药物筛选（精选7篇）
药物筛选 篇1
为筛选出防治家蚕细菌病的理想药物, 依据正在使用、相对较新、杀菌广普、适用于口服、价格相对低廉、与传统防治药物有一定的衍生关系等原则, 从人用药和兽用药品种中定性选择出了盐酸环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、氟苯尼考等药物。在此基础上, 进行了目的药物的筛选试验。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试蚕种
9202×鲁七, 青州蚕种场生产。
1.1.2 供试病原
山东农业大学蚕病室继代培养, 主要种类是黑胸败血菌和灵杆败血菌。
1.1.3 供试药物
盐酸环丙水洗星、诺氟沙星、恩诺沙星、红霉素均为市售原粉。
1.1.4 培养基成分
牛肉膏3g、蛋白冻10g、NaCI5g、琼脂15g、定容1L、pH=7.5。
1.2 试验方法
1.2.1 浓度设置
药敏试验药剂浓度为3%的原液, 药效试验药剂浓度均为180mg/L。
1.2.2 试验设区
每个处理设3个重复, 每个重复均为20头蚕。
1.2.3 体外抑菌试验方法
(1) 细菌准备:将培养好的细菌每管倒入20ml无菌水, 将菌膜充分刮起后倒入三角瓶中, 然后充分搅拌。 (2) 培养基的准备:将制好的培养基放入沸水中溶化, 备用。 (3) 接种:在无菌条件下, 吸取菌液分别放入已消毒的培养皿中, 每个培养皿放入2ml菌液, 然后将冷却后的培养基倒入培养皿中, 用量以盖过培养皿底为佳, 适当摇匀后, 将直径6mm滤纸片放入已配好的药液中, 滤纸片被药液浸透后, 再放入相应浓度编号的培养皿中间, 30℃下培养48h, 观察抑菌圈大小。
1.2.4 药效试验方法
(1) 病菌接种:在无菌条件下用接种环刮取细菌, 用昆虫针蘸取, 从节间膜处穿刺, 将病原接种于蚕体。 (2) 药物添食法:从4龄起蚕开始各处理每天添食1次相应的药物, 到5龄第3天蚕儿接种细菌, 后继续进行药物添食, 直到毒对照蚕儿发病止, 调查发病率。 (3) 发病调查方法:待毒对照蚕儿明显表现出病症时, 用肉眼观察法调查各区蚕的发病情况。
2 药物的初选结果与分析
2.1 体外药敏试验
(结果见表1)
从表1中可以看出, 试验药剂对黑胸败血杆菌, 灵杆菌均有抑制作用。在所有的药剂中氟苯尼考对黑胸杆菌和灵杆败血菌的抑制作用最好, 抑菌圈直径分别是48.5mm、32.6mm。其抑菌效果明显好于其它药物, 特别是对灵杆菌效果更明显。其次是盐酸环丙沙星, 抑菌圈直径分别是42.7mm、7.6mm。
2.2 不同药剂药效对比试验
(结果见表2)
从表2可以看出, 3种药剂对黑胸败血病治疗效果均较好, 但氟苯尼考效果最佳, 发病率为0。比盐酸环丙沙星低12%, 比氯霉素低9%。3种药剂对灵杆菌败血病治疗效果差别较大, 氟苯尼考效果最佳, 发病率为26%, 而盐酸环丙沙星、氯霉素的治疗效果均较差、发病率分别为88%和64%, 比氟苯尼考分别高62%和38%。
2.3 小结
经体外药敏试验和药效对比试验, 氟苯尼考对黑胸败血病和灵菌败血病的治疗效果均比盐酸环丙沙星和氯霉素好, 尤其对灵菌败血病的治疗效果最突出。
3 讨论
(1) 长期以来, 家蚕细菌病一直是影响蚕业生产的一重要因素。传统的做法是通过消毒和使用普通药物氯霉素。而消毒具有局限性, 传统药物由于长期使用已产生抗药性, 选择有效的抗菌药物已是蚕业生产的重要任务。
(2) 最近几年, 人用药和兽用药的发展速度很快, 从人用药和兽用药中选择有效的抗菌药物, 而且使之与传统防治药物有一定的衍生关系, 这是治疗家蚕细菌性疾病行之有效的办法。
(3) 科学试验的结果表明, 氟苯尼考是治疗家蚕黑胸杆菌和灵杆败血菌病的有效药物。同时更加经济、更加安全地使用新的抗菌药物, 也是今后研究的方向。
摘要：本试验通过药敏试验和药效对比的办法筛选出对黑胸败血杆菌、灵杆菌有抑制作用的药物。结果表明, 盐酸环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、红霉素、氟苯尼考药物中, 氟苯尼考对黑胸败血杆菌和灵杆菌败血菌病的治疗效果最好。
关键词：家蚕,细菌病,药物,筛选
鸡柔嫩艾美耳球虫药物筛选试验 篇2
关键词：养鸡,柔嫩艾美耳球虫,耐药性,敏感药物,药物筛选,试验,牡丹江地区
鸡球虫病是严重危害养鸡业稳定健康发展的一种普遍多发的疾病, 是由艾美耳科艾美耳属原虫引起的寄生虫病。无论是养鸡专业户, 还是机械化程度高、饲养管理严格的集约化养鸡场, 球虫病的发生都无法避免。防治鸡球虫病是一个长期的问题, 任何一种方法或措施都要因地制宜, 结合当地实际情况, 不可完全照搬。需要根据本地实际, 结合定期进行优势虫种调查的抗药性监测, 参照历史用药, 制订合理的用药方案, 才能发挥最大的效益。目前, 牡丹江地区主要是以在饲料或饮水中添加抗球虫药物为主的方式来进行防治鸡球虫病。但是由于抗球虫药物长时间应用, 使鸡球虫对抗球虫药物产生了耐药性, 从而达不到理想的防治效果, 甚至无防治作用。亚临床鸡球虫病或临床鸡球虫病的出现, 给养鸡业造成了巨大的经济损失。因此, 应该定期对本地区的主要感染球虫进行敏感药物筛选试验, 观察常用抗球虫药物的防治球虫效果, 从而可以科学地指导本地区合理使用抗球虫药物, 使牡丹江地区养鸡业得到较好的经济效益, 减少经济损失。
