降解研究

降解研究（共12篇）

降解研究 篇1

氯嘧磺隆(豆磺隆)是20世纪80年代初期美国杜邦公司开发的磺酰脲类除草剂[1]。由于它的用量少，活性高，杀草谱广，成本低等优点，在农业中得到了广泛的应用[1,2]。它在土壤中不易挥发，不易光解，随pH的升高其半衰期延长[3,4,5,6]。在土壤中主要通过水解和微生物降解作用而消失，其生物活性高，易对后茬敏感作物产生药害，尤其在高pH土壤中，残留期比较长[5]。

20世纪90年代以来部分地区大面积使用氯嘧磺隆，连续多年使用在土壤中持续积累，在轮作农田中不仅对后茬敏感作物造成严重药害，导致作物减产甚至绝产，而且还可能对土壤环境造成污染。如何清除土壤中长残留的除草剂，解决残留药害是当前世界研究的重要课题。

氯嘧磺隆在酸性和中性土壤中的降解主要靠微生物降解和化学水解;在碱性土壤中，微生物的降解起主要作用[7,8,9]。随着生物技术的迅猛发展，应用微生物进行生物修复己成为环境修复的一个重要内容。现通过筛选氯嘧磺隆降解菌并研究其降解效果，旨在为氯嘧磺隆残留的生物治理提供一条有效途径。

1 材料与方法

1．1材料

从长期使用氯嘧磺隆的大豆田取土，利用限定性培养富集获得氯嘧磺降解菌。

供试水稻品种为垦鉴稻12;试验药剂有氯嘧磺隆20%可湿性粉剂(沈阳化工研究院试验厂生产)。

培养基为无机盐培养基：K2HPO4·7H2O1.6g、KH2PO4 0.4g、MgSO4·7H2O 0.06g、Fe2(SO4)30.03 g、CaCl20.01 g、CuSO40.05mg、ZnSO40.05 mg、NH4Cl 1.0g、HBO30.03mg、琼脂15g、蒸馏水1 000mL。

1．2方法

1．2．1降解菌的富集

取多年施用氯嘧磺隆的土壤用无菌水溶解稀释得到土壤悬浊液，将135mL的富集培养基加入250 mL的三角瓶中(氯嘧磺隆浓度为1g·L-1)，并按10%的接种量接种土壤悬液，置37℃、130r·min-1的摇床培养2d，将培养液按10%接种量接种于氯嘧磺隆浓度为1g·L-1的新鲜富集培养基中，然后在37℃摇瓶培养2d，依次类推5次接种，最终富集得到降解菌株培养物种子。将菌悬液用涂布法在以氯嘧磺隆为唯一碳源的无机培养基上进行分离，37℃培养1d，挑取单菌落反复划线纯化。最终得到纯菌，4℃冰箱保存备用。

1．2．2降解试验设计

试验氯嘧磺隆设5个水平，分别为0、5、10、15、20μg·kg-1。氯嘧磺隆降解菌设5个水平，分别为清水、降解菌发酵液稀释10、100、1 000、10 000倍。每个处理3次重复，共75个处理。

将水稻种子浸种，催芽后待芽长为1mm左右播种。在每个培养皿中铺一张滤纸，将氯嘧磺隆20%可湿性粉剂配成母液，再采用逐步稀释的方法配成试验所需的各浓度药液，每个培养皿放15mL各浓度药液，对照放15mL清水。再向每个平皿中加入15mL的稀释菌液，使菌达到试验所需的浓度。之后选籽粒饱满、无病虫害、芽长均匀一致的30粒水稻种子均匀放入每个培养皿。把培养皿随即放入26℃的恒温培养箱里黑暗培养8d后取出，测定根长、根鲜重、芽长、芽鲜重。利用Excel进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2．1降解菌菌株形态

菌株在无机盐培养基平板生长菌落呈圆形，不透明，乳白色，边缘整齐。

2．2不同处理对水稻芽长的影响

由图1可知，在同一降解菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度的增加，芽长呈逐渐降低的趋势。在菌量为0时，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对芽长的抑制率依次为16.4%、32.3%、47.6%和72.3%。方差分析结果表明，与无氯嘧磺隆处理相比较，氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1时，对芽的抑制作用不显著;氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，对芽的抑制达到显著水平;氯嘧磺隆浓度为20μg·kg-1时达到极显著水平。

同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌用量的增加，各处理芽长都有逐渐增加的趋势。方差分析表明：氯嘧磺隆浓度为5～15μg·kg-1处理中，与降解菌对照相比，降解菌浓度稀释10 000倍时水稻芽长的增加不显著，菌浓度稀释倍数≤100倍时水稻芽长的增加即达到极显著水平，但当菌浓度稀释倍数在10～100倍时，各处理间差异不显著。

2．3不同处理对水稻芽鲜重的影响

由图2可知，在同一降解菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度的增加，芽鲜重逐渐降低。未施用降解菌处理中，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对芽鲜重的抑制率依次为9.4%、15.3%、28.4%、43.0%。

同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度的增加，各处理芽鲜重均有增加的趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆0水平处理中，降解菌浓度稀释倍数为10 000、1 000、100、10时，芽鲜重分别提高了2.6%、10.2%、21.4%、20.6%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100、10时，芽鲜重分别提高了14.3%、7.1%、13.8%、12.8%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了3.4%、2.4%、6.8%、6.4%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了13.7%、22.1%、18.9%、17.9%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，芽鲜重分别提高了11.6%、13.9%、14.9%、14.2%。可见，不同浓度的氯嘧磺隆处理加入一定浓度的降解菌对芽鲜重均有不同程度增加。

2．4不同处理对水稻根长的影响

根是植物生长的重要器官，根系发育状况及其活力高低对水稻生长具有重要作用。水稻根系对氯嘧磺隆非常敏感，随氯嘧磺隆浓度增加，水稻根长缩短。由图3可知，在同一菌浓度下，随氯嘧磺隆浓度增加，各处理根长均呈逐渐降低趋势。在菌量为0时，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对根长的抑制率依次为20.6%、33.5%、49.6%、78.7%。方差分析表明，与氯嘧磺隆处理比较，氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1时根长没有显著减小;氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，对根长的抑制即达到了显著水平;氯嘧磺隆浓度为15μg·kg-1时，对根长的抑制已达到了极显著水平。

同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度的增加，各处理根长均有逐渐增加的趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆对照中，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.3%、12.7%、21.1%、10.9%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了3.5%、7.8%、13.5%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了52.1%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了14.0%、3.7%、35.7%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了50.5%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.1%、17.5%、32.2%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了50.0%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根长分别提高了9.9%、20.1%、28.1%;降解菌稀释倍数为10时，根长降低了35.5%。可见，一定浓度的降解菌能促进水稻根系生长。不同氯嘧磺隆浓度下各处理水稻根长的方差结果表明，氯嘧磺隆浓度5μg·kg-1处理与未加菌相比，加菌稀释倍数为10 000时根长未显著增加，当菌稀释倍数1 000时水稻根长增加达到显著水平。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1处理与未加菌相比，菌的稀释倍数为100时水稻根长增加达到显著水平;氯嘧磺隆浓度为20μg·kg-1，各处理间处理差异均不显著，此时氯嘧磺隆浓度过大，降解菌已不能解除其对水稻根长产生的影响。

2．5不同处理对水稻根鲜重的影响

由于氯嘧磺隆对根长和根数产生一系列影响，根鲜重也随之变化。由图4可以看出，在同一菌水平下，随氯嘧磺隆浓度增大，各处理根鲜重都表现为逐渐降低的趋势。未施用降解菌处理中，与氯嘧磺隆0水平处理相比，氯嘧磺隆浓度为5～20μg·kg-1时，对水稻根鲜重的抑制率依次为30.6%、35.0%、57.2%、82.2%。

在同一氯嘧磺隆水平下，随降解菌浓度增加水稻根重表现为逐渐增加趋势。与不加降解菌相比，氯嘧磺隆0水平处理中，降解菌浓度稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了14.3%、18.2%、22.1%、19.9%。氯嘧磺隆浓度为5μg·kg-1，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了21.2%、26.1%、38.4%、33.3%。氯嘧磺隆浓度为10μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了57.2%、24.9%、31.9%;降解菌稀释倍数为10时，根鲜重降低了18.3%。氯嘧磺隆15μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为10 000、1 000、100时，根鲜重分别提高了37.0%、66.9%、79.2%;降解菌稀释倍数为10时，根鲜重降低了36.1%。氯嘧磺隆20μg·kg-1时，降解菌稀释倍数为1 000、100、10时，根鲜重分别提高了3.8%、11.5%、18.8%、14.7%。通过加入不同浓度的降解菌，在一定程度上有效减轻了氯嘧磺隆对根系产生的药害。但当菌浓度过大时渗透压过大，会对水稻的生长产生抑制作用。

3 结论

根据已有报道[9]，少量的氯嘧磺隆残留即可对敏感作物产生严重的药害，抑制根生长，植物的根系发育严重受阻。该试验研究结果表明：氯嘧磺隆5μg·kg-1对水稻生长发育未产生明显影响，但随着氯嘧磺隆浓度的增加，水稻生长受阻，表现出明显药害症状，芽及根系性状显著下降。试验结果表明：在同一菌浓度下，氯嘧磺隆5μg·kg-1时降解效果最好。在同一氯嘧磺隆水平下，降解菌稀释倍数为100时降解效果最好。

参考文献

[1]藤春红.氯嘧磺隆对土壤微生态的影响及其高效降解真菌的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2006.

[2]Jae Koo Lee,Ki Chang Ahn,Oee Sook Park,et al.Develop-ment of an immunoassay for the residues of the HerbicideBensulfuron-Methyl[J].Journal of Agricultural and FoodChemistry,2002,5:1791-1803.

[3]陶波,苏少泉,刘金宇.农作物对磺酰脲类除草剂耐性的研究[J].东北农业大学学报,1995,6(2):43-44.

[4]黄明智,邓金保.磺酰脲类除草剂的作用方式及其对作物的选择性[J].世界农药,1997,8(3):436-438.

[5]赵姝,张合豫,胡远富,等.生物制剂降解氯嘧磺隆残留对水稻根系及产量性状的影响[J].中国农学通报,2007,6(23):552-555.

[6]苏少泉.常残留除草剂对后茬敏感作物安全性问题[J].农药,1998,37(12):4-7.

[7]范志全,钱传范,胡继业.磺酰脲类除草剂的化学水解[J].四川师范大学学报:自然科学版,2003,26(1):69-73.

[8]黄明智,邓金宝.磺酰脲类除草剂的作用方式及其对作物的选择性[J].农药译丛,1997,19(3):24-31.

[9]刘祥英,柏连阳.土壤微生物降解磺酰脲类除草剂的研究进展[J].现代农药,2006,5(1):29-32.

降解研究 篇2

原油降解菌丝状真菌的筛选及降解性能研究

从南京炼油厂原油污染的土壤中筛选得到2株高效降解原油的.菌株,OBD-LM2和OBD-HQM,经初步鉴定菌株OBD-LM2为木霉属,菌株OBD-HQM为曲霉属.原油液体培养基中添加N、P营养盐、温度为25～35℃、盐度<3%时7d菌株OBD-LM2原油降解率为40%～68%,菌株OBD-HQM为35%～55%.采用GC、GC/MS对两株霉菌的原油降解前后组分进行测定,结果表明:菌株OBD-LM2的原油组分降解范围为C11～C28并有许多种类的短链烃(C10)产生,菌株OBD-HQM的原油降解范围仅为C11～C20.

