纤维降解菌（精选10篇）
纤维降解菌 篇1
摘要：利用刚果红稀释平板法选育纤维素降解菌, 从安徽省山区的树上分离出一株具有较强纤维素降解能力的霉菌。在好氧状态下, 以高温灭菌后的稻草和稻壳酒糟为降解对象, 72h可以降解20%以上的粗纤维, 该菌在稻草制造乙醇方面具有较好的工业化应用前景。
关键词：粗纤维,稻草,降解
引言
植物体内的纤维素是地球每年接受太阳能量最大的储藏体, 据统计, 全球每年通过光合作用产生的植物高达1.8×1011t, 这些植物所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍。在生物界, 结合于有机体中的炭达27×1010t, 据测算, 植物界中纤维素总量约达26.0×1010t, 而且还在不断更新和积累, 可以说, 纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源[1~3], 我国每年达6亿t以上[4]。稻草是草类纤维原料中纤维较短而细的一种, 其纤维平均长度为1mm左右, 宽度仅8μm左右, 细胞上明显的纹孔或不甚明显的纹孔, 胞腔较小[5]。
利用自然或人工改造的微生物将植物体内纤维素材料转化为可直接利用的液体燃料, 是人类解决过多依赖化石能源的一条重要途径[6~7]。筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。本研究从安徽省某山区树木上分离出一株具有较高粗纤维降解能力菌株, 在好氧状态下, 72h之内, 可以将以上废物中20%以上的粗纤维转化为糖类, 该技术在稻草制造乙醇方面具有较好的工业化应用前景。
1 菌种的选育方法[8~9]
1.1 选育原理
利用纤维素降解菌在刚果红培养基内以CMC-Na为主要炭源, 产生水解圈, 通过观察水解圈的大小的方法进行纤维素降解菌的初步筛选。
利用滤纸条培养基进行纤维素降解菌的复筛, 通过菌株将滤纸条内粗纤维降解为糖类, 通过测定糖类和测定CMC-Na酶活吸光值指示该菌分解粗纤维的能力, 供筛选用。
1.2 培养基的准备
(1) 刚果红培养基
(NH4) 2SO4 (2.0g/L) ;Mg2SO4·7H2O (0.5g/L) ;K2HPO4 (1g/L) ;Na Cl (0.5g/L) ;CMC-Na2g/L;刚果红0.4g/L;琼脂:20g/L;p H:7.0;121℃灭菌30min备用。
(2) PDA培养基
葡萄糖20g;琼脂20g;马铃薯液1000ml;200g马铃薯去皮挖眼切小块入1000ml蒸馏水中煮沸30min, 用纱布过滤后加入葡萄糖和琼脂, 加蒸馏水补足至1000ml。121℃灭菌30min备用。
(3) 筛选培养基
滤纸条若干;蛋白胨 (2.0g/L) ;酵母粉 (2.0g/L) ;无机盐 (100ml/L) ;121℃灭菌30min备用。
(4) 固体培养基
稻糠皮 (10%) ;玉米粉 (4%) ;稻草粉 (52%) ;稻壳酒糟 (32%) ;尿素 (1%) ;酵母粉 (0.4%) ;碳酸钙 (0.3%) ;磷酸二氢钙 (0.3%) 。
1.3 初步筛选步骤
(1) 将样品放入富集培养瓶内进行菌种富集, 37℃下用蒸馏水震荡30min, 150r/min。
(2) 配成10-2、10-3、10-4、10-5, 4个数量级样品。
(3) 每个平板内倒入18ml刚果红培养基。
(4) 用无菌吸管吸取适量菌液均匀涂布于刚果红平板内, 每个数量级做3个平行。
(5) 37℃无菌培养箱培养48h后记录水解圈及菌株生长情况。
1.4 复筛步骤
(1) 利用接种针挑取有水解圈的菌株转入斜面保存, PDA培养基。
(2) 37℃无菌培养箱培养48h。
(3) 挑选长的好的菌株进行摇床培养, 培养基为不加琼脂的PDA培养基。
(4) 纯化, 接入斜面保存, PDA培养基。
(5) 利用接种针将菌株从二次纯化斜面挑入筛选培养基, 进行摇床培养。转速106r/min;30℃。直至某些菌株将滤纸分解完全为止。
(6) 72h后观察筛选培养基内菌种生长情况, 记录实验现象, 以供筛选。
(7) CMC-Na酶活吸光值的测定;离心液中葡萄糖吸光值的测定;连续测3d。
(8) 根据其吸光值的大小, 筛选出酶活吸光值和葡萄糖吸光值较大的菌株。
2 实验方法
(1) 将菌株进行摇床培养扩培。转速106r/min;30℃, 培养基为不加琼脂的PDA培养基。
(2) 稻草和酒糟培养基121℃灭菌30min备用。
(3) 按菌液:稻草和酒糟培养基为1:100进行喷洒接种, 并且调节好干湿比。
(4) 30℃培养箱好氧培养72h;每日翻堆2~3次。
(5) 根据国家标准《饲料中粗纤维测定方法》 (GBT6434-2006) 测定原样和降解样品中粗纤维的含量, 计算粗纤维降解率。
3 酶活及含葡萄糖量吸光值的测定[10~11]
3.1 CMC-Na酶活吸光值的测定
(1) 取筛选培养基培养液4ml于离心管中4000r/min, 离心5min, 上清液为粗酶液。
(2) 取0.5ml离心液, 加入1%CMC-Na溶液2ml。
(3) 放入50℃水浴锅中糖化30min。
(4) 取出后加入2.5ml DNS试剂, 沸水浴10min, 冷水浴3min。
(5) 用722N分光光度计比色, 550nm, 1cm比色杯。
(6) 同样方法做空白。
3.2 离心液中葡萄糖含量吸光值的测定
(1) 取筛选培养基培养液4ml于小离心管中4000r/min, 离心5min, 上清液为粗酶液。
(2) 取离心液3ml倒入试管。
(3) 加入5ml DNS试剂, 沸水浴10min, 冷水浴3min。
(4) 用722N分光光度计比色, 550nm, 1cm比色杯。
(5) 同样方法做空白。
4 实验结果
小结:CMC-Na酶活吸光值为负值, 可能是取样较少, 导致酶活检测不出, 由于酶活随时间变化较大, 该吸光值在本研究仅作为各个菌株之间的比较, 数据供筛选用。当取样较多时, 葡萄糖吸光值可以测出, 通过显色反应, 指示出某菌株将滤纸中粗纤维降解为葡萄糖的量, 供筛选菌株借鉴用。
小结:从15个样品中各个数据和实验现象等因素综合考虑, 2号样品的降解滤纸和利用滤纸中粗纤维能力最强, 选定2号菌作为纤维素降解菌培养。
小结:通过实验观察, 原样品粗纤维呈现条状亮晶状, 颗粒较大, 半透明。降解后样品的粗纤维呈现毛屑状, 深色, 主要以絮状形态存在, 初步判断属于半降解态, 如果降解时间延长, 其粗纤维含量有望进一步降低。
5 结论
(1) 通过形态分析, 确定2号菌属霉菌, 好氧。
(2) 2号菌具有较强的粗纤维降解能力, 实验研究表明, 以高温灭菌后的固体培养基为降解对象, 在好氧状态下, 72h, 可以将以上物料中20%以上的粗纤维转化为糖类, 该技术在稻草制造乙醇方面具有较好的工业化应用前景。
(3) 纤维素降解菌的筛分过程中, 不能仅依靠水解圈的大小作为筛选的依据, 2号菌的水解圈并不是很大, 多数细菌水解圈的大小是它的若干倍, 但是, 其真正的降解能力确是很低的, 所以, 在筛选纤维素降解菌时, 不能够仅凭水解圈大小来进行挑选。
(4) 通过测定酶活和糖的分光光度值的大小来筛分纤维素降解菌具有一定的借鉴意义, 但该菌的最终降解能力也不能够完全据此判断, 不同菌体生长速度不同, 其降解纤维素的能力差别很大, 所以不能够完全依赖其酶活和糖类多寡判断。
(5) 最终确定应当看其最终降解滤纸粗纤维的能力大小, 包括将滤纸物理形态的破坏能力, 破坏后滤纸的形态如何, 是否分解或仅仅改变物理形态, 基本的化学组成是否发生改变等等。
6 展望
通过实验可初步确定2号菌株具有较好的实际应用前景, 比如可以与其它菌株配伍, 制成相关固体废物处理的生物制品或利用其产生纤维素酶较好的优势作为相关酶制剂的微生物, 也可以在2号菌株的基础上构建纤维素分解工程菌, 拓宽其应用领域和功能, 可以在印染、制药、制乙醇、工农业废水治理等领域得到应用。
参考文献
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纤维降解菌 篇2
两株甲苯高效降解菌降解性能的比较
利用自行研制的玻璃龙头塞三角瓶对2株甲苯降解高效菌的甲苯降解性能进行了测定和比较.在纯培养和以甲苯为单一碳源条件下进行摇瓶实验,结果发现,在初始液相浓度为0～75mg/L范围内,甲苯不会对2株菌的甲苯降解活性产生抑制作用.2株菌对甲苯进行降解的.适宜pH值约为7～8,适宜温度范围为28～37℃.比较适宜条件下甲苯降解动力学参数可知,2号菌的甲苯降解性能优于1号菌,其最大比基质降解速率和表观最大比增殖速率分别为0.40h-1和0.18h-1.