1 材料与方法
1.1 试验药物
氯苯胍60mg/kg、氨丙啉125mg kg、常山酮3mg/kg、氯嗪苯乙氰5mg kg、马杜拉霉素5mg/kg、氯羟吡啶125mg/kg、盐霉素60mg/kg、莫能菌素120mg/kg。
1.2 试验动物
从牡丹江种鸡场购买海兰褐公雏, 在种鸡场经过孵化出壳后运回本校养鸡试验场。该公雏的生长环境要严格杜绝有球虫的存在, 饲养用具、所食的饲料和饮水事先要经过严格的消毒处理。饲料中不添加任何抗球虫药物, 饲养至21日龄时候, 进行粪便虫卵检查, 确定无任何球虫感染后才能用于药物敏感筛选试验。
1.3 球虫卵囊
E.tenella宁安株和穆棱株, 新鲜粪便采集于宁安县和穆棱县部分地区养鸡场, 用洁净塑料袋密封带回试验室进行球虫卵囊的分离、纯化、孢子化, 处理成单孢子卵囊后接种无球虫的雏鸡进行卵囊扩增, 饲养到第5d开始采集粪便进行球虫种类的鉴定, 纯化鉴定为柔嫩艾美耳球虫的, 培养孢子化卵囊后保存备用。
1.4 分组
选190只试验鸡 (21日龄海兰褐公鸡) , 试验前每只进行称重记录, 随机分成每组10只, 共19组, E.tenella宁安株和穆棱株分别设8个感染用药组和l个感染不用药组, 1个健康不用药组。18个感染组的试验鸡口服接种混合孢子化卵囊1×104个/只, 接种后, 分别在饮水或饲料中按有效治疗浓度添加氨丙啉、氯苯胍、马杜拉霉素、常山酮、地克珠利、盐霉素、克球粉、莫能菌素8中抗球虫药物。连续进行喂服, 每天观察每只鸡的临床症状和粪便的变化情况, 从第5d开始, 收集粪便直到第13d左右结束, 进行虫卵计数 (可用麦氏虫卵计数法) , 第8d的时候开始称重, 观察粪便病变情况, 进行粪便病变记分。感染后, 发生死亡的试验鸡, 马上进行称重后剖检观察肠道病理变化, 并收集肠内容物, 计数各试验组鸡小肠内平均的卵囊产量。
1.5 耐药性判定指标
本试验通过四项指标来综合评定球虫耐药性, 即抗球虫指数 (ACI) 、病变记分减少率 (RLS) 、相对卵囊产量 (ROP) 、最适合抗球虫活性百分率 (POAA) 。
2 结果与分析
各组试验鸡分别饲喂8种抗球虫药物后, 根据各组试验鸡的相对增重率、卵囊值、存活率、病变记分等情况, 经过计算, 四项指标的强弱顺序分别如下:
2.1 各种球虫药对E.tenella宁安株耐药性判定结果
POAA:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >马杜拉霉素>氯羟吡啶 (克球粉) >莫能菌素>常山酮>盐霉素>氯苯胍>氨丙啉。
RLS:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >马杜拉霉素>常山酮>氯羟吡啶 (克球粉) >莫能菌素>盐霉素>氨丙啉>氯苯胍。
ROP:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >马杜拉霉素>常山酮>莫能菌素>氯羟吡啶 (克球粉) >氨丙啉>盐霉素>氯苯胍。
ACI:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >马杜拉霉素>莫能菌素>常山酮>氯羟吡啶> (克球粉) >盐霉素>氨丙啉>氯苯胍。
2.2 各种球虫药对E.tenella穆棱株抗药性判断结果
POAA:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >盐霉素>氯羟吡啶 (克球粉) >氨丙啉>马杜拉霉素>氯苯胍>莫能菌素>常山酮。
RLS:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >氯羟吡啶 (克球粉) >马杜拉霉素>常山酮>氨丙啉>盐霉素>莫能菌素>氯苯胍。
ROP:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >马杜拉霉素>氯羟吡啶 (克球粉) >常山酮>莫能菌素>盐霉素>氨丙啉>氯苯胍。
ACI:氯嗪苯乙氰 (地克珠利) >氯羟吡啶 (克球粉) >马杜拉霉素>盐霉素>莫能菌素>常山酮>氯苯胍。
3 结论
本试验选取了E.tenella宁安株和穆棱株对目前8种常用的抗球虫药进行了敏感药物筛选试验, 用最适合抗球虫活性百分率 (POAA) 、病变记分减少率 (RLS) 、相对卵囊产量 (ROP) 和抗球虫指数 (ACI) 四项指标的综合判定结果表明: (1) E.tenella宁安株重度耐药的为氨丙啉、盐霉素和氯苯胍;中度耐药的为常山酮和克球粉;轻度耐药的为莫能菌素;敏感的药物为马杜拉霉素和地克珠利。 (2) E.tenella穆棱株重度耐药的为莫能菌素、氨丙啉、氯苯胍、盐霉素和常山酮;中度耐药的为克球粉和马杜拉霉素;敏感的药物为地克珠利。
降尿酸药物筛选方法学研究进展 篇3
