自动降解（通用7篇）
自动降解 篇1
0 引言
出凝血疾病在血液系统疾病中属于常见病,较难诊治。随着科技的发展,出凝血疾病的检测技术也由传统的手工检测逐渐演变成半自动或全自动的机器检测。Sysmex CS-5100全自动血凝仪(以下简称“Sysmex CS-5100血凝仪”)是日本Sysmex公司生产的全自动血凝分析仪,配置高端,检测速度快。该仪器检测纤维蛋白(原)降解产物(FDP)的方法是免疫比浊法。为了更好地服务于临床,笔者对该仪器检测FDP进行了性能评价,现报道如下。
1 材料和方法
1.1 检测仪器和试剂
检测仪器采用日本Sysmex公司提供的全自动血凝仪,型号:CS-5100,并采用与Sysmex CS-5100血凝仪配套的试剂(INNOVANCE)、质控品、校准品。试剂规格及批号分别为R1(稀释缓冲液:2×5.0 ml,批号为560154)、R2(乳胶试剂:2×5.0 ml,批号为560355)。
1.2 标本来源
随机选取门诊及住院患者60例,每人采集1份血液标本,其中抗凝管采用枸橼酸钠管。从临床住院患者样本中选取阳性指标血红蛋白(Hb)、胆红素(TBi L)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)样本作为抗干扰物。
1.3 精密度评价
精密度评价采用的样本为高、低值质控品,批号为150981,由厂家提供。方法:将厂家提供的室内高、低2个水平质控品各分装成5份,冷冻储存于冰箱备用。选择连续的5个工作日,每天开机保养后检查质控品;每份检查4次,记录其检查结果,从而分析仪器的精密度。其中,同一批号试剂盒的检测结果作为批内评价,不同批号试剂盒的检测结果作为批间评价。然后作统计分析,采用统计指标x軃±s、变异系数(cofficient of variation,CV)评价批内、批间精密度。
1.4 相关性分析
相关性分析采用的参照仪器是Sysmex CA-1500全自动血凝仪(以下简称“Sysmex CA-1500血凝仪”)。方法:选择门诊及住院患者60例,每人采集1份血液样本,分别在Sysmex CS-5100血凝仪和Sysmex CA-1500血凝仪上检测2次,取平均值,并对检测数据进行线性回归分析。对计量资料进行t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
1.5 分析测量范围
以EP6-A文件[1]的相关标准及要求作为参照,选择本院多发外伤患者(FDP浓度为75.2 mg/L)作为高值样本并进行分析测量范围验证。倍比稀释按照100%、75%、50%、25%、0%分配,对每个稀释度测定2次,并取平均值,得出y=ax+b,验证该仪器检测FDP的线性范围。如果每个检测的线性偏离在允许误差范围内,则该方法检测所达到的浓度区间即为分析测量范围。本评价要求a值在1±0.1内,r值应不小于0.990。
1.6 临床可报告范围
选取高、低、中3个水平(L1、L2、L3)的样本,先分别按照1∶10、1∶8、1∶5、1∶2稀释倍数进行倍比稀释,再通过检测得到测量值与预测值,从而求回收率。回收率的可接受范围为90%~110%。根据灵敏度和最大稀释倍数确定临床可报告范围。
1.7 抗干扰实验
从常规检测样本中选取阳性标本作为干扰物,配置其浓度分别为10.0 g/L Hb、141 mmol/L TBi L、10.4 mmol/L TG、16.8 mmol/L TC。干扰物样本按照100%、80%、60%、40%、20%依次倍比稀释,倍比稀释后的干扰物质与待测血浆按1∶9混合制作成干扰血浆,将每一个干扰血浆检测2次并取平均值,计算影响度。影响度(%)=(干扰血浆检测结果-原始结果)/原始血浆×100%。影响度在±10%范围内达标。
2 结果
2.1 批内和批间精密度评价
FDP试剂盒的性能指标要求(厂家提供):试剂盒批内瓶间差CV<5%,试剂盒的批间差CV<15%。其评价结果均达到了要求(见表1)。
2.2 相关性分析评价
60份样本的对比检测结果显示,t=2.35,P=0.103,差异无统计学意义(P>0.05)。Sysmex CS-5100血凝仪与Sysmex CA-1500血凝仪在检测FDP指标上具有良好的相关性,斜率a=1.104,截距b=0.080,r=0.986。
2.3 分析测量范围评价
通过倍比稀释、系列检测后观察相关系数r,结果显示:当稀释度分别为100%、75%、50%、25%、0%时,其均值为80.02%、61.13%、42.16%、21.05%、0%,a值为0.971,相关系数r为0.996。即Sysmex CS-5100血凝仪检测FDP的线性范围为0~80 mg/L,实验结果符合要求。
2.4 临床可报告范围评价
观察检测结果,稀释回收率最接近于100%的稀释倍数为1∶8,即该分析仪检测FDP的最大稀释倍数。根据该分析仪的分析测量范围和检测灵敏度(2.0 mg/L)则可确定Sysmex CS-5100血凝仪的临床可报告范围为2.0~640 mg/L(见表2)。
注:*为当稀释倍数为1∶8时,回收率最接近100%
2.5 抗干扰实验评价
从实验结果中可以看出,随着干扰物浓度的增加,影响度也会随之升高。但在实验配置的浓度下,影响度均在±10%之内,说明干扰物在该浓度下不会影响FDP的检测结果(见表3)。
3 讨论
随着社会环境的恶化和饮食条件的改变,出凝血相关疾病发病率在逐年上升。原发性或继发性纤溶亢进病在临床并不少见,而FDP与D-二聚体检测是该病的最重要的诊断指标。医院实验室检测FDP与D-二聚体基本上依赖血凝仪。因此,对该类仪器进行分析性能评价是临床检验质量管理的重要内容[2,3,4,5,6]。
注:“0”浓度是指理论上干扰物浓度为零,即未添加干扰物,亦可称之为空白;每种干扰血浆各浓度的影响度凡在±10%之内,均为合格
关于血凝仪性能评价的文献报道较多,大部分是对其检测性能方面的报道[7,8,9]。本文研究了Sysmex CA-1500血凝仪利用免疫比浊法检测FDP的性能评价,验证了该仪器检测FDP的可靠性和准确性,以便更好地服务于临床。研究结果显示:(1)免疫比浊法检测FDP的批内和批间CV值均在15%之内。(2)在检测FDP方面,Sysmex CS-5100血凝仪和Sysmex CA-1500血凝仪具有良好的相关性(P=0.103,r=0.935)。(3)在Sysmex CS-5100血凝仪检测FDP的线性范围为0~80 mg/L的基础上,1∶8为检测FDP的最适稀释倍数,临床可报告范围为2.0~640 mg/L,可以满足临床由于骨伤引起FDP数值较高的患者。(4)4种干扰血浆影响度均小于±10%,说明Sysmex CS-5100血凝仪检测FDP结果真实可靠,不会受实验选取的干扰物质的影响。
综上所述,Sysmex CS-5100血凝仪的性能较好,能够保证检验结果的质量。但从长久使用来看,检测人员只有规范操作,并定期按照保养手册对仪器进行常规保养,才能保证分析仪的正常运行。
参考文献
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氯嘧磺隆降解菌降解效果研究 篇2
20世纪90年代以来部分地区大面积使用氯嘧磺隆，连续多年使用在土壤中持续积累，在轮作农田中不仅对后茬敏感作物造成严重药害，导致作物减产甚至绝产，而且还可能对土壤环境造成污染。如何清除土壤中长残留的除草剂，解决残留药害是当前世界研究的重要课题。
氯嘧磺隆在酸性和中性土壤中的降解主要靠微生物降解和化学水解;在碱性土壤中，微生物的降解起主要作用[7,8,9]。随着生物技术的迅猛发展，应用微生物进行生物修复己成为环境修复的一个重要内容。现通过筛选氯嘧磺隆降解菌并研究其降解效果，旨在为氯嘧磺隆残留的生物治理提供一条有效途径。
1 材料与方法
1．1材料
从长期使用氯嘧磺隆的大豆田取土，利用限定性培养富集获得氯嘧磺降解菌。
供试水稻品种为垦鉴稻12;试验药剂有氯嘧磺隆20%可湿性粉剂(沈阳化工研究院试验厂生产)。
培养基为无机盐培养基：K2HPO4·7H2O1.6g、KH2PO4 0.4g、MgSO4·7H2O 0.06g、Fe2(SO4)30.03 g、CaCl20.01 g、CuSO40.05mg、ZnSO40.05 mg、NH4Cl 1.0g、HBO30.03mg、琼脂15g、蒸馏水1 000mL。