作 者：席劲瑛 胡洪营 朱洪博 钱易 XI Jin-ying HU Hong-ying ZHU Hong-bo QIAN Yi 作者单位：清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点实验室,北京,100084 刊 名：中国环境科学 ISTIC PKU英文刊名：CHINA ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)： 25(z1) 分类号：X172 关键词：甲苯 降解性能 摇瓶纤维降解菌 篇3
关键词：噻吩磺隆；丁香假单胞菌；生物降解
中图分类号：X172 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0369—04
噻吩磺隆（thifensulfuron-methyl）属磺酰脲类除草剂，其化学名称为3-（4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基）-1-（2-甲氧基甲酰基噻吩-3-基）-磺酰脲，常用作茎叶处理剂，通过抑制植物的乙酰乳酸合成酶（ALS）活性，干扰支链氨基酸的合成，最终导致敏感植物停止生长并死亡，目前在我国已广泛用于防除小麦、玉米、大豆等作物田间的阔叶杂草。噻吩磺隆在农业上的广泛应用在提高农业生产效率方面发挥了重要作用，但噻吩磺隆的残留也对生态环境、食用农产品安全及人类健康带来了诸多不利影响，并会对一些敏感农作物产生药害，有时甚至会严重影响到下茬作物的正常生长。
已有研究表明，磺酰脲类除草剂的降解可包括光解、水解和生物降解等多种途径，并认为微生物的降解作用是磺酰脲类除草剂的主要降解途径。例如，Jean等发现噻吩磺隆在未经灭菌处理的土壤中能快速降解，而在灭过菌的土壤中降解速度却非常缓慢，表明土壤中的微生物对噻吩磺隆的降解起到了关键作用。目前，有关微生物降解噻吩磺隆这一领域的研究工作报道较少，已有文献仅报道了一些噻吩磺隆降解菌株的分离以及相关降解特性的测试。例如，Geraldine等从土壤中分离获得了1株伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepa-cia），该菌株可较快地降解噻吩磺隆；黄星等人从土壤中分离到1株能高效降解噻吩磺隆的寡养单胞菌（Stenotroph-omonas sp.），并對该菌株的降解特性进行了系统研究；Hugh等则报道了7种可降解噻吩磺隆的细菌或放线菌。本研究以筛选出噻吩磺隆高效降解菌为研究对象，研究该菌株的生理生化特征及应用性能，以期为后续的应用研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试剂与培养基
噻吩磺隆（≥98.5%）购自上海市农药研究所，噻吩磺隆标准品购自Sigma-Aldrich公司（美国），本试验中所用其他化学试剂均为分析纯或以上级别。
无机盐培养基：1.0 g NH4N03，0.5 g KH2P04，1.5 gK2HP04，0.5 g NaCl，0.2 g MgSO4·7H2O，1 L蒸馏水，pH值7.0。在无机盐培养基中加入噻吩磺隆即为噻吩磺隆分离培养基。
富集培养基：4 g牛肉浸出粉，10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g酵母浸出粉，1 L蒸馏水，pH值7.0。制作培养平板或者斜面时，在培养基中加入2%的琼脂。
1.2仪器
安捷伦1260/6430高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（美国），安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（3.0×100 mm，1.8-Micron），IKATM匀浆机（德国），振荡培养箱（太仓华美），氮吹浓缩器，岛津UV-2550分光光度计（日本）。
1.3噻吩磺隆降解菌的分离与鉴定
用于分离噻吩磺隆降解菌的土壤样品取自四川遂宁农田，取土耕地使用磺酰脲类除草剂已有5年以上历史。在100 mL噻吩磺隆无机盐培养基（噻吩磺隆浓度为50 mL/L）中加入2.0 g土样，在30℃下振荡培养5 d（150 r/min）。检测降解效果，若5 d降解率大于30%，则吸取5 mL培养液转接到相同浓度的噻吩磺隆富集培养基中，并连续转接5次（若降解率不足30%，则重新取土样重复上述过程）。再次验证降解效果后，在噻吩磺隆无机盐培养基平板上涂布上述富集培养液，在30℃下倒置培养，挑取生长旺盛的菌落在培养平板上反复划线分离以得到纯培养物。最后，分离得到的纯培养物被接种到富集培养基上保存备用。
菌种的生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey’s Mannual 0f Determinative Bacteriology》（9th edi-tion）进行，同时按照16S rRNA序列分析法进行菌种鉴定。
1.4降解菌株16S序列的测定
总DNA的提取采用CTAB法，16S rDNA引物设计参见文献[9]：
正向引物为5′-AGAGrITTGATCCTGGCTCAG-3′；
反向引物为5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。
扩增反应体系如下：5.0μl 10×聚合酶反应缓冲液，4.0 μL dNTPs（2.5 mmoL/L），1.0μL引物（25μmoL/L），6.0μL Mg2+（25 mmoL/L），1.0μL模板DNA（浓度约为50 ng/μL），0.3 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50μL。反应条件：95℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃75 s，30个循环；72℃10 min。扩增产物的测序由上海生工公司完成，后将所测序列输入GenBank数据库进行相关分析。
1.5噻吩磺隆的定量分析
提取：称取10.0 mL（或固体样品10.0 g）待测样品于100 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL提取液（pH值7.8的磷酸盐缓冲溶液与甲醇等体积混合），加盖后振荡45 min（120 r/min），超声萃取5 min，布氏漏斗抽滤，滤液转移至50 mL容量瓶中，用提取液清洗、转移并定容至50 mL。移取20 mL上述溶液在40℃水浴中减压浓缩至10 mL，加10 mLpH值2.0的磷酸盐缓冲液并调节最终pH值至2.0～3.0。
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净化：依次用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL提取液淋洗活化固相萃取柱（Oasis HLB：200 mg，6 mL），将上述待净化液转移上柱，抽干。再用6 mL乙腈洗脱，收集至刻度管中，40℃氮吹至近干，取2.0 mL体积分数为50%的甲醇水溶液溶解样品，过0.22μm滤膜，待测。
測定：用安捷伦1260/6430高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪进行分析，外标法定量。流动相[A相（0.1%甲酸+4 mmoL乙酸铵），B相（甲醇），等度洗脱]，质谱采集参数（母离子388，子离子141/167，碎裂电压125，碰撞能量10/10）。
1.5接种体的准备
在肉汤培养基中培养所筛选的降解菌株，并通过离心方式收集菌体（6 000 r/min离心5 min），收集到的菌体用无菌水洗涤3遍后再用无菌生理盐水重悬，使D600nm=1.0，该悬浮液用作后续降解试验的接种体（特别标注的除外）。
1.6温度对菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影响
在以噻吩磺隆为唯一碳源的無机盐培养基（噻吩磺隆浓度100 mg/L，pH值7.0）中接种3%的上述接种体，然后分别置于20、25、30、35、40℃条件下振荡培养，每隔24 h以无菌操作的方式取样1次，测定噻吩磺隆残留浓度及D600nm值。
1.7 pH值对菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影响
将含有100 mg/L噻吩磺隆的无机盐培养基的pH值分别调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后分别接种3%的接种体，置于30℃下振荡培养，定时取样监测噻吩磺隆降解情况及D600nm值。
1.8菌株LXL-3对噻吩磺隆的耐受性
在含有不同浓度噻吩磺隆（50～800 mg/L）的无机盐培养基中分别接人菌株LXL-3，然后在30℃下振荡培养，定时取样测试D600nm，用以评价噻吩磺隆浓度对菌株LXL-3生长的影响。
1.9菌株LXL-3对NaCl的耐受性
调节无机盐培养基（含有100 mg/L噻吩磺隆）中的NaCl含量，使其NaCl含量分别为0.5%（作参照）、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%（共6组），然后分别接人等量的菌株LXL-3，在30℃下振荡培养，定时取样测试D600nm，用以评价菌株LXL-3对盐的耐受性。
1.10应用菌株LXL-3降解土壤中的噻吩磺隆
土壤样品取自四川省遂宁市射洪县农田，分4组，A组：灭菌土壤（新鲜土壤于121℃下灭菌30 min）；B组：新鲜土壤；C组：灭菌土壤中添加菌株LXL-3；D组：新鲜土壤中添加菌株LXL-3。另外，每组中噻吩磺隆浓度均为100 mg/kg。最后将其置于30℃下培养，每隔24 h取样测定噻吩磺隆的残留浓度。
2结果与分析
2.1噻吩磺隆降解菌株的鉴定及特性