人体内血尿酸含量正常值为1 200mg, 当血尿酸含量超过正常范围时, 易导致高尿酸血症, 损害肾脏功能;当血尿酸浓度过高时, 易在关节部位形成结晶沉淀, 导致关节肿胀和疼痛而引发痛风。此外, 高尿酸血症与血糖、血脂代谢密切相关, 是引发动脉粥样硬化、冠心病和高血压的危险因素, 是冠心病患者死亡的独立预警因子, 在糖尿病及其并发症发生和发展中起到重要作用[1]。
根据尿酸产生与排泄的机制, 降尿酸的途径主要包括减少尿酸生成、增加尿酸排泄、抑制尿酸重吸收。降尿酸药物可通过建立高尿酸血症动物模型进行体内筛选, 或建立肾小管上皮细胞 (RTEC) 模型进行体外筛选, 还可直接在体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。本文主要对降尿酸药物的体内和体外筛选方法进行综述, 为治痛风新药的研发提供参考依据。
1 降尿酸药物体内筛选方法
降尿酸药物的体内筛选方法为建立高尿酸血症动物模型, 造模方法主要分为以下三种[2]: (1) 直接摄入尿酸、高嘌呤食物或尿酸前体物质, 增加黄嘌呤氧化酶活性, 促进尿酸产生, 形成高尿酸血症模型; (2) 通过给药抑制尿酸排泄, 增加血尿酸浓度, 形成高尿酸血症, 常用药物为腺嘌呤、烟酸等; (3) 抑制尿酸酶活性。尿酸酶可氧化分解成尿酸, 通过抑制或消除尿酸酶活性可增加血尿酸浓度, 常用尿酸酶抑制剂为氧嗪酸。此外, 还可利用基因工程技术, 破坏小鼠尿酸酶基因, 获得尿酸酶缺乏的突变型小鼠高尿酸血症模型[3]。
高尿酸血症通常会伴有其他合并症, 引发一系列继发性损伤, 如糖脂代谢紊乱、痛风、肾损伤及心血管疾病。因此, 高尿酸血症动物模型可分为单纯性高尿酸血症模型和伴继发性损伤或合并症的高尿酸血症模型。
1.1 单纯性高尿酸血症动物模型
单纯性高尿酸血症常用造模动物为大鼠、小鼠。杨桂梅等[4]灌胃给予大鼠氧嗪酸, 大鼠体内尿酸含量明显升高, 且维持时间较长, 无肾功能损害。张培等[5]灌胃给予大鼠高酵母饲料及腺嘌呤溶液, 皮下注射氧嗪酸乳悬液, 获得慢性高尿酸血症模型, 该模型稳定、血尿酸含量高、维持时间长。董静[6]连续灌胃给予小鼠酵母膏和乙胺丁醇3周, 获得持久稳定的高尿酸血症模型。
1.2 伴继发性损伤或合并症的高尿酸血症动物模型
伴继发性损伤或合并症的高尿酸血症模型常用动物为大鼠、小鼠、鸡及鹌鹑。Stavric等[7]以氧嗪酸、尿酸混合饲料喂养大鼠, 使其血尿酸含量升高, 肾脏内出现明显的尿酸盐结晶沉积、肾小管间质纤维化及尿酸性梗阻型肾病。迪丽达尔·希力甫等[8]腹腔注射给予大鼠酵母膏和氧嗪酸, 使其尿酸维持高浓度水平, 且大鼠肾脏、心脏及动脉发生形态和病理改变, 是研究高尿酸血症引起继发性心血管病理损伤的良好模型。高碧珍等[9]以高糖、高脂饲料饲养大鼠, 以腺嘌呤灌胃, 可复制高尿酸血症合并糖脂代谢紊乱模型。匡红艳[10]采用高蛋白质、高钙饲料饲喂鸡并限水, 鸡的跗踝周径明显增大, 获得高尿酸痛风性关节炎动物模型。杨红莲等[11]采用尿酸、腺素混合饲料喂饲鹌鹑, 获得持续稳定的高尿酸血症模型, 随着造模时间的延长, 鹌鹑还伴发有糖、脂代谢紊乱, 肝、肾功能损伤等病理表现。
2 降尿酸药物体外筛选方法
降尿酸药物的体外筛选方法为建立肾小管上皮细胞模型, 还可直接在体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。尿酸进入肾脏后, 经肾小管上皮细胞顶模进入上皮细胞, 再经细胞的基底膜进入肾小管周围的毛细血管, 进而回到体液中, 当尿酸重吸收量增大时, 血浆中尿酸浓度便会升高。因此, 通过建立肾小管上皮细胞 (RTEC) 模型, 考察体外测定药物对RTEC尿酸重吸收功能的影响, 可筛选出降尿酸药物。黄嘌呤氧化酶 (XO) 在尿酸生成过程中具有重要作用, 其可催化次黄嘌呤生成黄嘌呤, 进而生成尿酸, XO还可直接催化黄嘌呤生成尿酸。因此, 可在体外测定药物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用, 筛选降尿酸药物。
2.1 肾小管上皮细胞模型
RTEC模型的建立可分为原代分离培养和细胞株培养两种, 各有优缺点。原代分离的RTEC形态和特征保留完整, 生物性状变化不大, 更接近体内状态, 具有较好的特异性, 且其分化程度高, 稳定性强, 是体外研究RTEC对尿酸吸收功能的最佳选择。但原代分离的RTEC中杂细胞多, 细胞纯度不高, 且原代分离的RTEC高度分化, 仅能传2~3代, 需重复分离。细胞株的培养可无限增殖和传代, 但功能特征与体内原始状态差异较大, 其尿酸吸收功能有一定改变, 在筛选降尿酸药物时具有一定的限制性。原代分离RTEC的介质主要为人、大鼠、小鼠和兔肾脏, 通过酶消化法获取肾小管节段进行组织培养, 进而获取RTEC。肾小管节段的纯化可采用细胞筛机械分离, 或者percoll分离液梯度离心分离, 也可两者联用。
臧路平等[12]取小鼠肾脏, 切取肾皮质剪碎研磨, 采用Ⅰ型胶原酶消化, 依次过50目、100目筛网, Per coll密度梯度离心分离肾小管节段进行培养, 获得小鼠RTEC。然后采用分离的细胞进行尿酸吸收功能测试, 验证了该模型可用于体外筛选降尿酸药物。严玉澄[13]取正常人肾皮质的组织块, 采用无血清培养液直接培养, 获得了人近端肾小管上皮细胞。