1．2方法
1．2．1降解菌的富集
取多年施用氯嘧磺隆的土壤用无菌水溶解稀释得到土壤悬浊液，将135mL的富集培养基加入250 mL的三角瓶中(氯嘧磺隆浓度为1g·L-1)，并按10%的接种量接种土壤悬液，置37℃、130r·min-1的摇床培养2d，将培养液按10%接种量接种于氯嘧磺隆浓度为1g·L-1的新鲜富集培养基中，然后在37℃摇瓶培养2d，依次类推5次接种，最终富集得到降解菌株培养物种子。将菌悬液用涂布法在以氯嘧磺隆为唯一碳源的无机培养基上进行分离，37℃培养1d，挑取单菌落反复划线纯化。最终得到纯菌，4℃冰箱保存备用。
1．2．2降解试验设计
试验氯嘧磺隆设5个水平，分别为0、5、10、15、20μg·kg-1。氯嘧磺隆降解菌设5个水平，分别为清水、降解菌发酵液稀释10、100、1 000、10 000倍。每个处理3次重复，共75个处理。
将水稻种子浸种，催芽后待芽长为1mm左右播种。在每个培养皿中铺一张滤纸，将氯嘧磺隆20%可湿性粉剂配成母液，再采用逐步稀释的方法配成试验所需的各浓度药液，每个培养皿放15mL各浓度药液，对照放15mL清水。再向每个平皿中加入15mL的稀释菌液，使菌达到试验所需的浓度。之后选籽粒饱满、无病虫害、芽长均匀一致的30粒水稻种子均匀放入每个培养皿。把培养皿随即放入26℃的恒温培养箱里黑暗培养8d后取出，测定根长、根鲜重、芽长、芽鲜重。利用Excel进行数据处理和统计分析。
2 结果与分析
2．1降解菌菌株形态
菌株在无机盐培养基平板生长菌落呈圆形，不透明，乳白色，边缘整齐。
2．2不同处理对水稻芽长的影响
由图1可知，在同一降解菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度的增加，芽长呈逐渐降低的趋势。在菌量为0时，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对芽长的抑制率依次为16.4%、32.3%、47.6%和72.3%。方差分析结果表明，与无氯嘧磺隆处理相比较，氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1时，对芽的抑制作用不显著;氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，对芽的抑制达到显著水平;氯嘧磺隆浓度为20μg·kg-1时达到极显著水平。
同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌用量的增加，各处理芽长都有逐渐增加的趋势。方差分析表明：氯嘧磺隆浓度为5～15μg·kg-1处理中，与降解菌对照相比，降解菌浓度稀释10 000倍时水稻芽长的增加不显著，菌浓度稀释倍数≤100倍时水稻芽长的增加即达到极显著水平，但当菌浓度稀释倍数在10～100倍时，各处理间差异不显著。
2．3不同处理对水稻芽鲜重的影响
由图2可知，在同一降解菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度的增加，芽鲜重逐渐降低。未施用降解菌处理中，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对芽鲜重的抑制率依次为9.4%、15.3%、28.4%、43.0%。
同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度的增加，各处理芽鲜重均有增加的趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆0水平处理中，降解菌浓度稀释倍数为10 000、1 000、100、10时，芽鲜重分别提高了2.6%、10.2%、21.4%、20.6%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100、10时，芽鲜重分别提高了14.3%、7.1%、13.8%、12.8%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了3.4%、2.4%、6.8%、6.4%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了13.7%、22.1%、18.9%、17.9%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了11.6%、13.9%、14.9%、14.2%。可见，不同浓度的氯嘧磺隆处理加入一定浓度的降解菌对芽鲜重均有不同程度增加。
2．4不同处理对水稻根长的影响
根是植物生长的重要器官，根系发育状况及其活力高低对水稻生长具有重要作用。水稻根系对氯嘧磺隆非常敏感，随氯嘧磺隆浓度增加，水稻根长缩短。由图3可知，在同一菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度增加，各处理根长均呈逐渐降低趋势。在菌量为0时，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对根长的抑制率依次为20.6%、33.5%、49.6%、78.7%。方差分析表明，与氯嘧磺隆处理比较，氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1时根长没有显著减小;氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，对根长的抑制即达到了显著水平;氯嘧磺隆浓度为15μg·kg-1时，对根长的抑制已达到了极显著水平。
同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度的增加，各处理根长均有逐渐增加的趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆对照中，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.3%、12.7%、21.1%、10.9%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了3.5%、7.8%、13.5%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了52.1%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了14.0%、3.7%、35.7%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了50.5%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.1%、17.5%、32.2%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了50.0%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.9%、20.1%、28.1%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了35.5%。可见，一定浓度的降解菌能促进水稻根系生长。不同氯嘧磺隆浓度下各处理水稻根长的方差结果表明，氯嘧磺隆浓度5μg·kg-1处理与未加菌相比，加菌稀释倍数为10 000时根长未显著增加，当菌稀释倍数1 000时水稻根长增加达到显著水平。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1处理与未加菌相比，菌的稀释倍数为100时水稻根长增加达到显著水平;氯嘧磺隆浓度为20μg·kg-1，各处理间处理差异均不显著，此时氯嘧磺隆浓度过大，降解菌已不能解除其对水稻根长产生的影响。
2．5不同处理对水稻根鲜重的影响
