

由图3可见,随着菌密度增长,吡啶浓度逐渐降低。前24h菌株生长不明显,所以吡啶浓度的降低主要是由于菌株的吸附作用。随后的24h,由于PY6菌暂时处于适应期,菌株密度增长较慢,吡啶浓度的衰减速率也缓慢。在48h后菌株开始适应环境,进入对数生长期,吡啶降解速度加快,在96h,菌密度最大,吡啶去除率达91.2%,随后菌密度下降。有报道[15]认为,由于吡啶的碳氮比为4.3∶1,此时微生物的死亡可能与缺乏碳有关。

4 结语

(1)从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离出1株能以吡啶为唯一的碳源、氮源的高效降解菌,该菌株为革兰氏阴性菌,经16S rDNA序列同源性分析以及部分生理生化反应初步鉴定PY6为假单胞菌。

(2)通过四因素三水平L9(34)正交实验结果发现该菌的环境适应性良好。吡啶初始浓度40 mg/L、25℃、摇床转速160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率达91.64%,因而PY6为1株高效吡啶降解菌。

(3)在吡啶去除率最优的条件下,通过跟踪测定结果发现,PY6菌生长状况良好,吡啶的快速去除过程与菌体的生长过程基本一致,在48h后菌株开始适应环境,进入对数生长期,在96h菌密度最大,吡啶去除率达90%以上。

摘要：从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离筛选出了1株能以吡啶为唯一碳源、氮源的菌株,通过形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列同源性分析对菌株进行了初步鉴定,确定该菌株为假单胞菌,命名为PY6。选用四因素三水平L9(34)正交实验表设计了实验,研究了吡啶初始浓度、温度、摇床转速以及pH值4个因素对菌株PY6降解能力的影响,结果表明:当吡啶初始浓度为40mg/L、温度为25℃、摇床转速为160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率最高,达91.64%,说明此菌株为1株高效吡啶降解菌。

降解菌筛选 篇5

4株苯系物降解菌菌株的筛选鉴定、降解特性及其降解基因研究

分别以苯、甲苯为碳源,从厦门污水处理厂活性污泥中富集筛选获得了2株苯降解菌B1、B2和2株甲苯降解菌J2、J6.16S rRNA基因鉴定结果表明B1、J2属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.),B2、J6属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.).研究表明,这些菌在pH7～10的碱性范围内能很好生长.在以0.1%(V/V)苯或甲苯为唯一碳源的无机盐培养基中,B1、B2菌在72小时内对苯的.降解率分别为67.7%、94.2%,J2、J6菌对甲苯的降解率分别为92.4%、84.8%.简并PCR扩增、序列分析表明,这些菌含有相同的苯双加氧酶基因,表明苯降解基因在这些降解菌中可能存在水平转移.此外,J2,J6两株菌还含有甲苯双加氧酶基因,而且J2能在甲苯浓度为70%(V/V)的LB培养基中生长.这些降解菌在苯、甲苯污染的生物治理中有应用前景.

作 者：王琳 邵宗泽 WANG Lin SHAO Zong-ze  作者单位：国家海洋局第三海洋研究所,海洋生物遗传资源重点实验室,厦门,361005 刊 名：微生物学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA MICROBIOLOGICA SINICA 年，卷(期)： 46(5) 分类号：Q93 关键词：苯系物   生物降解   有机溶剂耐受性   双加氧酶基因  

降解菌筛选 篇6

海洋石油污染已成为一个普遍而严重的问题，对海洋生态环境的危害巨大。目前国际上通行的治理海洋溢油的方法主要分为物理处理方法、化学处理方法和生物修复技术三大类。其中，生物修复技术与传统的物理和化学处理法相比，具有成本低、效果好、无二次污染等优点，特别是对机械装置无法清除的薄油膜而且化学试剂被限制使用时，生物处理溢油的优越性更加显著[2]。而且，石油烃的最终消失要依靠生物降解，微生物群落对石油烃的生物降解是清除污染物的一个主要机制[3]。因此，利用微生物清除海水中石油污染物正日益受到人们的重视。20世纪80年代美国利用生物修复技术成功消除了Exxon Valdez溢油造成的大面积污染，创造了生物修复海洋污染的先例[4]。

许多因素会对石油降解产生影响，如温度、营养盐、接种的菌量等。温度通过影响石油的物理、化学性质、菌株的生化活动、菌群结构来影响石油的生物修复。在一定温度范围内，石油烃降解率随温度升高而升高。对于常温好氧菌来说，最佳的石油降解温度一般在15～30℃之间[5]。营养盐的添加对促进石油烃降解作用很大。如1998年美国油轮在阿拉斯加海峡触礁后，利用添加N和P到沙滩或石滩，而成功加速了土著菌对石油的分解。溢油事故发生后，短时间内土著微生物不会大量增加，因而添加外源高效石油烃降解菌能够提高石油烃降解效率。这些接种的降解菌可以从土著微生物中进行富集，也可以从其他区域获取。

我国海岸线漫长并且有众多港口，海上的石油运输量巨大，海上船舶溢油事故不断增加。而且，我国的港湾多属于内弯，水体交换能力差，更易受石油污染的影响。本研究从大连港表层海水中分离出一株高效的石油降解菌，并对其降解特性进行了研究，以期为我国海洋溢油污染生物修复的应用提供优良菌源和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