RTEC可自发性或诱发性转变为永生化细胞株, 使用SV40病毒可有效诱导RTEC无限增殖[14]。目前实验室已获得了高度专一的肾小管上皮细胞株, 包括近曲肾小管细胞、髓袢升支细胞等[15]。
2.2 黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选
XO可催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化生成尿酸, 并产生氧自由基, 因此抑制XO活性即可达到降尿酸效果。在体外测定药物对XO活性的影响, 即可筛选XO抑制剂。XO活性的测定方法主要为紫外分光光度法, 吸光度值越大, XO活性越高。此外, 也可在反应体系中加入氯化硝基四氮唑蓝 (NBT) , NBT可与氧自由基产生紫色的甲臜, 通过测定甲臜的吸光度可反映XO的活性。体外筛选XO抑制剂时, 需考虑待测样品的吸光度干扰, 设置空白对照实验。
朱深银等[16]建立了XO抑制剂的高通量筛选模型, 并筛选了71 760个化合物和初提物。黎莉等[17]利用体外XO抑制剂筛选方法, 发现枳椇子乙醇提取物、高良姜乙醇提取物和葛花乙酸乙酯提取物对XO具有较强的抑制活性。
3 结语
尿酸水平升高可引发痛风、肾功能损伤、心血管疾病及代谢综合征等。随着生活水平的提高, 高尿酸血症的发病率呈上升趋势, 因此筛选降尿酸药物对高尿酸血症的防治至关重要。
降尿酸药物的筛选分为体内和体外两种。体内筛选是建立高尿酸血症动物模型, 给药后进一步筛选出具有降尿酸作用的药物。体外筛选是建立肾小管上皮细胞模型和体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。肾小管上皮细胞模型的建立可选择原代分离和细胞株培养, 该模型药物作用靶点精准, 数据直观。黄嘌呤氧化酶抑制剂的体外筛选具有效率高、灵敏性好、作用准确等优点。
与体内筛选方法相比, 降尿酸药物的体外筛选具有明显的局限性, 不能充分反映药物的药理作用以及机体对药物的吸收代谢过程。但体外筛选方法可在细胞和分子水平上进行降尿酸药物的筛选, 具有高效、灵敏、准确、经济等特点, 特别适合高通量药物的筛选。随着体外筛选模型评价标准的发展以及新药作用靶点的研究发掘, 筛选模型将更加具有新颖性和实用性, 将成为新药开发的一个重要研究方向。
摘要：降尿酸药物的筛选方法分为体内和体外筛选两种。体内筛选方法是建立高尿酸血症动物模型, 体外筛选方法是建立肾小管上皮细胞模型和体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。目前体内动物模型筛选方法研究比较成熟, 已有诸多文献报道, 体外酶抑制剂和细胞水平筛选尚需进一步探索研究。总结降尿酸药物体内外筛选方法, 为新药开发利用提供参考依据。
药物筛选 篇4
1 结直肠癌概论
结直肠癌 (Colorectal cancer , CRC) 的特点是癌基因的渐进性突变, 或是肿瘤抑制基因的突变:科学研究证据表明至少需要4-5个突变才会导致恶性肿瘤的发生。这些突变中有些似乎经常发生在相同的序列, 并且在很多罹患这种肿瘤的个体中出现, 而另一些个体的突变则不同, 这些突变最终决定了肿瘤表型。引起CSC突变的大多数信息来源于肿瘤遗传形式的研究, 占所有结直肠癌病例的5-10%。家族性腺瘤性息肉 (Familial adenomatous polyposis , FAP) 是一种常染色体显性遗传CRC综合征, 由腺瘤性结肠息肉病 (adenomatous polyposis coli, APC) 基因突变引起, 具有多个CRC特征。APC在名为wingless/wnt信号通路的底部。APC主要的功能是调节胞浆β-catenin的水平, 这是一种能迁移到细胞核并激活转录蛋白复合物TNA的一种蛋白质 (转录cmyc和cyclinD1) , 负责调节增生、分化、迁移和凋亡[1]。对于后续发展, 肿瘤需要更多的突变, 包括KRAS和TP53基因突变以及染色体18q的缺失[2]。
作为基因和/或遗传学改变的结果, 肿瘤干细胞可以来源于正常干细胞或前体细胞[3]。肿瘤干细胞通常能在传统治疗中存活下来;即使经过治疗原发肿瘤明显地完全地消除了, 而残余的CSCs仍然能够诱发最微小的残留性病变 (minimal residual disease , MRD) 。所以, 理解维持未成熟状态的机制成为有助于开发新的抗肿瘤策略的关键。
2 结直肠干细胞的存在
在成年人的结直肠里, 上皮层大约有14, 000个隐窝/平方厘米, 每个隐窝大约含有2, 000-3, 000个细胞, 结直肠干细胞就位于其底部, 周围有间充质细胞形成干细胞的niche。肠道中的每个隐窝主要有三种不同的细胞组成:结肠细胞或称柱状细胞, 分泌粘液的杯状细胞和内分泌细胞。所有这些细胞的产生都起始于结直肠干细胞, 通过不对称分裂能产生和其本身相同的细胞 (自我更新能力) , 成熟转型中的细胞在迁移到隐窝顶部的过程中发生增殖和分化。这种"一元论" (一个单细胞能产生所有的细胞类型) 最初在1974年形成[4], 并在随后的实验中得到证实[5,6]。在人的一生中, 这些干细胞对于结直肠上皮细胞源源不断地补充着肠道上皮, 正常情况下每2-7天更新一次, 在组织受到损伤时它们更新得会更快。