由于氯嘧磺隆对根长和根数产生一系列影响，根鲜重也随之变化。由图4可以看出，在同一菌水平下，随氯嘧磺隆浓度增大，各处理根鲜重都表现为逐渐降低的趋势。未施用降解菌处理中，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对水稻根鲜重的抑制率依次为30.6%、35.0%、57.2%、82.2%。
在同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度增加水稻根重表现为逐渐增加趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆0水平处理中，降解菌浓度稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了14.3%、18.2%、22.1%、19.9%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了21.2%、26.1%、38.4%、33.3%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了57.2%、24.9%、31.9%;降解菌稀释倍数为10时，根鲜重降低了18.3%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了37.0%、66.9%、79.2%;降解菌稀释倍数为10时，根鲜重降低了36.1%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为1 000、100、10时，根鲜重分别提高了3.8%、11.5%、18.8%、14.7%。通过加入不同浓度的降解菌，在一定程度上有效减轻了氯嘧磺隆对根系产生的药害。但当菌浓度过大时渗透压过大，会对水稻的生长产生抑制作用。
3 结论
根据已有报道[9]，少量的氯嘧磺隆残留即可对敏感作物产生严重的药害，抑制根生长，植物的根系发育严重受阻。该试验研究结果表明：氯嘧磺隆5μg·kg-1对水稻生长发育未产生明显影响，但随着氯嘧磺隆浓度的增加，水稻生长受阻，表现出明显药害症状，芽及根系性状显著下降。试验结果表明：在同一菌浓度下，氯嘧磺隆5μg·kg-1时降解效果最好。在同一氯嘧磺隆水平下，降解菌稀释倍数为100时降解效果最好。
参考文献
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高效苯酚降解菌的分离与降解特性 篇3
人的苯酚口服致死量报道不一, LD为2～15g或MLD为140mg/kg。国外报道酚液污染皮肤面积达25%, 血酚浓度为0.74mmol/L, 10分钟死亡。酚类会对人类的身心健康造成危害, 毒害其他生物, 破坏了生态系统的稳定性, 故我国及其他国家都将其列入重点污染物名单。目前研究人员已获得的降酚菌包括真养产碱杆菌 (Alcaligenes eutrophus) [2]、醋酸钙不动杆菌 (A.calcoaceticus) [3]、藻类 (Alga Ochromonas danica) [4]、根瘤菌 (Rhizobia) [5]、假单胞菌 (Pseudonomonassp.) [6]、酵母菌 (Yeast Trichosporon cutaneum) [7]等苯酚降解菌。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源
佳木斯黑龙化工厂排污口。
1.1.2 培养基
(1) 富集培养基:
蛋白胨5.0g, 牛肉膏1.5g, NaCl 1.5g, 污水1000mL, 琼脂15.0g, pH 7.0～7.2, 培养基在1×105Pa灭菌15min后备用。然后将浓度为10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5的土样溶液接种到富集培养基上, 培养48h后观察。
(2) 选择培养基[1]:
KNO34.0g, NaCl 5.0g, 琼脂15.0g, 污水1000mL, pH 7.0～7.2, 1×105Pa灭菌15min。待冷却后加入15.0mL经过灭菌处理的不同浓度的苯酚溶液制成固体培养基, 然后用平板涂布法接种, 等3天后观察菌的长势情况, 观察和记录。
1.2 实验方法
1.2.1 高效苯酚降解菌的富集与驯化
菌种的富集与驯化采用一次性加入大剂量化合物的方法[8]。将菌种在无菌条件下接种到20mL细菌富集固体培养基中, 25℃培养箱中培养48h后, 挑拣长势好的菌体分别接种于苯酚含量为50mg/L和100mg/L的细菌驯化固体培养基中, 置于培养箱中培养48h。共驯化5个周期, 同时苯酚浓度由0.15、0.20、0.25g/L浓度梯度逐渐递增到0.75g/L。与此同时选用摇床培养作为参考[9]。
1.2.2 高效苯酚降解菌的分离筛选及鉴定
(1) 分离和纯化:
待降解菌长势稳定后用平板划线法, 挑取单菌落进行细菌的分离, 反复纯化5次后, 将培养的纯种菌种接种至斜面培养基上继续培养。
(2) 菌种筛选:
划线法挑取少量的单一菌落分离出单一的降解菌继续培养待鉴定, 并将其编号1、2、3、4、5、6、7。
(3) 菌种鉴定:
①用接种环挑取少量菌落接种于鉴别培养基, 25℃恒温培养48h后观察并记录。②细菌的简单染色实验和革兰氏染色实验见文献[10]。
2 主要环境因子对高效菌生长剂降解苯酚能力的影响
2.1 pH值对降解菌的影响
将筛选出的7株抗性菌分离出来, 用筛选培养基分别培养。将他们分别接种到不同pH值的固体培养基上, pH值的梯度分别为6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6, 以此获得降解菌的最适pH值, 培养48小时后观察并记录。
2.2 苯酚初始浓度的影响
将用选择培养基扩大培养的生长状况良好的待测的各种菌体分离出来, 用筛选培养基培养分离得到的各种菌, 无菌条件下用划线法将纯菌落接种到固体培养基上。将得到的菌体用更高浓度的苯酚培养基驯化以待变异成更具降解能力的降解菌, 与此同时将得到的苯酚降解菌配成无机盐菌悬液, 按12mL的接种量接到pH7.2, 苯酚初始浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75g/L的培养基中, 于110r/min、25℃摇床振荡培养, 48h后测培养基的吸光度及计算残余的苯酚浓度。
3 结果与分析
3.1 结果
3.1.1 筛选出7株降解能力强的菌株对苯酚都有一定的点适应性, 且对苯酚有很强的降解能力, 其0.5g/L和0.65g/L浓度的苯酚降解率达到90%以上, 最大苯酚降解浓度达到0.70g/L。
3.1.2 通过对这7株菌在不同温度、pH值、以及不同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察, 确定了这7株菌的最适pH值为7.2, 最适生长温度为25℃, 最大可降解苯酚浓度为0.70g/L。
3.1.3 在低温下生物降解苯酚的代谢基质中若加一些有机碳源或无机盐可以促进降解作用, 如葡萄糖、硫酸铵, 硫酸铵对低温条件下苯酚的微生物降解具有促进作用, 可以考虑在菌群驯化和低温苯酚类降解过程中添加一些。
3.2 分析
由于工农业迅猛发展, 同时对含酚废水的配方监管漏洞, 如今含酚废水的不合理排放污染了水资源, 严重影响了人们的身心健康, 并已成为城市可持续发展道路上的障碍。水是生命之源, 由于水循环过程又污染了整个生态系统, 进而威胁到人类的生存质量, 由此改善水污染环境已迫在眉睫。目前虽然含酚污水的研究很广泛, 但对高浓度含酚污水的研究仍有深度可挖, 因此必须在排水之前将其浓度降低稀释, 利用生物法处理含酚废水。此方法危害, 经济, 效率高。因此抗性菌的特性即利用价值受到重视, 利用抗性菌高效率的降解苯酚的能力净化废水、保护环境, 对维持可持续发展有极其深远的意义。
黑龙化工厂地处松花江上游, 其沿岸区域有大面积农作物种植区, 利用松花江水进行灌溉, 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害作用, 同时人们适用后有毒物质在人体内富集, 进而对人体有直接或潜在的威胁。借以东北地区特有的寒冷气候, 苯酚降解菌的研究也对将来大面积的低温微生物的研究提供了参考资料。