作 者：沈薇 杨树林 宁长发 SHEN Wei YANG Shu-lin NING Chang-fa 作者单位：南京理工大学生物工程研究所,南京,210094刊 名：环境科学与技术 ISTIC PKU英文刊名：ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY年，卷(期)：200629(5)分类号：X17关键词：原油污染 生物降解 降解特性

降解研究 篇3

关键词：可降解；育苗钵；粘结剂

中图分类号：S359文献标识码：A文章编号：1674-0432（2010）-12-0093-1

在研制可降解育苗钵的过程中，要求所选的粘合剂可使秸秆纤维之间充分粘结，且不污染环境。

1 可降解秸秆育苗钵粘结剂的选择原则

粘合剂对育苗钵的性能有直接的影响，其选择原则有如下几个：（1）秸秆纤维与粘合剂之间的粘合性；（2）粘合剂埋入土壤后可完全生物降解；（3）该粘合剂与秸秆纤维混合后在压力与加温下有较好的流动性。根据以上原则，拟选择改性淀粉作为育苗钵的粘合剂。

2 交联变性淀粉的优势

为了得到不同用处的粘合剂，淀粉可经过物理、酶和化学等方法成为变性淀粉。目前变性淀粉主要有以下几种：预糊性淀粉、糊精、酸变性淀粉、次氯酸钠氧化淀粉；交联变性淀粉和阳离子淀粉等。经过一定处理的变性淀粉，其不良性质得到改善，有效功能提高。

育苗钵的研制中，选择交联变性淀粉作为粘合剂。交联变性淀粉是用具有两个或两个以上官能团的化学试剂与淀粉起反应，不同淀粉分子间的羟基经醚化或酯化使键连接起来。此交联变性淀粉分子间有如架“桥”，糊化后交联键不断裂，增强粘度的稳定性，对酸、碱、温度、搅拌、剪力的影响变化小。

3 几种交联变性淀粉按不同方法压制育苗钵的实验分析

为了得到满足育苗钵的机械强度、耐水性及流动性等条件的粘合剂，对几种变性淀粉进行了混合压制实验，并测其各项性能进行比较，以选择出合适的粘合剂。

3.1 实验原料及化学试剂

3.1.1 淀粉

3.1.2 氢氧化钠 分析纯。

3.1.3 甲醛 分析纯，苏州市第二化学研究院。

3.1.4 硼砂 分析纯，江苏太仓化工二厂。

3.1.5 硼酸 分析纯，上海菲达工贸有限公司。

3.2 实验仪器和设备

电热恒温水浴锅。

3.3 不同粘合剂配制过程

3.3.1 粘合剂1# 将淀粉与水配制成均匀的悬浮液，然后在80℃的恒温水浴锅中慢慢加热，在其过程中需不停地搅拌，直到呈糊状粘稠体。

3.3.2 粘合剂2# 首先将氢氧化钠和硼砂分别配成10%的溶液，与上述步骤一样，将淀粉悬浮液放入80℃的恒温水浴锅中搅拌，然后徐徐倒入氢氧化钠溶液，当悬浮液变成粘稠状的液体时倒入硼砂溶液进行交联，获得凝胶状的物体。

3.3.3 粘合剂3# 将淀粉和水配制成均匀的悬浮液，同时将称好的硼酸溶解于70℃的水中，形成10%的溶液。然后将淀粉悬浮液放入50℃的恒温水浴锅中搅拌，稍后将硼酸徐徐倒入悬浮液中，当悬浮液的温度达到50℃时，将10%的甲醛溶液缓缓倒入悬浮液中进行反应。一定时间后，升高恒温水浴锅的温度至80℃，以使悬浮液成为粘稠状液体。

3.4 实验过程及测定指标

将三种粘合剂分别与粉碎后的秸秆混合，并进行充分搅拌，混合料在相同的压制条件下，压制成长12.5cm，宽5.5cm的试样。对混合料的流动性和试样的机械强度和耐水性进行测定和比较，以获得所需要的粘合剂。

4 实验结果和讨论

4.1 不同粘合剂混合料的流动性的比较

以不同粘合剂混合料在7kPa压力，每30秒通过直径为4mm的特制小孔的克数为参考值可得：含1#和3#粘合剂的混合料的流动性最好，其挤出质量较高，含2#粘合剂的混合料的流动性差，其挤出质量很少。

4.2 不同粘合劑与机械强度的关系

采用相同预处理及粉碎粒度及压制条件，对不同粘合剂配方压制的试样进行比拉伸强度、比静曲强度的测试。结果显示使用不同粘合剂制成的样板的强度不同，其中粘合剂3#的样板的比静曲强度最好，比拉伸强度次之。另外，用粘合剂2#制成的标准试样比拉伸强度为最好，比静曲强度次之。

4.3 不同粘合剂与耐水性的关系

三种粘合剂压制的试样分别同时进行1h和24h的浸泡试验，样品浸泡1h后，粘合剂3#吸水量少，并且在24h的浸泡处理后，粘合剂3#的样品其吸水率为71.06%，仍为最小，因此可得知粘合剂3#的样品其耐水性最好。分析其原因为：粘合剂3#中的淀粉糊在配制及进一步的压制、烘干过程中交联效果较好，与纤维的粘合强度和紧密度最好，并且性能稳定，不易为其它因素所影响。

5 小结

从上述三个试验结果得到：粘合剂1#与纤维混合后有好的流动性，但其压制试样的机械强度和耐水性较差；粘合剂2#通过硼砂来交联淀粉，虽然其机械强度较好，但耐水性一般，混合料流动性较差；粘合剂3#通过甲醛交联改型淀粉，其压制前的混合料不仅流动性好，满足模压料要求，而且其压制试样的机械强度、耐水性也为最好。

参考文献

[1] （美）D.B.沃兹堡.沈言行,周永元译.变性淀粉的性能与应用[M].纺织工业出版社,1989,12.

[2] 常焕球,衷明华.快干性瓦楞纸箱粘合剂的研制[J].适用技术之窗,1996,(4):9.

[3] 郭康权,赵东,等.植物秸秆模压成型流变特性的试验研究[J].西北农业大学学报,1995,23(3):11-15.

[4] 王孟钟,黄应昌.胶粘剂应用手册[M].化学工业出版社, 1987,11.

氯苯降解菌的筛选及降解条件研究 篇4

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源:

吉化集团污水处理车间污水处理曝气池中活性污泥。

1.1.2 培养基组成:

无机盐氯苯培养基各成分质量分数:KH2PO4 0.05%, K2HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.02%, CaCl2 0.01%, NaCl 0.02%及适量氯苯 (按实验要求配置不同浓度) , pH 7.0。牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.3%, 蛋白胨 1%, NaCl 0.5%, pH 7.2～7.4。

1.2 实验方法

1.2.1菌株的驯化和筛选

取活性污泥2 mL, 接种于100 mL无机盐氯苯液体培养基 (氯苯质量浓度为20 mg·L-1) 中, 30℃、120 r·min-1摇床振荡培养5 d。从中吸取1 mL 转接至100 mL无机盐氯苯液体培养基 (氯苯质量浓度应逐次递增, 增加梯度为10 mg·L-1) , 连续富集, 转接5次。然后用稀释平板分离法, 在牛肉膏蛋白胨培养基上分离, 以得到单菌落, 重新将单菌落挑接至无机盐氯苯固体培养基 (氯苯质量浓度为50 mg·L-1) 上, 以生长与否验证菌株是否具有氯苯降解能力。

1.2.2 菌株的观察与鉴定

将分离得到的菌株分别编号, 观察记录菌株生长情况、菌落特征、菌体形态结构、染色反应及生理生化反应, 依据参考文献[6,7]进行。

1.2.3氯苯降解率的测定

将菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化, 37℃振荡培养24 h, 活化后的菌液转移至无菌离心管中3500 r·min-1离心10 min, 倾去上清液, 再用无菌磷酸盐缓冲液反复清洗离心3次, 最后使微生物悬浮于缓冲液中制成菌悬液, 使菌悬液的细菌浓度约为每毫升1×109个细胞。无菌条件下将菌悬液接种于氯苯无机盐培养基中。适当温度下振荡培养。培养结束后采用紫外分光光度法[8]测定氯苯残余量, 计算氯苯降解率。

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选和鉴定

经过反复驯化、富集培养和划线分离纯化, 分离得到12株具有降解氯苯能力的菌株, 其中JH02菌株的降解效率最高, 故对其进行进一步研究。

菌株JH02的菌落为圆形, 隆起, 颜色为微红色。边缘整齐, 菌落透明。显微观察菌体为球状, 呈链状排列。革兰氏染色阳性, 无芽孢, 无鞭毛。能够利用乳糖、葡萄糖、山梨醇、明胶、淀粉和油脂, 不能利用阿拉伯糖。吲哚实验、VP实验以及硫化氢实验阴性, MR实验阳性。通过对菌落形态、菌体形态的观察和生理生化特征的测定, 依据Bergey (1994) 分类系统初步鉴定菌株JH02属于链球菌属 (Streptococcus) 。

2.2 菌株JH02降解氯苯条件的考察

2.2.1 氯苯质量浓度对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量为体积分数2%, 培养温度为37℃, 转速120 r·min-1, pH 8.0, 培养时间为24 h时, 氯苯质量浓度对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图1 所示。

从图1不难看出, 氯苯质量浓度的变化对菌株的降解性能有很大的影响。随着氯苯质量浓度的提高, 降解率呈现下降趋势, 但即使氯苯质量浓度达到70 mg·L-1时菌株JH02对氯苯的降解率仍在75%以上, 可见菌株JH02完全适合较高质量浓度的氯苯废水的处理。氯苯质量浓度在50 mg·L-1时, 降解率可在90%以上, 因此后续的实验中, 氯苯质量浓度设定为50 mg·L-1。

2.2.2培养时间对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量体积分数为2%, 培养温度为37℃, 转速120 r·min-1, pH 8.0, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1时, 培养时间对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图2 所示。

由图2可知, 菌株JH02对氯苯的降解率随着培养时间的增加而提高, 氯苯降解最快时期发生在培养6～24 h阶段;在培养时间达到24 h后降解率基本稳定, 不再有显著提高。

2.2.3培养温度对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量体积分数为2%, 摇床转速120 r·min-1, pH 8.0, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1, 培养时间为24 h时, 培养温度对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图3所示。

由图3可见, 在10～35℃之间, 菌株JH02对氯苯的降解率随温度显著升高;在35～37℃之间降解率变化不大, 在当温度超过37℃后, 降解率开始下降。室温条件 (25℃) 下, 降解率也可在75%左右, 这对于工业生产中的实际应用十分重要。

2.2.4 pH值对菌株降解性能的影响

考察菌悬液接种量为体积分数2%, 培养温度为37℃, 摇床转速120 r·min-1, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1, 培养时间为24 h时, pH值对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图4所示。

图4说明, JH02菌株在降解氯苯的行为中受pH的影响较小, pH在4～10范围时, 菌株的降解能力变化不大, 但在中性偏碱条件下 (pH=8) 相对更适合降解行为。

2.2.5 菌悬液接种量对菌株降解性能的影响

考察培养温度为37℃, 摇床转速120 r·min-1, 氯苯质量浓度为50 mg·L-1, pH8.0, 培养时间为24 h时, 菌悬液接种量对菌株JH02降解性能的影响, 结果如图5所示。

图5说明, 菌悬液接种量对菌株的降解有一定影响, 接种量较小时, 随接种量增加, 降解率也增加。接种量达到4%以后再继续增加接种量对菌株的降解影响不大, 没有降解率的明显增加。

2.2.6 摇床转速对菌株降解性能的影响

测定氯苯质量浓度为50 mg·L-1, 温度为37℃, 菌悬液接种量体积分数为2%, pH8.0, 培养时间为24 h时, 不同摇床转速对菌株JH02降解性能的影响, 如图6所示。

摇床转速间接反应溶解氧的含量, 同时影响微生物絮体的生长情况。图6说明菌株JH02在摇床转速为140 r·min-1时, 对氯苯降解效果最好。

3 结论

综上, 菌株Streptococcus JH02对氯苯的最适降解条件为:氯苯质量浓度50 mg·L-1, 温度为37℃, 菌悬液接种量为体积分数4%, pH8.0, 培养时间24 h, 摇床转速140 r·min-1, 此条件下氯苯的降解率可达94.7%。