关于干细胞的定位有两种模式:一是“干细胞区域”模型, 描述了结直肠干细胞是位于深藏在隐窝底部的柱状细胞。二是与此相反的“+4部位”模型, 认为肠道干细胞位于隐窝底部潘氏细胞上的+4部位[7]。实际上还缺乏特异性的结直肠干细胞标记物来确认它们。
3 肠道Niche对干细胞的作用
Niche定义为负责维持干细胞的微环境, 它通过精确信号控制来确保干细胞的增殖。最具决定性作用的似乎是肠上皮下肌纤维母细胞 (intestinal sub-epithelial myofibroblasts , ISEMFs) , 它的作用是调节器官形成和组织修复, 它的生长似乎是由多种生长因子调控的。最近的研究显示维持干细胞niche是由Wnt, 骨形态发生蛋白BMP, Notch和Shh途径控制。
在niche调控信号网络中, Wnt途径绝对起着关键性作用:B-catenin在这其中起了中心作用, 在没有Wnt配体时它结合APC蛋白, 这个蛋白是糖原合成激酶3B (GSK3B) 和蛋白axin, 然后磷酸化、泛素化, 最后被蛋白酶机制降解。相反, Wnt信号的激活需要Wnt家族蛋白结合到它们的受体Frizzled信号家族 (Frizzled family , Fz) 后促进B-catenin积累到细胞核, 和TCF4结合, 这就激活了好几种基因的转录, 包括细胞周期调节和增殖相关的基因。B-catenin也诱导Ephrin受体EphB1和EphB2的表达, 它调节干性维持、细胞迁移和分化, 这些受体随后和ephrin配体相互作用, 扩增隐窝最上部区域的细胞增殖范围。有趣的是Wnt途径成员沿着隐窝轴的分布是不同的, 比如分泌出来的Fz相关蛋白 (sFRP) -5, Wnt-3, Wnt-6, Wnt-9b和Fz-5的mRNA可以在隐窝基底部发现, 它们的浓度朝向隐窝顶部方向逐渐减少, 而隐窝顶部驻留着更多已分化细胞。另外, 隐窝顶部的细胞似乎表达Wnt信号抑制因子[8]。
Notch通路是研究最多的细胞信号系统之一, 它包括四个不同的I型跨膜受体:Notch1, Notch2, Notch3 and Notch4。它的激活涉及结合五种不同的配体包括Jagged-1 (JAG1) , -2 (JAG2) , Delta-like (DLL) 1, 2 (DLL2) 和4 (DLL4) :这些配体的胞外结合触发细胞内区域 (intracellular domain, NICD) 的释放, 通过一些金属蛋白酶比如ADAM10或ADAM17介导的蛋白裂解进行。NICD移到细胞核内并在那里和一些DNA-结合蛋白形成一个复合物, 把它们从抑制剂转变成所有靶基因转录的激活剂[9]。
BMP蛋白是TGF-B超家族成员的亚型, 和它们的受体连接后能激发不同的生物学过程。这个途径使得Smad1, Smad5, Smad8/R-Smad磷酸化, 并和Smad4 (Co-Smad) 一起移到细胞核内, 并与其他转录因子合作能调节靶基因表达。BMP促进终末分化和凋亡, 增加传统治疗对肿瘤的作用, 但没有出现随之而来的SMAD4的突变和PI3K结构性激活。KOSINSKI等[10]报道了不同的因子沿着隐窝有着精确的分布:在隐窝顶部细胞高表达BMP1, BMP2, BMP5, SMAD7, BMP7, 和BMP受体2, 而在隐窝底部有可能是因为有肌纤维母细胞的存在, 细胞产生高水平的BMP拮抗剂如GREM1, GREM2和chordin样-1, 这有助于干性的维持。
Shh在肠道形成中起了重要作用。激活需要Shh结合它的受体Patched (PTCH) , 它允许G耦联蛋白Smoothened (SMO) 释放, 连同GLI转录因子一起迁移到细胞核内介导靶基因激活[11]。另外, VERMEULEN等[12]报道了肌纤维母细胞和它们分泌的因子的重要作用, 比如肝细胞生长因子 (HGF) 在维持肠道隐窝干细胞niche上的重要性。分化了的细胞能还原它们的表型, 能对外加的肌纤维母细胞或HGF产生反应从而还原成干细胞, 既成瘤性。
4 肿瘤干细胞理论
近几年, 肿瘤研究中新的见解认为, 在肿瘤实体中具有启动和维持肿瘤生长能力的是一小撮具备干性特点的肿瘤细胞, 被称为“肿瘤干细胞” (CSCs) 或“肿瘤起始细胞”[13]。这个发现已经深刻地改变了人们看待肿瘤的方式, 以前肿瘤仅仅被看作是一种基因性疾病。有两种不同的肿瘤模式可以解释肿瘤的发展:第一种是由VOGELSTAIN[14]和NOWELL[15]假设的成瘤性“经典模式”, 描述了通过致癌基因和肿瘤抑制基因序贯突变发展成肿瘤。照这个理论, 肿瘤由异质性的细胞群组成, 获得新的突变, 发生无法控制的增殖和侵袭。这种随机的模式认为, 在移植到免疫抑制小鼠后所有的肿瘤细胞都能形成一个肿瘤。与此相反的第二个理论, “肿瘤干细胞”模型是基于这样一个证据, 在肿瘤群系中仅有一小撮细胞--CSCs才能启动和维持肿瘤的生长[16]。