参考文献
[1]黄蓓佳, 张兰英, 等.低温条件下1, 2, 4-三氯苯降解菌的筛选及降解特性[J].环境科学研究, 2008, 21 (5) :19-22
[2]金相灿, 程振华, 等.有机化合物污染化学[M].北京:清华大学出版社, 1999:250-265
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[5]简放棱, 黄凯那.合成酚醛树脂废水前处理初探[J].仲剀农业技术学院学报, 2000, 13 (1) :40-44
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[8]任源, 吴超飞, 等.苯胺分离菌的驯化筛选研究[J].环境科学研究, 1998, 4 (11) :4-26
自动降解 篇4
关键词：柴油降解,分离鉴定,解脂耶罗维亚酵母KML,降解特性,GC-MS
石油是目前环境中广泛存在的污染物之一,包括汽油、煤油、柴油、润滑油、石蜡和沥青等,由多种烃类(正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃)和少量其他有机物组成。随着经济的发展,人类对能源的需求不断扩大,石油已成为人类最主要的能源之一。随着石油产量和需求的不断提高,冶炼、储存、运输等环节泄漏所造成的水体、土壤和大气等环境污染更加突出。石油进入土壤后与土粒粘连,土壤结构被破坏,降低土壤的透气性和渗水性[1]。目前,国内外石油污染土壤修复技术按其性质可分为3种:物理方法、化学方法和生物方法。石油污染的生物修复,是指利用处理系统中生物(主要是微生物)的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其无害化的过程,其最终产物是CO2、H2O等物质[2]。与物理、化学修复技术相比,具有多种优点[3]:成本低;对人和环境造成的影响小;污染物氧化完全。微生物的生物降解效果受许多因素的影响,如温度,pH值,营养物,氧,培养基组成,污染物的浓度和生物利用度[4]。关于石油类降解微生物已有一些报道,但符合实际应用要求的菌株还有待不断地开发和研究。为研究适合非洲本土环境的石油类降解微生物,研究从来自喀麦隆未受柴油污染土壤中,筛选分离出高效柴油降解酵母,分析了影响其降解能力的几种因素,为进一步应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品的来源
降解柴油的菌株从来自喀麦隆的土壤中分离得到。
1.1.2 培养基的配制
无机盐培养基(MSM)[5]:NH4Cl 1g,K2HP04 1g,Na2SO4 2g,MgS04·7H20 1g,CaCl2·6H2O 0.01g,蒸馏水1L,pH=6.0,121℃高压蒸汽灭菌20min。
无机盐含柴油固体培养基:无机盐培养基,琼脂 15～20 g,柴油 1 mL。
查氏固体培养基(Czapek agar medium):K2HPO4 1 g;KCl0.5g,蔗糖30g,FeSO4 0.01g;MgSO4 0.5g,NaNO3 2g,蒸馏水1L,pH 6.8,琼脂15～20g,121℃高压蒸汽灭菌20min。
1.1.3 仪器
UV-1000紫外分光光度计;双层全温恒温培养摇床;Agilent Technologies 6890-5975气相色谱—质谱法联用仪等。
1.2 方法
1.2.1 柴油降解菌株的筛选与鉴定
柴油降解菌株的筛选:吸取1 mL土壤悬液涂布于查氏固体培养基,30℃倒置培养72 h。在培养后,为进一步利用将菌株在40%甘油-20℃保存。将甘油保藏菌重新转接到以柴油为唯一碳源的无机培养基中,30℃,180rpm 摇床培养5d,待培养基变混浊后,用无机盐含柴油固体培养基培养,将纯化菌株于试管斜面培养后4℃保藏。
柴油降解菌株的鉴定:对分离得到的柴油降解菌株应用5.8S rDNA-ITS序列分析进行酵母的分子鉴定,结合传统的鉴定方法,根据微生物的形态特征和生理生化特征,参照《酵母菌的特征与鉴定手册》[6]及相关文献,最终将菌株鉴定到属。酵母总DNA提取,用Ezup 柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取酵母的DNA。用PCR扩增仪进行扩增反应,体系总体积为50μL。采用通用引物(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[7]扩增供试菌株的ITS1-5.8S rDNA-ITS片段,送至上海英俊生物技术公司测序。将测序结果进行BLAST比对分析并用软件MEGA5.0构建系统进化树。
1.2.2 柴油降解率的测定
将柴油配成0.1 mg/mL的标准溶液,分别移取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL溶液于10 mL容量瓶中,用正己烷稀释定容。分别倒入石英比色皿中,以正己烷作空白对照在紫外分光光度计中在254nm波长下测定,得到标准曲线。将试验中的萃取液在10 000r/min,4℃下高速冷冻10min。稀释定容后测定萃取吸光度。根据回归计算得标准曲线方程:y=4.820x-0.001(R2=0.999),其中y表示吸光度,x表示柴油质量浓度,R2表示相关系数。
柴油降解率的计算:柴油的降解率=(初始柴油浓度-残余柴油浓度)/初始柴油浓度×100%
1.2.3 影响柴油降解因素的研究
在装有50mL无机盐培养基的250mL三角瓶加入1mL 柴油,2mL种子液(4.6×108 cells/mL)。测定不同的温度(20℃、30℃、和37℃)、pH值(分别为6、7、8、9和10)、不同的氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素和NH4Cl,浓度均为1 g/L),以及添加不同浓度的鼠李糖脂 (10 g/L、20 g/L和60g/L)对柴油降解的影响,同时设置了空白试验,即除不加菌株外其余条件保持一致,在180r/min 恒温摇床连续培养9d,检测柴油降解并确定优化降解条件。
1.2.4 气相色谱—质谱法联用仪设置
分别提取培养0d,5d,9d后的残油1ul,按照之前描述过的方法进行GC/MS分析[8]。载气为He,载气总流量为1 mL/min;进样模式为分流;进样口温度:250℃;检测器接口温度:250℃;柱箱温度:60℃,保持2min,以20℃/min升至300℃,保持5min;电离方式:EI;电离能:70eV;扫描模式:全扫描;扫描质量范围:41～500amu。
2 结果与分析
2.1 柴油降解菌株的鉴定
分别采用常规的土壤稀释法和平板涂布法从来自喀麦隆地区的土壤中分离出一高效柴油降解菌株,在含柴油平板和摇瓶中都能很好地生长。将菌接入液体柴油无机盐培养基摇床培养2d后,培养基开始逐渐变成乳白色,浮在液面上的柴油逐渐减少。通过稀释涂平板,最终得到一株能利用石油烃的酵母菌,命名为KML。将筛选出的进行菌体形态特征,菌落圆形,乳白色,大小为1.7-4.2×2.3-7.7μm。菌株的生理生化试验结果见表1。
注: “+”为阳性结果,“一”为阴性结果。
对该菌株DNA进行PCR扩增,以酵母5.8S rDNA-ITS通用引物,扩增到358bp的DNA片段,GenBank登录号为JX420122。通过NCBI数据库进行BLAST比对,结果显示该菌株于解脂耶罗维亚酵母的序列同源性最高。选出9种同源性较高的序列,利用MEGA5.0的邻近法构建系统发育树。结果如图1所示,该菌株与Yarrowia lipolytica Y25 (EU603297)位于同一个系统发育的分支。
2.2 降解影响因素的研究
2.2.1 初始pH对降解率的影响
由图2(A)可知,菌株对pH值有较广泛的适应范围,pH从6～10均具有比较好的适应性。但在pH为9时降解率最高,达到75.1%。一般适合酵母生长的pH环境是偏酸的,在有的研究中,pH 6.0时柴油降解率最大[9]。而在吴兰等人的研究中,游离解脂耶罗维亚酵母在初始pH 6～10范围内对色拉油都有着较好的降解效果,降解率维持在60%以上,表明解脂耶罗维亚酵母能很好地适应中性偏碱的环境[10]。
