高效苯酚降解菌研究

高效苯酚降解菌研究（精选7篇）

高效苯酚降解菌研究 篇1

摘要：为从黑龙化工厂废弃排污口处污泥处得到高效降酚菌株,并对其降酚特性进行研究。以苯酚为唯一碳源的无机盐培养液进行驯化培养得到6种降酚菌株,从中得到具有较高效耐酚性的菌株,并进行降解特性研究。测定苯酚浓度并计算苯酚降解率在25℃时,BF-2的苯酚降解率达到顶峰,为89.7%,BF-4的苯酚降解率最低,仅为65.5%。pH值为7时,BF-2的苯酚降解率效果最为理想,为78.0%;BF-4的降解效果最差,苯酚降解率为58.0%。BF-2在苯酚浓度为100mg/L时苯酚降解率高达93.3%,在苯酚浓度升至为2200mg/L时,BF-2对苯酚的降解率降至39.6%;此时,BF-4的降解率仅为15.2%。经研究菌株的最佳降解条件为接种量为20%、pH值等于7、温度为25℃,并筛选得到具有高效降酚能力菌株并命名为BF-2。

关键词：苯酚,降解率,温度,筛选,pH值

引言

石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。未经净化的含酚废水可导致水源被污染,致使鱼类死亡,危害农作物,最终威胁人类的健康。许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。目前,国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物,处理方法无2次污染且安全、经济。目前,已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌(Pseudonomonas.sp)[3]、芽孢杆菌(Bacillus.sp)[4]、酵母菌(Yeast trichosporon)[5]、根瘤菌(Rhizobia)[6]、醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)[7]等,降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选,得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株,进一步测定苯酚降解的影响因素。对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。

1 实验材料和方法

1.1 菌株来源

采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。

1.2 培养基

基础培养基:Na Cl 5.0g/L,蛋白胨10g/L,琼脂15~20g/L,酵母浸膏5.0g/L,调节p H为7.0。

以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基:Ca Cl20.1 g/L,Fe SO4.7H2O 0.01 g/L,K2HPO40.5g/L,Mn SO4.7H2O 0.05 g/L,Na Cl 0.2 g/L,KH2PO40.5g/L,Mg SO4.H2O 0.01 g/L,NH4NO31.0g/L苯酚按实验需要量添加,调节p H为7.0[8]。

富集培养基:葡萄糖10.0g/L,营养琼脂33.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,调节p H为7.5。

1.3 研究内容与方法

1.3.1 菌株和的驯化和分离

在超净工作台中,将10m L含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿,取10 g污泥加90m L蒸馏水搅拌15min,静置5min后取上层清液为菌原液[8]。取1m L菌原液加入无菌水中分别制成100、10-1、10-2、10-3、10-4等梯度的菌液,然后分别从各菌液试管中取1m L用涂布法接种于基础培养基平板上。在p H值为7、25℃情况下培养24~48h。挑取单一菌落于富集培养基平板上划线、扩繁。编号,将平板置于25℃的恒温培养箱中培养24~48h后放于4℃冰箱保存。依据革兰氏染色进行微生物鉴定。

1.3.2 降酚菌的筛选

将OD(吸光度)为600的单一菌株,按20%(体积分数)的接种量接入无机盐培养基中,筛选同一时间内对苯酚降解能力最强的作为优势菌株。

1.3.3 培养温度对菌株降酚能力的影响

在p H值为7时,蘸取适量的菌液涂布培养与生化培养箱中调节温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。24h后测定苯酚浓度计算苯酚降解率。

1.3.4 培养p H值对菌株降酚能力的影响

将菌液以20%的量接种于苯酚浓度为1000mg/L的无机盐培养基中,培养条件为28℃、270 r/min,调节p H值为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,研究p H值对菌株降酚能力的影响。24h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率。

1.3.5 底物浓度对菌株降酚能力的影响

将菌液以20%的量分别接种于苯酚浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.2g/L的富集培养基中,培养条件为270 r/min、28℃、p H值7,比较菌株在苯酚浓度不同时对苯酚降解率的影响,24 h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率[9]。

1.3.6 接种量对菌株降酚能力的影响

设置菌株接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%,菌株培养条件为p H值为7、270r/min、28℃、底物浓度为1000mg/L、装液量50m L,24h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率。

1.4 分析测定方法

分析温度、接种量、p H值及底物浓度等因素对该苯酚降解菌降解性能的影响。采用4-氨基安替吡林分光光度法测量苯酚浓度。苯酚的降解率由式(1)计算[10]。

降解率(%)=(1-处理后体系中苯酚浓度/体系中苯酚浓度)×100%(1)

2 结果与讨论

2.1 降解菌的初步鉴定

对得到苯酚降解菌株进行初步鉴定,并分别命名为BF-1、BF-2、BF-3、BF-4、BF-5、BF-6,其中BF-2菌株生长速度最快在培养基上直径达到89.1mm(平板直径90mm),BF-4菌株生长速度最慢在培养基上直径为56.4mm。镜检为革兰氏阴性菌,单个细胞呈杆状,细胞单个或数个连接。(见表1)。

2.2 温度对苯酚降解菌降解性能的影响

不同温度下苯酚降解菌的降解率见图1。比较不同温度下菌株的降解率,可以发现菌株在温度在25~40℃时,随着温度的升高,苯酚降解率逐渐降低。在25℃时6株菌株的苯酚降解效果均达到最佳。

其中,BF-2的苯酚降解率最高,达到89.7%,BF-4的苯酚降解率最低,为65.5%。在培养温度为30~40℃时,菌株的降解能力逐渐减弱,40℃时BF-2的降解率降为57.6%,此时BF-1的苯酚降解率最低,为49.1。根据数据分析得出:菌株最佳苯酚降解温度为25℃。