参考文献

[1]金相灿.有毒有机物污染化学[M].北京:清华大学出版社1990:250~265

[2]翟福平, 张晓健, 何苗.氯苯驯化活性污泥对同类有机物的好氧降解性比较研究[J].环境科学, 1996, 16 (3) :309

[3]陈明, 张维, 徐玉泉, 等.氯代芳香族污染物降解菌株的分离及其降解质粒的初步研究[J].高技术通讯, 2000, 2, 21~23

[4]HBettmann et al.Degradation of phenol by polymer en-trapped microorganism.Appl.Microbiol.Biotechnol., 1985, 20:285~290

[5]陆军, 王菊思, 赵丽辉.苯系化合物好氧降解菌的驯化和筛选[J].环境科学, 1996, 17 (6) :1~4

[6]东秀珠, 蔡妙莫, 等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社, 2001

[7]John G Holt, Nolel R Krieg, et al.Bergey's manual ofdeterminative bacteriology (ninth edition) [M].Batimorephiadelphia honking London munich Sydney tolyo.Wil-iams&Wilkins, 1994

降解研究 篇5

烯唑醇降解菌的分离筛选及降解特性研究

从生产烯唑醇的农药厂废水处理池的活性污泥中驯化、分离得到6株能以烯唑醇为唯一碳源生长的`细菌,分别命名为1#、2#、3#、4#、5#、6#.实验结果表明,这六种菌都是好氧菌种,对烯唑醇降解率大于30%的有1#、3#、4#、6#,其中1#为优势菌种.该优势菌降解烯唑醇的最适温度为30～35 ℃,最适pH值为7.0,投加0.404 mg/L的菌株母液量为10%,烯唑醇的最佳初始浓度为30 mg/L.该菌在上述最适条件下,150 r/min摇床培养6d,对烯唑醇的降解率可达78.14%;优势菌1#单菌对烯唑醇的降解要比复合菌对其降解的效果好.

作 者：张凤霞 李学德 花日茂 吴祥为 唐俊 汤锋 操海群 作者单位：安徽农业大学资源与环境学院,安徽省农产品安全重点实验室,安徽,合肥,230036刊 名：激光生物学报 ISTIC英文刊名：ACTA LASER BIOLOGY SINICA年，卷(期)：18(5)分类号：X506 X172关键词：烯唑醇 微生物降解菌 分离筛选 降解特性

降解研究 篇6

【关键词】聚丙酰胺；油田；驱油；机理

通过水解聚丙酰胺的的方式来发挥其独特的高分子性和低浓度的高粘度特性，这一性质被运用得到油田的原有采集中来，在一定程上取得非常好的效果和成绩。聚丙酰胺水溶液的粘度有着非常特殊的性质和价值。它可以从容夜中提取出特定的菌落且在特定的实验环境培养中逐渐的生长和繁殖并降解，针对这样的现象俩进行更深入的分析，了解聚丙酰胺在实际中油田污水中的降解机理。

1.聚丙酰胺的化学降解方法的种类和作用机理

1.1 HPAM氧化降解和作用机理

HPAM氧化降解的过程是一个自由基相互反应的过程，有不少科学家涉及了这一领域的研究，其中总结了氧化降解的主要过程分为两个步骤，首先，自动氧化过程，其二，连锁裂解过程。在聚丙酰胺氧化降解的过程中需要先对其自身的氧化杂环进行分解来产生最初的级别的自由基，进而在开展一系列的自动氧化反应。还原性的物质能够促进聚丙酰胺的自由基形成，接着聚合物链接反应进一步发生，使聚合物发生裂变反应和裂解反应。

如果反应过程中存在缺氧的条件则连接的自由基之间会发生分子链接，而发生偶合作用，产生一种特殊的结构。其中裂解反应和裂变反应都会导致聚合物发生断裂，进过这样的断裂之后溶液中的聚合物分子总量迅速下降。在这个过程中还包含了脱酰胺的反应，进而又会产生其他形式的降解产物，需要明确说明的是在整个氧化反应的过程中都是具有非常大的链接力学存在的，因此氧的存在会对反应的结果造成巨大的影响。这是科学家詹亚力等人做出的实验结论，除此之外还有其他的科学家在酚酞试剂氧化作用下进行降解机理的研究。主要的作用机理在在同体系条件下生成[Fe（III）（HO2）]2+，这样就会促进Fe（II）粒子的形成，进而促进降解的进一步进行。高锰酸钾的氧化同样可以处理油田污水，其主要的原理在于能够够促进聚丙酰胺先发生断裂，然后一小分子的形式来进一步被氧化成单体形式，实现降解目的。

1.2聚丙酰胺的光降解作用机理

通过大量的实验研究数据表明光和紫外线能在一定程度上实施对聚丙酰胺的降解作用。以不同的天然水溶液来配置相关的HPAM溶液，并将其放置在具有阳光直射的地方，通过六个星期的实验之后，来观察容颜和各种粒子的数量变化以及溶液的Ph变化情况。其中显示溶液中AAMD的生长显著，同时铵离子的浓度有所下降，微生物的浓度没有发生明显的变化。这项实验研究充分的说明了聚丙酰胺在自然环境条件下发生了分解作用，而单体不随着这种变化而变化，通过实验的研究可以解释其导致发生降解的主要因素是光。管裂解导致的反应可以从几个方面来不同的解释，其中主要是使HPAM中德C-C、C-H、C-N键发生断裂而引起的一系列的连锁反应，其键能的数值分别是340，420，414kj/mol，而是这些键发生断裂需要的波长分别是325，250，288nm。由于大气层中臭氧的存在，决定了只能对波长在286和300nm之间的波长进行吸收，因此这就科学的解释了C-C键发生断裂的原因以及对另外两种键的影响很小。

进过这一系列的研究和分析总结出了一些科学性的结论，对上述的结果有了明确的指示。可以采用对照试验的办法来进一步确认实验结果的准确性，一组选择在阳光下面，另一组则在避光处。进过分阶段时间的放置过程来测量其中HPAM的降解情况，降实验的结果一图形的方式绘制出来，在图形中就能够清晰的展现其中各物质浓度的大小关系，进而科学的验证了光对聚丙酰胺的作用机理。

1.3聚丙酰胺的催化降解机理

通过实验研究的办法证明光降解机理能够很大程度上实现去污的效果，尤其针对传统方法中不能去除的污物就有特别显著的效果。就此的论述的结果相关科学家做了实验的验证，以不同瓦数的灯以及烤箱进行相关的对照试验，验证的结果显示：烤箱中的讲解情况最不明显，而中亚压汞灯的效果是最好的，这说明对光源的选择问题上也会影响到聚丙酰胺的讲解效果。分析原因发现汞灯中所采用的光源的波长在385以下，这就说明紫外线靠近的波长光是降解聚丙酰胺的最好范围。其中以光反应的活化能主要是由光子能量产生的，光源能量的不同也是造成反应速度的主要因素，进而直接影响到聚丙酰胺的讲解速度。

2.HPAM的生物降解研究

2.1生物降解法的概述

生物降解的方法主要是指有机物在一些生物催化酶的作用下发生相关的反应，以生物化学的变化方式来进行复杂物质的转变过程。甚至可以直接转变成无机物，而聚合物的生物降解反应基本就是这样的流程。通过研究表明微生物并不是天生就具备某些特殊的降解能力，而是在进过特殊的处理之后表现出来的一种特殊性质。例如，催化降解的酶是经过专门的驯化和诱导反应儿而来，使它具有一定的催化功能，其中具有这类降解功能的微生物主要有细菌、藻类和真菌。作用的原理分成三个不同类型来具体的讲述，第一种，生物物理的作用机理，这种降解方法主要针对细胞的增长和聚合物的水解进行作用，使物质都发生电离反应，将其中有机污染物分解成为低聚化合物，第二种，生物化学作用，微生物对聚合物作用而产生了水、二氧化碳、甲烷等无机物。第三种，酶反应直接作用，这个过程中的作用机理是微生物直接侵入到聚合物的内部进入导致聚合物的性质发生变化，这个过程的原理相对比较复杂，他和微生物的结构特性有着密切的关系，共同发挥了生物和化学作用。

2.2生物降解法的作用机理

通过相关科学家的研究表明微生物降解聚合物的机理主要与微生物的内部结构有关，其体内含有一种脱氨酶，能够在还原性酶的辅助条件下发生一系列复杂的变化，先是断开聚丙酰胺中的C-N建，将其中的铵根离子解离出来，同时以OH-来取代原来的NH2-离子的位置最终生成含有羧基的物质。通过与O2结合来使微生物酶发生断裂和进行反应，在只加入氧化酶的情况下能够首先对碳链末端的甲基进行先反应，在被氧化之后在进一步的氧化变成羧基，羧基中的一个氧原子是来自H2O中的氧，经过一系列的反应之后，聚丙酰胺的长链就被分解成为多个不同的小段，其中有能够被微生物直接吸收的物质，这样的方式能够在一定程度上实现降解聚合物的作用。

2.3微生物降解菌类的局限性

在微生物降解的放应中通常使用的是一些比较常见的菌种，以单菌群落为主，然和目前大量的化学物质的只用对微生物的降解作用产生一定的影响，而使实际作用的效果并不是非常明显。例如，外界中一些有毒、有害的物质进入到微生物的内部对微生物的正常机理造成一定的影响，进而阻碍了其作用的发生，分析原因发现主要在于微生物本身不具备单独降解聚合物的的能力。进而影响了最终的降解效果。

【参考文献】

[1]邵强，闫光绪，郭绍辉.Fenton试剂处理油田含聚污水中聚丙烯酰胺的试验研究[J].能源环境保护，2007（6）.

[2]包木太，陈庆国，王娜，郭省学，李希明.油田污水中聚丙烯酰胺（HPAM）的降解机理研究[J].高分子通报，2008（2）.

降解研究 篇7

氮杂环化合物广泛存在于焦化、医药、染料、食品加工和农药等工业废水中,在焦化废水中占40%左右,而且大都是有毒且难降解的有机物,不易受代谢过程的破坏,对生态系统和人类健康会产生潜在的长期危害[1,2,3,4]。吡啶是目前氮杂环化合物中开发与应用范围最广的化合物之一,是重要的工业原料,对神经有致毒作用,水溶性和扩散性好。由于其毒性大,具有致畸、致癌和难生物降解等特点,致使传统生物处理方法对其降解效果不佳[5],因此筛选高效稳定的专属降解菌成为国内外研究的热点[6,7,8,9]。

本研究从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离得到了一株吡啶降解菌,对其进行性能测试和菌株鉴定,并选用四因素三水平L9(34)正交试验对其进行培养条件优化,得到最佳培养条件,为含吡啶废水的生物强化处理提供了新菌株材料及其基本特性参数。

2 材料与方法

2.1 菌源

从处理吗啉废水SBR反应器(进水COD浓度2466mg/L,TN为435mg/L, COD和TN去除率分别稳定于90.12%和76.41%左右)里驯化成熟的活性污泥中筛选出的能以吡啶为唯一碳源、氮源的4株优势菌种。

2.2 培养基

(1)富集培养基:

(NH4)SO4,0.47g/L;KH2PO4,1g/L;FeCl2·4H2O,1.058g/L;CaCl2,0.094g/L;MgSO4,0.489g/L;柠檬酸三钠,5.1g/L;pH值7.0～7.5。

(2)液体测试培养基:

KH2PO4, 2g;MgSO4·7H2O,0.04g;FeCl3.6H2O, 0.004g;10mL相应浓度的吡啶储备液定容至1000mL,调pH值至7.0,121℃高温灭菌20min,待放凉加入10mL浓度为2000mg/L(3000mg/L)的吡啶储备液,此时培养基浓度为20mg/L(30mg/L)。

(3)吡啶储备液:

移取2.00g(3.00g)相对密度为0.98(20℃)的吡啶至1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容。此时吡啶储备液的浓度为2000mg/L(3000mg/L)。