实验中用到的培养基主要有MMC液体培养基、2216E液体培养基和2216E琼脂培养基。MMC液体培养基组分:NaCl:24 g;NH4NO3:1.0 g;KCl:0.7 g;KH2PO4:2.0 g;Na2HPO4:7.563 4 g;Mg SO4·7H2O:7.0 g;微量元素;去离子水1 000 m L，调p H值为7.4，在121℃下高压灭菌。2216E液体培养基和2216E琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.2 实验用油

实验所用柴油为市售0#柴油，经0.22μm无菌滤膜过滤后使用。

1.1.3 试剂

各种化学试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 采样

石油污染海水样品采自大连港(地理坐标为121°39'9″E,38°56'14″N)，取表层水样，样品采集后立即装入无菌广口玻璃瓶中，低温保存带回实验室，放入冷藏柜4℃保存。

1.2.2 富集与驯化

于250 m L三角瓶中加入100 m L MMC培养液，高温灭菌，加入海水样品5 m L和灭菌后的柴油1m L。置入生化培养箱，于150 r/min、22℃下振荡培养7 d，然后从中取5 m L培养液加入到100 m L含有高一梯度柴油浓度的MMC培养液中，培养7 d。如此反复培养3次，柴油浓度逐级增加为10、20、30m L/L。以不接种海水样品的MMC培养液做空白对照。

1.2.3 分离与纯化

细菌的分离、纯化采用稀释涂布法和平板划线法。用移液枪(枪头已经灭菌)吸取富集驯化后的培养液l m L，置于9 m L无菌去离子水中，作为10-1稀释液;混匀后，再吸取该试管中的1 m L菌液置于9 m L无菌去离子水中，作为10-2稀释液，以此类推，形成不同浓度梯度的稀释液。然后分别吸取0.1m L的不同稀释度的样品涂布于已经高温灭菌的2216E固体平板上，置入生化培养箱，于22℃下培养直至长出清晰的菌落。挑选生长良好的菌落，在已灭菌平板上分3个区域进行划线。在同样的条件下培养2～3 d，挑取3区具有生长优势的单菌落，进行二次划线分离。反复多次，直到分离出菌落单一的菌株。

1.2.4 生长曲线测定

预先将HD-1接种到2216E液体培养基中，22℃下培养1 d，备用。取盛有100 m L的无菌2216E液体培养液的250 m L的锥形瓶12个，编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。各瓶中依次加入5m L HD-1,22℃下振荡培养。第一天取1号锥形瓶3 m L菌液，用可见光分光光度计，在600 nm条件下测定其吸光度。每隔24 h按序号依次测定菌液的吸光度，直至吸光度数值明显下降。

1.2.5 降解率测定

采用紫外分光光度法。

1.2.6 降解影响因素分析

分别测定温度、初始接菌量、营养盐对石油降解率的影响。

2 结果与讨论

2.1 菌种的分离

在富集驯化的过程中，培养初期，柴油呈一层膜状漂浮在水面上，水相完全澄清，油水完全分离。随着培养时间的延长，培养液开始逐渐变浑浊，柴油被分散成椭圆粒状或层片状，然后逐渐乳化，柴油以液滴的形式分散在液相中。随着培养时间的进一步延长，柴油液滴越来越小，液相中出现絮状沉淀。表明培养液中存在能以柴油为唯一碳源的细菌，培养液中柴油逐渐被降解，同时石油烃降解菌被富集。经过三次富集培养，用2216E平板分离纯化后，从以柴油为唯一碳源的培养液中分离得到14株菌，分别命名为HD-1～HD-14。根据生长速度和数量，从中选出一株优势菌命名为HD-1。HD-1群落外观特征:规则圆形、边缘整齐、乳白色、隆起、光滑、湿润。基于16SrDNA对所分离到的HD-1进行鉴定。鉴定结果表明，HD-1属于α-变形菌纲、厦门栖东海菌属。

2.2 菌种的生长曲线

由图1可知，在前2 d内OD600快速增加，表明2216E液体培养基中石油降解菌浓度急剧上升。经过大约2 d的对数生长期后，虽增长速度放慢，但OD600仍缓慢继续上升，直到第7天，随着培养时间的增加，OD600不再有大的变化，只是在很小的范围内做窄幅波动，表明石油降解菌逐渐进入生长稳定期。第11天，OD600有下降趋势，细菌生长进入衰亡期。

2.3 降解影响因素分析

2.3.1 培养温度的影响对HD-1生长以及柴油降解率的影响

由图2可知，温度在8～22℃之间变化时，HD-1对柴油的降解率随温度的升高而升高，在22℃附近达到最高为:64.8%;同时OD600达到最大值0.61，表明2216E液体培养基中的菌液浓度达到最大值。当温度高于22℃后，降解率随温度升高而有所下降。由此表明，HD-1的最适降解温度约为22℃。温度过低，柴油粘度会随之升高，短链烷烃挥发性下降，石油烃溶解度降低，影响石油降解率对其的利用率;温度太高反而会抑制酶的活性，从而降低石油降解率。