新出现的证据表明CSCs可以从各种不同的肿瘤类型里分离获得, 仍然保有成瘤性能力, 并具有播散、复发和转移性播散的作用。CSCs可以从正常细胞基因/表观遗传学改变后获得自我更新能力, 也可以由前体细胞获得自我更新能力变化而来。已经发现肿瘤和正常干细胞之间的联系是基于共同的调节自我更新信号途径, 包括Wnt, Notch和Shh:这些途径调节异常在肿瘤的发生过程中起了关键性的作用。JAMIESON和同事们[17]在白血病干细胞播散病例中, 第一次确认了异常的Wnt/Bcatenin自我更新途径激活;Wnt途径后来也被认为在乳腺癌干细胞 (BCSCs) 中是很重要的。KORKAYA等[18]发现, Wnt/B-catenin增加的活性是由Akt信号激活介导的。Notch途径里的缺陷可以在结直肠CSC亚群中见到, 正常时Notch途径和干细胞生长分化有关。HOEY和他的同事们[19]用一种拮抗Notch途径的重要成分--DLL4的抗体, 观察到人结直肠癌异种移植的生长受到抑制, 因为这个抗体直接抑制了Notch信号。Notch途径在乳腺癌和胶质母细胞瘤CSCs模型里也被激活。在很多肿瘤里Hedgehog信号途径里的改变也有报道, 比如:白血病[20,21], 胰腺癌, 胃癌, 前列腺癌, 乳腺癌[22,23], 胶质母细胞瘤[24]和大肠癌[25]。
近年来CSCs的发现已经改变了人们对肿瘤发生和治疗方法的观点。即使有关化疗失败的分子基础仍然没有确定, 人们还是认为肿瘤能够通过多种机制逃避药物治疗引起的死亡信号。CSCs的特征是对药物和常规毒素的高度抵抗性, 这些药物和毒素是针对快速增殖中的细胞, 而慢分裂细胞是豁免的, 由于上调了几种ATP结合暗盒转运子, 激活了DNA修复能力, 抗凋亡分子的过度表达引起控制增殖、分化和凋亡的信号途径发生改变。
5 肿瘤干细胞的分离与鉴定
CSC的识别、分离与鉴定是基于对正常干细胞的认识, 且因CSC表面标记 (膜蛋白、黏附分子及受体等) 与一般肿瘤细胞不同, 可使用正常干细胞标记物, 采用流式细胞仪或免疫磁珠法进行分选。董强刚等[26]研究却发现, 在A549和SPC-AI肺腺癌细胞株中应用磁性细胞分选 (MACS) CSC时发现CDl33-、多药耐药蛋白 (MRCP+) 、CD24+、表皮生长因子受体 (EGFR+) 、胰岛素样生长因子受体 (IGF.RI+) 的细胞具备CSC特征。JIANG等[27]研究发现荧光活化细胞分选系统分离出的肺癌细胞高表达醛脱氢酶1 (ALDHI) 和CDl33在体外高表达CSC特征, 包括无限增殖、自我更新、分化和对化疗耐药的能力, 体外实验证明醛脱氢酶1阳性细胞可形成肿瘤, 具有与原来肿瘤相似的异质性。
CSC的鉴定主要有体内移植和体外培养两个方面。体内移植是将分离所得CSC和一般肿瘤细胞分别移植到非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷 (NOD/SCID) 小鼠体内, 因CSC仅需少量即可形成肿瘤;而一般肿瘤细胞需要大量细胞才能形成肿瘤。分选出的肿瘤宣布要具有以下干细胞特征:①具有巢蛋白, 干细胞调控因子 (Nanog) , 胚胎干细胞相关蛋白等干细胞表面分子标志;②有克隆形成能力;③有形成瘤球黏着力;④体外生长可分化为内皮和上皮细胞;⑤体外移植可形成干细胞标志 (+) 具有致瘤性的细胞群和干细胞标志 (-) 的非致瘤性细胞群。
第一个分离出来的CSCs是来自于急性髓系白血病AML的CD34+CD38-白血病干细胞亚群, 正是这一小撮白血病细胞能够在体外形成集落生长, 将它们移植到免疫缺陷小鼠会复制出其亲代的肿瘤表型。还有其他确认的CSC, 比如CD44+/CD24-细胞群[28]在乳腺癌干细胞 (BCSCs) 中特别丰富, 还有脑瘤[29], 结直肠癌[30,31,32], 头颈部肿瘤[33], 胰腺癌[34,35], 黑色素瘤[36], 间质肿瘤[37], 肝癌[38], 肺癌[39], 前列腺癌[40]和卵巢癌[41]中都发现了CSC的存在。
6 可选的结直肠癌干细胞标记物
很多研究团队发现, 只有在结直肠癌里的CD133+细胞能够启动并维持肿瘤生长。CD133+细胞能够在培养基中维持很长一段时间而不会丧失它们复制亲代人类表型的能力:CSCs用酶消化后, 在添加表皮生长因子EGF和基本成纤维生长因子bFGF的无血清培养基里, 采用低粘附环境 (这种环境由于失巢凋亡能介导已分化细胞死亡) 培养, 可以在体外扩增成肿瘤圆球体。在分化条件下CD133+细胞能生成类似于隐窝的特殊结构, 另外, 在体内或体外分化期间, 这些细胞逐渐获得典型的结肠上皮标志物, 比如CK20, 与此同时CD133的表达呈下降趋势。根据这些发现, 许多临床数据确认CD133作为一个独立的负性预后指标[42];它的表达结合细胞核β-catenin对于确定病人很差的生存率是非常重要[43,44]。
Msi-1是RNA-结合蛋白, 作为结直肠干细胞标记物, 是第一个被研究的分子之一, 它的作用在果蝇中可能是调节神经发育的非对称细胞分裂机制中所必需的物质, 定位在人和小鼠小肠的隐窝基底部, 使得它在结直肠干细胞特征中具有非常重要的地位。
β1整合素 (CD29) 作为高增殖性的标记物在隐窝的基底部有高表达水平, 可以同时检测干细胞和祖细胞。按照这些数据, EphB受体的表达有一个梯度组成:在隐窝基底部表达最高水平, 在隐窝绒毛连接处表达水平较低。