2.3 p H值对苯酚降解菌降解性能的影响

不同p H值下苯酚降解菌的降解率见图2,培养48h,仅BF-6在p H值为8.0时苯酚降解效率达到最高,为71.4%,其余菌株均在p H值为7.0时对苯酚的降解率达到最大,此时,BF-2的降解效果最好,苯酚降解率达78.0%;BF-4的降解效果最差,苯酚降解率为58.0%。在p H值为5.0和9.0时由于酸性和碱性过强导致酶蛋白变性从而失活,使细菌生长迟缓,降酚能力减弱。由此可见中性或弱碱性环境更有利于苯酚降解菌对苯酚的降解。根据实验数据分析得出:苯酚降解菌最适降解p H值为7.0或偏碱性。

2.4 底物浓度对苯酚降解菌降解性能的影响

不同底物浓度在降解24h后苯酚降解菌的降解率见图3,在苯酚浓度为100~2200mg/L时,BF-2的降解效果是6株菌株中最好的。BF-2在苯酚浓度为100mg/L时苯酚降解率高达93.3%;此时,BF-4的苯酚降解率最低,为67.5%。在苯酚浓度为2200mg/L时,BF-2对苯酚的降解率降至39.6%;此时,BF-4的降解率仅为15.2%。根据实验数据分析得出:随着苯酚浓度的升高,苯酚降解率逐渐降低。

2.5 接种量对苯酚降解菌降解性能的影响

接种量对苯酚降解率的影响见图4。接种量在5%~20%时,菌株对苯酚的降解能力随接种量的增加而逐渐增大。在接种量等于20%时,6株菌株对苯酚的降解率均在此时达到最大。其中,BF-2的降解效果最佳,降解率为91.5%;BF-3的降解效果最差,降解率为67.7%。当接种量为20%~30%时,菌株对苯酚的降解率逐渐下降。以上结果说明,过多的增加投菌量不但会降低降解速率,且造成资源浪费,而适当增加投菌量,有利于快速去除水体中的苯酚,即应该按科学比例投加苯酚降解菌。

3 结论

从原黑龙化工厂废弃排污口处采集污泥,分离、筛选出以苯酚为唯一碳源的高效降解菌株,经研究菌株对不同的p H值、温度、苯酚浓度、接种量的适应能力。得出以下结论:降酚菌可以将100mg/L及以下的苯酚高效降解,在温度为25℃、p H为中性或弱碱性、接种量为20%的条件下对苯酚的去除效率最高,在苯酚浓度达至1200mg/L时仍有一定的降解效果。考虑各种环境因素,运用到实际中应充分考虑实际情况,进一步提高含酚废水的处理效率,充分发挥高效降酚菌在解决实际问题中的作用。因此在苯酚降解菌株的筛选中,不仅需要具有高产能力的菌株,更需要能够在短时间中达到最大降解率的菌株。即对于筛选出的高效耐酚菌株还要进一步的探究,以便缩短达到最大降解率所需的时间和提高降酚菌的活力。

参考文献

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高效苯酚降解菌研究 篇2

摘要：用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐驯化液对沈阳某煤气厂土壤进行驯化培养,从中分离筛选到1株苯酚降解菌,编号为MW-1.该菌株最高可耐受1600 mg/L苯酚,其降解性能研究表明:该菌具有较强的苯酚降解能力,在30℃,pH 5.5～7.5,装液量为60 mL,接种量20%,摇床振荡速度120 r/min的条件下,振荡培养6 h后可使400mg/L的苯酚降解率达80%以上.虽然葡萄糖对该菌体的生长及降解苯酚均有一定的抑制作用,但有葡萄糖(600 mg/L)存在的`情况下,该菌对苯酚的降解率仍接近60%.这对处理含有其它碳源的含酚废水具有一定的意义.作 者：刘长风 刘桂萍 刘学贵 张月澜 王丽多 LIU Chang-feng LIU Gui-ping LIU Xue-gui ZHANG Yue-lan WANG Li-duo 作者单位：刘长风,LIU Chang-feng(东北大学,资源与土木工程学院,辽宁,沈阳,110004;沈阳化工学院,环境与生物工程学院,辽宁,沈阳,110142)

刘桂萍,刘学贵,张月澜,王丽多,LIU Gui-ping,LIU Xue-gui,ZHANG Yue-lan,WANG Li-duo(沈阳化工学院,环境与生物工程学院,辽宁,沈阳,110142)

高效苯酚降解菌的分离与降解特性 篇3

人的苯酚口服致死量报道不一, LD为2～15g或MLD为140mg/kg。国外报道酚液污染皮肤面积达25%, 血酚浓度为0.74mmol/L, 10分钟死亡。酚类会对人类的身心健康造成危害, 毒害其他生物, 破坏了生态系统的稳定性, 故我国及其他国家都将其列入重点污染物名单。目前研究人员已获得的降酚菌包括真养产碱杆菌 (Alcaligenes eutrophus) [2]、醋酸钙不动杆菌 (A.calcoaceticus) [3]、藻类 (Alga Ochromonas danica) [4]、根瘤菌 (Rhizobia) [5]、假单胞菌 (Pseudonomonassp.) [6]、酵母菌 (Yeast Trichosporon cutaneum) [7]等苯酚降解菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

佳木斯黑龙化工厂排污口。

1.1.2 培养基

(1) 富集培养基:

蛋白胨5.0g, 牛肉膏1.5g, NaCl 1.5g, 污水1000mL, 琼脂15.0g, pH 7.0～7.2, 培养基在1×105Pa灭菌15min后备用。然后将浓度为10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5的土样溶液接种到富集培养基上, 培养48h后观察。