2.3.2 初始接菌量对HD-1生长以及柴油降解率的影响

由图3可知，在接种量为1～10 m L之间时，HD-1菌液对柴油的降解率随菌株接种量的增加而上升，当接种量为10 m L/10 m LMMC时，HD-1降解菌对柴油的降解率达到最大为86.8%。当接菌量为1 m L时，HD-1对柴油的降解率只有64.80%，说明接种量少，细菌的数量增加慢，因此消耗的碳源少，柴油的降解率低。当接菌量增加时，细菌数量快速增加，大量的细菌繁殖消耗较多的碳源，因此柴油的降解率增加。但当接种量为15 m L时，并没有出现随接种量的增加而上升的趋势。主要原因为:接种量过大会使微生物大量生长，营养物质迅速消耗限制细菌的生长和新陈代谢活动，因此柴油降解率有所下降。说明了在石油降解过程中，降解率受接种量的影响较大，并不是投菌量越多越好。

2.3.3 营养盐对HD-1生长和柴油降解率的影响

由图4可知:加入N、P营养盐后，HD-1菌液对石油烃的降解率都较未加营养盐的空白组有所增加。其中加入氮源氯化铵后，HD-1对柴油的降解率达到最大为88.9%，在其他条件相同的情况下，较未加营养盐高24.1%;加入磷源磷酸氢二钠后，HD-1对柴油降解率达到94.9%，在其他条件相同的情况下，较未加营养盐高30.1%。由此可见，HD-1降解菌的最佳N、P营养盐搭配为氯化铵+磷酸氢二钠。

3 结论与展望

目前石油烃降解菌多是从土壤中筛选出来，而从海洋环境筛选的相对较少。随着海域溢油污染风险的加大，以及国内外对石油降解菌研究的逐渐深入，微生物修复石油污染海域成为研究热点。本研究从大连近海岸的石油污染海水中筛选出了14株石油降解菌，并从中选取了一株优势菌(HD-1)进行了研究。通过16SrDNA方法鉴定该菌属于α-变形菌纲、厦门栖东海菌属。采用紫外分光光度计法考察了温度、接种量和营养盐对HD-1降解柴油效率的影响，实验结果表明温度在8～22℃之间变化时，HD-1对柴油的降解率随温度的升高而升高，在22℃附近达到最高为:64.8%;同时OD600达到最大为:0.61。当温度高于22℃后，降解率随温度升高而有所下降;HD-1的生长和柴油降解最佳接种量是10 m L/10 m LMMC;最佳氮源磷源组合为氯化铵+磷酸氢二钠。

研究结果可以为海洋微生物修复提供一定的理论依据和技术支撑，但论文中很多的研究工作还处于初始阶段。而且海洋环境复杂，影响外源降解菌的生长。因此，如何构建适应自然环境条件的石油降解菌剂并进行应用修复等问题还需要进一步研究。

参考文献

[1] Head I M,Jones,D M,Roling W F,et al.Marine microorganisms make a meal of oil.Nat Rev Microbiol,2006;4:173—182

[2] April T M,Foght J M,Currah R S,et al.Hydrocarbon degrading filamentous fungi isolated from flare pit soils in northern and western Canada.Canadian Journal of Microbiology,2000;46(1):38—49

[3] Atlas R M.Microbial degradation of petroleum hydrocarbons:an environmental perspective.Microbiological Reviews,1981;45:180—209

[4] Swannell R P J,Lee K,Mc Donagh M,et al.Field evaluations of marine oil spill bioremediation.Microbiological Reviews,1996;60:342 —365

降解菌筛选 篇7

国内外有很多学者都致力于这方面的研究,以求得更安全、更经济的方法治理溢油污染。通常溢油处理技术有物理处理、化学处理和生物处理。物理方法仅是对石油进行稀释、聚集、迁移,不能彻底清除海洋表面和海水中的溶解油;化学方法是向海水中加入化学药品,容易造成二次污染;生物修复技术是将石油烃进行生物降解后,转化为无毒的水和二氧化碳以及生物自身的生物量,可对石油进行彻底清除[1,2]。生物修复技术相对于其他处理方法而言,费用也较低,经济效益和环境效益俱佳,将成为一种解决复杂环境污染问题的有效方法。[2,3]

本文研究的主要内容是从被污染土壤中分离出来的能够降解石油烃的微生物,通过驯化,优化其降解条件之后,对土壤中的石油烃进行修复,筛选所得到的菌种降解效率也比较高,修复效果好。由于利用生物修复石油烃污染具有无可比拟的优越性,而选育高效石油烃降解菌是修复微生物的重要前提,能为石油污染的治理提供微生物基础,为大规模工业污染的处理提供菌种。因此,本课题具有重要的经济和社会意义。

1 实验方法

1.1 菌种的培养

取四个完全一样的250 mL广口三角瓶,其中一个为空白对照组,标号为0,另外三个为实验组,分别标号1、2、3,在三个实验组中各加入100 mL选择性培养基,120 ℃灭菌15 min,移至净化工作台冷却后,分别取3 g、5 g、7 g污水处理厂取得的污染土样加入1、2、3号250 mL广口三角瓶中,敞口,35 ℃、150 r/min恒温培养摇床中水浴条件下培养5天。