2.3 吡啶降解菌株的富集驯化

取250mL锥形瓶,在无菌操作条件下将实验室已分离出的4株以吡啶为唯一碳源、氮源的优势菌种以10%的接种量接种于150mL吡啶浓度为20mg/L的液体测试培养基中,于30℃ 、180r/min下好氧振荡培养120h,每隔24h测定菌株OD600,确定菌株生长曲线。本周期驯化结束后,将测试培养基中的菌株按10%的接种量接种到富集培养基中培养24h进行富集,再进行新一周期的驯化,持续数周期。然后将底物浓度提高到30mg/L,筛选出适应性较强的菌株继续驯化,通过筛菌过程中对菌株生长曲线的观察以及对吡啶分解利用情况的监测,挑选耐受能力和降解能力最高的菌株作为下一步实验的优势降解菌。

2.4 菌株鉴定

2.4.1 形态及生理生化鉴定

菌株形态观察和生理生化特征实验包括接触酶实验、液化明胶实验、淀粉水解、葡萄糖发酵实验、吲哚试验、乙醇氧化实验、脲酶实验、甲基红实验、V-P实验、温度、pH值实验,操作步骤参照文献[10]。

2.4.2 16SrDNA基因片段分离与序列分析

以TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA作为PCR反应模板,16Sr DNA序列分析采用通用引物[11]:正向引物为27f (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3');反向引物为1492r (5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应体系为模板DNA加2.5μL,上下引物各2.5μL,PCR MasterMix2.5μL,加超纯水至50μL。PCR反应程序:94℃预变性4 min,然后94℃变性30s,52℃退火80s,72℃延伸90s,30个循环。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸8min,使反应产物扩增充分。委托三博远志生物科技有限公司对PCR扩增产物进行测序,测序结果在Gen Bank数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行相似度分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发育树[12,13]。

2.5 正交实验优化菌株吡啶降解性能的方法

在微生物降解过程中,其反应速率限制因素可能包括碳源、DO、pH值、C/N和温度等。李长征等[14]认为影响吡啶降解效果的主要环境因素包括温度、摇床转速、菌种投加量等。孙庆华等[15]利用Shinella Zoogloeoides BC026菌进行吡啶降解实验中指出,初始浓度是影响吡啶降解速率的重要因素。综合考虑前人的研究成果本文选用四因素三水平L9(34)正交表设计实验,L9(34)因素水平表及正交实验结果分别见表1和表3,菌株在各条件下培养96h后测吡啶去除率。

2.6 分析方法

菌体生长吸光度(OD600):采用吸光度法,用721可见分光光度计在光密度为600nm处测吸光度值;

CODcr:采用美国HACH快速测定仪;

pH值:采用9157BN型Thermo Orion pH计。

吡啶浓度以固相微萃取—顶空气相色谱法测定,仪器型号为VARIAN CP-3800气相色谱仪,色谱柱为WARIAN CP-Wax 58(FFAP)CB极性(酸性)色谱柱。分流比10∶1,升温程序∶初始温度40 ℃,保持2min(升温速率 40℃/ min)至140 ℃,保持5min。检测器采取氢火焰 (FID)检测器,检测器温度280 ℃,气化温度200℃, 各气流速:载气N2为2 mL/ min,H2为40 mL/ min,空气为350 mL/min。

水样预处理及固相微萃取方法:从液体测试培养基中取15mL水样于离心管中,12000r/min高速离心10min,将上清液倾出,用0.22μm的水系滤膜过滤,取清液5mL,置于15mL顶空瓶中,加入1.5g氯化钠,立即用聚四氟乙烯垫和帽密封顶空瓶,轻轻摇匀,待氯化钠溶解后放入水浴温度为58℃水浴中,插入固相微萃取头,插入深度为2.5cm,萃取40min后取出针头进样进行色谱分析,解析5min,每两次萃取过程之间将萃取头在250℃下烘烤12min以去除残留。

3 结果与分析

3.1 菌株的驯化与筛选

4株吡啶降解菌经过不同吡啶浓度的液体培养基驯化后,筛选出1株降解能力最强且能以吡啶为唯一碳源、氮源和能源的菌株,命名为PY6,将PY6按10%的接种量接种到初始浓度为30mg/L的液体测试培养基中,30℃ 、180 r/min的条件下好氧振荡培养,经过96h后对吡啶的降解率达到84.12%,可作为下一步实验的优势降解菌。

3.2 PY6的初步鉴定结果

3.2.1 菌株的形态及生理生化特征

菌株PY6在平板培养基上培养2d后观察,菌株特征为淡黄色、湿润、不透明、隆起、表面光滑、边缘整齐。初步鉴定结果为革兰氏阴性,杆状菌(革兰氏染色后菌株PY6的显微照片见图1)。

菌株生理生化试验结果见表2,从结果可以看出该菌株具有接触酶、明胶酶、淀粉酶,在糖代谢过程可将葡萄糖分解为酸性物,分解蛋白胨中的色氨酸,可生成吲哚,可氧化乙醇。

注 F:发酵型;+:阳性; -:阴性

3.2.2 菌株的分子生物学鉴定结果

对提取的菌株模板DNA进行PCR扩增,电泳图结果如图2所示,从图中可以看出约1500bp处出现荧光条带,且无明显拖尾现象,阴性对照无条带,说明反应体系没有被污染。因此,PCR扩增产物能够满足后续测序的要求,利用Blast软件在Gen Bank数据库中进行序列相似性搜索。结合菌株的形态观察、生理生化以及16S rDNA分子生物学鉴定,初步判断菌株PY6为假单胞菌。

M:DNAMarker 1:PY6

3.3 菌株培养条件的优化

由表3对正交实验结果进行分析,发现9组正交实验中有5组实验吡啶去除率均达到了70%以上,可见该菌株的环境适应性良好,同时以吡啶去除率为指标,计算不同因素下各个水平的去除率,以及反映各因素对指标影响大小的极差R。由表3极差分析可以判断出各因素影响的主次顺序为:振荡速度>初始浓度>温度>pH值,振荡速度是影响去除率的主要因素,转速太低使溶解氧浓度偏低,转速太高菌株会因离心力集中成团,减少与吡啶反应的机率;由K(均值)可以看出,对应理论最优条件为:温度=25℃,pH值=6.5,吡啶初始浓度=40 mg/L,摇床转速=160r/min;而表观最优条件为实验组2:温度=25℃,pH值=7.5,吡啶初始浓度=40mg/L,摇床转速=160r/min。

由于表观最优条件不同于理论最优条件,以表观最优条件作为培养条件,对其进行验证实验,结果理论最优条件下吡啶去除率为90.59%,这与表观最优条件结果基本一致,而两个最优条件只有pH值不同,说明pH值对该菌株影响不大,这也与极差分析的结论pH值的影响最弱一致。pH值是废水处理中不易控制的因素,但是所有因素中pH值的影响最小,证明PY6具有潜在的工程推广应用价值。

3.4 降解性能跟踪实验

为了准确描述该菌株对吡啶的降解性能,在吡啶去除率最优的条件即表观最优条件下,对OD600和吡啶浓度进行跟踪测定,结果如图3所示。

由图3可见,随着菌密度增长,吡啶浓度逐渐降低。前24h菌株生长不明显,所以吡啶浓度的降低主要是由于菌株的吸附作用。随后的24h,由于PY6菌暂时处于适应期,菌株密度增长较慢,吡啶浓度的衰减速率也缓慢。在48h后菌株开始适应环境,进入对数生长期,吡啶降解速度加快,在96h,菌密度最大,吡啶去除率达91.2%,随后菌密度下降。有报道[15]认为,由于吡啶的碳氮比为4.3∶1,此时微生物的死亡可能与缺乏碳有关。

4 结语

(1)从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离出1株能以吡啶为唯一的碳源、氮源的高效降解菌,该菌株为革兰氏阴性菌,经16S rDNA序列同源性分析以及部分生理生化反应初步鉴定PY6为假单胞菌。

(2)通过四因素三水平L9(34)正交实验结果发现该菌的环境适应性良好。吡啶初始浓度40 mg/L、25℃、摇床转速160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率达91.64%,因而PY6为1株高效吡啶降解菌。

(3)在吡啶去除率最优的条件下,通过跟踪测定结果发现,PY6菌生长状况良好,吡啶的快速去除过程与菌体的生长过程基本一致,在48h后菌株开始适应环境,进入对数生长期,在96h菌密度最大,吡啶去除率达90%以上。

摘要：从处理吗啉废水的成熟活性污泥中分离筛选出了1株能以吡啶为唯一碳源、氮源的菌株,通过形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列同源性分析对菌株进行了初步鉴定,确定该菌株为假单胞菌,命名为PY6。选用四因素三水平L9(34)正交实验表设计了实验,研究了吡啶初始浓度、温度、摇床转速以及pH值4个因素对菌株PY6降解能力的影响,结果表明:当吡啶初始浓度为40mg/L、温度为25℃、摇床转速为160r/min、pH值为7.5时吡啶去除率最高,达91.64%,说明此菌株为1株高效吡啶降解菌。

降解研究 篇8

关键词：低温,氨氮降解菌,筛选,降解能力

0 引言

随着工农业的快速发展，我国水污染问题日趋严重，其中氨氮污染普遍存在，已引起人们的广泛关注[1]。常规的通过混凝-沉淀-过滤-消毒的水处理工艺无法去除原水中的氨氮，为了使饮用水中的氨氮低于《生活饮用水标准》(GB5749-2006)中的氨氮限值(0.5 mg/L)，通常采用折点氯化技术，然而折点加氯会产生大量有机氯化物，对人体健康不利[2]。

近年来，生物脱氮成为研究热点，研究发现一些自养和异氧硝化细菌能够去除水中氨氮[3,4,5]，氨氮的降解效率与温度有关，最适温度为25～37℃，低于15℃氨氮去除效率降低[6,7]。我国东北地区冬季漫长，年平均水温低于15℃。目前，对于低温氨氮降解菌的研究报道较少，为此，笔者采用富集培养方法从松花江水中筛选出1株低温氨氮降解菌株，通过形态与生理生化特性、16S r DNA序列分析以及BIOFOSUN微生物鉴定分析系统鉴定菌株，测定其低温氨氮降解能力和反硝化能力，旨在为冬季低温期饮用水氨氮生物降解提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

水样取自4月份哈尔滨九站公园江心1.5m处松花江水，水温10℃，4℃保存备用。

1.1.2 培养基

异氧硝化细菌培养基:硫酸铵0.5 g，醋酸钠5g，微量元素溶液50 m L，水950 m L,p H 7.0。

基本培养基:硫酸铵0.05 g，醋酸钠0.5g，微量元素溶液50 m L，水950 m L,p H 7.0。

微量元素溶液:磷酸氢二钾5 g，硫酸镁2.5 g，氯化钠2.5g，硫酸铁0.05 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1L,p H 7.0～7.4。

反硝化细菌培养基:用硝酸钾替代硫酸铵，其它成分与异氧硝化细菌培养基相同。

LB:蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖1%，水100 m L。

1.2 方法

1.2.1 菌株富集培养

取100 m L松花江水放入无菌的500 m L三角瓶中，8℃、160 r/min震荡培养3～5 d直至培养液浑浊，4℃保存备用。

1.2.2 氨氮降解菌筛选

取1 m L富集培养液加入含100 m L异氧硝化细菌培养基的三角瓶中，8℃、160 r/min震荡培养2 d，倍比稀释后，取103稀释液100 m L涂布在异氧硝化细菌固体平板上，8℃低温培养2～4 d，挑取单菌落划线纯化。采用纳氏试剂平板法初筛脱氨氮菌株[8]，取纯化后的菌株点接在异氧硝化细菌固体平板上，8℃低温培养2 d，去掉菌落，加入5 m L纳氏试剂，测量菌落周围的透明圈直径。