(2) 选择培养基[1]:

KNO34.0g, NaCl 5.0g, 琼脂15.0g, 污水1000mL, pH 7.0～7.2, 1×105Pa灭菌15min。待冷却后加入15.0mL经过灭菌处理的不同浓度的苯酚溶液制成固体培养基, 然后用平板涂布法接种, 等3天后观察菌的长势情况, 观察和记录。

1.2 实验方法

1.2.1 高效苯酚降解菌的富集与驯化

菌种的富集与驯化采用一次性加入大剂量化合物的方法[8]。将菌种在无菌条件下接种到20mL细菌富集固体培养基中, 25℃培养箱中培养48h后, 挑拣长势好的菌体分别接种于苯酚含量为50mg/L和100mg/L的细菌驯化固体培养基中, 置于培养箱中培养48h。共驯化5个周期, 同时苯酚浓度由0.15、0.20、0.25g/L浓度梯度逐渐递增到0.75g/L。与此同时选用摇床培养作为参考[9]。

1.2.2 高效苯酚降解菌的分离筛选及鉴定

(1) 分离和纯化:

待降解菌长势稳定后用平板划线法, 挑取单菌落进行细菌的分离, 反复纯化5次后, 将培养的纯种菌种接种至斜面培养基上继续培养。

(2) 菌种筛选:

划线法挑取少量的单一菌落分离出单一的降解菌继续培养待鉴定, 并将其编号1、2、3、4、5、6、7。

(3) 菌种鉴定:

①用接种环挑取少量菌落接种于鉴别培养基, 25℃恒温培养48h后观察并记录。②细菌的简单染色实验和革兰氏染色实验见文献[10]。

2 主要环境因子对高效菌生长剂降解苯酚能力的影响

2.1 pH值对降解菌的影响

将筛选出的7株抗性菌分离出来, 用筛选培养基分别培养。将他们分别接种到不同pH值的固体培养基上, pH值的梯度分别为6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6, 以此获得降解菌的最适pH值, 培养48小时后观察并记录。

2.2 苯酚初始浓度的影响

将用选择培养基扩大培养的生长状况良好的待测的各种菌体分离出来, 用筛选培养基培养分离得到的各种菌, 无菌条件下用划线法将纯菌落接种到固体培养基上。将得到的菌体用更高浓度的苯酚培养基驯化以待变异成更具降解能力的降解菌, 与此同时将得到的苯酚降解菌配成无机盐菌悬液, 按12mL的接种量接到pH7.2, 苯酚初始浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75g/L的培养基中, 于110r/min、25℃摇床振荡培养, 48h后测培养基的吸光度及计算残余的苯酚浓度。

3 结果与分析

3.1 结果

3.1.1 筛选出7株降解能力强的菌株对苯酚都有一定的点适应性, 且对苯酚有很强的降解能力, 其0.5g/L和0.65g/L浓度的苯酚降解率达到90%以上, 最大苯酚降解浓度达到0.70g/L。

3.1.2 通过对这7株菌在不同温度、pH值、以及不同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察, 确定了这7株菌的最适pH值为7.2, 最适生长温度为25℃, 最大可降解苯酚浓度为0.70g/L。

3.1.3 在低温下生物降解苯酚的代谢基质中若加一些有机碳源或无机盐可以促进降解作用, 如葡萄糖、硫酸铵, 硫酸铵对低温条件下苯酚的微生物降解具有促进作用, 可以考虑在菌群驯化和低温苯酚类降解过程中添加一些。

3.2 分析

由于工农业迅猛发展, 同时对含酚废水的配方监管漏洞, 如今含酚废水的不合理排放污染了水资源, 严重影响了人们的身心健康, 并已成为城市可持续发展道路上的障碍。水是生命之源, 由于水循环过程又污染了整个生态系统, 进而威胁到人类的生存质量, 由此改善水污染环境已迫在眉睫。目前虽然含酚污水的研究很广泛, 但对高浓度含酚污水的研究仍有深度可挖, 因此必须在排水之前将其浓度降低稀释, 利用生物法处理含酚废水。此方法危害, 经济, 效率高。因此抗性菌的特性即利用价值受到重视, 利用抗性菌高效率的降解苯酚的能力净化废水、保护环境, 对维持可持续发展有极其深远的意义。

黑龙化工厂地处松花江上游, 其沿岸区域有大面积农作物种植区, 利用松花江水进行灌溉, 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害作用, 同时人们适用后有毒物质在人体内富集, 进而对人体有直接或潜在的威胁。借以东北地区特有的寒冷气候, 苯酚降解菌的研究也对将来大面积的低温微生物的研究提供了参考资料。

参考文献

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[8]任源, 吴超飞, 等.苯胺分离菌的驯化筛选研究[J].环境科学研究, 1998, 4 (11) :4-26

高效苯酚降解菌研究 篇4

为了探索高效菌应用于工程中降解高浓度焦化废水的有效方法,投加HENGJIE高效混合菌制剂和作为载体的粉末活性炭于OAO2工艺中,进行中试试验.试验结果表明:此方法可以很好地固定高效菌,对未经稀释的高浓度焦化废水进行直接处理.在水里停留时间为84 h,进水COD浓度平均值为5435.7 mg/L时,出水COD浓度为369.3 mg/L,COD去除率为93.17%;进水NH3-N浓度平均值为67.80 mg/L,出水NH3-N浓度为1.04 mg/L,NH3-N去除率为98.18%.色度为100～200倍.除COD与色度外,其他检测项目均可达到一级排放标准.菌剂一次投加,投菌量小,操作简单,适合工程应用.