1.2 菌种的筛选

将熔化好并冷却至45~50 ℃的选择性固体培养基分别注入到三个相同的培养皿中(培养皿中注入量为18 mL),三个培养皿也进行编号,分别为1、2、3号。待培养基冷却凝固后,取105 mg/kg的石油烃二氯甲烷300 μL,均匀地涂布在1号培养皿上,以同样的方法涂布2号、3号培养皿,待二氯甲烷挥发后,将三个培养皿倒置,以除去三个培养皿表面的凝结水。将三个培养皿放在培养箱中,24 h后,确定无细菌污染才可以开始后面的实验。分别观察三个250 mL广口三角瓶中溶液的浑浊情况,确定2号为以后的实验组。取2号广口三角瓶中1 mL的菌液,以生理盐水稀释105、106、107倍后,各吸取0.5 mL均匀地涂布在三个培养皿上,每个浓度重复5次,将三个培养皿置于35 ℃的恒温培养箱中培养5天,生长出来的菌就是能够降解石油烃的菌种[4]。

1.3 菌种的驯化

为了使筛选得到的菌种对石油烃的降解效率高些,需要对其进行驯化。以下是驯化步骤:采样二氯甲烷作为增溶剂,配置石油烃含量为10%的二氯甲烷溶液,将该溶液分别加入到4个100 mL的选择性培养基(将4个广口三角瓶进行编号,分别为0、1、2、3,其中0号为空白对照实验)中,使石油烃含量达到300 mg/kg,将从1号、2号、3号培养皿中筛选得到的菌落分别加到1号、2号、3号广口三角瓶中,一一对应。并将4个广口三角瓶敞口,置于35 ℃、150 r/min恒温培养摇床中水浴条件下培养7天。培养结束后,分别从1号、2号、3号这3个三角瓶中各取2 mL菌液移入三个标有1号、2号、3号的石油烃含量为500 mg/kg的选择性培养基中继续培养,培养方式同上次。如此逐步提高培养基中石油烃的含量至8000 mg/kg。

1.4 菌种的鉴定

采用革兰氏染色实验。

染色步骤:

(1)涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用灭菌移液吸头吸取10 μL待检菌液滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将菌液涂布成一层均匀薄层(涂布面不宜过大)。

(2)干燥:将涂布面朝上,手持载玻片两侧,在酒精灯高处小心地微微加热,使水分蒸发。应注意的是,切勿紧靠火焰,液不宜加热过久,以防菌液烤枯而变形。

(3)固定:利用高温,手持载玻片的一端,涂布面向上,在酒精灯火焰出尽快地来回通过2~3 s,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜,一般不超过60 ℃。放置待冷却后,进行染色。

(4)初染: 在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1~2滴,使染色液覆盖涂片,染色约1 min。

(5)水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下,用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。

(6)媒染:用移液器吸取约300 mL的碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1 min。

(7)水洗。

(8)脱色:斜置载玻片,滴加95%的乙醇进行脱色,至流出的乙醇溶液不出现紫色为止,大约20~30 s后进行水洗。

(9)复染:在涂片薄膜上滴加1~2滴复染剂,使染色液覆盖涂片,染色约需1 min。

(10)水洗。

(11)干燥、观察:用吸水纸吸掉水滴,待载玻片干燥后置于显微镜下,用低倍镜观察,发现细菌之后,滴一滴浸油在载玻片上,用油镜观察细菌的形态及颜色。

结果及结论:按照以上步骤重复对1号、2号、3号实验组进行革兰氏染色,结果发现三组细菌的颜色一致呈红色。由此可知,我们筛选所得到的石油烃降解菌为革兰氏阴性菌[5]。

2 石油烃的萃取

2.1 石油烃萃取方法

将菌液放入超声仪超声粉碎后,8000 r/min离心分离,除去上层清夜,用50 mL二氯甲烷反复萃取三次,收集二氯甲烷层,40 ℃旋转蒸发至近干,后转移至比色管中定容至5 mL,待测[6]。

2.2 石油烃降解菌降解效率的测定

我们采用二氯甲烷按上述萃取方法(这种萃取方法的萃取效率一般都在90%以上,效果比较理想)测定石油烃降解菌的降解效率。因此,在将石油烃降解菌应用在工业污水生态修复的实验中,我们还是可以采用该萃取方法,并根据石油烃浓度1000、2000、3000、5000、8000 mg/kg 时的降解率绘制条形图,结果如图1。

3 结论与建议

目前,生物修复特别是微生物修复技术被认为是迄今为止处理石油烃污染比较好的一种方法,而利用微生物修复技术处理石油污染问题的关键是获得高效、稳定、适应性强的石油烃降解微生物[7]。

通过以上研究得到了以下结论:

(1)通过大量的筛选工作,筛选得到高效石油烃降解菌,都能以石油烃为唯一碳源生长,在温度为35 ℃、pH为7.0、微生物接种量为3 mL、N:P=3:5的最佳降解条件下,水浴培养7天后,石油烃的降解率高达85%,处理效果比较理想[8]。

(2)通过菌落的形体观察、生理生化实验,对石油烃降解菌进行了初步分类鉴定,鉴定结果为石油烃降解菌是革兰氏阴性菌。

(3)当石油烃含量大于2000 mg/kg时,随着石油烃含量的增加,石油烃降解菌对石油烃的降解率略有下降;石油烃含量在2000 mg/kg范围内时,随着石油烃含量的增加,石油烃降解菌对石油烃的降解率略有上升[9]。

参考文献

[1]Amund,O.O.The Oil-eating Microbes:A Remedy to the Menace ofOil Pollution[J].Nigeria,2000,27:63-87.

[2]范晓宁.烃降解菌的选育及其对海洋溢油生态修复室内模拟研究[D].青岛:中国海洋大学,2008.