1.2.3 菌株鉴定

形态鉴定:将培养24 h的菌液，革兰氏染色后显微镜下观察形状大小。

生理生化特性鉴定:按照参考文献[9]方法进行接触酶、氧化酶、精氨酸双水解酶、V.P试验、M.R试验、葡萄糖利用、明胶液化试验。

16S r DNA序列分析:用LB培养基培养菌株，离心收集菌体，用北京康为世纪细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，用细菌通用引物Primer 1:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和Primer 2:TACGGYTACCTTGT-TACGACTT进行PCR扩增，将PCR产物测序，在NCBI的BLAST数据库中进行DNA序列分析，用MEGA version 4.1软件构建系统进化树。

BIOFOSUN微生物鉴定分析系统鉴定:按照BIOFOSUN微生物鉴定分析系统说明进行操作。

1.2.4 菌株低温氨氮降解能力测定

用500 m L基本培养液培养氨氮降解菌，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，

悬浮于5 m L无菌水中，作为种子液。取1 m L种子液接种到50 m L新的异氧硝化细菌培养液中，3个平行样，培养液初始氨氮浓度为5 mg/L，碳氮比分别为10:1,p H 7.0。将培养液在8℃、160 r/min震荡培养2 d，每隔4 h取样测定菌浊度OD600值、氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度，计算氨氮降解率。

1.2.5 菌株的反硝化能力

取1 m L种子液接种到50 m L新的反硝化细菌培养液中，3个平行样，培养液初始氨氮浓度为5 mg/L，碳氮比分别为10:1,p H 7.0。将培养液在8℃、160 r/min震荡培养1 d，每个4 h取样测定菌浊度OD600值、硝态氮和亚硝态氮浓度，计算硝态氮降解率。

1.2.6 分析方法

采用纳氏试剂光度法测定氨氮浓度，酚二磺酸光度法测定硝酸亚浓度，N-奈基-乙二胺光度法测定亚硝态氮浓度[10]。取菌液样品5 m L,6 000 r/min离心5 min，取1mL上清液测定，按公式氮降解率=C0-C1/C0×100%计算氮降解率，C0为初始氮浓度，C1为残留氮浓度。

2 结果与分析

2.1 氨氮降解菌筛选与鉴定

松花江水经富集和分离，采用纳氏试剂平板法筛选，获得8株氨氮降解菌(图1)，菌株WSW-1001半透明圈直径最大为15 mm。该菌株菌落白色、圆形、光滑，边缘整齐，菌体短杆状，大小0.2～0.4μm×1.0～1.3μm。革兰氏阴性，好氧，氧化酶阳性，接触酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P阴性，M.R阴性，液化明胶。PCR扩增产物大小1 400bp，与NCBI数据库中的Pseudomonas.fluorescens p1-1同源性为99%(图3)。BIOFOSUN微生物鉴定分析系统分析结果表明该菌株与荧光假单胞杆菌聚为1组(图2)。结合菌株WSW-1001的形态学和生理生化特性，以及16S r DNA序列分析和BIOFOSUN微生物鉴定系统分析结果，菌株WSW-1001被鉴定为荧光假单胞杆菌Pseudomonas fluorescens。

2.2 菌株低温氨氮降解能力

菌株WSW-1001低温氨氮降解效果见图4。菌株在8℃条件下具有较强的脱氮能力，48 h内，随着菌体的生长，氨氮浓度持续下降，24 h对初始氨氮浓度为5.23 mg/L的氨氮降解率为71.7%,48 h的降解率为80.4%，脱氮过程中无亚硝态氮积累，有少量(约0.48 mg/L)硝态氮产生。

2.3 菌株的异氧反硝化能力

菌株WSW-1001在以硝酸钾为唯一氮源的培养基中生长与硝态氮含量变化情况见图5。菌株在8℃条件下能够利用硝态氮生长，24 h对初始5.03 mg/L硝态氮的降解率为69.8%，有微量亚硝酸盐产生。

■:OD600;◆:NH+4-N浓度;▲:NO+3-N浓度;×:NO+2-N浓度。

■:OD600;◆:NO+3-N浓度;▲:NO+2-N浓度。

3 讨论

纳氏试剂光度法是测定氨氮常用方法，纳氏试剂与氨氮反应生成黄棕色络合物，颜色深浅与氨氮浓度成正比。固体平板中的氨氮被微生物降解后不能与纳氏试剂进行显色反应，因此可以通过菌落周围半透明圈大小定性测定固体平板上生长的菌株氨氮降解能力。本研究采用纳氏试剂平板法可以对氨氮降解菌进行快速初筛。细菌的鉴定方法包括传统方法、分子生物学鉴定和仪器自动化鉴定，每种方法都有其各自的优缺点，三种方法结合可以确保鉴定结果的准确性。

国内外对于异氧硝化细菌的研究报道较多，多数菌株在常温下脱氮效率较高，辛玉峰等报道不动杆菌YF14在30℃培养3d，可去除92%的氨氮[11]，邱晓帆等报道1株假单肥菌WSH1001在20～35℃培养9h，氨氮去除率达95%[12]。对于低温菌的研究报道较少，本文报道的菌株WSW-1001低温氨氮降解能力高于已有报道。Zhang D等人报道从松花江水中分离出1株异氧硝化细菌Microbacterium sp SFA13,5℃培养30h后对5.09 mg/L初始氨氮的降解率为63.6%[13];Zhang J等人报道Pseudomonas stutzeri YZN-001 10℃培养2 d氨氮降解率为45.5%[14]。本文报道的菌株WSW-1001低温氨氮降解能力高于已有报道。

降解研究 篇9

关键词：苯酚,降解率,温度,筛选,pH值

引言

石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。未经净化的含酚废水可导致水源被污染,致使鱼类死亡,危害农作物,最终威胁人类的健康。许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。目前,国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物,处理方法无2次污染且安全、经济。目前,已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌(Pseudonomonas.sp)[3]、芽孢杆菌(Bacillus.sp)[4]、酵母菌(Yeast trichosporon)[5]、根瘤菌(Rhizobia)[6]、醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)[7]等,降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选,得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株,进一步测定苯酚降解的影响因素。对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。

1 实验材料和方法

1.1 菌株来源

采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。

1.2 培养基

基础培养基:Na Cl 5.0g/L,蛋白胨10g/L,琼脂15~20g/L,酵母浸膏5.0g/L,调节p H为7.0。

以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基:Ca Cl20.1 g/L,Fe SO4.7H2O 0.01 g/L,K2HPO40.5g/L,Mn SO4.7H2O 0.05 g/L,Na Cl 0.2 g/L,KH2PO40.5g/L,Mg SO4.H2O 0.01 g/L,NH4NO31.0g/L苯酚按实验需要量添加,调节p H为7.0[8]。

富集培养基:葡萄糖10.0g/L,营养琼脂33.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,调节p H为7.5。

1.3 研究内容与方法

1.3.1 菌株和的驯化和分离

在超净工作台中,将10m L含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿,取10 g污泥加90m L蒸馏水搅拌15min,静置5min后取上层清液为菌原液[8]。取1m L菌原液加入无菌水中分别制成100、10-1、10-2、10-3、10-4等梯度的菌液,然后分别从各菌液试管中取1m L用涂布法接种于基础培养基平板上。在p H值为7、25℃情况下培养24~48h。挑取单一菌落于富集培养基平板上划线、扩繁。编号,将平板置于25℃的恒温培养箱中培养24~48h后放于4℃冰箱保存。依据革兰氏染色进行微生物鉴定。

1.3.2 降酚菌的筛选

将OD(吸光度)为600的单一菌株,按20%(体积分数)的接种量接入无机盐培养基中,筛选同一时间内对苯酚降解能力最强的作为优势菌株。

1.3.3 培养温度对菌株降酚能力的影响

在p H值为7时,蘸取适量的菌液涂布培养与生化培养箱中调节温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。24h后测定苯酚浓度计算苯酚降解率。

1.3.4 培养p H值对菌株降酚能力的影响

将菌液以20%的量接种于苯酚浓度为1000mg/L的无机盐培养基中,培养条件为28℃、270 r/min,调节p H值为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,研究p H值对菌株降酚能力的影响。24h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率。

1.3.5 底物浓度对菌株降酚能力的影响

将菌液以20%的量分别接种于苯酚浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.2g/L的富集培养基中,培养条件为270 r/min、28℃、p H值7,比较菌株在苯酚浓度不同时对苯酚降解率的影响,24 h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率[9]。

1.3.6 接种量对菌株降酚能力的影响

设置菌株接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%,菌株培养条件为p H值为7、270r/min、28℃、底物浓度为1000mg/L、装液量50m L,24h后测定苯酚浓度并计算苯酚降解率。

1.4 分析测定方法

分析温度、接种量、p H值及底物浓度等因素对该苯酚降解菌降解性能的影响。采用4-氨基安替吡林分光光度法测量苯酚浓度。苯酚的降解率由式(1)计算[10]。

降解率(%)=(1-处理后体系中苯酚浓度/体系中苯酚浓度)×100%(1)

2 结果与讨论

2.1 降解菌的初步鉴定

对得到苯酚降解菌株进行初步鉴定,并分别命名为BF-1、BF-2、BF-3、BF-4、BF-5、BF-6,其中BF-2菌株生长速度最快在培养基上直径达到89.1mm(平板直径90mm),BF-4菌株生长速度最慢在培养基上直径为56.4mm。镜检为革兰氏阴性菌,单个细胞呈杆状,细胞单个或数个连接。(见表1)。

2.2 温度对苯酚降解菌降解性能的影响

不同温度下苯酚降解菌的降解率见图1。比较不同温度下菌株的降解率,可以发现菌株在温度在25~40℃时,随着温度的升高,苯酚降解率逐渐降低。在25℃时6株菌株的苯酚降解效果均达到最佳。

其中,BF-2的苯酚降解率最高,达到89.7%,BF-4的苯酚降解率最低,为65.5%。在培养温度为30~40℃时,菌株的降解能力逐渐减弱,40℃时BF-2的降解率降为57.6%,此时BF-1的苯酚降解率最低,为49.1。根据数据分析得出:菌株最佳苯酚降解温度为25℃。

2.3 p H值对苯酚降解菌降解性能的影响

不同p H值下苯酚降解菌的降解率见图2,培养48h,仅BF-6在p H值为8.0时苯酚降解效率达到最高,为71.4%,其余菌株均在p H值为7.0时对苯酚的降解率达到最大,此时,BF-2的降解效果最好,苯酚降解率达78.0%;BF-4的降解效果最差,苯酚降解率为58.0%。在p H值为5.0和9.0时由于酸性和碱性过强导致酶蛋白变性从而失活,使细菌生长迟缓,降酚能力减弱。由此可见中性或弱碱性环境更有利于苯酚降解菌对苯酚的降解。根据实验数据分析得出:苯酚降解菌最适降解p H值为7.0或偏碱性。

2.4 底物浓度对苯酚降解菌降解性能的影响

不同底物浓度在降解24h后苯酚降解菌的降解率见图3,在苯酚浓度为100~2200mg/L时,BF-2的降解效果是6株菌株中最好的。BF-2在苯酚浓度为100mg/L时苯酚降解率高达93.3%;此时,BF-4的苯酚降解率最低,为67.5%。在苯酚浓度为2200mg/L时,BF-2对苯酚的降解率降至39.6%;此时,BF-4的降解率仅为15.2%。根据实验数据分析得出:随着苯酚浓度的升高,苯酚降解率逐渐降低。

2.5 接种量对苯酚降解菌降解性能的影响

接种量对苯酚降解率的影响见图4。接种量在5%~20%时,菌株对苯酚的降解能力随接种量的增加而逐渐增大。在接种量等于20%时,6株菌株对苯酚的降解率均在此时达到最大。其中,BF-2的降解效果最佳,降解率为91.5%;BF-3的降解效果最差,降解率为67.7%。当接种量为20%~30%时,菌株对苯酚的降解率逐渐下降。以上结果说明,过多的增加投菌量不但会降低降解速率,且造成资源浪费,而适当增加投菌量,有利于快速去除水体中的苯酚,即应该按科学比例投加苯酚降解菌。

3 结论

从原黑龙化工厂废弃排污口处采集污泥,分离、筛选出以苯酚为唯一碳源的高效降解菌株,经研究菌株对不同的p H值、温度、苯酚浓度、接种量的适应能力。得出以下结论:降酚菌可以将100mg/L及以下的苯酚高效降解,在温度为25℃、p H为中性或弱碱性、接种量为20%的条件下对苯酚的去除效率最高,在苯酚浓度达至1200mg/L时仍有一定的降解效果。考虑各种环境因素,运用到实际中应充分考虑实际情况,进一步提高含酚废水的处理效率,充分发挥高效降酚菌在解决实际问题中的作用。因此在苯酚降解菌株的筛选中,不仅需要具有高产能力的菌株,更需要能够在短时间中达到最大降解率的菌株。即对于筛选出的高效耐酚菌株还要进一步的探究,以便缩短达到最大降解率所需的时间和提高降酚菌的活力。

参考文献

[1]钱莹莹.钛基氧化物电极电催化氧化含酚废水的研究[D].上海师范大学,2014.