作 者：张洪起 李立敏 李柳 徐军富 ZHANG Hong-qi LI Li-min LI Liu XU Jun-fu  作者单位：张洪起,ZHANG Hong-qi(河北工业大学,教务处,天津,300130)

李立敏,LI Li-min(河北工业大学,教务处,天津,300130;石家庄焦化集团有限责任公司,河北,050031)

李柳,LI Liu(石家庄焦化集团有限责任公司,河北,050031)

徐军富,XU Jun-fu(宁波恒洁水处理工程有限公司,浙江,315800)

刊 名：河北工业大学学报  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HEBEI UNIVERSITY OF TECHNOLOGY 年，卷(期)： 35(6) 分类号：X703 关键词：粉末活性炭   高效菌   焦化废水   O1AO2工艺  

高效苯酚降解菌研究 篇5

关键词：镰刀菌,对氯苯酚,降解动力学

氯酚类化合物(CPs)广泛用作木材防腐剂、防锈剂、杀菌剂和除草剂等,大量的CPs污染物进入环境,对人体健康和自然生态系统造成危害[1]。CPs被美国环保局列入优先控制污染物名单[2]。目前对含CPs废水的处理主要采用光催化氧化、电催化等高级氧化法,成本较高,容易产生二次污染,因此用生物法降解CPs成为人们日益关注的焦点。目前CPs的生物降解主要集中在对细菌的研究上[3,4],而用真菌降解CPs的报道不多。细菌对生长环境要求较高,对重金属尤其敏感,而真菌则对环境重金属具有较强的忍耐性及解毒作用[5],在实际废水处理中有更高的实用价值。本实验室筛选出一株镰刀菌HJ01,经研究表明对一些偶氮染料和苯酚都有很好的降解效果[6,7,8]。

本工作采用实验室筛选的一株镰刀菌HJ01作为降解菌,以对氯苯酚(4-CP)为目标物,探讨了镰刀菌HJ01对4-CP的降解性能,并对降解动力学和降解机理进行初步研究。

1 实验部分

1.1 实验材料

镰刀菌HJ01,本实验室自行分离[9]。

马铃薯培养基[10]。

无机盐液体培养基:MgSO4·7H2O 0.5 g,ZnSO4·7H2O 0.01 g,FeSO4·7H2O 0.1 g,MnSO4·H2O 0.01 g,CaCl2 0.1 g,NH4Cl 0.25 g,CuSO4·5H2O 0.05 g,蒸馏水1 000 mL。无机盐固体培养基:在液体培养基中加入质量分数为2%的琼脂。

1.2 试剂和仪器

实验用试剂均为分析纯。

UV2450PC型紫外-可见分光光度计:日本岛津公司;DGG-9123A型电热干燥箱:上海森信实验仪器有限公司;DHZ-DA型恒温振荡器:太仓市实验设备厂;SW-CJ-1F型单人净化工作台:苏州净化设备有限公司;TitraMate20型pH测定仪:梅特勒托利多公司。

1.3 菌种驯化及菌悬液的配制

将4℃斜面保存的镰刀菌HJ01菌种于25℃下活化24 h后接种到4-CP质量浓度为50 mg/L的马铃薯培养基上。在25℃恒温培养箱中培养10 d,10 d后平板上出现丰富的白色菌落,将其先后接种到4-CP质量浓度为50 mg/L和100 mg/L的无机盐固体培养基上,分别培养7 d,然后刮取菌落用蒸馏水配成菌悬液,控制菌悬液浓度使其在600 nm处的吸光度约为1.0。

1.4 4-CP的降解实验

取1 mL菌悬液接种于25 mL 4-CP初始质量浓度为50 mg/L的无机盐液体培养基中,用6 mol/L盐酸和10 mol/L NaOH溶液调节pH,加入一定量蔗糖为外加碳源,在100 r/min下进行培养。每间隔24 h取样10 mL,于5 000 r/min下离心10 min后取上清液1 mL测定4-CP质量浓度。将剩余物摇匀后倒回培养液,继续培养。

1.5 分析方法

采用4-氨基安替比林法测定4-CP质量浓度[11]。

菌体生长量测定:用两层中速滤纸真空过滤培养液,收集菌体,用蒸馏水洗3次后在恒温干燥箱中105℃下干燥24 h,再在干燥器中冷却至恒重,以滤纸的质量净增加量作为菌体的干重,换算为单位体积培养液菌体干重即为菌体生长量。

2 结果与讨论

2.1 蔗糖质量浓度对菌体生长量和4-CP质量浓度的影响

在降解温度为30℃、初始pH为7的条件下,蔗糖质量浓度对菌体生长量和4-CP质量浓度的影响见图1和图2。由图1和图2可见:在以4-CP为惟一碳源和能源生长的情况下,4-CP在8 d内降解完全,菌体生长量达0.72 mg/L;在蔗糖质量浓度为3 g/L的条件下,4-CP在6 d内降解完全,菌体生长量达2.55 mg/L;在蔗糖质量浓度为5 g/L的条件下,4-CP在8d内降解完全,菌体生长量达2.31 g/L。在没有外加碳源的情况下,因为4-CP的抑制作用,菌体生长较为缓慢,后期4-CP被逐渐降解,体系中4-CP质量浓度下降,菌体生长速率和4-CP降解速率加快;外加蔗糖后,菌体生长量明显要高于以4-CP为惟一碳源时的生长量,但过量的蔗糖又会对菌体的生长起到抑制作用。这表明镰刀菌HJ01对碳源有一定的选择作用,实验确定最佳蔗糖质量浓度为3 g/L。