2.2.2 温度对降解率的影响
由图2(B)可以看出,该菌株KML对柴油降解的适宜温度在20℃～37℃范围内,温度在30℃降解率最高达到59.0%,在37℃时降解率最低,只有41.0%。温度对降解率的影响主要表现在两方面:一是影响石油烃降解菌的生长速度;二是影响油的物理状态和化学组成[11]。低温时,由于某些对微生物有毒害的低分子量石油烃类在低温下难挥发,石油黏度升高,会对石油烃类的降解有一定的抑制作用,同时酶活力也降低,所以低温下石油烃类较难降解[12]。随着温度的上升,烃的代谢增加,高温引起的烃化合物膜毒性增加,使得温度对生物的新陈代谢过程起了相反的作用,抑制了石油烃类的微生物降解。
2.2.3 不同的氮源对降解率的影响
由图3(A)可知,添加酵母膏后降解效果最佳,降解率接近77%。微生物的生长繁殖需要碳、氢、氧、磷和其他各种矿物质元素[13]。石油污染物含有大量的碳和氢,是微生物可以利用的底物,但它只能够提供有机碳而不能提供其他营养物。因此,氮源和磷源是常见的烃类生物降解限制因素,添加适量营养物可以促进生物降解。
2.2.4 不同的鼠李糖脂浓度对降解率的影响
从图3(B)可以看到,在添鼠李糖脂浓度10mg/mL时降解率达到最高,为78.0%。但随着浓度的增大,降解率有所下降,这表明表面活性剂对细胞有一定的毒害作用。少量的表面活性剂会促进柴油的降解。因为加入表面活性剂可以为菌体提供一个既亲水又亲油的界面,一方面使柴油易于和菌体接触,另一方面能降低油—水界面张力,使柴油变为细小油滴,对汽油产生显著的协同增溶作用,构成乳液,增加柴油的生物可利用性,使扩散进入菌体细胞,加速汽油的降解[14]。
2.2.5 GC-MS 分析结果
图4表示对降解后(第5d和第9d后)剩下的柴油进行了分析,探求生物降解后石油烃组分的变化。如图分别是培养前后(5d和9d后)培养基中柴油的GC-MS图谱。经过5d和9d后,柴油链烃含量有所下降,主要降解了C9～C25的直链烃和少量支链烃,最后只剩下了一些不饱和烃。
3 结论
自动降解 篇5
关键词：低温,氨氮降解菌,筛选,降解能力
0 引言
随着工农业的快速发展，我国水污染问题日趋严重，其中氨氮污染普遍存在，已引起人们的广泛关注[1]。常规的通过混凝-沉淀-过滤-消毒的水处理工艺无法去除原水中的氨氮，为了使饮用水中的氨氮低于《生活饮用水标准》(GB5749-2006)中的氨氮限值(0.5 mg/L)，通常采用折点氯化技术，然而折点加氯会产生大量有机氯化物，对人体健康不利[2]。
近年来，生物脱氮成为研究热点，研究发现一些自养和异氧硝化细菌能够去除水中氨氮[3,4,5]，氨氮的降解效率与温度有关，最适温度为25～37℃，低于15℃氨氮去除效率降低[6,7]。我国东北地区冬季漫长，年平均水温低于15℃。目前，对于低温氨氮降解菌的研究报道较少，为此，笔者采用富集培养方法从松花江水中筛选出1株低温氨氮降解菌株，通过形态与生理生化特性、16S r DNA序列分析以及BIOFOSUN微生物鉴定分析系统鉴定菌株，测定其低温氨氮降解能力和反硝化能力，旨在为冬季低温期饮用水氨氮生物降解提供菌株资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料
水样取自4月份哈尔滨九站公园江心1.5m处松花江水，水温10℃，4℃保存备用。
1.1.2 培养基
异氧硝化细菌培养基:硫酸铵0.5 g，醋酸钠5g，微量元素溶液50 m L，水950 m L,p H 7.0。
基本培养基:硫酸铵0.05 g，醋酸钠0.5g，微量元素溶液50 m L，水950 m L,p H 7.0。
微量元素溶液:磷酸氢二钾5 g，硫酸镁2.5 g，氯化钠2.5g，硫酸铁0.05 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1L,p H 7.0～7.4。
反硝化细菌培养基:用硝酸钾替代硫酸铵，其它成分与异氧硝化细菌培养基相同。
LB:蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖1%，水100 m L。
1.2 方法
1.2.1 菌株富集培养
取100 m L松花江水放入无菌的500 m L三角瓶中，8℃、160 r/min震荡培养3～5 d直至培养液浑浊，4℃保存备用。
1.2.2 氨氮降解菌筛选
取1 m L富集培养液加入含100 m L异氧硝化细菌培养基的三角瓶中，8℃、160 r/min震荡培养2 d，倍比稀释后，取103稀释液100 m L涂布在异氧硝化细菌固体平板上，8℃低温培养2～4 d，挑取单菌落划线纯化。采用纳氏试剂平板法初筛脱氨氮菌株[8]，取纯化后的菌株点接在异氧硝化细菌固体平板上，8℃低温培养2 d，去掉菌落，加入5 m L纳氏试剂，测量菌落周围的透明圈直径。
1.2.3 菌株鉴定
形态鉴定:将培养24 h的菌液，革兰氏染色后显微镜下观察形状大小。
生理生化特性鉴定:按照参考文献[9]方法进行接触酶、氧化酶、精氨酸双水解酶、V.P试验、M.R试验、葡萄糖利用、明胶液化试验。
16S r DNA序列分析:用LB培养基培养菌株，离心收集菌体，用北京康为世纪细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，用细菌通用引物Primer 1:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和Primer 2:TACGGYTACCTTGT-TACGACTT进行PCR扩增，将PCR产物测序，在NCBI的BLAST数据库中进行DNA序列分析，用MEGA version 4.1软件构建系统进化树。
BIOFOSUN微生物鉴定分析系统鉴定:按照BIOFOSUN微生物鉴定分析系统说明进行操作。
1.2.4 菌株低温氨氮降解能力测定
用500 m L基本培养液培养氨氮降解菌，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，
悬浮于5 m L无菌水中，作为种子液。取1 m L种子液接种到50 m L新的异氧硝化细菌培养液中，3个平行样，培养液初始氨氮浓度为5 mg/L，碳氮比分别为10:1,p H 7.0。将培养液在8℃、160 r/min震荡培养2 d，每隔4 h取样测定菌浊度OD600值、氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度，计算氨氮降解率。
1.2.5 菌株的反硝化能力
取1 m L种子液接种到50 m L新的反硝化细菌培养液中，3个平行样，培养液初始氨氮浓度为5 mg/L，碳氮比分别为10:1,p H 7.0。将培养液在8℃、160 r/min震荡培养1 d，每个4 h取样测定菌浊度OD600值、硝态氮和亚硝态氮浓度，计算硝态氮降解率。
1.2.6 分析方法
采用纳氏试剂光度法测定氨氮浓度，酚二磺酸光度法测定硝酸亚浓度，N-奈基-乙二胺光度法测定亚硝态氮浓度[10]。取菌液样品5 m L,6 000 r/min离心5 min，取1mL上清液测定，按公式氮降解率=C0-C1/C0×100%计算氮降解率，C0为初始氮浓度，C1为残留氮浓度。
2 结果与分析
2.1 氨氮降解菌筛选与鉴定
松花江水经富集和分离，采用纳氏试剂平板法筛选，获得8株氨氮降解菌(图1)，菌株WSW-1001半透明圈直径最大为15 mm。该菌株菌落白色、圆形、光滑，边缘整齐，菌体短杆状，大小0.2～0.4μm×1.0～1.3μm。革兰氏阴性，好氧，氧化酶阳性，接触酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P阴性，M.R阴性，液化明胶。PCR扩增产物大小1 400bp，与NCBI数据库中的Pseudomonas.fluorescens p1-1同源性为99%(图3)。BIOFOSUN微生物鉴定分析系统分析结果表明该菌株与荧光假单胞杆菌聚为1组(图2)。结合菌株WSW-1001的形态学和生理生化特性，以及16S r DNA序列分析和BIOFOSUN微生物鉴定系统分析结果，菌株WSW-1001被鉴定为荧光假单胞杆菌Pseudomonas fluorescens。