[2]樊瑜.耐高浓度苯酚菌株的筛选及其降解特性研究[D].西安建筑科技大学,2012.

[3]朱艳霞.太湖入水口底泥微生物宏基因组及聚磷菌多样性研究[D].苏州科技学院,2012.

[4]叶长明,杨艳琴,任屹罡,等.高效秸秆降解菌株的分离与选育[J].河南农业科学,2012,41(8):89-92.

[5]刘姗姗,刘永军,黎兵.固定化活细胞苯酚生物降解特性研究[J].水处理技术,2012,38(9):30-33.

[6]刘国正,何义亮.焦化废水的MBR处理工艺[J].净水技术,2013,32(1):34-37.

[7]雷湘华,周鑫钰,夏花,等.一株朝鲜蓟内生菌降解苯酚初步研究[J].农学学报,2013,3(7):22-25.

[8]张雯,苏静静,曹丽琴.苯酚降解菌的筛选及其降解性能研究[J].环境科学与管理,2013,38(2):89-94.

[9]赵雪梅.降解苯酚的微生物菌种筛选研究[J].安徽农业科学,2012,40(3):1677-1678.

降解研究 篇10

敌敌畏(Dichlorvos,DDVP)化学名称:2,2-二氯乙烯基二甲基磷酸酯(C4H7Cl2O4P),是一种具有广谱、内吸、触杀等特点的高效、中等毒性有机磷农药,可用于防治多种虫害。目前,国内外对DDVP的研究报道主要集中在其环境毒理方面。对DDVP的降解方法主要是化学方法,沸石负载TiO2光催化法[2,3]。近年来,对于敌敌畏的微生物降解已有报道,降解菌包括尼古丁节杆菌[4]、木霉[5]、鞘氨醇单胞菌等[6],但是还未见甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)降解菌的报道。本研究利用长期受有机磷农药污染的土壤进行驯化培养,拟从中分离出高效降解菌,为2,2-二氯乙烯基二甲基磷酸酯农药的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

土壤样品采自沈阳地区长期受有机磷农药污染土壤。降解菌分离自所采集的土壤样品。

1.1.2 试剂

DDVP原药含量80%,购自沈阳农药厂;DDVP标准品含量99%,购自沈阳科发新技术开发公司;其余试剂均为分析纯,购自沈阳禹王化玻璃试剂有限公司。

1.1.3 仪器

自动高温灭菌锅LDZX-40(上海申安医疗器械厂);恒温摇床(中科院武汉科学仪器厂);气浴恒温振荡器(江苏金坛市医疗仪器厂);电泳仪(Thermo EC);PTC-200 PCR仪(Bio-Rad);725N型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);气相色谱仪(Thermo Finnigan)。

1.1.4 培养基

无机盐培养基的组成为:MgSO4·7H2O 0.20g,(NH4)2SO4 0.50g,NaCl 1.0g,KH2PO4 0.50g,K2HPO4 1.50g,加蒸馏水至1 000ml,调pH至7.0～7.5。不同驯化时间DDVP分别为100～500mg·L-1。

惟一磷源培养基:MgSO4·7H2O 0.50g,(NH4)2SO4 1.0g,NaCl 1.0g,葡萄糖1.0g,KCl 0.5g,加蒸馏水至1 000ml,调pH 7.0～7.5。

牛肉膏蛋白胨培养基的组成为:牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 10g,琼脂15.0～20.0g,水1 000ml,调pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 降解菌的筛选

取2g长期受污染的土样放入装有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中,调整DDVP浓度为100mg·L-1,30℃、180r·min-1摇床培养条件下振荡培养5～7d,再以10%的接种量转接入新鲜培养液中。每周转接1次,浓度依次以100mg·L-1递增,连续转接4次,直至DDVP浓度达到500mg·L-1。采用十倍稀释平板法,在以DDVP为惟一碳源的选择性无机盐培养基固体平板划线分离,同样操作重复3次。30℃恒温倒置培养。待平板上出现单菌落后,挑取单菌落分别转接至含DDVP(500mg·L-1)无机盐选择性液体培养基中,留待测定其降解率。

1.2.2 降解菌降解率的测定

农药提取及其分析:取上述培养液6ml(1次/d),8 000r/min离心,去除菌体,取上层清液4mL,加入8mL丙酮,剧烈振荡;再加入氯化钠至饱和,剧烈振荡1min,室温下静置5min,使水相与丙酮相分层,移出上层丙酮,过无水硫酸钠柱,收集流出的丙酮,留待气相色谱测定[7]。以上试验处理均为3次重复。

气相色谱测定条件:美国Thermo Finnigan TRACE GC,NPD检测器;DB-1701P色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm);氧气流量60mL·min-1,氢气流量2.3mL·min-1,氮气流量1.2ml·min-1,检测器温度300℃,进样口温度290℃,色谱柱程序升温度:60℃保持1min,30℃·min-1上升至130℃,5℃·min-1上升至170℃,进样量1.0μL。采用色谱纯丙酮作为溶剂。按峰面积定量。

1.2.3 菌株鉴定

1.2.3.1 生理生化鉴定

生理生化鉴定方法参见文献[8]。

1.2.3.2 基因组DNA提取

菌体基因组总DNA提取、纯化、检测方法参见文献[9]。

1.2.3.3 16S rDNA序列PCR扩增

引物设计[10]:5’端引物:5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’(Escherichia coli bases 8 to 27);3’端引物:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'(Escherichia coli bases 1507 to 1492)。扩增反应体系如下:10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL,dNTP(2.5mmol·L-1)4μL,引物(10pmol·μL-1)各1μL,Taq DNA聚合酶(5U·μL-1)0.4μL,菌体DNA(约50ng·L-1)2μL,加H2O至50μL。

反应条件:95℃变性5min;(94℃、1min, 55℃、1min,72℃、2min)30个循环;最后72 ℃延伸10min,保持10℃。

将PCR产物克隆后,委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.3.4 系统发育树的建立

将所获得的DDW-1菌株的16SrDNA序列在GenBank核酸数据库中进行BLAST比对[5],选择合适序列,利用Clusta1X1.8.3进行分析,通过MEGA3.1软件分析生成系统发育树。

1.2.4 降解酶定位

牛肉膏蛋白胨培养基,30℃、180r/min培养48h。4℃、6 000r/min,收集菌体及发酵液,菌体pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤、重悬,超声破碎、离心,分别收集碎片、上清。上清液即为胞内粗酶液。将发酵液、上清液、菌体碎片分别加到500mg/L的敌敌畏溶液中,8h后测降解率。以上试验处理均为3次重复。

2 结果与分析

2.1 降解菌株的分离与鉴定

从富集液中筛选到一株以DDVP为惟一碳源或磷源进行生长的细菌,命名为DDW-1。在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落乳白色、圆形、不透明、边缘整齐、表面微隆起、湿润光滑。在无机盐-DDVP培养基上菌落呈亮粉色。菌体呈长杆状,革兰氏染色阴性,甲基红阳性(弱),V.P.反应阴性,吲哚实验阴性,接触酶测定阳性(弱),葡萄糖,乳糖,蔗糖发酵不产气,产极少量酸。

DDW-1菌株16SrDNA序列构建的系统发育树见图1。菌株DDW-1位于Methylobacterium sp.分支上,与Methylobacterium sp.的相似性达到99%。结合形态结构和生理生化试验结果,将DDW-1归属为甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)。

2.2 DDW-1的生长及降解曲线

在惟一碳源培养基中,添加DDVP至浓度为500mg·L-1,以10%的接种量接入DDW-1,以灭活的DDW-1为对照,30℃、180r·min-1摇床培养,每隔1 d取样测定菌体OD值以及培养基中DDVP的含量(图2)。

从图2可以看出,随着菌体OD值增加,降解率也随着增大,在培养5d后,菌体浓度达到最高,降解率也最大,可达到74.9%。农药的微生物降解实质是酶促反应,这些酶是微生物固有的,或是由于变异产生的[11]。DDW-1菌株能够降解DDVP,可能是因为其体内存在可以分解DDVP的酶,有研究表明降解酶往往比微生物本身更具有好的降解效果[12]。因此,随着菌体增长,菌生物量改变,可能导致降解DDVP酶的改变,从而影响DDVP的降解效能。

在以DDVP为惟一磷源、碳源生长时,生长极其缓慢,4d后OD600仅为0.02,同样降解率也不高,仅有20%左右。

另外,将DDW-1接种于不同浓度的DDVP-无机盐培养基中,其耐受底物浓度可高达1 000mg·L-1。最适生长浓度在500mg·L-1。

2.3 温度对DDW-1的影响

在惟一碳源培养基中,DDVP至浓度为500mg·L-1,pH 7.0～7.5,以10%的接种量接入DDW-1,以灭活的DDW-1为对照,分别在20、25、28、30、35℃的不同恒温摇床培养箱(180r·min-1)培养,4d后测定吸光度值以及DDVP的残留量。

由图3可知,在28℃时,菌生长最快,并且在该温度下,DDVP的降解率最高,为63.7%。这进一步证明,菌体生长与DDVP的降解密切相关。另外,该菌在20～35℃范围内均能生长良好,对DDVP的降解率都达到40%以上,这说明DDW-1能够在较广的温度范围内降解DDVP。

2.4 pH对DDW-1的影响

在惟一碳源培养基中,DDVP至浓度为500mg·L-1,调节初始pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10,以10%接种量接入DDW-1菌液,设灭活的DDW-1为对照,1d/次测定其OD值,4d后测定其降解率。在pH 3、pH 4、pH 10时菌体均不能生长,另外,降解实验表明,碱性条件下降解效果要优于酸性条件,在碱性条件下DDVP降解更快,降解率更高,3d后降解率可达到80%以上。这可能由于DDVP在碱性条件下更容易降解。由图4可知,pH对菌的生长影响也较大,在pH 7菌体生长最佳。

2.5 降解酶定位

8h后测定发酵液、细胞裂解液、菌体碎片、菌体对敌敌畏的降解率分别为0.27%、29.80%、3.73%、8.26%。据此刻推断该酶为胞内酶。

3 讨论

本实验筛选到一株能降解DDVP的甲基杆菌(Methylobacterium sp.) ,目前还未见甲基杆菌属有降解DDVP功能菌株的报道。该DDW-1菌株能够以DDVP作为惟一碳源生长,同时以DDVP为惟一碳源和磷源时,生长极其缓慢,4d后OD600仅为0.02,同样降解率也不高,仅有20%左右。这很有可能说明该菌株不能直接以DDVP做为磷源,而需要在菌体生长初期加入少量的磷。姚杰等研究了DDVP在环境中能发生降解归转,部分水解产生PO43-[13],因而,菌株DDW-1在以DDVP为惟一碳源、磷源时,很有可能利用DDVP部分水解时产生的磷,从而启动生长繁殖。这与段雪梅等研究的结果相似[14]。