2.2 降解温度对4-CP质量浓度的影响

在蔗糖质量浓度为3 g/L、初始pH为8的条件下,降解温度对4-CP质量浓度的影响见图3。由图3可见,降解温度为25～35℃时,4-CP都能在8 d内降解完全。降解温度的变化对4-CP的降解并没有太大影响,最终选择30℃为最佳的降解温度。

2.3 初始pH对4-CP质量浓度的影响

在蔗糖质量浓度为3 g/L,降解温度为30℃的条件下,初始pH对4-CP质量浓度的影响见图4。由图4可见:初始pH为6,7,8时,4-CP在7 d内降解完全;初始pH为2,4,10时,4-CP在8d内都不能降解完全。这说明在酸性和碱性条件下均会抑制镰刀菌HJ01对4-CP的降解,故实验选取最佳初始pH为8。

初始pH:●2;■4;▲6;◆7;○8;□10

2.4 4-CP的降解动力学

以4-CP为惟一碳源和能源时,镰刀菌HJ01菌体的生长和4-CP的降解开始比较缓慢,而后期随着4-CP质量浓度的下降,HJ01菌生长速率及4-CP降解速率明显加快,这说明对于镰刀菌HJ01来说,4-CP是一种抑制型底物,其降解动力学可以用Haldane模型来分析[12],Haldane模型见式(1)、式(2)和式(3)。

式中:μ为菌体比生长速率,d-1;μA为类似于菌体最大比生长速率的常数,d-1;ρs为4-CP质量浓度,mg/L;Ks为半速率常数,mg/L;Ki为底物抑制系数,mg/L;t为降解时间,d;Q为菌体生长量,mg/L;Y为菌体的收率,%。

用matlab软件拟合以4-CP为惟一碳源时的实验数据结果,菌体生长量和4-CP质量浓度拟合曲线见图5。由图5可见,Haldane模型能够较好地反映镰刀菌HJ01在以4-CP为惟一碳源时的生长和4-CP降解情况。拟合结果为μA=0.857 d-1,Y=14.5%,Ks=0.58 mg/L,Ki=180 mg/L。

外加蔗糖条件下的4-CP降解动力学可用一级动力学方程表示,方程见式(4)。

式中:K为降解速率常数,d-1。由图2中蔗糖质量浓度为3 g/L的4-CP降解数据进行拟合,拟合结果为K=0.506 6 d-1,r=0.967 4,基本符合一级动力学模型。

2.5 4-CP降解产物的紫外-可见光谱

以4-CP为惟一碳源时4-CP降解产物的紫外-可见光谱图见图6。由图6可见,随降解时间逐渐延长,4-CP的特征峰逐渐消失,同时没有出现新的特征峰,这表明在降解过程中4-CP分子中的苯环结构被打破,4-CP可被完全降解。镰刀菌HJ01降解4-CP的具体途径还需进一步研究。

3 结论

a)镰刀菌HJ01能以4-CP为惟一碳源和能源生长;外加蔗糖作为碳源可提高镰刀菌HJ01的生长速率和4-CP的降解速率。镰刀菌HJ01降解4-CP的最佳实验条件为:蔗糖质量浓度3 g/L,初始pH 8,降解温度30℃。

b)在以4-CP为惟一碳源时HJ01菌的生长和4-CP降解动力学符合Haldane模型;在外加蔗糖作为碳源时,4-CP的降解动力学基本符合一级动力学模型。

c) 4-CP降解产物的紫外-可见光谱图表明,降解过程中4-CP分子中的苯环结构被打破,4-CP可被完全降解。

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高效苯酚降解菌研究 篇6

氮杂环化合物广泛存在于焦化、医药、染料、食品加工和农药等工业废水中,在焦化废水中占40%左右,而且大都是有毒且难降解的有机物,不易受代谢过程的破坏,对生态系统和人类健康会产生潜在的长期危害[1,2,3,4]。吡啶是目前氮杂环化合物中开发与应用范围最广的化合物之一,是重要的工业原料,对神经有致毒作用,水溶性和扩散性好。由于其毒性大,具有致畸、致癌和难生物降解等特点,致使传统生物处理方法对其降解效果不佳[5],因此筛选高效稳定的专属降解菌成为国内外研究的热点[6,7,8,9]。

本研究从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离得到了一株吡啶降解菌,对其进行性能测试和菌株鉴定,并选用四因素三水平L9(34)正交试验对其进行培养条件优化,得到最佳培养条件,为含吡啶废水的生物强化处理提供了新菌株材料及其基本特性参数。

2 材料与方法

2.1 菌源

从处理吗啉废水SBR反应器(进水COD浓度2466mg/L,TN为435mg/L, COD和TN去除率分别稳定于90.12%和76.41%左右)里驯化成熟的活性污泥中筛选出的能以吡啶为唯一碳源、氮源的4株优势菌种。

2.2 培养基

(1)富集培养基:

(NH4)SO4,0.47g/L;KH2PO4,1g/L;FeCl2·4H2O,1.058g/L;CaCl2,0.094g/L;MgSO4,0.489g/L;柠檬酸三钠,5.1g/L;pH值7.0～7.5。

(2)液体测试培养基:

KH2PO4, 2g;MgSO4·7H2O,0.04g;FeCl3.6H2O, 0.004g;10mL相应浓度的吡啶储备液定容至1000mL,调pH值至7.0,121℃高温灭菌20min,待放凉加入10mL浓度为2000mg/L(3000mg/L)的吡啶储备液,此时培养基浓度为20mg/L(30mg/L)。

(3)吡啶储备液:

移取2.00g(3.00g)相对密度为0.98(20℃)的吡啶至1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容。此时吡啶储备液的浓度为2000mg/L(3000mg/L)。