2.2 菌株低温氨氮降解能力
菌株WSW-1001低温氨氮降解效果见图4。菌株在8℃条件下具有较强的脱氮能力，48 h内，随着菌体的生长，氨氮浓度持续下降，24 h对初始氨氮浓度为5.23 mg/L的氨氮降解率为71.7%,48 h的降解率为80.4%，脱氮过程中无亚硝态氮积累，有少量(约0.48 mg/L)硝态氮产生。
2.3 菌株的异氧反硝化能力
菌株WSW-1001在以硝酸钾为唯一氮源的培养基中生长与硝态氮含量变化情况见图5。菌株在8℃条件下能够利用硝态氮生长，24 h对初始5.03 mg/L硝态氮的降解率为69.8%，有微量亚硝酸盐产生。
■:OD600;◆:NH+4-N浓度;▲:NO+3-N浓度;×:NO+2-N浓度。
■:OD600;◆:NO+3-N浓度;▲:NO+2-N浓度。
3 讨论
纳氏试剂光度法是测定氨氮常用方法，纳氏试剂与氨氮反应生成黄棕色络合物，颜色深浅与氨氮浓度成正比。固体平板中的氨氮被微生物降解后不能与纳氏试剂进行显色反应，因此可以通过菌落周围半透明圈大小定性测定固体平板上生长的菌株氨氮降解能力。本研究采用纳氏试剂平板法可以对氨氮降解菌进行快速初筛。细菌的鉴定方法包括传统方法、分子生物学鉴定和仪器自动化鉴定，每种方法都有其各自的优缺点，三种方法结合可以确保鉴定结果的准确性。
国内外对于异氧硝化细菌的研究报道较多，多数菌株在常温下脱氮效率较高，辛玉峰等报道不动杆菌YF14在30℃培养3d，可去除92%的氨氮[11]，邱晓帆等报道1株假单肥菌WSH1001在20～35℃培养9h，氨氮去除率达95%[12]。对于低温菌的研究报道较少，本文报道的菌株WSW-1001低温氨氮降解能力高于已有报道。Zhang D等人报道从松花江水中分离出1株异氧硝化细菌Microbacterium sp SFA13,5℃培养30h后对5.09 mg/L初始氨氮的降解率为63.6%[13];Zhang J等人报道Pseudomonas stutzeri YZN-001 10℃培养2 d氨氮降解率为45.5%[14]。本文报道的菌株WSW-1001低温氨氮降解能力高于已有报道。
自动降解 篇6
海洋石油污染已成为一个普遍而严重的问题，对海洋生态环境的危害巨大。目前国际上通行的治理海洋溢油的方法主要分为物理处理方法、化学处理方法和生物修复技术三大类。其中，生物修复技术与传统的物理和化学处理法相比，具有成本低、效果好、无二次污染等优点，特别是对机械装置无法清除的薄油膜而且化学试剂被限制使用时，生物处理溢油的优越性更加显著[2]。而且，石油烃的最终消失要依靠生物降解，微生物群落对石油烃的生物降解是清除污染物的一个主要机制[3]。因此，利用微生物清除海水中石油污染物正日益受到人们的重视。20世纪80年代美国利用生物修复技术成功消除了Exxon Valdez溢油造成的大面积污染，创造了生物修复海洋污染的先例[4]。
许多因素会对石油降解产生影响，如温度、营养盐、接种的菌量等。温度通过影响石油的物理、化学性质、菌株的生化活动、菌群结构来影响石油的生物修复。在一定温度范围内，石油烃降解率随温度升高而升高。对于常温好氧菌来说，最佳的石油降解温度一般在15～30℃之间[5]。营养盐的添加对促进石油烃降解作用很大。如1998年美国油轮在阿拉斯加海峡触礁后，利用添加N和P到沙滩或石滩，而成功加速了土著菌对石油的分解。溢油事故发生后，短时间内土著微生物不会大量增加，因而添加外源高效石油烃降解菌能够提高石油烃降解效率。这些接种的降解菌可以从土著微生物中进行富集，也可以从其他区域获取。
我国海岸线漫长并且有众多港口，海上的石油运输量巨大，海上船舶溢油事故不断增加。而且，我国的港湾多属于内弯，水体交换能力差，更易受石油污染的影响。本研究从大连港表层海水中分离出一株高效的石油降解菌，并对其降解特性进行了研究，以期为我国海洋溢油污染生物修复的应用提供优良菌源和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基
实验中用到的培养基主要有MMC液体培养基、2216E液体培养基和2216E琼脂培养基。MMC液体培养基组分:NaCl:24 g;NH4NO3:1.0 g;KCl:0.7 g;KH2PO4:2.0 g;Na2HPO4:7.563 4 g;Mg SO4·7H2O:7.0 g;微量元素;去离子水1 000 m L，调p H值为7.4，在121℃下高压灭菌。2216E液体培养基和2216E琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司。
1.1.2 实验用油
实验所用柴油为市售0#柴油，经0.22μm无菌滤膜过滤后使用。
1.1.3 试剂
各种化学试剂均为市售分析纯。
1.2 方法
1.2.1 采样
石油污染海水样品采自大连港(地理坐标为121°39'9″E,38°56'14″N)，取表层水样，样品采集后立即装入无菌广口玻璃瓶中，低温保存带回实验室，放入冷藏柜4℃保存。
1.2.2 富集与驯化
于250 m L三角瓶中加入100 m L MMC培养液，高温灭菌，加入海水样品5 m L和灭菌后的柴油1m L。置入生化培养箱，于150 r/min、22℃下振荡培养7 d，然后从中取5 m L培养液加入到100 m L含有高一梯度柴油浓度的MMC培养液中，培养7 d。如此反复培养3次，柴油浓度逐级增加为10、20、30m L/L。以不接种海水样品的MMC培养液做空白对照。
1.2.3 分离与纯化
细菌的分离、纯化采用稀释涂布法和平板划线法。用移液枪(枪头已经灭菌)吸取富集驯化后的培养液l m L，置于9 m L无菌去离子水中，作为10-1稀释液;混匀后，再吸取该试管中的1 m L菌液置于9 m L无菌去离子水中，作为10-2稀释液，以此类推，形成不同浓度梯度的稀释液。然后分别吸取0.1m L的不同稀释度的样品涂布于已经高温灭菌的2216E固体平板上，置入生化培养箱，于22℃下培养直至长出清晰的菌落。挑选生长良好的菌落，在已灭菌平板上分3个区域进行划线。在同样的条件下培养2～3 d，挑取3区具有生长优势的单菌落，进行二次划线分离。反复多次，直到分离出菌落单一的菌株。
1.2.4 生长曲线测定
预先将HD-1接种到2216E液体培养基中，22℃下培养1 d，备用。取盛有100 m L的无菌2216E液体培养液的250 m L的锥形瓶12个，编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。各瓶中依次加入5m L HD-1,22℃下振荡培养。第一天取1号锥形瓶3 m L菌液，用可见光分光光度计，在600 nm条件下测定其吸光度。每隔24 h按序号依次测定菌液的吸光度，直至吸光度数值明显下降。
1.2.5 降解率测定
采用紫外分光光度法。
1.2.6 降解影响因素分析
分别测定温度、初始接菌量、营养盐对石油降解率的影响。
2 结果与讨论
2.1 菌种的分离
在富集驯化的过程中，培养初期，柴油呈一层膜状漂浮在水面上，水相完全澄清，油水完全分离。随着培养时间的延长，培养液开始逐渐变浑浊，柴油被分散成椭圆粒状或层片状，然后逐渐乳化，柴油以液滴的形式分散在液相中。随着培养时间的进一步延长，柴油液滴越来越小，液相中出现絮状沉淀。表明培养液中存在能以柴油为唯一碳源的细菌，培养液中柴油逐渐被降解，同时石油烃降解菌被富集。经过三次富集培养，用2216E平板分离纯化后，从以柴油为唯一碳源的培养液中分离得到14株菌，分别命名为HD-1～HD-14。根据生长速度和数量，从中选出一株优势菌命名为HD-1。HD-1群落外观特征:规则圆形、边缘整齐、乳白色、隆起、光滑、湿润。基于16SrDNA对所分离到的HD-1进行鉴定。鉴定结果表明，HD-1属于α-变形菌纲、厦门栖东海菌属。
2.2 菌种的生长曲线
由图1可知，在前2 d内OD600快速增加，表明2216E液体培养基中石油降解菌浓度急剧上升。经过大约2 d的对数生长期后，虽增长速度放慢，但OD600仍缓慢继续上升，直到第7天，随着培养时间的增加，OD600不再有大的变化，只是在很小的范围内做窄幅波动，表明石油降解菌逐渐进入生长稳定期。第11天，OD600有下降趋势，细菌生长进入衰亡期。