[3]Amund,O.O.,A.G.Adebiyi.Effect of viscosity on the biodegradabili-ty of automotive lubricating oils[J].Tribology Int.,1991,24:235-237.

[4]秦晓.石油降解真菌筛选及其修复效应[D].天津:天津理工大学,2011.

[5]郑立,崔志松,高伟,等.海洋石油降解菌剂在大连溢油污染岸滩修复中的应用研究[J].海洋学报:中文版,2012(3):5.

[6]Black,C.A.Methods of Soil Analysis[J].American Society for Agrono-my(Agronomy No.9 Part 2),1965,54:305-315.

[7]徐冯楠.高效石油解菌的筛选、降解特性分析及应用研究[D].咸阳:西北农林科技大学,2010.

[8]冯晋阳.石油烃优良降解菌的筛选分离及其降解性能的研究[D].西安:西安建筑科技大学,2004.

降解菌筛选 篇8

关键词：粗纤维,稻草,降解

引言

植物体内的纤维素是地球每年接受太阳能量最大的储藏体, 据统计, 全球每年通过光合作用产生的植物高达1.8×1011t, 这些植物所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍。在生物界, 结合于有机体中的炭达27×1010t, 据测算, 植物界中纤维素总量约达26.0×1010t, 而且还在不断更新和积累, 可以说, 纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源[1~3], 我国每年达6亿t以上[4]。稻草是草类纤维原料中纤维较短而细的一种, 其纤维平均长度为1mm左右, 宽度仅8μm左右, 细胞上明显的纹孔或不甚明显的纹孔, 胞腔较小[5]。

利用自然或人工改造的微生物将植物体内纤维素材料转化为可直接利用的液体燃料, 是人类解决过多依赖化石能源的一条重要途径[6~7]。筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。本研究从安徽省某山区树木上分离出一株具有较高粗纤维降解能力菌株, 在好氧状态下, 72h之内, 可以将以上废物中20%以上的粗纤维转化为糖类, 该技术在稻草制造乙醇方面具有较好的工业化应用前景。

1 菌种的选育方法[8~9]

1.1 选育原理

利用纤维素降解菌在刚果红培养基内以CMC-Na为主要炭源, 产生水解圈, 通过观察水解圈的大小的方法进行纤维素降解菌的初步筛选。

利用滤纸条培养基进行纤维素降解菌的复筛, 通过菌株将滤纸条内粗纤维降解为糖类, 通过测定糖类和测定CMC-Na酶活吸光值指示该菌分解粗纤维的能力, 供筛选用。

1.2 培养基的准备

(1) 刚果红培养基

(NH4) 2SO4 (2.0g/L) ;Mg2SO4·7H2O (0.5g/L) ;K2HPO4 (1g/L) ;Na Cl (0.5g/L) ;CMC-Na2g/L;刚果红0.4g/L;琼脂:20g/L;p H:7.0;121℃灭菌30min备用。

(2) PDA培养基

葡萄糖20g;琼脂20g;马铃薯液1000ml;200g马铃薯去皮挖眼切小块入1000ml蒸馏水中煮沸30min, 用纱布过滤后加入葡萄糖和琼脂, 加蒸馏水补足至1000ml。121℃灭菌30min备用。

(3) 筛选培养基

滤纸条若干;蛋白胨 (2.0g/L) ;酵母粉 (2.0g/L) ;无机盐 (100ml/L) ;121℃灭菌30min备用。

(4) 固体培养基

稻糠皮 (10%) ;玉米粉 (4%) ;稻草粉 (52%) ;稻壳酒糟 (32%) ;尿素 (1%) ;酵母粉 (0.4%) ;碳酸钙 (0.3%) ;磷酸二氢钙 (0.3%) 。

1.3 初步筛选步骤

(1) 将样品放入富集培养瓶内进行菌种富集, 37℃下用蒸馏水震荡30min, 150r/min。

(2) 配成10-2、10-3、10-4、10-5, 4个数量级样品。

(3) 每个平板内倒入18ml刚果红培养基。

(4) 用无菌吸管吸取适量菌液均匀涂布于刚果红平板内, 每个数量级做3个平行。

(5) 37℃无菌培养箱培养48h后记录水解圈及菌株生长情况。

1.4 复筛步骤

(1) 利用接种针挑取有水解圈的菌株转入斜面保存, PDA培养基。

(2) 37℃无菌培养箱培养48h。

(3) 挑选长的好的菌株进行摇床培养, 培养基为不加琼脂的PDA培养基。

(4) 纯化, 接入斜面保存, PDA培养基。

(5) 利用接种针将菌株从二次纯化斜面挑入筛选培养基, 进行摇床培养。转速106r/min;30℃。直至某些菌株将滤纸分解完全为止。

(6) 72h后观察筛选培养基内菌种生长情况, 记录实验现象, 以供筛选。

(7) CMC-Na酶活吸光值的测定;离心液中葡萄糖吸光值的测定;连续测3d。

(8) 根据其吸光值的大小, 筛选出酶活吸光值和葡萄糖吸光值较大的菌株。

2 实验方法

(1) 将菌株进行摇床培养扩培。转速106r/min;30℃, 培养基为不加琼脂的PDA培养基。

(2) 稻草和酒糟培养基121℃灭菌30min备用。

(3) 按菌液:稻草和酒糟培养基为1:100进行喷洒接种, 并且调节好干湿比。

(4) 30℃培养箱好氧培养72h;每日翻堆2~3次。

(5) 根据国家标准《饲料中粗纤维测定方法》 (GBT6434-2006) 测定原样和降解样品中粗纤维的含量, 计算粗纤维降解率。

3 酶活及含葡萄糖量吸光值的测定[10~11]