2.3 吡啶降解菌株的富集驯化

取250mL锥形瓶,在无菌操作条件下将实验室已分离出的4株以吡啶为唯一碳源、氮源的优势菌种以10%的接种量接种于150mL吡啶浓度为20mg/L的液体测试培养基中,于30℃ 、180r/min下好氧振荡培养120h,每隔24h测定菌株OD600,确定菌株生长曲线。本周期驯化结束后,将测试培养基中的菌株按10%的接种量接种到富集培养基中培养24h进行富集,再进行新一周期的驯化,持续数周期。然后将底物浓度提高到30mg/L,筛选出适应性较强的菌株继续驯化,通过筛菌过程中对菌株生长曲线的观察以及对吡啶分解利用情况的监测,挑选耐受能力和降解能力最高的菌株作为下一步实验的优势降解菌。

2.4 菌株鉴定

2.4.1 形态及生理生化鉴定

菌株形态观察和生理生化特征实验包括接触酶实验、液化明胶实验、淀粉水解、葡萄糖发酵实验、吲哚试验、乙醇氧化实验、脲酶实验、甲基红实验、V-P实验、温度、pH值实验,操作步骤参照文献[10]。

2.4.2 16SrDNA基因片段分离与序列分析

以TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA作为PCR反应模板,16Sr DNA序列分析采用通用引物[11]:正向引物为27f (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3');反向引物为1492r (5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应体系为模板DNA加2.5μL,上下引物各2.5μL,PCR MasterMix2.5μL,加超纯水至50μL。PCR反应程序:94℃预变性4 min,然后94℃变性30s,52℃退火80s,72℃延伸90s,30个循环。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸8min,使反应产物扩增充分。委托三博远志生物科技有限公司对PCR扩增产物进行测序,测序结果在Gen Bank数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行相似度分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发育树[12,13]。

2.5 正交实验优化菌株吡啶降解性能的方法

在微生物降解过程中,其反应速率限制因素可能包括碳源、DO、pH值、C/N和温度等。李长征等[14]认为影响吡啶降解效果的主要环境因素包括温度、摇床转速、菌种投加量等。孙庆华等[15]利用Shinella Zoogloeoides BC026菌进行吡啶降解实验中指出,初始浓度是影响吡啶降解速率的重要因素。综合考虑前人的研究成果本文选用四因素三水平L9(34)正交表设计实验,L9(34)因素水平表及正交实验结果分别见表1和表3,菌株在各条件下培养96h后测吡啶去除率。

2.6 分析方法

菌体生长吸光度(OD600):采用吸光度法,用721可见分光光度计在光密度为600nm处测吸光度值;

CODcr:采用美国HACH快速测定仪;

pH值:采用9157BN型Thermo Orion pH计。

吡啶浓度以固相微萃取—顶空气相色谱法测定,仪器型号为VARIAN CP-3800气相色谱仪,色谱柱为WARIAN CP-Wax 58(FFAP)CB极性(酸性)色谱柱。分流比10∶1,升温程序∶初始温度40 ℃,保持2min(升温速率 40℃/ min)至140 ℃,保持5min。检测器采取氢火焰 (FID)检测器,检测器温度280 ℃,气化温度200℃, 各气流速:载气N2为2 mL/ min,H2为40 mL/ min,空气为350 mL/min。

水样预处理及固相微萃取方法:从液体测试培养基中取15mL水样于离心管中,12000r/min高速离心10min,将上清液倾出,用0.22μm的水系滤膜过滤,取清液5mL,置于15mL顶空瓶中,加入1.5g氯化钠,立即用聚四氟乙烯垫和帽密封顶空瓶,轻轻摇匀,待氯化钠溶解后放入水浴温度为58℃水浴中,插入固相微萃取头,插入深度为2.5cm,萃取40min后取出针头进样进行色谱分析,解析5min,每两次萃取过程之间将萃取头在250℃下烘烤12min以去除残留。

3 结果与分析

3.1 菌株的驯化与筛选

4株吡啶降解菌经过不同吡啶浓度的液体培养基驯化后,筛选出1株降解能力最强且能以吡啶为唯一碳源、氮源和能源的菌株,命名为PY6,将PY6按10%的接种量接种到初始浓度为30mg/L的液体测试培养基中,30℃ 、180 r/min的条件下好氧振荡培养,经过96h后对吡啶的降解率达到84.12%,可作为下一步实验的优势降解菌。

3.2 PY6的初步鉴定结果

3.2.1 菌株的形态及生理生化特征

菌株PY6在平板培养基上培养2d后观察,菌株特征为淡黄色、湿润、不透明、隆起、表面光滑、边缘整齐。初步鉴定结果为革兰氏阴性,杆状菌(革兰氏染色后菌株PY6的显微照片见图1)。

菌株生理生化试验结果见表2,从结果可以看出该菌株具有接触酶、明胶酶、淀粉酶,在糖代谢过程可将葡萄糖分解为酸性物,分解蛋白胨中的色氨酸,可生成吲哚,可氧化乙醇。

注 F:发酵型;+:阳性; -:阴性

3.2.2 菌株的分子生物学鉴定结果

对提取的菌株模板DNA进行PCR扩增,电泳图结果如图2所示,从图中可以看出约1500bp处出现荧光条带,且无明显拖尾现象,阴性对照无条带,说明反应体系没有被污染。因此,PCR扩增产物能够满足后续测序的要求,利用Blast软件在Gen Bank数据库中进行序列相似性搜索。结合菌株的形态观察、生理生化以及16S rDNA分子生物学鉴定,初步判断菌株PY6为假单胞菌。