从土壤中分离到1株能以噻吩磺隆为唯一碳源的菌株，将其命名为LXL-3。该菌株为稍有弯曲的杆状菌，大小为（0.5～0.8）μm×（2.0～2.5）μm，革兰氏阴性，有1～7根鞭毛，可运动，不产芽孢，好氧生活，在营养肉汤平板上可形成表面湿润的圆形菌落。氧化酶、接触酶、明胶液化试验及V.P试验均为阳性，而淀粉水解试验和反硝化试验呈阴性。菌株TJXL-3经鉴定为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae），其生化鉴定结果与按照16S rRNA分析方法所得到的结果一致（菌株LXL-3的16S rRNA分析委托上海生工公司完成，GenBank登录号为KP125318）。
2.2温度和pH值对于菌株LXL-3生长及降解噻吩磺隆的影响
菌株LXL-3在25～30℃条件下的生长状况要优于其他温度条件，并且在这一温度下降解噻吩磺隆的效率也最高（图1、图2），在5 d后噻吩磺隆（起始浓度为100 mg/L）的降解率能达到99.0%以上，表明菌株LXL-3生长及降解噻吩磺隆的适宜温度为25～30℃。当温度为35℃时，菌株LXL-3的生长状况以及降解噻吩磺隆的效率会相对差一些，但是仍然处于较高的水平。若温度达到40℃，菌株的生长和噻吩磺隆降解率都会大幅度下降，在40℃下培养48 h，其D600nm和噻吩磺隆降解率分别仅为30℃时的68%、50%。以上结果表明，菌株LXL-3对高温是敏感的，若温度达到或高于40℃，其生长及降解噻吩磺隆的能力都将受到不利影响，因此菌株LXL-3仅适合应用于低于40℃的温度条件。
微生物的生长状况及降解能力等通常会受到pH值的影响。本研究结果表明，培养基的pH值为7.0时，菌株LXL-3的生长要优于在其他pH值条件（图3）；而适宜于菌株LXL-3降解噻吩磺隆的pH值为7.0或7.5，pH值为6.0时则降解率显著降低（图4），说明菌株LXL-3的生长与噻吩磺隆的降解速度呈正相关。此外，pH值会在一定程度上影响到菌株LXL-3的生长和噻吩磺隆的生物降解，但其4 d后的降解率也显示，pH值对于菌株LXL-3降解噻吩磺隆的影响在降解后期并不十分显著，因为在5个不同的pH值条件下，培养4 d后菌株LXL-3降解噻吩磺隆（起始浓度为100 mg/L）的降解率都可以达到90%以上，表明菌株LXL-3拥有极强的噻吩磺隆降解能力（图3、图4）。已有研究表明，在不考虑生物降解的情况下，在pH值中性时噻吩磺隆最为稳定，在培养基为酸性或碱性时则有利于噻吩磺隆的水解；然而，在本试验中并没有表现出这一现象（图4），可推测这里的降解行为主要是菌株LXL-3的生物降解作用。本试验中的最大降解率发生在pH值中性条件下，这主要是由于菌株LXL-3在中性条件下生长更好，可能会产生更多的降解酶，并且多数降解酶在pH值中性条件下有更大的酶活性。
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2.3噻吩磺隆浓度对菌株LXL-3生长的影响
当噻吩磺隆浓度从50 mg/L升高至250 mg/L時，D600nm值有增加的趋势，表明噻吩磺隆浓度为50 mg/L时不能充分满足试验条件下菌株LXL-3的碳源或能源需求，但在浓度达到250 mg/L时菌株生长达到基本饱和，继续增加噻吩磺隆可能会抑制该菌株的生长。当浓度由250mg/L增加到500 mg/L时，D600nm值有所下降，但统计学上的差异不显著；若增加至1000 mg/L，则菌株的生长受到明显抑制，但仍然可以生长（图5）。因此，初步判定菌株LXL-3在试验条件下能耐受浓度为500 mg/L的噻吩磺隆，在这一浓度下，菌株LXL-3的生长不会受到显著影响。依据本试验结果，可作以下推测：（1）由于500 mg/L的噻吩磺隆不会对菌株LXL-3的生长产生显著影响，故认为菌株LXL-3对噻吩磺隆有很好的耐受性。（2）菌株LXL-3拥有很强的降解噻吩磺隆的能力，能够用于较宽的噻吩磺隆浓度范围；菌株LXL-3显示了更快的噻吩磺隆降解速率（相比较文献报道的噻吩磺隆降解菌株而言）。（3）菌株LXL-3可能能用于噻吩磺隆污染的生物修复，特别是高浓度的噻吩磺隆污染。菌株LXL-3所拥有的噻吩磺隆降解能力可能与分离该菌株的农田土壤长期使用噻吩磺隆农药密切相关，按照记录，相关农田已经有使用噻吩磺隆5年以上的历史。通常，土壤微生物长期持续接触某种人工合成有机化合物可能会诱导出降解该化合物的能力，这些具备了新的降解特性的微生物可能与问题土壤中农药的快速失活密切相关。
2.4 NaCl浓度对菌株LXL-3生长的影响
当NaCl浓度从0.5%升高至4.0%时，所测得的D600nm值未出现显著变化（图6），这表明菌株LXL-3至少能耐受4.0%的NaCl；同时，由于供试培养基中只有噻吩磺隆1种碳源，菌株LXL-3是以降解噻吩磺隆来获取碳源进行生长，表明该菌株在高盐压力下仍可保持对噻吩磺隆的降解能力。此外，当NaCl浓度从4.0%升高至6.0%时，菌株LXL-3的生长受到了较明显影响，D600nm值显著降低，但该菌株仍然能较好地生长；即使NaCl浓度提高至8.0%，菌株LXL-3仍可维持低水平的生长（（图6），因此认为该菌株属中等或以上程度的耐盐菌。菌株LXL-3的耐盐性可能与采样地点的盐碱化有一定关系，微生物持续处于滲透压胁迫环境下，可诱导产生耐盐性能，这一般通过渗透调节或蛋白质调节这2种方式实现。
2.5土壤中噻吩磺隆的降解
通过添加菌株LXL-3到土壤中用以降解土壤中的噻吩磺隆是可行的，添加了菌株LXL-3的土壤中噻吩磺隆的降解率要明显高于未添加菌株LXL-3的土壤，噻吩磺隆（起始浓度是100 mg/kg）的10 d降解率约为90%，14 d降解率则可达到99%以上，趋于完全降解（图7）。然而，在不含菌株LXL-3的土壤中其10、14 d的降解率仅分别为29%、14%，说明菌株LXL-3具有较强的生存能力，并能在土壤中有效降解噻吩磺隆。此外，在新鲜土壤中噻吩磺隆的降解率要稍高于其在灭菌土壤中的降解率，存在于新鲜土壤中的某些拥有噻吩磺隆降解能力的天然微生物可能是导致这一现象的原因。在不含活微生物的灭菌土壤中，经历14 d后其噻吩磺隆的含量下降了14%（图7），噻吩磺隆数量随时间逐渐减少的现象则可能是由水解和光解作用所造成。Andersen等的研究已经证实磺酰脲类除草剂在土壤环境中的降解行为受很多因素的影响，如温度、pH值、光、微生物、土壤类型以及施用的肥料等。
3小结
在本研究中分离到1株能有效降解噻吩磺隆的细菌，该菌被命名为LXL-3，并被鉴定为丁香假单胞菌。在不同的条件下测试了该菌株的生理生化特征和噻吩磺隆降解性能，其中在含100 mg/L噻吩磺隆的无机盐液体培养基中，菌株LXL-3培养48 h后，噻吩磺隆的降解率可达81%以上。菌株LXL-3降解噻吩磺隆的适宜pH值为7.0～7.5，适宜温度为25～30℃。此外，该菌还对噻吩磺隆和NaCl有很好的耐受性，至少能耐受500 mg/L以上的噻吩磺隆和4.0%以上的NaCl。将菌株LXL-3添加到被噻吩磺隆污染的土壤，结果表明该菌株能在土壤中生长并发挥降解噻吩磺隆的作用。因此，菌株LXL-3可用于污染物的生物处理，在后续研究中尝试将菌株LXL-3制作成微生物活菌制剂用于噻吩磺隆及其他相关污染物的生物治理。
纤维降解菌 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌种:侧耳 (平10号) 母种, 东北农业大学食用菌研究室;玉米秸秆:上一年收割的干燥、无污染玉米秸秆。
1.2 方法
玉米秸秆处理与分组 (见表1) 。
玉米秸秆被分成3个处理组, 分别由筛网孔径为1.5 cm (Ⅰ组) 、2.5 cm (Ⅱ组) 、3.5 cm (Ⅲ组) 的粉碎机粉碎, 按照单因素随机分组试验设计, 各处理混合拌匀, 自然pH值, 装袋 (长度17 cm×33 cm, 厚度0.4～0.5 mm) , 灭菌 (1.3～1.4 kg/cm, 30 min) , 待温度降低到室温后接种佛州侧耳菌种, 在22～25 ℃恒温培养, 分别于8, 14, 20, 26, 35天采样, 每次采样各处理取3袋, 去袋, 烘干, 粉碎。
1.3 玉米秸秆木质纤维成分的测定
采用ANKOM220 Fiber Analyzer仪器按照VanSoest分析法分析NDF、ADF、纤维素、ADL的含量。
1.4 数据的处理与统计分析
用DPS 3.01软件和Excel 2003进行统计分析, 差异显著时用LSD法做多重比较。
2 结果
侧耳菌生长正常, 试验进展顺利, 试验过程中未出现菌袋发霉、鼠害等现象。
2.1 粒度对玉米秸秆
NDF降解率的影响 (见表2)
注:同行同项数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
2.2 粒度对玉米秸秆
ADF降解的影响 (见表3)
注:同行同项数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
2.3 粒度对玉米秸秆纤维素降解率的影响 (见表4)
注:同行同项数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
2.4 粒度对玉米秸秆
ADL降解率的影响 (见表5)
3 讨论
3.1 粒度对玉米秸秆NDF、ADF降解的影响
统计结果显示, 粒度增大对玉米秸秆中NDF、ADF的降解有推迟作用。原因在于菌丝首先利用其分泌的超纤维素酶溶解表面的蜡质, 然后菌丝进入秸秆内部并产生纤维素酶、半纤维素酶、内切聚糖酶等, 降解秸秆中的木质素和纤维素。秸秆粒度越小与菌丝的接触面积越大, 越有利于植物细胞壁结构的降解。另一方面, 较大的饲料颗粒可以促进咀嚼和唾液的产生, 日粮中的NDF对于维持乳脂率、瘤胃pH值、VFA产量等具有重要意义。Allen M S[1]报道了用切碎的饲草替代未处理饲草, 唾液分泌量下降5%。当饲草长度小于3 mm时日粮中NDF的含量会提高几个百分点;当饲料NDF的含量低于20%时, 细菌产量下降, NDF每下降1%细菌产量减少2.5%。