2.3 降解影响因素分析
2.3.1 培养温度的影响对HD-1生长以及柴油降解率的影响
由图2可知，温度在8～22℃之间变化时，HD-1对柴油的降解率随温度的升高而升高，在22℃附近达到最高为:64.8%;同时OD600达到最大值0.61，表明2216E液体培养基中的菌液浓度达到最大值。当温度高于22℃后，降解率随温度升高而有所下降。由此表明，HD-1的最适降解温度约为22℃。温度过低，柴油粘度会随之升高，短链烷烃挥发性下降，石油烃溶解度降低，影响石油降解率对其的利用率;温度太高反而会抑制酶的活性，从而降低石油降解率。
2.3.2 初始接菌量对HD-1生长以及柴油降解率的影响
由图3可知，在接种量为1～10 m L之间时，HD-1菌液对柴油的降解率随菌株接种量的增加而上升，当接种量为10 m L/10 m LMMC时，HD-1降解菌对柴油的降解率达到最大为86.8%。当接菌量为1 m L时，HD-1对柴油的降解率只有64.80%，说明接种量少，细菌的数量增加慢，因此消耗的碳源少，柴油的降解率低。当接菌量增加时，细菌数量快速增加，大量的细菌繁殖消耗较多的碳源，因此柴油的降解率增加。但当接种量为15 m L时，并没有出现随接种量的增加而上升的趋势。主要原因为:接种量过大会使微生物大量生长，营养物质迅速消耗限制细菌的生长和新陈代谢活动，因此柴油降解率有所下降。说明了在石油降解过程中，降解率受接种量的影响较大，并不是投菌量越多越好。
2.3.3 营养盐对HD-1生长和柴油降解率的影响
由图4可知:加入N、P营养盐后，HD-1菌液对石油烃的降解率都较未加营养盐的空白组有所增加。其中加入氮源氯化铵后，HD-1对柴油的降解率达到最大为88.9%，在其他条件相同的情况下，较未加营养盐高24.1%;加入磷源磷酸氢二钠后，HD-1对柴油降解率达到94.9%，在其他条件相同的情况下，较未加营养盐高30.1%。由此可见，HD-1降解菌的最佳N、P营养盐搭配为氯化铵+磷酸氢二钠。
3 结论与展望
目前石油烃降解菌多是从土壤中筛选出来，而从海洋环境筛选的相对较少。随着海域溢油污染风险的加大，以及国内外对石油降解菌研究的逐渐深入，微生物修复石油污染海域成为研究热点。本研究从大连近海岸的石油污染海水中筛选出了14株石油降解菌，并从中选取了一株优势菌(HD-1)进行了研究。通过16SrDNA方法鉴定该菌属于α-变形菌纲、厦门栖东海菌属。采用紫外分光光度计法考察了温度、接种量和营养盐对HD-1降解柴油效率的影响，实验结果表明温度在8～22℃之间变化时，HD-1对柴油的降解率随温度的升高而升高，在22℃附近达到最高为:64.8%;同时OD600达到最大为:0.61。当温度高于22℃后，降解率随温度升高而有所下降;HD-1的生长和柴油降解最佳接种量是10 m L/10 m LMMC;最佳氮源磷源组合为氯化铵+磷酸氢二钠。
研究结果可以为海洋微生物修复提供一定的理论依据和技术支撑，但论文中很多的研究工作还处于初始阶段。而且海洋环境复杂，影响外源降解菌的生长。因此，如何构建适应自然环境条件的石油降解菌剂并进行应用修复等问题还需要进一步研究。
参考文献
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[2] April T M,Foght J M,Currah R S,et al.Hydrocarbon degrading filamentous fungi isolated from flare pit soils in northern and western Canada.Canadian Journal of Microbiology,2000;46(1):38—49
[3] Atlas R M.Microbial degradation of petroleum hydrocarbons:an environmental perspective.Microbiological Reviews,1981;45:180—209
[4] Swannell R P J,Lee K,Mc Donagh M,et al.Field evaluations of marine oil spill bioremediation.Microbiological Reviews,1996;60:342 —365
自动降解 篇7
敌敌畏(Dichlorvos,DDVP)化学名称:2,2-二氯乙烯基二甲基磷酸酯(C4H7Cl2O4P),是一种具有广谱、内吸、触杀等特点的高效、中等毒性有机磷农药,可用于防治多种虫害。目前,国内外对DDVP的研究报道主要集中在其环境毒理方面。对DDVP的降解方法主要是化学方法,沸石负载TiO2光催化法[2,3]。近年来,对于敌敌畏的微生物降解已有报道,降解菌包括尼古丁节杆菌[4]、木霉[5]、鞘氨醇单胞菌等[6],但是还未见甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)降解菌的报道。本研究利用长期受有机磷农药污染的土壤进行驯化培养,拟从中分离出高效降解菌,为2,2-二氯乙烯基二甲基磷酸酯农药的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
土壤样品采自沈阳地区长期受有机磷农药污染土壤。降解菌分离自所采集的土壤样品。
1.1.2 试剂
DDVP原药含量80%,购自沈阳农药厂;DDVP标准品含量99%,购自沈阳科发新技术开发公司;其余试剂均为分析纯,购自沈阳禹王化玻璃试剂有限公司。
1.1.3 仪器
自动高温灭菌锅LDZX-40(上海申安医疗器械厂);恒温摇床(中科院武汉科学仪器厂);气浴恒温振荡器(江苏金坛市医疗仪器厂);电泳仪(Thermo EC);PTC-200 PCR仪(Bio-Rad);725N型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);气相色谱仪(Thermo Finnigan)。
1.1.4 培养基
无机盐培养基的组成为:MgSO4·7H2O 0.20g,(NH4)2SO4 0.50g,NaCl 1.0g,KH2PO4 0.50g,K2HPO4 1.50g,加蒸馏水至1 000ml,调pH至7.0～7.5。不同驯化时间DDVP分别为100～500mg·L-1。
惟一磷源培养基:MgSO4·7H2O 0.50g,(NH4)2SO4 1.0g,NaCl 1.0g,葡萄糖1.0g,KCl 0.5g,加蒸馏水至1 000ml,调pH 7.0～7.5。
牛肉膏蛋白胨培养基的组成为:牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 10g,琼脂15.0～20.0g,水1 000ml,调pH 7.0～7.5。
1.2 方法
1.2.1 降解菌的筛选
取2g长期受污染的土样放入装有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中,调整DDVP浓度为100mg·L-1,30℃、180r·min-1摇床培养条件下振荡培养5～7d,再以10%的接种量转接入新鲜培养液中。每周转接1次,浓度依次以100mg·L-1递增,连续转接4次,直至DDVP浓度达到500mg·L-1。采用十倍稀释平板法,在以DDVP为惟一碳源的选择性无机盐培养基固体平板划线分离,同样操作重复3次。30℃恒温倒置培养。待平板上出现单菌落后,挑取单菌落分别转接至含DDVP(500mg·L-1)无机盐选择性液体培养基中,留待测定其降解率。
1.2.2 降解菌降解率的测定
农药提取及其分析:取上述培养液6ml(1次/d),8 000r/min离心,去除菌体,取上层清液4mL,加入8mL丙酮,剧烈振荡;再加入氯化钠至饱和,剧烈振荡1min,室温下静置5min,使水相与丙酮相分层,移出上层丙酮,过无水硫酸钠柱,收集流出的丙酮,留待气相色谱测定[7]。以上试验处理均为3次重复。