3.1 CMC-Na酶活吸光值的测定

(1) 取筛选培养基培养液4ml于离心管中4000r/min, 离心5min, 上清液为粗酶液。

(2) 取0.5ml离心液, 加入1%CMC-Na溶液2ml。

(3) 放入50℃水浴锅中糖化30min。

(4) 取出后加入2.5ml DNS试剂, 沸水浴10min, 冷水浴3min。

(5) 用722N分光光度计比色, 550nm, 1cm比色杯。

(6) 同样方法做空白。

3.2 离心液中葡萄糖含量吸光值的测定

(1) 取筛选培养基培养液4ml于小离心管中4000r/min, 离心5min, 上清液为粗酶液。

(2) 取离心液3ml倒入试管。

(3) 加入5ml DNS试剂, 沸水浴10min, 冷水浴3min。

(4) 用722N分光光度计比色, 550nm, 1cm比色杯。

(5) 同样方法做空白。

4 实验结果

小结:CMC-Na酶活吸光值为负值, 可能是取样较少, 导致酶活检测不出, 由于酶活随时间变化较大, 该吸光值在本研究仅作为各个菌株之间的比较, 数据供筛选用。当取样较多时, 葡萄糖吸光值可以测出, 通过显色反应, 指示出某菌株将滤纸中粗纤维降解为葡萄糖的量, 供筛选菌株借鉴用。

小结:从15个样品中各个数据和实验现象等因素综合考虑, 2号样品的降解滤纸和利用滤纸中粗纤维能力最强, 选定2号菌作为纤维素降解菌培养。

小结:通过实验观察, 原样品粗纤维呈现条状亮晶状, 颗粒较大, 半透明。降解后样品的粗纤维呈现毛屑状, 深色, 主要以絮状形态存在, 初步判断属于半降解态, 如果降解时间延长, 其粗纤维含量有望进一步降低。

5 结论

(1) 通过形态分析, 确定2号菌属霉菌, 好氧。

(2) 2号菌具有较强的粗纤维降解能力, 实验研究表明, 以高温灭菌后的固体培养基为降解对象, 在好氧状态下, 72h, 可以将以上物料中20%以上的粗纤维转化为糖类, 该技术在稻草制造乙醇方面具有较好的工业化应用前景。

(3) 纤维素降解菌的筛分过程中, 不能仅依靠水解圈的大小作为筛选的依据, 2号菌的水解圈并不是很大, 多数细菌水解圈的大小是它的若干倍, 但是, 其真正的降解能力确是很低的, 所以, 在筛选纤维素降解菌时, 不能够仅凭水解圈大小来进行挑选。

(4) 通过测定酶活和糖的分光光度值的大小来筛分纤维素降解菌具有一定的借鉴意义, 但该菌的最终降解能力也不能够完全据此判断, 不同菌体生长速度不同, 其降解纤维素的能力差别很大, 所以不能够完全依赖其酶活和糖类多寡判断。

(5) 最终确定应当看其最终降解滤纸粗纤维的能力大小, 包括将滤纸物理形态的破坏能力, 破坏后滤纸的形态如何, 是否分解或仅仅改变物理形态, 基本的化学组成是否发生改变等等。

6 展望

通过实验可初步确定2号菌株具有较好的实际应用前景, 比如可以与其它菌株配伍, 制成相关固体废物处理的生物制品或利用其产生纤维素酶较好的优势作为相关酶制剂的微生物, 也可以在2号菌株的基础上构建纤维素分解工程菌, 拓宽其应用领域和功能, 可以在印染、制药、制乙醇、工农业废水治理等领域得到应用。

参考文献

[1]吴明生.物工程学-过去现在未来[M].上海:知识出版社, 1989.

[2]李国学, 张福锁.固体废物堆肥化与有机复混肥生产[M].北京:化学工业出版社, 2000.

[3]邬义明.植物纤维化学 (第二版) [M].北京:中国轻工业出版社, 1991.

[4]顿宝庆, 等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J]中国农业科技导报, 2008, 10 (1) :113~117.

[5]王兰芬.纤维素酶的作用机理及开发应用[J].酿酒科技, 1997, 84 (6) :16~17.

[6]Katharine S.US biofuels a field in ferment[J].Nature, 2006, 444:673~676.

[7]Goldemberg J.Ethanol for a sustainable energy future[J].Science, 2007, 315:808~810.

[8]刘德海, 等.饲用纤维素酶活力测定方法的探讨[J].饲料工业, 2002, 23 (4) :34~35.

[9]肖舸.绿色木霉的筛选与产纤维素酶发酵条件优化及部分酶学性质研究[D].四川大学, 2004.

[10]陈展.秸秆堆肥中纤维素降解菌的筛选及组合[D].中国农业大学, 2005.