3.2 粒度对玉米秸秆纤维素降解的影响
提高秸秆利用效率的关键在于“解放”纤维素, 让瘤胃微生物与纤维素接触更充分。白腐真菌产生的酶使与木质素交连在一起的纤维素和半纤维素游离出来, 同时秸秆细胞内可利用的营养物质也暴露出来, 增加了细胞壁及细胞内容物与消化液的接触机会, 使秸秆的消化率提高。试验统计结果显示, 处理Ⅱ、Ⅲ与Ⅰ纤维素含量随降解时间的延长差异变化在极显著和不显著间波动。可能这一点可以从20～26 d ADL降解率的变化中得到体现。
3.3 粒度对玉米秸秆的ADL降解的影响
试验统计结果显示:随玉米秸秆颗粒增大ADL降解率降低, 降解时间延长的趋势明显;各处理纤维素降解率超过木质素 (ADL) 降解率的时间随着粒度增大而延长。在降解的前8 d, 处理Ⅱ、Ⅲ的ADL降解率均高于其他组分的降解率, 仅处理Ⅰ的ADL降解率略低于纤维素降解率, 这都显示出所选菌种在降解初期对底物的选择性。杜甫佑用白腐菌BP2降解玉米秸木质纤维素, 结果木质素 (33.9%) 降解相对速率最快, 降解纤维素的速率 (19.3%) 最慢, 对木质素具有一定的降解优势, 王宏勋也得到了相似的结论。
4 结论
(1) 侧耳菌对玉米秸秆降解过程中, 木质纤维素成分含量与秸秆颗粒大小呈正相关, 与降解时间呈负相关。
(2) 试验所选侧耳菌对玉米秸秆木质纤维成分中的木质素具有一定的降解优势并且玉米秸秆粒度越大这种选择性越明显。
(3) 经14 d的侧耳菌降解, 处理Ⅲ的ADL含量有较大下降 (6.99%) , 同时纤维素损失较小 (0.37%) 。
参考文献
纤维降解菌 篇5
摘要：用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐驯化液对沈阳某煤气厂土壤进行驯化培养,从中分离筛选到1株苯酚降解菌,编号为MW-1.该菌株最高可耐受1600 mg/L苯酚,其降解性能研究表明:该菌具有较强的苯酚降解能力,在30℃,pH 5.5～7.5,装液量为60 mL,接种量20%,摇床振荡速度120 r/min的条件下,振荡培养6 h后可使400mg/L的苯酚降解率达80%以上.虽然葡萄糖对该菌体的生长及降解苯酚均有一定的抑制作用,但有葡萄糖(600 mg/L)存在的`情况下,该菌对苯酚的降解率仍接近60%.这对处理含有其它碳源的含酚废水具有一定的意义.作 者：刘长风 刘桂萍 刘学贵 张月澜 王丽多 LIU Chang-feng LIU Gui-ping LIU Xue-gui ZHANG Yue-lan WANG Li-duo 作者单位：刘长风,LIU Chang-feng(东北大学,资源与土木工程学院,辽宁,沈阳,110004;沈阳化工学院,环境与生物工程学院,辽宁,沈阳,110142)
刘桂萍,刘学贵,张月澜,王丽多,LIU Gui-ping,LIU Xue-gui,ZHANG Yue-lan,WANG Li-duo(沈阳化工学院,环境与生物工程学院,辽宁,沈阳,110142)
纤维降解菌 篇6
关键词：桦剥管菌,纤维素酶,半纤维素酶,诱导物,温度,pH值,酶学性质
纤维素是地球中存储量最大的可再生资源,通过物理、化学或生物转化的方式可以生成能源替代物质。在地球资源日益枯竭而人类能源消耗迅速增加的今天,开发生产石化能源的替代品已成为全世界关注的焦点[1]。传统纤维素的转化主要通过物理或化学手段,转化效率较低,对环境污染较大。真菌微生物是木质纤维素主要的降解生物[2],利用真菌微生物分泌的胞外酶降解木质纤维素,可低污染、低能耗、高效率地转化利用自然界中的生物质能源。
桦剥管菌(Piptoporus betulinus,P.betulinus)是一种木材褐腐真菌,可以分泌纤维素和半纤维素酶,高效分解纤维素。木材腐朽菌将木纤维分解为简单的碳水化合物,供木腐菌有机体腐生,是森林生态系统中微生物的重要组成部分,在森林生态系统中具有重要作用[2]。揭示木腐菌的木材降解机制,有利于木材保护和森林病害防治。研究和开发利用木质纤维素降解相关酶,在生物质能源利用和环境保护、食品生产和饲料加工、纺织印染和医药生产等诸多领域拥有广阔应用前景[3]。
桦剥管菌属于非褶菌目多孔菌科剥管菌属,专性寄生桦木属树干木质部,褐色腐朽,为药用真菌,嫩时可食用,子实体可分离多孔菌酸、蹄菌酸等多种药用物质,有抑制分枝杆菌、抵抗化脓小球菌生长、抑制小白鼠肉瘤、抵抗小白鼠及猴子的脊髓灰质炎等作用。目前,国内外对桦剥管菌菌种发酵条件以及抗肿瘤物质的研究较多,但系统性研究桦剥管菌生物学特性以及酶学性质较少[4,5]。
本研究采用常规生物学检测,分析不同培养条件下桦剥管菌产两种纤维素酶和两种半纤维素酶的变化,系统地探讨了桦剥管菌中两种半纤维素降解相关酶部分酶学性质,以期为开发新型高效木质纤维素酶系的工程菌提供技术支持,为木材生物防腐剂的开发及经济真菌的培养提供理论依据,为桦剥管菌的药用价值研究提供理论基础。
1 材料
1.1 菌株
桦剥管菌,于2013年东北林业大学凉水自然保护区采集白桦枯立木真菌子实体,用组织分离法得到纯菌丝[6],接种到木屑麦麸培养基中,并于-4℃保存。
1.2 主要试剂
羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、D-葡萄糖、榉木聚糖、D-木糖、甘露聚糖、D-甘露糖、3,5-二硝基水杨酸(DNS),均购自Sigma-Aldrich公司。
2 方法
2.1 菌丝生长速度的测定
取少许木屑、麦麸培养基中的纯菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)的中心位置,待菌丝覆盖整个培养基后取直径约为1.50 cm的菌饼接种于另一个PDA培养基中心(培养皿直径为9 cm),封口后标明接种日期分别放入23℃、28℃气候培养箱中培养,每个温度处理设3个重复,每24 h测量培养基中菌落直径变化,直到菌丝长满整个平皿[7]。
2.2 菌种培养及纤维素酶和半纤维素酶粗酶液的制备
木屑培养基中桦剥管菌菌丝接种到PDA培养基平板上,培养7~10 d;待白色絮状菌丝铺满培养皿,钻取2个相同大小的菌饼,置于2 g产酶固体培养基,于人工气候培养箱中23℃培养数天;向培养基中加入5倍纯化水浸泡12 h;用纱布过滤,去除固体培养物,4 000 r/min离心10 min,得上清液即为粗酶液,用于纤维素、半纤维素酶活性测定[8],每个处理样品做3个重复。
2.3 木质纤维素降解相关酶活性的检测
以1%羧甲基纤维素钠溶液为底物,在40℃、p H值为5.4的条件下反应30 min,还原产物为D-葡萄糖;以2%微晶纤维素溶液为底物,在40℃、p H值为4.8的条件下反应2 h,还原产物为D-葡萄糖;以0.67%榉木聚糖溶液为底物,40℃、p H值为5.0的条件下反应30 min,还原产物为D-木糖;以0.67%榉木聚糖溶液为底物,40℃、p H值为5.0的条件下反应60 min,还原产物为D-甘露糖;均以DNS为显色剂,沸水浴反应10 min,在540 nm处测酶解反应前后吸光度变化。分别用绘制的D-葡萄糖标准曲线、D-木糖标准曲线、D-甘露糖标准曲线计算反应液中还原糖含量及纤维素内切酶的活力和纤维素外切酶的活力[9]、木聚糖酶的活力及甘露聚糖酶的活力[10]。
2.4 不同培养基对桦剥管菌产酶变化的影响
以云杉木屑、白桦木屑、麦麸3种物质为唯一碳源制备固体培养基,以不加诱导物的PDA培养基为对照,用2.2方法培养桦剥管菌,检测粗酶液中的两种纤维素酶活性,每个处理样品设3个重复。以云杉木屑、白桦木屑、玉米秸秆、麦麸4种物质为唯一碳源制备固体培养基,用2.2方法培养桦剥管菌,每3 d取一次菌样,检测粗酶液中的两种半纤维素酶活性,每个处理样品设3个重复。
2.5 两种半纤维素酶部分酶学性质
以白桦木屑为碳源配制产酶固体培养基,在人工气候箱中23℃培养桦剥管菌,取第18天菌样制备粗酶液,检测不同条件下酶活值,探究两种半纤维素酶部分酶学性质;每个处理样品设3个重复[11]。在p H值为3.0~9.0的不同缓冲液条件下,初步测定粗酶液中两种半纤维素酶酶活,寻找酶反应最适p H值。在4℃条件下,将粗酶液分别于p H值为3.0~9.0的不同缓冲液中放置1 h和24 h,测定两种半纤维素酶酶活,计算酶相对活性以探究p H值对酶活稳定性的影响(其中,以初测值的最适p H时的酶活值为100%,相对于最高酶活值,不同p H处理1 h和24 h后的酶活以百分数表示,为相对酶活性)。最适p H值的条件下,分别测定30~80℃不同反应温度时粗酶液中两种半纤维素酶酶活,寻找酶反应最适温度。将粗酶液在30~80℃不同温度下分别保温1 h和24 h,在最适p H值的条件下测定两种半纤维素酶酶活,探究温度对酶稳定性的影响(其中,以初测值的最适温度时的酶活值为100%,不同温度处理1 h和24 h后的酶活性,以百分数形式表示相对酶活性)。在50℃和最适p H值条件下,分别在反应体系中加入下列金属离子:Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+和金属离子抑制剂EDTA,平衡时浓度为5 mmol/L和10 mmol/L,参照样不加金属离子,测定粗酶液两种半纤维素酶酶活。在50℃和最适p H值的条件下,测定粗酶液中两种半纤维素酶在不同底物浓度时的酶活,采用Lineweaver-Burk作图法作米氏方程,确定米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax),初步研究两种半纤维素酶反应动力学性质。
3 结果与分析
3.1 桦剥管菌生物学特性
见图1。
由图1可见,桦剥管菌于28℃培养,前2 d处于调整期,生长速度缓慢,第3天进入快速生长期,第5天生长速度减慢,第6天菌丝长满整个培养基,经计算平均菌落直径变化为1.3 cm/d。在23℃条件下,前3 d菌落直径变化较小,在第4天进入快速生长期,第7天生长速度减慢,于第8天菌落直径达到9.0 cm,经计算平均菌落直径变化为0.94 cm/d,可见桦剥管菌在28℃培养环境生长速度快于23℃培养环境。