M:DNAMarker 1:PY6

3.3 菌株培养条件的优化

由表3对正交实验结果进行分析,发现9组正交实验中有5组实验吡啶去除率均达到了70%以上,可见该菌株的环境适应性良好,同时以吡啶去除率为指标,计算不同因素下各个水平的去除率,以及反映各因素对指标影响大小的极差R。由表3极差分析可以判断出各因素影响的主次顺序为:振荡速度>初始浓度>温度>pH值,振荡速度是影响去除率的主要因素,转速太低使溶解氧浓度偏低,转速太高菌株会因离心力集中成团,减少与吡啶反应的机率;由K(均值)可以看出,对应理论最优条件为:温度=25℃,pH值=6.5,吡啶初始浓度=40 mg/L,摇床转速=160r/min;而表观最优条件为实验组2:温度=25℃,pH值=7.5,吡啶初始浓度=40mg/L,摇床转速=160r/min。

由于表观最优条件不同于理论最优条件,以表观最优条件作为培养条件,对其进行验证实验,结果理论最优条件下吡啶去除率为90.59%,这与表观最优条件结果基本一致,而两个最优条件只有pH值不同,说明pH值对该菌株影响不大,这也与极差分析的结论pH值的影响最弱一致。pH值是废水处理中不易控制的因素,但是所有因素中pH值的影响最小,证明PY6具有潜在的工程推广应用价值。

3.4 降解性能跟踪实验

为了准确描述该菌株对吡啶的降解性能,在吡啶去除率最优的条件即表观最优条件下,对OD600和吡啶浓度进行跟踪测定,结果如图3所示。

由图3可见,随着菌密度增长,吡啶浓度逐渐降低。前24h菌株生长不明显,所以吡啶浓度的降低主要是由于菌株的吸附作用。随后的24h,由于PY6菌暂时处于适应期,菌株密度增长较慢,吡啶浓度的衰减速率也缓慢。在48h后菌株开始适应环境,进入对数生长期,吡啶降解速度加快,在96h,菌密度最大,吡啶去除率达91.2%,随后菌密度下降。有报道[15]认为,由于吡啶的碳氮比为4.3∶1,此时微生物的死亡可能与缺乏碳有关。

4 结语

(1)从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离出1株能以吡啶为唯一的碳源、氮源的高效降解菌,该菌株为革兰氏阴性菌,经16S rDNA序列同源性分析以及部分生理生化反应初步鉴定PY6为假单胞菌。

(2)通过四因素三水平L9(34)正交实验结果发现该菌的环境适应性良好。吡啶初始浓度40 mg/L、25℃、摇床转速160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率达91.64%,因而PY6为1株高效吡啶降解菌。

(3)在吡啶去除率最优的条件下,通过跟踪测定结果发现,PY6菌生长状况良好,吡啶的快速去除过程与菌体的生长过程基本一致,在48h后菌株开始适应环境,进入对数生长期,在96h菌密度最大,吡啶去除率达90%以上。

摘要：从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离筛选出了1株能以吡啶为唯一碳源、氮源的菌株,通过形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列同源性分析对菌株进行了初步鉴定,确定该菌株为假单胞菌,命名为PY6。选用四因素三水平L9(34)正交实验表设计了实验,研究了吡啶初始浓度、温度、摇床转速以及pH值4个因素对菌株PY6降解能力的影响,结果表明:当吡啶初始浓度为40mg/L、温度为25℃、摇床转速为160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率最高,达91.64%,说明此菌株为1株高效吡啶降解菌。

高效苯酚降解菌研究 篇7

本研究从生产辛酰溴苯腈农药厂污水处理池的活性污泥中分离筛选出一株能够以辛酰溴苯腈为唯一碳源生长并将其快速降解的高效降解菌, 并经过鉴定为不动杆菌属 (Acinetobacter sp.) , 命名为XB2, 并对其进行了降解效果研究, 以期为在实践中利用微生物消除环境中辛酰溴苯腈的污染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

无机盐培养基 (g·L-1) :Na Cl 1.0, (NH4) 2SO41.0, KH2PO40.5, K2HPO41.5, Mg SO4·7H2O 0.2, 去离子水补足至1000m L, p H7.0。

LB培养基 (g·L-1) :Na Cl 10.0, 蛋白胨10.0, 酵母粉5.0, p H7.0;添加质量分数为2%的琼脂即为固体培养基。

富集分离培养基:无机盐培养基中添加辛酰溴苯腈储备液作为唯一碳源, 浓度视要求添加, 添加质量分数为2%的琼脂即为固体培养基。

辛酰溴苯腈 (纯度≥97%) 购自江苏苏州某农药厂。使用前将辛酰溴苯睛原药溶于丙酮溶液并过滤除菌, 试验按所需浓度添加到各培养基中。二氯甲烷、丙酮为分析纯, 甲醇为色谱纯, 购自Sigma公司。活性污泥取自江苏苏州某农药厂的污水处理池。

1.2 辛酰溴苯腈含量的测定

取待测定辛酰溴苯睛无机盐培养基, 加等体积二氯甲烷, 振荡萃取后取下层有机相过无水硫酸钠柱, 紫外扫描。再利用液相色谱仪进一步定量, 待二氯甲烷吹干后, 加入甲醇 (色谱纯) 重新溶解, 经0.45μm有机滤膜过滤, 采用高效液相色谱法测定, 测定条件如下:ultimate C18 (2μm, 250mm×4.6mm) 色谱柱, 流速1.0m L/min;流动相:甲醇 (色谱纯) , 经0.45μm滤膜过滤, 并用超声波清洗器脱气30min;检测波长229nm, 进样体积20μL, 采用外标法按峰面积定量。