降解菌筛选 篇9

1 方法

1.1 降解菌株的分离与筛选

土样采自胜利油田污染土壤, 利用石油原油作为唯一碳源的基本培养基进行菌株的分离与筛选, 并对筛选的菌株利用划线分离的方法进行菌株的纯化, 在纯化过程中, 始终保持以石油原油作为唯一碳源。

1.2 降解菌株的鉴定

对筛选的菌株进行显微镜形态学观察、培养皿观察以及生理生化实验进行鉴定[4]。

1.3 石油吸收波峰测定

利用紫外分光光度计, 在200～600 nm处, 进行光谱扫描, 确定石油的最高吸收峰。

1.4 菌株对石油降解能力的测定

在基本培养基中加入足量的石油, 稍微加热使其充分溶解, 取中层溶液做成石油饱和液。取适量加入比色皿中, 扫描测出石油饱和液的吸收峰, 然后, 挑取菌落加入石油饱和液中, 在37℃振荡箱中振荡培养。分别测量0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 h的由1.3中确定的石油吸收波长下的吸收峰值。以未接种石油降解菌的为阴性对照[5]。

2 结果与分析

2.1 通过以石油为唯一碳源的基本培养基进行分离, 并纯化后, 得到一株石油降解菌, 生长良好, 编号为X1。

2.2 对X1形态观察及部分生理生化性状鉴定结果 (见表1) 表明:该菌株X1属于假单胞菌属 (Pseudomonas sp.)

2.3 通过对石油的光谱扫描, 发现在211 nm处的 石油吸收峰最大。

注:表1中“+”表示为阳性, “—”表示为阴性。

2.4 通过分光光度计在不同时段进行211 nm和600 nm处吸光度值的测定结果 (见表2, 图1) 表明:随着菌悬液的加入, 其溶液在211 nm处吸光度值逐渐减小, 在2 h降至阴性对照的80%, 在6 h降至阴性对照值的58%, 在10 h降至阴性对照值的31%, 这说明石油混合液中211 nm处具有吸收峰的物质正在逐渐降解, 而600 nm处的吸光度值代表菌悬液中X1的生长情况, 从中我们可以看出, 随着时间的推移, 其值符合基本的细菌生长曲线, 而且与211 nm处吸光值的降低成对应关系。这说明石油混合液中物质的降解是由X1的作用引起的。菌X1具有一定的石油降解能力。

3 结论与讨论

本实验通过富集培养基进行富集, 筛选分离并纯化得到一株石油降解菌, 对其基本的生理生化指示进行鉴定, 并确定为假单胞菌属。经过紫外分光光度计进行分析其降解能力, 发现其具有一定的降解石油的能力。

下一步应对菌株X1采用诱变等实验手段进行降解性能的提高, 对其降解的底物范围进行分析, 弄清其对石油烃类进行降解的途径, 并对其进行室内的模拟驱油和降解试验, 为具体的应用打下基础。

摘要：从胜利油田污染土壤中分离纯化得到石油降解菌, 并对其部分性状及生理生化特性进行了实验研究。经鉴定该菌株属于假单胞菌属, 能够以石油作为唯一碳源生长。通过光谱扫描200600 nm范围内石油的吸光度确定在211 nm处石油有较高吸收峰。通过测量不同时间段菌的悬浮液在600 nm和211 nm处的吸光度, 结果表明随着菌的生长211 nm处的吸收峰显著下降。这表明该菌能以石油为碳源且降解能力较强。

关键词：石油降解菌,分离,纯化

参考文献

[1]王晓娟, 金樑, 顾宗镰.机油降解菌的筛选及其降解能力的研究[J].复旦学报 (自然科学版) , 2001, 40 (5) :562-567.

[2]Vecchioli G I, Del Panno M T, Painceira M T.Use of selectedautochthonous soil bacteria to enhance degradation of hydro-carbons in soil[J].Environmental Pollution, 1990, 67 (3) :24-258.

[3]叶小梅, 常志州, 朱万宝, 等.调理剂对污泥中石油降解速率的影响[J].环境导报, 1999 (2) :21-22.

[4]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京:科学出版社, 1978:1-57.

一株纤维素降解菌的筛选与鉴定 篇10

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源。

样品取自重庆市缙云山落叶覆盖的腐殖层土壤。

1.1.2 培养基。

LB培养基、刚果红培养基[3]、羧甲基纤维素培养基[4]。

1.2 试验方法

1.2.1 纤维素降解菌的初筛和纯化。纤维素降解菌的初筛和纯化按照卢月霞等[5]的方法进行。

1.2.2 纤维素降解菌的复筛。

分别将纯化后的单菌落点样于刚果红培养基中,每个平板点1个菌种,且只点3个样,降解圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小可以直接反应纤维素酶活的相对大小[6]。因此,筛选降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落,即为纤维素高效降解菌,用CMC培养基作斜面培养,4℃保存。

1.2.3 16s rRNA测序。

使用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒对纤维素降解菌进行基因DNA提取,以此为模板,以通用引物8F和1495R进行PCR扩增16s rRNA。PCR体系为:D.W 14.5μL,Buffer(Mg2+free)2.5μL,Mg2+1.5μL,d NTP 2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,模板2μL,Taq酶2 U。反应条件:95℃预变性5 min,94℃变性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环,扩增结束后72℃延伸10min。扩增后的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳(100 V,30min)进行分析,将在1000~2000 bp出现较亮条带的样品送去宝生物公司进行测序。

1.2.4 纤维素酶酶活的测定。

按照李慧君等[7]的方法进行粗酶的提取,同时通过DNS显色检测酶活,葡萄糖标准曲线的绘制以及酶活的检测具体操作参照GB 20287-2006[8]。酶活力单位(U):1 mL原样酶液,1 min产生1μg葡萄糖定义为1个酶活力单位。