3.2 不同培养基中纤维素和半纤维素降解相关酶活性变化
3.2.1 纤维素外切酶活性检测结果
见图2。培养初期对照样酶活相对较高,培养6天时3个诱导样中的酶活变化不大,酶活仍低于对照样,培养后期麦麸持续诱导桦剥管菌产纤维素外切酶,于12天达到峰值,高于其他培养基产酶量,白桦木屑、云杉木屑诱导样酶活较低;12天白桦木屑诱导样酶活下降。从检测结果看麦麸对桦剥管菌纤维素外切酶诱导作用最强,优于无诱导对照样和云杉木屑和白桦木屑。
3.2.2 纤维素内切酶活性检测结果
见图3。培养初期4个处理中酶活均逐渐降低,除麦麸诱导样,12天酶活均略有所上升。由于缺乏诱导物的存在,对照组产酶量最低,培养时间内酶活相对稳定,12 d内的酶活变化不大。相对于其他两个诱导样,白桦木屑诱导样产酶量较低,略高于对照组;麦麸样品与其他样品酶活差异较大,3 d酶活远高于其他处理,12 d内酶活持续下降。云杉木屑诱导样酶活相对较高,12天酶活迅速增高,远高于其他处理酶活。从检测结果看,云杉木屑对桦剥管菌纤维素内切酶诱导作用最强,优于麦麸和白桦木屑。
3.2.3 木聚糖酶活性检测结果
见图4。云杉木屑、白桦木屑、玉米秸秆3种培养基中,15~21 d木聚糖酶酶活性差异不明显,24 d酶活开始下降;麦麸培养基中该菌酶活逐渐增高,24 d酶活达到最高值,还有继续增高趋势,经计算,麦麸21天酶活是玉米秸培养基最高酶活(21天)的1.24倍,是白桦木屑培养基(21 d)最高酶活的1.57倍。从检测结果看,麦麸对桦剥管菌木聚糖酶诱导作用最强,草本植物秸秆诱导作用优于云杉木屑、白桦木屑两木本植物纤维。
3.2.4 甘露聚糖酶活性检测结果
见图5。培养初期,4种培养基中酶活都迅速上升,玉米秸秆中酶活上升相对较快,18天时酶活高于其他培养基;21天时各培养基中酶活均达到峰值;第24天各培养基中酶活均有所下降,玉米秸中酶活下降不明显,麦麸降幅最大。从检测结果看,各培养基可诱导桦剥管菌产较高甘露聚糖酶,但就持续诱导能力而言,玉米秸秆对桦剥管菌产甘露聚糖酶诱导作用优于麦麸,草本植物秸秆作用优于白桦木屑、云杉木屑培养基。
3.3 两种半纤维素酶部分酶学性质研究
3.3.1 反应最适p H值及p H值稳定性
以白桦木屑为碳源配制产酶固体培养基,在人工气候箱中23℃培养桦剥管菌,取第18天菌样,分别以0.67%榉木聚糖、0.67%甘露聚糖,检测桦剥管菌产木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶在不同p H值酶促环境中活性变化。p H值对木聚糖酶活性的影响见图6。由图6可见,最适p H值为5.0,p H值4.5~6.0之间酶活较高,经计算相对酶活大于最高酶活75%;p H值8.0酶活下降,相对酶活低于25%;p H值9.0酶活性略有升高,相对酶活高于50%。
p H值对甘露聚糖酶活性的影响见图7。由图7可见,酶在p H值4.5~7.0之间酶活力较高,相对酶活在50%以上;最适p H值为6.0,p H值8.0时酶活略有下降,相对酶活为40%;p H值9.0时酶活略有上升,相对酶活大于50%。
在4℃条件下,将粗酶液在不同p H值缓冲液中放置1 h和24 h,检测木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶残存酶活力,结果见图8、图9。由图8可见,p H值6.0时木聚糖酶酶活最为稳定,p H值稳定范围在5.0~6.5之间,在最适p H值5.0时酶活定性并不是最高,粗酶液在此p H值范围内放置1 h,相对酶活均能保持在70%以上;放置24 h相对酶活均能保持在60%以上。结果说明桦剥管菌木聚糖酶p H值稳定性较好。
由图9可见:不同p H值处理粗酶液1 h,酶在最适p H值6.0酶活的稳定性较好;p H值稳定范围在4.5~6.5之间,相对酶活均能保持在75%以上;不同p H值处理粗酶液24 h,相对酶活均低于10%。检测结果说明桦剥管菌甘露聚糖酶的p H值稳定性较差。
3.3.2 酶反应最适温度及热稳定性
以白桦木屑为碳源配制产酶固体培养基,在人工气候箱中23℃培养桦剥管菌,第18天取菌样,以0.67%榉木聚糖、0.67%甘露聚糖为底物,最适p H值条件下,检测桦剥管菌产木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶在不同温度(30~80℃)酶促环境中活性变化,木聚糖酶活变化见图10。由图10可见:酶活性随温度升高逐渐增加,50℃时达到酶活峰值;温度继续升高酶活逐渐下降,在45~65℃之间酶活相对较高,可保持在最高酶活60%以上,温度升至80℃时相对酶活降至最高酶活的20%。
温度对甘露聚糖酶活性的影响见图11。随温度升高该酶活性逐渐增加,50℃时甘露聚糖酶达到最大酶活值。温度继续升高酶活逐渐下降,在30~60℃之间,相对酶活较高,活性保持在50%以上;当温度达到70℃时残存酶活低于20%。
将粗酶液在不同温度水浴中放置1 h和24 h,最适p H值条件下,检测木聚糖酶、甘露聚糖酶两种半纤维素酶残存酶活力。木聚糖酶活稳定性见图12。在低于50℃的水浴保温1 h后,测得相对酶活随着处理温度升高而逐渐升高;60℃时残存酶活为90%,当处理温度继续升高时残存酶活将会下降。在低于60℃的水浴处理24 h,检测相对酶活不低于60%;当处理温度高于60℃时,随处理温度升高残存酶活性才逐渐下降。结果说明桦剥管菌木聚糖酶常温状态热稳定性较好,适宜在常温条件下贮存。
甘露聚糖酶活稳定性见图13。在低于50℃水浴保温1 h后,相对酶活随着处理温度的升高而逐渐升高;处理温度高于60℃时,相对酶活随处理温度升高而降低。在低于50℃的水浴保温24 h后,相对酶活性保持在60%以上;处理温度高于70℃时,随处理温度提高残存酶活性有所下降,但残存酶活仍不低于30%。说明桦剥管菌甘露聚糖酶常温条件稳定性较好,可在常温保存运输。
3.3.3 金属离子与EDTA对两种半纤维素酶活性影响
在50℃和最适p H值条件下,分别在反应体系中加入金属离子Mg2+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+和金属离子抑制剂EDTA,反应体系中金属离子浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L,对照样不加金属离子,测定粗酶液三种半纤维素酶酶活。结果表明:Ca2+、Co2+、Cu2+对木聚糖酶活均具有促进作用,Fe2+、Fe3+和Mg2+对木聚糖酶活均具抑制作用。Fe2+、Fe3+、Co2+对甘露聚糖酶活均具有促进作用;Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+对甘露聚糖酶活均具有抑制作用;金属离子抑制剂EDTA在5 mmol/L和10 mmol/L两种浓度时,对两种半纤维酶酶活均有较强抑制作用。
3.3.4 两种半纤维素酶反应动力学研究
结果见图14、图15。采用Lineweaver-Burk作图法得米氏方程,最终得到木聚糖酶在50℃时,对榉木聚糖酶底物的Km为0.072 mmol/L,Vmax为0.071 mmol/(L·min),其木聚糖酶与榉木聚糖亲和力较大,该酶对榉木聚糖偏好性较强,但催化速率较慢。甘露聚糖酶底物的Km为3 746.7 mmol/L,Vmax为0.267mmol/(L·min),其甘露聚糖酶对底物甘露聚糖亲和力较小,对甘露聚糖底物偏好性不高,催化速率尚可。
4 讨论
桦剥管菌在23℃、28℃两种不同温度培养下,其生长速度相差较大。在28℃培养时,平均生长速度为1.3 cm/d,生长速度更快,长势更旺。在23℃培养条件下生长缓慢,平均生长速度为0.85 cm/d,可见桦剥管菌的生长受温度影响较大,喜中高温的生长环境。28℃培养,桦剥管菌接种初期长势较弱,3 d后迅速生长,最后生长速度趋于平缓,其在PDA培养的生长速度符合微生物的生长规律,与多数真菌生长速度曲线类似[12]。
纤维素外切酶更偏好麦麸诱导,麦麸对桦剥管菌纤维素外切酶诱导作用优于无诱导对照样,优于云杉木屑和白桦木屑。纤维素内切酶更偏好云杉木屑诱导,云杉木屑对桦剥管菌纤维素内切酶诱导作用优于麦麸和白桦木屑。木聚糖酶更偏好麦麸底物诱导,其对桦剥管菌木聚糖酶诱导作用最强,诱导作用优于玉米秸秆,草本植物秸秆诱导作用优于云杉木屑、白桦木屑两种木本植物纤维。4种培养基均可诱导桦剥管菌产较高甘露聚糖酶,但就持续诱导能力而言,玉米秸对桦剥管菌产甘露聚糖酶诱导作用优于麦麸,草本植物秸秆作用优于白桦、云杉木屑培养基。桦剥管菌纤维素酶和半纤维素酶具有底物偏好性及响应方式的差异,其具体原因还有待于进一步探究。
在酶促反应体系中加入浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L的8种金属离子及EDTA,以检测粗酶液中两种半纤维素酶酶活,结果表明,Ca2+、Co2+、Cu2+对木聚糖酶活均具有促进作用,Fe2+、Fe3+对木聚糖酶活均具有抑制作用;Fe2+、Fe3+、Co2+对甘露聚糖酶活均具有促进作用,Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+对甘露聚糖酶活均具有抑制作用。EDTA两不同浓度对两种半纤维酶酶活均有较强抑制作用。这一结果与尚洁等[13]的结果不太一样,可能原因是金属离子对酶活力的影响因酶的来源不同而有所差异。由于桦剥管菌半纤维素酶性质研究报道较少,未能找到试验条件设定的可参考依据,酶促反应温度、p H值环境、金属离子相对浓度等相关因素,是否对金属离子与酶分子间相互作用的影响尚不清楚,这几种金属离子对酶活影响作用有待进一步探讨。