另外,酶定位实验表明,该菌产生的酶为胞内酶。菌株DDW-1在生长过程中,缓慢的分解农药作为营养源。大多数有机磷降解酶类为胞内酶,且多为水解酶。最近有研究表明有的菌株能通过有机渗透机制来降解DDVP[15],还有研究认为细胞色素CYP201A2在有机磷生物降解中起着重要作用[16]。该菌参与敌敌畏降解过程中,随着菌体OD值的增加,降解率也随着增大,在菌体生长到稳定期时,对DDVP的降解率达到74.9% 。推断该菌株能将DDVP完全降解,具体代谢途径有待进一步研究。

降解特性的研究表明,该菌株能够在20～35℃范围内很好地降解DDVP,在pH 4～10之间菌体能够生长。温度对菌的生长影响不大,pH对菌的生长以及DDVP的降解较大都有较大的影响。在碱性条件下该菌的降解效果最优,但是综合实际应用考虑,选择菌体的最佳生长条件较为适合。该菌的最佳生长pH值为7,最佳生长、降解温度为28℃。

4 结论

4.1 实验筛选到一株能降解DDVP的菌株DDW-1,该菌株属于甲基杆菌属(Methylobacterium sp.),该DDW-1菌株能够以DDVP作为惟一碳源生长, 另外,该菌亦可以以对硫磷、甲胺磷、甲基异柳磷、辛硫磷作为惟一碳源生长。

4.2 该菌的最佳生长pH值为7,最佳生长温度为28℃。在该条件下,500mg·L-1DDVP经过DDW-1菌株代谢3d后,降解率达63.7%。

降解研究 篇11

关键词联合厌氧发酵；尽料量；进料浓度；产气量

随着人们生活水平的不断提高，生活垃圾的产量逐年增加，无害化处理方法很多，与其它方法相比较厌氧处理有占地面积小、污泥产量少、运行成本较低[1]、有机物减量化明显，并且在处理过程中可以产生沼气、有机肥等副产品的优点，在1arm的状态下，甲烷燃烧的热值达到了9100 kcal／m3[2]符合垃圾的资源化处理，所以它代表了未来垃圾处理的一种趋势。

厌氧消化是在无氧的条件下，由兼性厌氧菌和专性厌氧菌联合降解有机物[2]的方法，较多人支持M.P.Bryant[3] 提出的沼气发酵三个阶段理论。能够进行厌氧发酵的物料有很多如：秸秆类物质为代表的农业废弃物、禽畜粪便和污水处理厂的活性污泥、以及生活垃圾等[4][5]。现价段应用于厌氧发酵的底物大多为单一物料，单一物料厌氧反应周期一致，过程容易控制，但是底物抑制较严重，反应往往不能进行彻底，所以内蒙古鄂尔多斯传祥垃圾处理厂采用了多种底物共同发酵，增加了反应物料的降解程度，提高了过程的产气量。参与反应的底物有生活垃圾中可生物降解部分、市政粪便、污水处理厂的污泥和餐厨垃圾等，各种物料通过预处理调节后进入混合发酵罐发酵。以内蒙古鄂尔多斯传祥垃圾处理厂的联合厌氧发酵工艺的投料量为研究对象，分析投料量与降解量以及沼气产量的关系，目的是优化发酵工艺、提高发酵设备的利用率。

1.实验原料和器材

1.1实验原料来源于内蒙古鄂尔多斯传祥垃圾处理厂调节罐的物料，该物料包括：经过分选预处理的生活垃圾中可生物降解部分、粪便、餐厨垃圾。

1.2实验器材

1.2.1实验装置为总容积1.1m³的玻璃钢罐，直径1m,总高1.8m。进料方式为连续式进料，出料靠溢流出料，罐底设150mm的排泥口，加热用水浴温控加热水箱。

1.2.2气体收集采用气体流量计，型号：LFM-1湿式防腐气体流量计，产地长春汽车制造有限责任公司。

1.2.3恒温干燥箱：101A-1上海东兴建材试验设备有限公司

1.2.4恒温电阻箱：A-10型，上海东兴建材试验设備有限公司

1.2.5 pH测定仪：5-3型，上海智光仪器仪表有限公司。

1.2.5磅秤：50kg

1.2.6胶体磨：出料粒径2-50μm

2实验步骤

2.1接种

接种，根据不同的固体量有很大的差异有时固体废物的量与接种物的量之比达到60：4O以上[6] 。该实验取内蒙古鄂尔多斯传祥垃圾处理厂的厌氧发酵罐的发酵液为接种物料，接种物料的取量为：300kg约为0.3m³，（接种量为实验罐总容积的1/3），接种后开始加温，调节菌种的温度为35℃。

2.2投料

接种后，第二天开始第一次投料，物料来源于蒙古鄂尔多斯传祥垃圾处理厂调节罐的混合物料，投料量： ，中温培养25天。

2.3菌种培养完成后，开始连续进料

2.3.1连续进料实验周期为30天

2.3.2进料量为44kg(0.044m³)/d

2.3.3原料预处理

预处理的目的是减小进罐物料的粒径，加快反应速度，增加产气量。预处理方式：取回的实验原料经过胶体磨破碎，破碎后物料粒径小于0.5mm。

2.3.4进料方式

准确称取44kg物料从反应器的进料口注入反应器（进料口在反应器的底部），进料过程中反应器的排气管打开，溢流口打开，让物料在重力作用下自然流入反应器，同时发酵后的物料溢流排出。

2.3.5收集原料和溢流料分析得出如下数据：

注意：本实验设定30天的实验周期是为了测定物料的平均反应效果。

3.测定方法

3.1沼气产气量用LFM-1湿式防腐气体流量计测量，流量计在使用前经过标定。

3.2TS、VS测定均采用BG规定的方法。

4结果与分析

4.1固体物质降解与产气量关系

用特性指标来确定有机物的厌氧生物降解性

这种方法是测定基质(被测有机物)在厌氧反应前后的浓度,以它作为特性指标,然后用浓度的变化(去除率η)来表示有机物的厌氧生物降解性：

η=1-Ce/Co（1）

式中Ce——反应后基质浓度,mg/L；

Co——反应前基质浓度,mg/L。[7]

根据实验数据和公式计算：

进料固体量为：0.26kg

出料固体量为：0.18kg

η=1-0.18/0.26

η=31%

降解量：0.26kg-0.18kg=0.08kg

降解单位体积固体物质产气量：

62L/0.0806kg=769L/kg固体

由以上计算可以看出本实验装置在处理低固体混合物料时固体降解率为：31%，每降解1kg固体产气量为769L。

4.2有机物降解与产气量关系

根据公式（1）和表一实验数据计算：

进料有机物量：0.1456kg

出料有机物量：0.0828kg

η=1-0.0828/0.1456

η=42%

降解量：0.1456-0.0828=0.0628kg

降解单位体积有机物产气量：

62L/0.0628kg=987L/kg有机物

由以上计算得出有机物降解率为42%，每降解1kg有机物产气量为987L。

1升沼气中，含碳C量的平均值约为0.538克/升。由此推算，原料被分解1克TOC气化后的产气量为1.86升。

G=1/Cg=1/0.538≈1.86（升/克）

只要实测了发酵原料的含水率（或污泥浓度）、有机份和TOC的含量，再根据4.2计算出有机物分解率。就可以在暂不考虑原料成分情况下，计算出混合发酵原料的单位体积的理论产沼气量。若实验室没检测TOC的含量，那么可以根据《污水污泥处理》一书中提出的：在理论上“一般有机物中，大约含有55%的碳”，这一数值推算出每升发酵原料中的TOC的含量，进而推算出污泥的理论产沼气量来。因本实验有机物降解量为：0.0628kg，该有机物中TOC含量为0.0628kg×55%=0.03454kg，理论产气量为0.03454kg×1860L/kg=64.2L

通过以上计算可知，本实验结论每降解1kg的有机物沼气产量已接近理论沼气产量。

4.3固体降解量、有机物降解量与进料固体量的关系

厌氧发酵产生沼气的反应是在缺氧和厌氧条件多种群微生物共同作用完成底物的降解的，因此厌氧发酵符合单一菌群发酵的普通规律，同时又会受到相关菌群相互制约，其表现在发酵底物和底物的浓度有关，一定底物浓度范围底物的降解与底物浓度成正相关，底物浓度越高降解量越大，底物浓度低时会产生反馈抑制，部分菌体休眠，将减量随之减小。该规律从图2和3可以看出。

5结论

该实验是厌氧法处理城市有机固体废弃物的一次中试试验，实验原料包括城市生活垃圾中的有机物（可以生物降解的物质）、粪便、城市集中源产生的餐厨垃圾等物料，通过本次试验得出厌氧法处理混合型城市有机固体废弃物的可行性结论，每1kgVS可以产生1019L沼气，换算成原生垃圾量为：每降解1T原生垃圾可以产沼气55m³，需要注意的是为了提高城市有机固体废弃物降解量和沼气的产生量，降低能耗，在实际生产中应尽量提高发酵底物的固体含量，保证厌氧微生物有足够营养，大量繁殖，以提高发酵效率，缩短发酵周期。

参考文献

[1]MURPHY J D,MCKOGH E Technical,economic and environmental analaysis of production from municipal solid waste[J] Renewable Energy,2004,29:1034-1057

[1] 林聪，王久臣，周长吉．沼气技术理论与工程[M]．北京：化学工业出版社，2007

[2]公维佳，李文哲，刘建禹．厌氧消化中的产甲烷菌研究进展[J]．东北农业大学学报，2006.37

降解研究 篇12

本研究从长期受苯胺污染的土壤中筛选、分离到一株降解苯胺能力较高的细菌菌株, 该菌株能以苯胺为惟一碳源、氮源和能源生长。本文对该菌株降解苯胺的生理生化特性和降解苯胺代谢途径中的相关酶进行了初步研究, 通过16S rDNA基因序列同源性比较, 该菌属芽孢杆菌的一种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种:

从长期受苯胺污染的土壤中分离获得。

1.1.2 试剂:

PCR所需各类试剂:10×PCR buffer, 10mmol/L dNTP混合物, 25mmol/L MgCl2, Taq DNA聚合酶, DNA Marker, 购自大连宝生生物制品有限公司, 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega公司, 其他试剂为国产分析纯。PCR引物Primer 1与Primer 2由大连宝生生物制品有限公司合成。

1.1.3 仪器:

TGL-16B高速台式离心机, KYC-1102C气恒温摇床, SPX-150BS-Ⅱ生化培养箱, YX280A手提式不锈钢蒸汽灭菌锅, SW-CJ-2F超净工作台, DELTA320度计, TU-1810紫外可见分光光度计。

1.1.4 培养基:

筛选培养基采用加入一定浓度苯胺的A15无碳、无氮基础培养基[7], 培养基组成为:K2HPO4 0.1g/L、KH2PO4 0.4g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、FeSO4·H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01 /L、NaCl 0.1g/L、Na2MoO4·H2O 0.01g/L, pH 6.8, 121℃灭菌20min。

1.2 方法

1.2.1 样品的富集和菌种分离纯化

从长期受苯胺污染的土壤中取10ml泥浆加入90ml 0.7%的灭菌生理盐水中, 充分振荡, 静置15min, 按2%加样量加入含苯胺500mg/L的100ml A15培养基中, 在30℃、120r/min摇床培养72h后, 按2%接种量连续转接8次, 每次转接时将苯胺的浓度依次提高250mg/L, 经过6次驯化, 其降解苯胺的最高浓度达到2 500mg/L。在苯胺浓度为1 500mg/L的A15固体培养基上涂平板, 30℃培养72h, 根据形态、色泽及大小挑取单菌落, 利用摇瓶培养和镜检经多次验证为单菌落, 接种保存。

1.2.2 细菌生长的测定

按2%的接种量将菌液接种到苯胺浓度为1 500mg/L的培养液中, 从培养12h开始, 每12h测定细菌生物量, 以蒸馏水校零, 在600nm波长下测定菌液的吸光值, 以OD600值表示细菌的相对生长情况。