1.2.5 降解菌培养条件的优化。

研究不用培养温度、pH值、碳源、氮源对其产酶的影响,并在各因子最适条件下培养该菌,检测其产酶酶活。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选与纯化

经过初筛,得到12株具有降解能力的菌株,再经过复筛得到5株较强降解能力的菌株,其中以菌株X10的降解能力最强,初步判断该菌为纤维素降解菌。菌株X10点样培养后透明降解圈如图1所示(经过1 mol/L HCl处理呈蓝紫色),测定其D∶d=2∶21。

2.2 测序结果

经过对该菌的16s r RNA测序,测得其序列。通过在GENBALK中使用BLAST进行对比,可见该菌和氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)有99%的同源性,可判断该菌属于氧化微杆菌。

2.3 纤维素酶活的测定

测得每8 h的粗酶CMC酶活曲线如图2所示。可见在40 h的时候酶活达到最大,酶活值为51.59 U。

2.4 降解菌培养条件的优化

2.4.1 培养温度对产酶的影响。

将菌株X10分别接种于5个150 mL的羧甲基纤维素培养基中,并分别在25、30、35、40、45℃下培养,40 h后,测定其CMC酶活,结果如图3所示。可以看出,当温度为30℃时,酶活最高。因此,30℃为该菌产酶的最适温度。

2.4.2 培养起始pH对产酶的影响。

将菌株X10分别接种于5个150 mL羧甲基纤维素培养基中,并将其起始pH值分别调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。培养40 h后,测定其CMC酶活,结果如图4所示。可以看出,当pH值为7.5时,酶活最高。因此,7.5为该菌产酶的最适pH值。

2.4.3 不同碳源对产酶的影响。

分别以CMC-Na、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、葡萄糖+CMC-Na、葡萄糖+微晶纤维素、蔗糖+CMC-Na、蔗糖+微晶纤维素为碳源,添加量均为2%,培养纤维素降解菌。40 h后,测定其CMC酶活,结果如图5所示。可以看出,以葡萄糖+微晶纤维素为碳源的酶活最高,因此,该组合碳源为该菌产酶的最适碳源。同时可以看出,含有蔗糖的碳源,无论是单一的蔗糖还是含蔗糖的组合碳源,酶活都是0,可见蔗糖对该菌产酶或生长可能具有抑制作用。

2.4.4 不同氮源对产酶的影响。

分别以0.2%的蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨+牛肉膏、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、酵母浸粉+NH4NO3、尿素为氮源,添加量均为0.2%,培养菌株。40 h后,测定其CMC酶活,结果如图6所示。可以看出,该菌对有机氮的利用强于对无机氮的利用。在有机氮源中以蛋白胨+牛肉膏组合为最佳,同时发现无机氮中以尿素最差,其酶活为0,可见,尿素对该菌产酶或生长可能也具有抑制作用。因此,该菌产酶的最适氮源为蛋白胨+牛肉膏复合组合。

2.5 在最适条件下培养该菌

根据以上结果,配制以葡萄糖+微晶纤维素(1∶1)为碳源,以蛋白胨+牛肉膏(1∶1)为氮源的培养基,pH值7.5,并在最适温度30℃的条件下培养40 h,测得其酶活达到了67.44 U。

3 结论

通过对落叶腐殖质层土壤进行富集筛选,筛到12株具有降解纤维素功能的菌株,并以降解能力最强的X10菌株作为研究对象,进行分子鉴定以及产酶优化,最后以各因子最佳的优化培养基培养X10菌株,测得其CMC酶活可达67.44 U。该菌经过测序鉴定为氧化微杆菌属,目前多有研究表明该属细菌具有降解多环芳烃化合物及脱硫能力[9,10],但很少有文章显示该属具有降解纤维素的能力。在试验过程中发现该菌生长较快,40 h即可到达稳定期,其酶活也到达最大值。相比之下,该菌纤维素降解酶酶活较高。若进一步诱导,可能获得具有更高酶活的菌株,用以发酵产酶,可以节约发酵时间,提高产量。

参考文献

[1]MIYAZAKI T,OIKAWA N.Studies on fungal polysaccharide,XII.Water-soluble polysaccharide of Grifola umbellate(Fr.)pilat[J].Chem PharmBull,1973,21(11):2545-2548.

[2]靳振江.纤维素酶降解纤维素的研究进展[J].广西农业科学,2007,38(2):127-130.

[3]叶姜瑜.一种纤维素分解菌鉴别培养基[J].微生物学通报,1997,24(4):251-252.

[4]齐海萍,胡文忠,范圣第,等.纤维素酶产生菌的筛选[J].江苏农业科学,2010(3):420-422.

[5]卢月霞,宋惠月,刘凯南,等.一株纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化[J].湖北农业科学,2010,49(1):95-97.

[6]陈敏.一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基[J].杭州师范学院学报:自然科学版,2001,18(5):11-12.

[7]李慧君,杜双田,孙婷,等.纤维素分解菌的筛选及玉米秸秆降解[J].西北农业学报,2010,19(8):74-79.

[8]国家标准化管理委员会,中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB20287-2006农用微生物菌剂[S].北京:中国标准出版社,2006.

[9]王春明,李大平,王春莲.微杆菌3-28对萘、菲、蒽、芘的降解[J].应用与环境生物学报,2009,15(3):361-366.