1.3 降解菌株的富集、分离与纯化

取农药厂污水处理池中的活性污泥5g, 加入到100m L辛酰溴苯腈浓度为100mg·L-1的无机盐培养基中, 30℃、160r·min-1条件下培养, 每隔5d以5% (体积分数, 下同) 的接种量接入到新鲜富集分离培养基中, 连续转接4次。富集液经紫外扫描仪和液相色谱法测定, 富集培养液经测定降解效果达90%以上的富集液, 即为有活性的富集液。取1m L活性富集液作梯度稀释, 用无菌水分别稀释到10-2~10-6五个梯度, 取稀释过的液体各0.2m L涂布于300mg·L-1无机盐固体培养基平板上, 30℃培养, 挑取单菌落划线分离纯化。纯化后的菌株转接至加有100mg·L-1辛酰溴苯腈的无机盐培养基中, 30℃、160r·min-1摇床培养5d后检测其降解效果。

1.4 降解菌株的鉴定

1.4.1 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定

将降解菌株采用平板涂布法接种于LB固体培养基上, 30℃恒温培养48h后观察菌落形态。并用光学显微镜观察菌体形态, 降解菌的鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[4]和《Bergey’s manual of determinative bacteriology》[5]进行。

1.4.2 降解菌株16Sr RNA基因序列测定与分析

采用SDS高盐沉淀法[6]提取菌体总DNA。提取菌体总DNA作为模板, 进行16Sr RNA基因扩增。16S r RNA基因采用通用引物[7]进行PCR扩增, 上游引物为5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′ (Escherichia coli bases 8 to 27) , 下游引物为5′-TAC-CTTGTTACGACTT-3′ (Escherichia coli bases 1507 to 1492) 。采用PCR回收试剂盒回收目的片段, 将回收的DNA酶连到T载体上。参照《精编分子生物学指南》[8]进行质粒DNA的小量提取, 提取的质粒进行验证, 将质粒正确的转化子送至测序公司。测序结果通过在线分析, 与Ez Taxon server 2.1基因库中已有的16S r RNA基因序列进行同源性比较, 并构建系统发育树。

1.5 含辛酰溴苯睛废水的生物处理

取农药厂含辛酰溴苯睛废水200m L, 加入100m L的去离子水, 再加入20m L的5倍浓度的无机盐培养基, 调节p H至7.0, 按10%的体积分数接入降解菌株XB2种子液, 在30℃、160r·min-1摇床培养7d, 测定辛酰溴苯睛残留量。

2 结果与分析

2.1 降解菌株的分离筛选及降解效果验证

通过多次富集转接, 得到降解效果明显的富集液, 从该富集液中, 分离纯化得到一株能以辛酰溴苯腈为唯一碳源生长的菌株, 命名为XB2, 降解辛酰溴苯腈的效果如图1所示, 通过HPLC测定, 经过XB2处理后辛酰溴苯腈含量由100mg·L-1降为3.28mg·L-1, 降解率高达96%以上, 降解效果显著。

2.2 菌株XB2的生理生化特征及系统发育定位

注:+为阳性反应;-为阴性反应。

测序结果显示扩增所得的16Sr RNA总共1496个碱基, 登录号是HM149349。发现菌株XB2与Acinetobacter calcoaceticus同源性为99%。根据生理生化结果及序列特征, 菌株XB2被鉴定为Acinetobacter sp., 其系统发育树见图2。

2.3 菌株XB2处理含辛酰溴苯睛的废水

由于高浓度的辛酰溴苯睛对菌株具有一定毒性抑制其生长, 所以对辛酰溴苯睛废水进行了稀释, 再把菌株接种到废水中进行处理。实验结果表明, 经过稀释处理后的废水, 辛酰溴苯睛的去除效果良好。在经过稀释处理后的含辛酰溴苯睛浓度为100mg·L-1的工业废水中, 加入一定体积的无机盐培养基, 接种10%体积的菌株XB2培养7d后, 辛酰溴苯睛的残留量为7.22mg·L-1, 去除率达到92.78%, 所以菌株XB2在含辛酰溴苯睛的工业废水的生物处理中具有很好的应用潜力。

3 结论

(1) 通过富集培养, 获得一株能以辛酰溴苯睛为唯一碳源的降解菌株XB2, 运用16S r RNA基因扩增和Blastn软件分析等方法, XB2菌株初步鉴定为不动杆菌属 (Acinetobacter sp.) 。该菌株为革兰氏阴性菌。不动杆菌属 (Acinetobacter) 是一种比较常见的微生物[9~10], 广泛存在于土壤和水体中。

(2) 经过辛酰溴苯睛降解菌株XB2处理后辛酰溴苯腈含量由100mg·L-1降为3.28mg·L-1, 降解率高达96%以上, 降解效果显著。

(3) 废水小试实验表明, 在经过稀释处理后的含辛酰溴苯睛浓度为100mg·L-1的工业废水中, 加入一定体积的无机盐培养基, 接种10%体积的菌株XB2培养7d后, 辛酰溴苯睛的去除率达到92.78%, 所以菌株XB2在含辛酰溴苯睛的工业废水的生物处理中具有很好的应用潜力。

摘要：本研究从生产辛酰溴苯腈农药厂废水处理池中污泥中经过富集、分离、筛选得到一株能以辛酰溴苯腈为唯一碳源生长的菌株, 根据表型特征、生理生化特性, 结合16SrRNA基因序列同源性比较, 将菌株初步鉴定为不动杆菌属 (Acinetobacter sp.) , 命名为XB2。在辛酰溴苯睛最终浓度为100mg·L-1的工业废水经菌株XB2处理7d后, 辛酰溴苯睛的去除率达到92.78%, 说明菌株XB2在废水处理中具有很好的应用前景。

关键词：辛酰溴苯睛,不动杆菌属,分离鉴定

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