对两种半纤维素酶进行酶学性质初步研究,以白桦木屑为碳源,23℃培养18 d桦剥管菌产木聚糖酶的反应最适p H值为5.0,p H值稳定范围为5.0~6.5,反应最适温度为50℃,耐受温度低于60℃,热稳定性较好,适宜在常温条件下贮存;50℃、p H值为5.0时,以榉木聚糖为底物,木聚糖酶Km值为0.072 mmol/L,Vmax为0.071 mmol/(L·min)。应用于工业生产的木聚糖酶必须具有耐碱性和耐高温性,郄卫那等[14]认为真菌一般只产低分子质量的耐碱性木聚糖酶,最适反应p H值为4.0~7.0,最适反应温度为40~60℃。嗜热真菌(Talaromyces thermophilus)来源的耐高温木聚糖酶,最适反应酶活为75℃,酶活p H值稳定范围较宽泛,在4.0~9.0之间,p H值在5.0,9.0时,酶活存在两个峰值[15]。本研究中木聚糖酶在p H值为7.0亦有2个峰值,p H值9.0相对酶活力高于50%,p H值稳定性较好,适于工业用耐碱性酶的生产开发。
纤维降解菌 篇7
1 试验材料与方法
a.土壤样品来源 常年堆放秸秆垛下面的土壤;腐烂的秸秆;森林里有机质丰富的土壤。
b.初筛分离平板培养基 KH2PO42.0g、 (NH4) 2SO41.4g、MgSO4·7H2O0.3g、CaCl20.3g、FeSO4·7H2O 0.005g、MnSO40.0016g、ZnCl20.0017g、CoCl20.002g、蒸馏水1000mL, pH值5.5~6.0, 121℃/30min灭菌, 以滤纸为惟一碳源。
c.羟甲基纤维素钠复筛培养基 CMC-Na20g、NaH2PO42.5g、KH2PO41.5g、蛋白胨2.5g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g, pH值7.0~7.2、121℃/30min灭菌。
d.滤纸条培养基 KH2PO42g、MnSO41.6mg、ZnCl21.7mg、CoCl22.0mg、 (NH4) 2SO41.4g、MgSO4·7H2O0.3g、CaCl20.3g、FeSO45mg、蒸馏水1000mL, pH值5.5。于直径为1.5cm、长15cm试管中加入上述无机盐培养基5mL, 加1条去淀粉处理的新华滤纸 (6cm×1cm) 垂直于试管中, 加棉塞121℃/30min灭菌。
e.刚果红鉴别培养基 (NH4) 2SO42.0g、MgSO40.5g、KH2PO41.0g、NaCl0.5g、CMC-Na2.0g、刚果红0.2g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。
f.秸秆纤维素的制备 将水稻秸秆剪成2~3cm小段, 烘干后粉碎至60目, 加入2%的氢氧化钠溶液至固液重量比为1∶5, 在80℃水浴处理1h, 水洗至中性, 烘干备用。
g.滤纸的预处理 将大块滤纸剪成直径近于培养皿大小的圆形, 用1%的醋酸浸泡一昼夜除去淀粉, 用碘液检验, 再用2%NaHCO3洗至中性, 晒干待用。
h.纤维素分解菌的筛选分离方法 将所采土样在灭过菌的滤纸平板上点样, 每个平板4~5个点, 28~29℃培养7d进行初筛。再将初筛出的菌株通过接种于CMC-Na培养基上, 入培养箱中28~29℃培养3d进行增殖, 然后编号放冰箱保存待用。将增殖后的菌株用接种针点种 (5mm菌碟) 于鉴别培养基平板上, 每个平板上点3个点, 28~29℃培养48h, 测溶解圈直径, 将溶解圈大的菌株纯化4℃冰箱保存。
i.滤纸分解度的观察 将发酵液经滤纸过滤, 再经4000r/min离心15min, 再经0.22μm的细菌过滤器过滤所得上清液即为粗酶液, 在试管中加入酶液3mL的酶液, 再加入pH值4.4的柠檬酸缓冲液2mL摇匀后加入滤纸条 (1cm×6cm) 和几滴二甲苯, 置于50℃恒温水浴中静置反应24h后稍加震动, 观察其分解强度并用失重法测定其降解度:滤纸边缘膨胀 (+) ;滤纸整齐膨胀并下弯 (++) ;滤纸不定形 (+++) ;全成糊状 (++++) 。
2 试验结果与分析
2.1 纤维素降解菌的初步分离
从各地采集的样品中共分离到比值大于1的菌株22株, 其中包括木霉菌20株、青霉菌1株、细菌1株, 该细菌的溶解圈直径为30.44mm, 真菌中比值大于1.5的有8株, 分别是M1、M2、M3、M13、M19、M21、DZ、M49, 其中M2、M19生长速度最快, 3d可长满皿, 且产孢量大。其它生长比较缓慢。选择上述两种木霉和一株青霉为试验对象进行下一步试验。其溶解圈的大小如表1所示。
mm
2.2 纤维素降解菌对滤纸降解的测定
由表2可以明显看出, 选定的3株菌对滤纸都有较强的降解作用, M2和M19菌株在酶反应24h后, 滤纸成糊状, 另外各菌种在同等条件下对秸秆都有一定的降解能力。但在不同温度条件下降解率不尽相同, 两株菌在37℃下降解率分别为53.22%和52.37%, 在30℃条件下降解率有所下降。
3 结论与讨论
纤维素的彻底降解是在微生物区系中多种微生物长期相互作用的结果, 这一过程仅靠一种微生物是很难完全实现的。分解纤维素的酶是由多种组分组成的酶系。因此, 在进行纤维素大分子降解的研究过程中要考虑到微生物产酶体系之间的协同效应, 尤其是不同真菌之间具有较强的相互作用。试验筛选出分解秸秆的具有高活性的3株菌株, 通过对滤纸率进行初步的测定, 表明3株菌株均具有较高的降解能力。对菌种的鉴定、抗药性的测定以及在低温条件下对纤维素的降解能力等有待进一步研究。
参考文献
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纤维降解菌 篇8
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌种
菌株采自农村多年堆肥粪堆的底部土壤,由本课题组分离、纯化获得的1株纤维素降解菌,命名为NY06,对照菌株为市场购买的商品有机物料腐熟剂,核心菌株为枯草芽孢杆菌。
1.1.2培养基
培养基为:牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、羧甲基纤维素钠培养基、纤维素-刚果红培养基、滤纸液体培养基、羧甲基纤维素钠液体发酵培养基[5],培养基均在121℃灭菌30min。
1.2 方法
1.2.1透明圈的测定
取待测菌株,分别点接至纤维素-刚果红培养基上,每皿2 点,每个处理3次重复,30℃条件下培养,于48、72、96、120h分别测定各处理的菌落直径(d)和其产生的透明圈直径(D)大小,并计算透明圈直径和菌落直径的比值D/d[6]。
1.2.2滤纸条崩解试验
选取新华1号滤纸,将其剪成同样大小和质量的滤纸条,在无菌条件下,将灭菌的滤纸条转移到150mL滤纸液体培养基中,分别接种200μL菌株NY06和对照菌株的菌液,以不接菌只加滤纸条的培养基作为空白处理CK。25℃、200r·min-1振荡培养15d,观察滤纸条的溃烂和崩解情况,根据滤纸条的降解情况来判断各处理降解纤维素能力的强弱:“+”滤纸边缘膨胀,“++”滤纸整齐膨胀并下弯,“+++”滤纸不定形,“++++”滤纸成糊状。
1.2.3纤维素降解菌酶活力的测定
①粗酶液制备:将菌株NY06和对照菌株分别接入羧甲基纤维素钠液体发酵培养基,在温度为25℃,转速为200r·min-1条件下培养,于12、24、48、72和96h分别取上述菌株的发酵液5.0mL,4 000r·min-1离心10min,取上清液即粗酶液。
②CMC酶活力测定:移取含有0.5%CMC-Na的醋酸缓冲液(0.05mol·L-1,pH4.4)1.5mL于试管中,加入酶液0.5mL,50℃水浴锅准确作用30min,在每试管内加1.5mLDNS试剂,沸水浴5min,立即冷却,定容至25mL(对照应先将酶液沸水浴5min,之后步骤相同),520nm处测定其OD值[7]。
③滤纸酶活(FPA)的测定:将新华1 号滤纸(1cm×6cm)卷成小卷,放进试管内,加入1.5mL HAc-NaAc缓冲液(pH4.8),再加入0.5mL酶液,轻轻摇匀,使滤纸完全浸泡在液体中,50℃保温1h后,在每试管内加1.5 mLDNS试剂,沸水浴5min,立即冷却,定容至25mL(对照应先将酶液沸水浴5 min,之后步骤相同),520nm处测定其OD值[7]。
2 结果与分析
2.1 透明圈的测定
透明圈可粗略判断纤维素降解菌产酶情况,一般透明圈出现越早,酶类产生也越早,透明圈越清晰,说明纤维素降解越彻底,酶类也就越齐全[8]。将菌株NY06和对照菌株分别点接至纤维素-刚果红培养基上,观察透明圈的出现,测定透明圈大小(见图1)。王志超等[9]认为透明圈直径与菌苔直径比值(D/d值)超过2.5的菌株纤维素酶活性高。由表1可以看出,在接种72h后,菌株NY06的D/d值为2.98,对照菌株的D/d值为2.43;在接种120h,对照菌株的透明圈直径(D)为2.39cm、菌苔直径(d)为0.69cm、D/d值为3.46,菌株NY06 的透明圈直径(D)为3.45cm、菌苔直径(d)为0.87cm、D/d值为3.97,分别达到最大值,说明两株菌种均能在纤维素-刚果红培养基上产生清亮的透明圈,根据透明圈情况初步判断菌株NY06的产酶活性大于对照菌株。
2.2 滤纸崩解程度的测定
将菌株NY06和对照菌株分别接种于滤纸液体培养基中,观察滤纸条的崩解程度。结果表明,菌株NY06和对照菌株均能不同程度地分解滤纸,而空白处理CK的滤纸始终没有崩解。菌株NY06处理和对照菌株处理摇瓶中的滤纸第3天时开始崩解,菌株NY06处理的滤纸崩解效果最好,在第12天时滤纸呈糊状,对照菌株处理在第15天时滤纸才呈糊状(见表2)。
2.3 CMC酶和FPA酶活力的测定
将菌株NY06和对照菌株分别接入羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中,培养96h,对其进行CMC酶活性和FPA酶活性的测定,如图2和图3所示,经不同时间培养,菌株NY06 在最初的48h内酶活力增幅较大,在接种48h时CMC酶和FPA酶的OD值达到最大值,分别为0.158和0.108,在随后的48h酶活力下降;对照菌株在最初的24h内酶活力增幅较大,在接种24h时CMC酶和FPA酶的OD值达到最大值,分别为0.140和0.092,在随后的72h酶活力下降。菌株NY06的CMC酶活和FPA酶活的最大值均大于对照菌株,说明菌株NY06较对照菌株对纤维素具有更好的降解效果。