1.2.3 苯胺浓度的测定

用萘乙二胺偶氮光度法[8]测定细菌生长过程中苯胺的残存量, 以苯胺降解率 (%) 来表示菌株对苯胺的降解能力。

1.2.4 苯胺双加氧酸粗酶液的制备及活力测定

按2%的量接种菌液于含苯胺1 500mg/L浓度的A15培养液, 30℃摇床培养, 24h后取样10ml, 4 000r/min离心10min收集培养液和细胞沉淀, 培养液用1:1的冷丙酮4℃下沉淀12h, 离心收集沉淀, 加5ml磷酸缓冲液 (0.1mol/L, pH 7.0) 制成粗酶液。细胞用磷酸缓冲液 (0.1mol/L, pH 7.0) 洗涤2次, 悬浮在相同的缓冲液中, 制成具有一定细胞浓度的细胞悬液, 细胞悬浮液在4℃冷藏后, 采用超声波破碎仪进行细胞破碎 (破碎5s停5s为一次, 共进行15次, 直到显微镜下观察到细胞破碎率大约90%左右为止) , 然后加入2倍体积的冷丙酮, 于4℃下沉淀2h, 再经12 000r/min离心10min, 加入适量磷酸缓冲溶液即为粗酶液。

1.2.5 苯胺双加氧酶液的活力测定

苯胺双加氧酶有邻苯二酚-2, 3-双加氧酶和邻苯二酚-1, 2-双加氧酶两种, 活力测定具体操作如下:

(1) 邻苯二酚-2, 3-双加氧酶:采用分光光度法, 测定体系总体积3ml, 分别向试管中加入2.4ml、pH 7.5的磷酸缓冲液, 0.4ml的20μmol/L的邻苯二酚溶液, 以及0.2ml的粗酶液。混匀后, 37℃水浴反应, 记录反应初始时375nm处的吸光值, 反应30min后, 测定反应液在该波长的光吸收增加值。酶活力单位 (U) 定义为在标准测定条件下, 每分钟内OD值变化0.001为1个酶活力单位U。 (2) 邻苯二酚-1, 2-双加氧酶:以邻苯二酚为底物, 反应混合物25℃水浴中反应40min, 每5min取样一次。反应产物顺, 顺-己二烯二酸的吸收峰在260nm处。OD260吸收值的增加表示产物顺, 顺-己二烯二酸的积累。酶活力以每mg蛋白每min生成产物的μmol数表示 (1mol邻苯二酚完全转变成顺, 顺-己二烯二酸时, OD260增加5.6) 。

1.2.6 蛋白质含量测定

采用紫外吸收法测定蛋白含量[9]。

1.2.7 细菌基因组DNA的提取及PCR扩增、PCR产物纯化、连接及转化

细菌基因组DNA的提取参照萨姆布鲁克等的方法进行[10]。以细菌的总DNA为模板, 采用下列16S rDNA引物:

Primer 1: 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3';

Primer 2: 5'-T AAGGAGGTGATCCAAC-3'。

PCR反应条件为:95℃预变性5min后, 95℃变性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸1.5min, 循环30次后, 72℃充分延伸10min。反应结束后取5μL产物用琼脂糖电泳检测PCR扩增结果, 目标产物经凝胶DNA回收试剂纯化后, 利用Promega pGEM-T Easy Vector Systems对PCR产物进行克隆, 连接产物转化E.coli DH5α, 然后在含氨苄青霉素 (50μg/ml) /IPTG/X-gal的LB平板上选择白斑, 碱解法提取质粒。核酸序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成, 测序结果用BLAST软件与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较分析。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离和筛选

按接种量为2%, 样品经含有不同苯胺浓度的A15培养基多次筛选、反复分离纯化, 获得20株可以苯胺为惟一碳源、氮源和能源生长的菌株。把这些菌株分别接种于1 500mg/L苯胺浓度的培养基中, 结果发现4号菌株降解苯胺的效果最好, 并将其命名为AN6-4, 以下实验均是利用该菌株进行的。

2.2 菌株降解苯胺的最适环境因素

2.2.1 温度

将AN6-4菌株接种于苯胺浓度为1 500mg/L、pH值为7.0的A15液体培养液中, 分别于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃条件下摇床培养72h, 每隔12h取样测定溶液中剩余苯胺的量, 结果表明, 该菌株生长和降解苯胺的温度范围为15℃～37℃, 30℃是细菌生长和降解苯胺的最佳温度 (图1) 。

—▲— percentage of aniline degradation;—■— cell growth.

2.2.2 pH值

将AN6-4菌株接种于苯胺浓度为1 500mg/L, pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的A15培养基中, 30℃摇床培养72h后, 取样测定苯胺降解率, 所得结果见图2, 从图2可以看出, 该菌株细胞生长和降解苯胺的最适pH值条件为7.0。

—◆— percentage of aniline degradation;—■— cell growth.

2.2.3 不同苯胺浓度对菌株生长的影响

将AN6-4菌株接种在pH值为7.0, 苯胺浓度分别为500mg/L、1 000mg/L、1 500mg/L、2 000mg/L、2 500mg/L、3 000mg/L、4 000mg/L和5 000mg/L的A15培养基中, 30℃摇床培养24h后, 测定细菌生长情况, 结果见图3。

图3结果表明, 在含苯胺浓度小于1 500mg/L的培养基中, 菌株细胞生长较快, 苯胺浓度大于1 500mg/L时, 细菌生长速度迅速下降, 而当苯胺为3 000mg/L及其以上的高浓度时, 细菌生长几乎停滞, 从36h开始培养基逐渐变成褐色, 并有黑色沉淀出现, 这可能是由于苯胺浓度过高, 导致细菌死亡的结果。

2.2.4 苯胺降解进程的变化

按2%接种量将AN6-4菌株接种于pH 7.0、苯胺浓度1 500mg/L的A15培养液中, 30℃培养72h后的结果见图4。

—■— percentage of aniline degradation;—◆— cell growth.

图4结果表明, 当苯胺浓度为1 500mg/L时, 细菌对苯胺降解效果较好;60h降解率可以达到100%, 以后培养液逐渐变混浊, 这是由于培养液中作为有机养分的苯胺已被完全消耗尽, 导致菌体自溶的结果。

2.3 重金属离子对菌株降解苯胺的影响

在含有1 500mg/L苯胺的基础培养基中, 分别添加Cu2+ (1mmol/L) 、Hg2+ (0.01mmol/L) 和Ag+ (0.025mmol/L) 三种重金属离子, 并以未添加重金属离子为对照, 在相同培养条件下观察三种重金属离子对苯胺降解效率的影响 (图5) 。结果表明, 1mmol/L Cu2+、0.01mmol/L Hg2+以及0.025mmol/L Ag+的重金属离子均能显著抑制菌株降解苯胺, 其中Ag+抑制作用最明显, 其次是Hg2+, 而Cu2+抑制作用最小。

2.4 不同时间内菌株邻苯二酚加氧酶活性的测定

已有的研究表明, 邻苯二酚-1, 2-双加氧酶和邻苯二酚-2, 3-双加氧酶均可以催化邻苯二酚芳香环的氧化开环反应[11], 如果在以苯胺为C源、N源和能源生长的细胞内或培养基中含有这两种酶的活性, 则说明在苯胺的微生物代谢过程中形成了邻苯二酚, 亦即邻苯二酚是苯胺降解的代谢中间产物。为此测定了培养过菌株的培养基中的这两种酶的活性。结果表明, 培养基中邻苯二酚-2, 3-双加氧酶的活性高达220U, 而邻苯二酚-1, 2-双加氧酶活性很低, 仅为8U (表1) 。因此, 可以认为邻苯二酚-2, 3-双加氧酶是AN6-4菌体催化降解苯胺的主要酶。说明在降解苯胺的过程中形成了邻苯二酚的中间产物, 进而被细胞中所含的邻苯二酚-2, 3-双加氧酶氧化开环形成2-羟基己二烯半醛酸。在细菌培养液中邻苯二酚-2, 3-双加氧酶的活性大于细菌菌体中的酶活性, 这表明该酶为胞外酶, 酶在菌体内合成后分泌到细胞外降解苯胺。不含苯胺的培养基中两种酶的活性均为0, 表明苯二酚-2, 3-双加氧酶是一种诱导酶。

注:1单位酶活定义为每分钟氧化1mol的邻苯二酚所需的酶量, 比活定义为每mg蛋白所含的酶活单位。

2.5 分子鉴定

AN6-4菌株镜检形态为杆状, 革兰氏染色阳性。为了确定其分类地位, 以基因组DNA为模板, 利用细菌16S rDNA特异引物进行PCR扩增, 得到长约1.5kb的扩增产物 (图6) 。测序确定其长度为1 544bp (Genbank登录号:FJ357795) , 后经BLAST软件与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较分析结果表明, AN6-4菌株16S rDNA基因序列与芽孢杆菌 (Bacillus) 属多个细菌的16S rDNA基因具有同源性高达99% (1530/1544) , 表明AN6-4菌株应属于芽孢杆菌属的一种。

3 讨论

我们分离获得了一株高效苯胺降解菌菌株AN6-4, 分子鉴定结果表明AN6-4菌株为芽孢杆菌属的一种。AN6-4营养条件需求简单, 可以苯胺为惟一碳、氮和能源生长, 只需补充少量的磷源和硫源;菌体生长和降解苯胺的温度和pH范围较广, 最适温度和pH分别为30℃、7.0;Ag+、Hg2+和Cu2+等重金属离子对该菌株生长和苯胺的降解均有不同程度的抑制作用。这与文献报道的苯胺降解菌的苯胺降解特性是一致的[1,12]。AN6-4菌株在苯胺浓度高于2 500mg/L时, 其细胞生长速度显著下降, 说明其对较高浓度苯胺的耐受能力还不是很强, 但苯胺浓度为1 500mg/L时, 经60h培养可全部被降解, 表明该菌株对降解苯胺的效率较高;酶活性分析结果证明, 苯胺诱导生成的胞外酶邻苯二酚-2, 3-加双氧酶在AN6-4菌株的苯胺降解中具有重要作用。本文结果表明, 芽孢杆菌AN6-4菌株在含苯胺的化工废水生物处理以及在已被苯胺污染区域的生物修复中将具有很好的应用前景。

M: DNA maker; 1, 2: Fragment of 16S rDNA.

参考文献

[1]张逸飞, 顾挺, 王国祥, 等.一株苯胺降解菌的分离鉴定、及其特性研究[J].环境污染与防治, 2008, (2) :12-15.

[2]任华峰, 李淑芹, 刘双江.等.一株对氯苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性[J].环境科学, 2005, 26 (1) :154-158.

[3]任随周, 郭俊, 曾国驱, 等.处理印染废水的厌氧折流板反应器中的微生物种群组成及分布规律[J].生态学报, 2005, 25 (9) :2297-2303.

[4]Bachofer Lingens F, Schater W.Conversion of aniline into pyrocatechol byaNocardia spincorporation of oxygen 18[J].FEBS Lett., 1975 Feb 1, 50 (2) :288-290.

[5]任随周, 郭俊, 曾国驱, 等.2株苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性研究[J].环境科学, 2006, 27 (12) :2525-2530.

[6]梁泉峰, 陈明, 徐玉泉, 等.高效降解苯胺的菌株AD9的分离、生理生化特性分析和分子鉴定[J].高技术通讯, 2005, 15 (11) :69-73.

[7]周霞, 郑先强, 佟树敏, 等.苯胺降解菌的特性研究及分子生物学基础[J].南开大学学报:自然科学版, 2004, 37 (2) :24-28.

[8]中国标准出版社第二编辑室.水质分析方法国家标准汇编[M].北京:中国标准出版社, 1996:169-171.

[9]李建武.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社, 1994:171-173.

[10]萨姆布鲁克J, 弗里奇E F, 曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].2版.北京:科学出版社, 1992:674-683.

[11]刘志培, 杨惠芳, 周培瑾.食酸丛毛单胞菌AN3菌株降解苯胺代谢途径的研究[J].微生物学报, 1999, 19 (15) :448-453.