Bmi-1是一个polycomb组的受体, 为造血干细胞和成体神经干细胞自我更新所必需, 通过抑制衰老相关的几个基因起作用, 它在小肠靠近隐窝基底部的地方有表达, 这和结直肠干细胞所处的地方相一致, 有Bmi-1过度表达的病人生存率很差[45]。
Lgr5蛋白 (Gpr49) 是一种G蛋白偶联受体, 它的基因是Wnt信号调控靶点, 单个Lgr5+细胞在体外能够生成整个隐窝样结构, 生成结直肠上皮里出现的所有细胞类型。尽管它的功能还不明确但近来作为选择性的结直肠干细胞标志物进行研究, 有报道显示Lgr5在进展期CRCs里过度表达, 这种过度表达和肿瘤进展相关[46]。
7 现有疗法对CRC的效用
现在, 对于有转移到肝脏的CRC病人来说, 有两种有用的可选方案, FOLFOX (亚叶酸/氟尿嘧啶和奥沙利铂) , 以及FOLFIRI (FOLFOX加上VitB和伊立替康) 。在III期临床研究中, FOLFOX和FOLFIRI都显示出有良好的疗效, 而且这两种方案更多用于年轻患者[47]。在有转移的结直肠癌患者中, 可以用新辅助化疗结合抗血管生成药物贝伐单抗进行治疗, 后者是一种针对血管上皮生长因子 (vascular endothelial growth factor , VEGF) 的人多克隆抗体, VEGF在原发和有转移的人CRC中是一种重要的血管生成因子。很早就有人发现, 从恶变前的腺瘤到侵袭性和转移性病灶的进展过程中有VEGF表达。另外, 检测肿瘤尺寸、转移和病人存活率指标时发现VEGF的表达和结直肠肿瘤中增加的微血管量有相关性, 而VEGF和微血管量与很差的临床结果有联系。还有一种方案是FOLFIRI联合多克隆抗体--西妥昔单抗也称为爱必妥, 这是一种抑制上皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor , EGFR) 的单克隆抗体, 它还和细胞分化、增殖有关, 因此被批准用于EGFR表达的患者, KRAS野生型转移的结直肠肿瘤, 单独或联合FOLFIR进行治疗。最近, 两个西妥昔单抗大型临床研究-OPUS和CRYSTAL的结果已有报道, 证明西妥昔单抗能显著提高有转移的KRAS野生型CER患者反应率。
另一种可选择的方案是针对CSCs途径比如IL-4, 这是一种由CSCs自分泌方式产生的细胞因子, 参与活化的B细胞刺激, T细胞增殖和CD4+细胞分化成Th2细胞。在CCSCs中, 用抗-IL-4的中和抗体或IL-4受体a拮抗剂来抑制IL-4信号转导途径, 通过下调抗凋亡蛋白cFLIP, Bcl-xL和PED使得这些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。IL-4抗体治疗联合标准的化疗药物 (5-氟尿嘧啶或奥沙利铂) 能够减少肿瘤生长。近来有研究发现, 上调CD133+的CCSCs干细胞中IL-4细胞因子对于保护这些成瘤细胞不会凋亡来说是个重要的机制。
BMP4是另一个重要的分子因为它能在CCSCs里激活分化进程和促进凋亡, 通过抑制PI3K/AKT途径能减少B-catenin激活, 并上调Wnt负性调节。化疗药物比如奥沙利铂和5-氟尿嘧啶能增加BMP4的抗肿瘤活性, 同时应用这些药物能介导异种移植的结直肠CSC获得完全而长期的肿瘤消退。
大多数肿瘤能抵抗目前的治疗是因为其缓慢的CSCs细胞周期, 因为这些细胞栖息于缺氧的niches里而获得了这种能力。生存期临床研究表明:和单用化疗药物比较, 协同使用化疗药物和免疫治疗对患者的健康状况是大有益处的。化疗药物也能够刺激肿瘤发生免疫细胞介导的杀伤, 通过T细胞分别交叉上调死亡受体Fas和TRAIL-R2 (DR5) 和它们的配体FasL (CD95L) 和TRAIL, 能增加肿瘤细胞对细胞毒的敏感性。
8 展望与挑战
在肿瘤发生过程中, 很多自我更新的途径发生“失监管”状态。CRC中CSCs的作用可能解释成瘤性, 有助于确定聚焦于肿瘤亚群的革命性治疗策略。CRC高度的预后不良是由于目前治疗在明确根除肿瘤方面的效率不足。因此, 肿瘤的生长/发展绝对需要针对清除CSCs, 这样才能防止最微小的残留病根引起复发和转移。
药物筛选 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
由吉林市经济技术开发区养殖户所饲养的肉鸡提供病死鸡, 从诊断为大肠杆菌病的病鸡中选取病变较为典型的鸡31只。从内脏器官中分离出疑似大肠杆菌的菌株作为被检样品。
1.1.2 培养基
Mueller-Hinton (MH) 培养基, 麦康凯鉴别培养基, 普通肉汤液体培养基, 伊红美兰琼脂, 柠檬酸盐琼脂, 三铁糖琼脂蛋白胨水, 葡萄糖蛋白胨水。
1.1.3 E.coli标准
“O”型血清购自中国药监所, 药物纸片按K-B规定自行制作。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离培养