2.4 纤维素降解菌NY06的初步鉴定结果
根据《伯杰细菌鉴定手册》第八版[10]对菌株NY06进行常规生理生化鉴定。
2.4.1菌株的形态特征
菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上呈乳白色,圆形,不透明,边缘为波浪状,有褶皱,有黏度,不易挑取;挑取单个菌落涂片进行显微观察,革兰氏染色为阳性,短杆状细菌,常成对或链状排列,在营养条件贫乏或生长条件不利的情况下有芽孢生成。
2.4.2菌株的生化特性
好氧菌,不能在厌氧环境中生长,生长最适温度为25~30℃,在初始pH8~9 的培养基中生长良好,利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇且产酸,能利用柠檬酸盐,不能利用丙酸盐,水解淀粉,可使明胶液化,产过氧化氢酶。根据以上试验结果,初步鉴定NY06为枯草芽孢杆菌。
3 结论
本试验从农村多年堆肥粪堆底部土壤中分离、纯化获得了1株具有很大纤维素降解潜力的菌株NY06,经初步鉴定,为枯草芽孢杆菌。为检测其降解纤维素能力,进行了透明圈、滤纸崩解、CMC酶活和FPA酶活的测定,试验结果表明,与对照菌株相比,菌株NY06能更早出现透明圈,且透明圈更大,滤纸崩解效果更好;菌株NY06 的CMC酶活和FPA酶活,随接种时间呈先升高后降低的趋势,在接种48h后达到最大OD值分别为0.158和0.108,均大于对照菌株,但产酶高峰期延后24h。虽然,筛选出产纤维素酶活力较高的菌株NY06,但还需要对其进行进一步研究,例如发酵条件的优化、产芽孢条件的优化、降解机制研究和分子生物学鉴定等。
参考文献
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纤维降解菌 篇9
1 材料与方法
1.1 试验材料
原料:牛粪、秸秆堆腐物、稻壳粉;培养基:纤维素粉、刚果红;菌株来源:堆肥、牛粪、秸秆堆腐物分离的纤维素分解菌。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株筛选及性能测定。
将堆肥、秸秆堆腐物样品点接在赫奇逊—滤纸平板上,置于28℃恒温培养,挑选生长速度快、分解滤纸能力强的菌落。将其接入刚果红平皿中,其活性按透明圈与菌落直径大小之比(D/d)计。再将透明圈与菌落直径大的菌株接种到赫奇逊液体培养基中恒温振荡培养,测定滤纸失重率。
1.2.2 堆肥试验。
试验设3个处理,处理1:84%牛粪+16%调理剂+纤维素分解菌剂1‰(FDQ1+FDQ2);处理2:84%牛粪+16%调理剂+纤维素分解菌剂1‰(FDQ1+FDQ3);对照(CK):84%牛粪+16%调理剂。鲜牛粪和鸡粪,以稻壳粉为调理剂调至含水量65%左右,混匀后堆成2.0m×1.5m×1.2m的堆体,根据发酵温度进行翻堆。
1.3 测定项目
滤纸失重率测定:用滤纸过滤发酵液将残留物在80℃下烘干称重,用减重法计算滤纸失重率。(CMC)酶活力:用DNS法测定还原糖的含量。纤维素分解率测定:利用CXC-06型粗纤维测定仪测堆肥发酵前及发酵后中纤维素含量,差值为纤维素分解率。有机质:马福炉550℃灼烧法。全碳测定:重铬酸钾外加热法。纤维素含量测定:重铬酸钾—碘量法。
2 结果与分析
2.1 菌株初筛
从堆肥、牛粪、秸秆堆腐物中分离4株纤维素分解菌。在以Whatman fiberous cellulose powder CF11为唯一碳源纤维素粉培养基中,有4株3~5d长满平皿,且在刚果红培养基中出现透明圈,透明圈与菌落直径比值较大。叶姜瑜研究证明,在纤维素刚果红培养基上,凡能形成红色水解圈的菌落即是能产纤维素酶的菌株。产酶愈多,水解圈愈大,产酶越快,水解圈出现越早。由表1可知,培养5d时,菌株FDQ1和FDQ2的透明圈直径大于4.0cm,透明圈直径与菌落直径比值分别为2.5、2.1,FDQ3和FDQ4的透明圈直径大于3.0cm,透明圈直径与菌落直径比值为2.0和1.9。初步判断FDQ1、FDQ2、FDQ3、FDQ4产纤维素酶能力较强。
2.2 菌株复筛
2.2.1 滤纸降解率。
对透明圈直径与菌落直径比值大的菌株进行滤纸失重研究,其结果见图1。FDQ1、FDQ2、FDQ3的滤纸失重率较高,随着培养时间的延长失重率明显提高,第6天分别达到34.8%、33.2%和30.0%,明显高于FDQ4菌株。
2.2.2 (CMC)酶活力。
以(CMC)酶活力作为复筛指标,将初筛得到的4个菌株在液体发酵培养基中培养5d,菌株FDQ1、FDQ2和FDQ3(CMC)酶活力第4天时达到高峰(图2),其中FDQ1最高,为697.58U/m L;其次是菌株FDQ2和FDQ3,分别为634.85U/m L和601.34 U/m L;FDQ4酶活最低。培养6d时所有菌株酶活力均呈下降趋势。FDQ4培养3d时酶活力虽然达到高峰,但第4天开始下降,且一直低于其他菌株。
2.3 不同菌株间协同效应研究
将滤纸失重率和(CMC)酶活力较高的FDQ1、FDQ2、FDQ3菌株分别以1∶1比例接种于赫奇逊培养液中(以滤纸碎片为唯一碳源)进行双菌混合培养,接种总量为5%。混菌发酵滤纸失重率见图3。可以看出,组合FDQ1+FDQ2、FDQ2+FDQ3、FDQ1+FDQ3均高于单菌培养滤纸失重率,随着培养时间的延长明显提高,第6天时的滤纸失重率分别为44.10%、33.51%、36.04%。FDQ1+FDQ2混合培养的滤纸失重率最高,较单菌分别培养提高26.72%和32.83%;FDQ2+FDQ3双菌混合滤纸失重率与FDQ2基本一致,较FDQ3单独培养时提高11.70%。FDQ1+FDQ3混合培养较单菌提高3.56%和20.13%。说明3个菌株间有协同效应。
2.4 纤维素混合菌剂对堆肥含碳物质转化的影响
2.4.1 使用混合菌剂堆肥有机质的变化动态。
在堆肥过程中,微生物首先利用易降解、结构简单的有机物合成细胞物质,以满足自身生长和繁殖需要,同时也伴随着有机物质的降解。选择FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3进行堆肥,由图4可知,FDQ1+FDQ2、FDQ1+FDQ3在1~3d内有机质含量明显下降,第3天时分别降至57.84%和59.47%;此后进入高温期,第4~5天时温度达到60℃以上,有机质含量的变化趋于平稳。5d后有机质又快速下降。堆肥结束时,FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3分别下降了19.57%和18.40%,对照只下降了6.58%。发酵前后的有机质含量反映出堆肥腐熟程度和堆肥品质。2.4.2使用混合菌剂堆肥全碳含量变化动态。全碳和有机质的含量变化趋势基本相同。初期FDQ1+FDQ2、FDQ1+FDQ3全碳的含量下降较快,对照全碳含量下降速度较慢(图5)。在堆肥的1~7d,FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3全碳含量明显下降,7d后趋缓慢下降,堆肥结束时全碳量分别为31.33%、32.42%,对照为41.20%,全碳量分别较发酵初期降低13.80%、12.71%和3.93%。可见,纤维素分解菌在堆肥中促进了碳素的矿化。
2.4.3 混合菌剂对堆肥纤维素分解率的影响。
接种纤维素分解混合菌剂,纤维素分解率较对照有明显提高,FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3纤维素分解率分别为67.59%和61.87%,较对照(34.64%)提高95.12%和78.61%。说明接种纤维素分解混合菌剂有利于堆肥中纤维素类大分子物质转化,提高堆肥中可溶性小分子有机物质的含量,促进碳素循环,提高堆肥品质。
3 结论
混菌组合发酵滤纸降解率和(CMC)酶活力均高于单菌。堆肥接种纤维素分解混合菌剂能有效地促进有机质转化,提高纤维素分解率,促进碳素的矿化,加快堆肥的腐殖化进程。
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氯嘧磺隆降解菌降解效果研究 篇10
20世纪90年代以来部分地区大面积使用氯嘧磺隆，连续多年使用在土壤中持续积累，在轮作农田中不仅对后茬敏感作物造成严重药害，导致作物减产甚至绝产，而且还可能对土壤环境造成污染。如何清除土壤中长残留的除草剂，解决残留药害是当前世界研究的重要课题。
氯嘧磺隆在酸性和中性土壤中的降解主要靠微生物降解和化学水解;在碱性土壤中，微生物的降解起主要作用[7,8,9]。随着生物技术的迅猛发展，应用微生物进行生物修复己成为环境修复的一个重要内容。现通过筛选氯嘧磺隆降解菌并研究其降解效果，旨在为氯嘧磺隆残留的生物治理提供一条有效途径。
1 材料与方法
1．1材料
从长期使用氯嘧磺隆的大豆田取土，利用限定性培养富集获得氯嘧磺降解菌。
供试水稻品种为垦鉴稻12;试验药剂有氯嘧磺隆20%可湿性粉剂(沈阳化工研究院试验厂生产)。
培养基为无机盐培养基：K2HPO4·7H2O1.6g、KH2PO4 0.4g、MgSO4·7H2O 0.06g、Fe2(SO4)30.03 g、CaCl20.01 g、CuSO40.05mg、ZnSO40.05 mg、NH4Cl 1.0g、HBO30.03mg、琼脂15g、蒸馏水1 000mL。
1．2方法
1．2．1降解菌的富集
取多年施用氯嘧磺隆的土壤用无菌水溶解稀释得到土壤悬浊液，将135mL的富集培养基加入250 mL的三角瓶中(氯嘧磺隆浓度为1g·L-1)，并按10%的接种量接种土壤悬液，置37℃、130r·min-1的摇床培养2d，将培养液按10%接种量接种于氯嘧磺隆浓度为1g·L-1的新鲜富集培养基中，然后在37℃摇瓶培养2d，依次类推5次接种，最终富集得到降解菌株培养物种子。将菌悬液用涂布法在以氯嘧磺隆为唯一碳源的无机培养基上进行分离，37℃培养1d，挑取单菌落反复划线纯化。最终得到纯菌，4℃冰箱保存备用。