气相色谱测定条件:美国Thermo Finnigan TRACE GC,NPD检测器;DB-1701P色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm);氧气流量60mL·min-1,氢气流量2.3mL·min-1,氮气流量1.2ml·min-1,检测器温度300℃,进样口温度290℃,色谱柱程序升温度:60℃保持1min,30℃·min-1上升至130℃,5℃·min-1上升至170℃,进样量1.0μL。采用色谱纯丙酮作为溶剂。按峰面积定量。
1.2.3 菌株鉴定
1.2.3.1 生理生化鉴定
生理生化鉴定方法参见文献[8]。
1.2.3.2 基因组DNA提取
菌体基因组总DNA提取、纯化、检测方法参见文献[9]。
1.2.3.3 16S rDNA序列PCR扩增
引物设计[10]:5’端引物:5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’(Escherichia coli bases 8 to 27);3’端引物:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'(Escherichia coli bases 1507 to 1492)。扩增反应体系如下:10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL,dNTP(2.5mmol·L-1)4μL,引物(10pmol·μL-1)各1μL,Taq DNA聚合酶(5U·μL-1)0.4μL,菌体DNA(约50ng·L-1)2μL,加H2O至50μL。
反应条件:95℃变性5min;(94℃、1min, 55℃、1min,72℃、2min)30个循环;最后72 ℃延伸10min,保持10℃。
将PCR产物克隆后,委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.3.4 系统发育树的建立
将所获得的DDW-1菌株的16SrDNA序列在GenBank核酸数据库中进行BLAST比对[5],选择合适序列,利用Clusta1X1.8.3进行分析,通过MEGA3.1软件分析生成系统发育树。
1.2.4 降解酶定位
牛肉膏蛋白胨培养基,30℃、180r/min培养48h。4℃、6 000r/min,收集菌体及发酵液,菌体pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤、重悬,超声破碎、离心,分别收集碎片、上清。上清液即为胞内粗酶液。将发酵液、上清液、菌体碎片分别加到500mg/L的敌敌畏溶液中,8h后测降解率。以上试验处理均为3次重复。
2 结果与分析
2.1 降解菌株的分离与鉴定
从富集液中筛选到一株以DDVP为惟一碳源或磷源进行生长的细菌,命名为DDW-1。在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落乳白色、圆形、不透明、边缘整齐、表面微隆起、湿润光滑。在无机盐-DDVP培养基上菌落呈亮粉色。菌体呈长杆状,革兰氏染色阴性,甲基红阳性(弱),V.P.反应阴性,吲哚实验阴性,接触酶测定阳性(弱),葡萄糖,乳糖,蔗糖发酵不产气,产极少量酸。
DDW-1菌株16SrDNA序列构建的系统发育树见图1。菌株DDW-1位于Methylobacterium sp.分支上,与Methylobacterium sp.的相似性达到99%。结合形态结构和生理生化试验结果,将DDW-1归属为甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)。
2.2 DDW-1的生长及降解曲线
在惟一碳源培养基中,添加DDVP至浓度为500mg·L-1,以10%的接种量接入DDW-1,以灭活的DDW-1为对照,30℃、180r·min-1摇床培养,每隔1 d取样测定菌体OD值以及培养基中DDVP的含量(图2)。
从图2可以看出,随着菌体OD值增加,降解率也随着增大,在培养5d后,菌体浓度达到最高,降解率也最大,可达到74.9%。农药的微生物降解实质是酶促反应,这些酶是微生物固有的,或是由于变异产生的[11]。DDW-1菌株能够降解DDVP,可能是因为其体内存在可以分解DDVP的酶,有研究表明降解酶往往比微生物本身更具有好的降解效果[12]。因此,随着菌体增长,菌生物量改变,可能导致降解DDVP酶的改变,从而影响DDVP的降解效能。
在以DDVP为惟一磷源、碳源生长时,生长极其缓慢,4d后OD600仅为0.02,同样降解率也不高,仅有20%左右。
另外,将DDW-1接种于不同浓度的DDVP-无机盐培养基中,其耐受底物浓度可高达1 000mg·L-1。最适生长浓度在500mg·L-1。
2.3 温度对DDW-1的影响
在惟一碳源培养基中,DDVP至浓度为500mg·L-1,pH 7.0～7.5,以10%的接种量接入DDW-1,以灭活的DDW-1为对照,分别在20、25、28、30、35℃的不同恒温摇床培养箱(180r·min-1)培养,4d后测定吸光度值以及DDVP的残留量。
由图3可知,在28℃时,菌生长最快,并且在该温度下,DDVP的降解率最高,为63.7%。这进一步证明,菌体生长与DDVP的降解密切相关。另外,该菌在20～35℃范围内均能生长良好,对DDVP的降解率都达到40%以上,这说明DDW-1能够在较广的温度范围内降解DDVP。
2.4 pH对DDW-1的影响
在惟一碳源培养基中,DDVP至浓度为500mg·L-1,调节初始pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10,以10%接种量接入DDW-1菌液,设灭活的DDW-1为对照,1d/次测定其OD值,4d后测定其降解率。在pH 3、pH 4、pH 10时菌体均不能生长,另外,降解实验表明,碱性条件下降解效果要优于酸性条件,在碱性条件下DDVP降解更快,降解率更高,3d后降解率可达到80%以上。这可能由于DDVP在碱性条件下更容易降解。由图4可知,pH对菌的生长影响也较大,在pH 7菌体生长最佳。
2.5 降解酶定位
8h后测定发酵液、细胞裂解液、菌体碎片、菌体对敌敌畏的降解率分别为0.27%、29.80%、3.73%、8.26%。据此刻推断该酶为胞内酶。
3 讨论
本实验筛选到一株能降解DDVP的甲基杆菌(Methylobacterium sp.) ,目前还未见甲基杆菌属有降解DDVP功能菌株的报道。该DDW-1菌株能够以DDVP作为惟一碳源生长,同时以DDVP为惟一碳源和磷源时,生长极其缓慢,4d后OD600仅为0.02,同样降解率也不高,仅有20%左右。这很有可能说明该菌株不能直接以DDVP做为磷源,而需要在菌体生长初期加入少量的磷。姚杰等研究了DDVP在环境中能发生降解归转,部分水解产生PO43-[13],因而,菌株DDW-1在以DDVP为惟一碳源、磷源时,很有可能利用DDVP部分水解时产生的磷,从而启动生长繁殖。这与段雪梅等研究的结果相似[14]。
另外,酶定位实验表明,该菌产生的酶为胞内酶。菌株DDW-1在生长过程中,缓慢的分解农药作为营养源。大多数有机磷降解酶类为胞内酶,且多为水解酶。最近有研究表明有的菌株能通过有机渗透机制来降解DDVP[15],还有研究认为细胞色素CYP201A2在有机磷生物降解中起着重要作用[16]。该菌参与敌敌畏降解过程中,随着菌体OD值的增加,降解率也随着增大,在菌体生长到稳定期时,对DDVP的降解率达到74.9% 。推断该菌株能将DDVP完全降解,具体代谢途径有待进一步研究。
降解特性的研究表明,该菌株能够在20～35℃范围内很好地降解DDVP,在pH 4～10之间菌体能够生长。温度对菌的生长影响不大,pH对菌的生长以及DDVP的降解较大都有较大的影响。在碱性条件下该菌的降解效果最优,但是综合实际应用考虑,选择菌体的最佳生长条件较为适合。该菌的最佳生长pH值为7,最佳生长、降解温度为28℃。
4 结论
4.1 实验筛选到一株能降解DDVP的菌株DDW-1,该菌株属于甲基杆菌属(Methylobacterium sp.),该DDW-1菌株能够以DDVP作为惟一碳源生长, 另外,该菌亦可以以对硫磷、甲胺磷、甲基异柳磷、辛硫磷作为惟一碳源生长。
4.2 该菌的最佳生长pH值为7,最佳生长温度为28℃。在该条件下,500mg·L-1DDVP经过DDW-1菌株代谢3d后,降解率达63.7%。