1．2．2降解试验设计
试验氯嘧磺隆设5个水平，分别为0、5、10、15、20μg·kg-1。氯嘧磺隆降解菌设5个水平，分别为清水、降解菌发酵液稀释10、100、1 000、10 000倍。每个处理3次重复，共75个处理。
将水稻种子浸种，催芽后待芽长为1mm左右播种。在每个培养皿中铺一张滤纸，将氯嘧磺隆20%可湿性粉剂配成母液，再采用逐步稀释的方法配成试验所需的各浓度药液，每个培养皿放15mL各浓度药液，对照放15mL清水。再向每个平皿中加入15mL的稀释菌液，使菌达到试验所需的浓度。之后选籽粒饱满、无病虫害、芽长均匀一致的30粒水稻种子均匀放入每个培养皿。把培养皿随即放入26℃的恒温培养箱里黑暗培养8d后取出，测定根长、根鲜重、芽长、芽鲜重。利用Excel进行数据处理和统计分析。
2 结果与分析
2．1降解菌菌株形态
菌株在无机盐培养基平板生长菌落呈圆形，不透明，乳白色，边缘整齐。
2．2不同处理对水稻芽长的影响
由图1可知，在同一降解菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度的增加，芽长呈逐渐降低的趋势。在菌量为0时，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对芽长的抑制率依次为16.4%、32.3%、47.6%和72.3%。方差分析结果表明，与无氯嘧磺隆处理相比较，氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1时，对芽的抑制作用不显著;氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，对芽的抑制达到显著水平;氯嘧磺隆浓度为20μg·kg-1时达到极显著水平。
同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌用量的增加，各处理芽长都有逐渐增加的趋势。方差分析表明：氯嘧磺隆浓度为5～15μg·kg-1处理中，与降解菌对照相比，降解菌浓度稀释10 000倍时水稻芽长的增加不显著，菌浓度稀释倍数≤100倍时水稻芽长的增加即达到极显著水平，但当菌浓度稀释倍数在10～100倍时，各处理间差异不显著。
2．3不同处理对水稻芽鲜重的影响
由图2可知，在同一降解菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度的增加，芽鲜重逐渐降低。未施用降解菌处理中，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对芽鲜重的抑制率依次为9.4%、15.3%、28.4%、43.0%。
同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度的增加，各处理芽鲜重均有增加的趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆0水平处理中，降解菌浓度稀释倍数为10 000、1 000、100、10时，芽鲜重分别提高了2.6%、10.2%、21.4%、20.6%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100、10时，芽鲜重分别提高了14.3%、7.1%、13.8%、12.8%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了3.4%、2.4%、6.8%、6.4%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了13.7%、22.1%、18.9%、17.9%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了11.6%、13.9%、14.9%、14.2%。可见，不同浓度的氯嘧磺隆处理加入一定浓度的降解菌对芽鲜重均有不同程度增加。
2．4不同处理对水稻根长的影响
根是植物生长的重要器官，根系发育状况及其活力高低对水稻生长具有重要作用。水稻根系对氯嘧磺隆非常敏感，随氯嘧磺隆浓度增加，水稻根长缩短。由图3可知，在同一菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度增加，各处理根长均呈逐渐降低趋势。在菌量为0时，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对根长的抑制率依次为20.6%、33.5%、49.6%、78.7%。方差分析表明，与氯嘧磺隆处理比较，氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1时根长没有显著减小;氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，对根长的抑制即达到了显著水平;氯嘧磺隆浓度为15μg·kg-1时，对根长的抑制已达到了极显著水平。
同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度的增加，各处理根长均有逐渐增加的趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆对照中，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.3%、12.7%、21.1%、10.9%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了3.5%、7.8%、13.5%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了52.1%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了14.0%、3.7%、35.7%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了50.5%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.1%、17.5%、32.2%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了50.0%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.9%、20.1%、28.1%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了35.5%。可见，一定浓度的降解菌能促进水稻根系生长。不同氯嘧磺隆浓度下各处理水稻根长的方差结果表明，氯嘧磺隆浓度5μg·kg-1处理与未加菌相比，加菌稀释倍数为10 000时根长未显著增加，当菌稀释倍数1 000时水稻根长增加达到显著水平。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1处理与未加菌相比，菌的稀释倍数为100时水稻根长增加达到显著水平;氯嘧磺隆浓度为20μg·kg-1，各处理间处理差异均不显著，此时氯嘧磺隆浓度过大，降解菌已不能解除其对水稻根长产生的影响。
2．5不同处理对水稻根鲜重的影响
由于氯嘧磺隆对根长和根数产生一系列影响，根鲜重也随之变化。由图4可以看出，在同一菌水平下，随氯嘧磺隆浓度增大，各处理根鲜重都表现为逐渐降低的趋势。未施用降解菌处理中，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对水稻根鲜重的抑制率依次为30.6%、35.0%、57.2%、82.2%。
在同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度增加水稻根重表现为逐渐增加趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆0水平处理中，降解菌浓度稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了14.3%、18.2%、22.1%、19.9%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了21.2%、26.1%、38.4%、33.3%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了57.2%、24.9%、31.9%;降解菌稀释倍数为10时，根鲜重降低了18.3%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了37.0%、66.9%、79.2%;降解菌稀释倍数为10时，根鲜重降低了36.1%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为1 000、100、10时，根鲜重分别提高了3.8%、11.5%、18.8%、14.7%。通过加入不同浓度的降解菌，在一定程度上有效减轻了氯嘧磺隆对根系产生的药害。但当菌浓度过大时渗透压过大，会对水稻的生长产生抑制作用。
3 结论
根据已有报道[9]，少量的氯嘧磺隆残留即可对敏感作物产生严重的药害，抑制根生长，植物的根系发育严重受阻。该试验研究结果表明：氯嘧磺隆5μg·kg-1对水稻生长发育未产生明显影响，但随着氯嘧磺隆浓度的增加，水稻生长受阻，表现出明显药害症状，芽及根系性状显著下降。试验结果表明：在同一菌浓度下，氯嘧磺隆5μg·kg-1时降解效果最好。在同一氯嘧磺隆水平下，降解菌稀释倍数为100时降解效果最好。
参考文献
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