无菌取病死鸡肝、脾等直接画线接种于麦康凯平板上, 37℃培养24小时, 挑取光滑的砖红色菌落, 经数次分纯后接种在伊红美蓝琼脂平板和三糖铁琼脂斜面上, 37℃培养24小时, 并对纯培养物进行常规生化鉴定, 有21株菌能在麦康凯琼脂平板上长出粉红色直径1～2毫米、边缘光滑、中心凹陷的菌落;在伊红美蓝琼脂平板上菌落有明显的紫色金属样光泽;三糖铁琼脂平面呈黄色, 底部产气但无H2S产生, 靛基质反应阳性, 能发酵乳糖产酸产气等, 这些均符合E.coli特性, 将21株菌编号为Q1、Q2……Q21。
1.2.2 E.coli的血清型鉴定
将已破坏K抗原的菌悬液稀释成10亿个/毫升的浓度与倍比稀释的不同滴度的血清做试管凝集试验, 每管稀释血清为0.5毫升, 然后向各管内添加等量待检抗原, 振荡使血清和抗原充分混匀, 置37℃恒温箱18～20小时, 取出后在室温静置2小时, 记录各管的反应情况。如滴度达到原血清O滴度的1/2时即可作出判断。
1.2.3 药敏试验
采用K-B纸片扩散法。
制备接种菌液:挑选琼脂平板上形态相同的菌落移种于MH液体培养基上, 置35℃水浴箱中孵育4小时, 校正浊度。以有黑字的白纸为背景, 调整浊度与比浊管相同。
接种平板:用灭菌的棉拭子蘸取药液, 在管壁上旋转挤压几次, 去掉过多的菌液。然后用拭子涂布整个培养基表面, 反复几次, 每次将平板旋转60度, 最后沿平皿周边绕两圈。
贴纸片:待平板上的水分被琼脂完全吸收后, 用镊子取纸片一张, 贴在琼脂平板表面, 用镊尖轻压, 使其贴平, 在直径为90毫米的平板内贴6张。贴好纸片后, 在15分钟内置35℃培养箱培养。
培养:平板在35℃培养箱内单独摆放, 平板培养18～24小时, 读取数据。
结果判定:培养后取出平板, 测量抑菌圈的直径。抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。
2 结果
2.1 血清型鉴定结果
对此21株大肠杆菌进行血清型鉴定, 鉴定出血清型16株, 其中O血清型7种, 分别为为O78 (Q1、Q5、Q6、Q9、Q12、Q15) , O35 (Q2、Q7、Q18) , O24 (Q4、Q21) , O1 (Q3、Q11) , O15 (Q10) , O76 (Q16) 和O88 (Q8) , 血清型为O78的菌株占定型菌株的37.5%, 为优势血清型。
2.2 药敏试验结果
用9种抗菌药物进行了药敏试验 (见表1) , 结果表明分离菌株呈现出不同程度的耐药性, 其中青霉素、红霉素的耐药率最高, 其次是环丙沙星, 而阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素的敏感率较高, 其中以阿米卡星最敏感。
注:抑菌圈直径≥16毫米为高敏;11～16毫米为中敏;≤10毫米为低敏;无抑菌圈为耐药。
3 小结与讨论
(1) 从吉林经济技术开发区诊断为大肠杆菌病的病死鸡中选取病变较为典型的鸡31只, 无菌取其肝脏、脾脏等作细菌分离、培养、鉴定, 共得大肠杆菌菌株21株, 平均分离率为67.7%。分离的21株大肠杆菌中筛选出的16株, 基本能反映出当地肉鸡源性大肠杆菌对供试药物的敏感情况, 对本地区的肉鸡大肠杆菌病防治选药具有一定的指导作用。
(2) 随着抗生素的广泛使用, E.coli的耐药性日益增多, 从表1可以看出, 9种药物中, 对大肠杆菌抑制作用最强的是阿米卡星, 敏感株为93.75% (15/16) ;其次为庆大霉素和妥布霉素, 敏感菌株为87.50% (14/16) , 研究数据显示阿米卡星、妥布霉素以及庆大霉素为最敏感药物;大肠杆菌对青霉素、红霉素都无高敏菌株, 中敏菌株也极少, 不适合选作预防、治疗用药。
药物筛选 篇6
关键词：湘云鲫,体表出血溃烂病,病原菌鉴定,药物筛选
湘云鲫又名工程鲫,是应用细胞工程技术和有性杂交相结合的方法培育出来的三倍体新型鱼类。由于其生长快、不育、食性广、抗病力强、耐低温低氧、适应各种淡水养殖形式等优良经济性状,且肉质细嫩鲜美,营养较普通鲫高,因此颇受消费者的青睬,市场需求量越来越大。但随着养殖规模的扩大,由于养殖密度和投饲频率的增加,近几年特别是在夏季高温季节,湘云鲫养殖池塘频繁出现批量死亡现象,症状主要以体表出血溃烂为主,有的体表鳞片大范围脱落、蛀鳍、烂鳃;解剖鱼体可见有的肝组织糊化严重,偶有出血、腹水。
目前有关湘云鲫病害的研究资料很少,已有的报道主要是对病症的简单描述及防治试验[1,2,3]。为了尽快了解湘云鲫体表出血溃烂病发病的原因和防治方法,2014年7—8月,笔者对浙江天台的湘云鲫发病池塘进行了调查和采样,并对典型病鱼进行了病原体筛查和病原菌分离鉴定及药物敏感性试验,以筛选出适宜的防治药物。
1 材料和方法
1.1 供试鱼来源
病鱼取自浙江天台湘云鲫养殖池塘,体重250~400 g;健康鱼取自浙江天台县里 石门水库 渔林场 , 体重250~300 g,外观检查并经抽样解剖检验确认无病。
1.2 主要药品和试剂
普通营养琼脂培养基 (杭州滨和微生物试剂有限公司);API 20E细菌鉴定试剂盒(法国生物梅里埃biomerieux公司);0.75%无菌生理盐水;药敏纸片(杭州滨和微生物试剂有限公司)。
1.3 病原菌的分离和菌悬液的制备
取发病症状典型的湘云鲫,无菌解剖取病鱼血液、肝、肾、脾等组织分别划线接种于普通营养琼脂培养基上,28℃恒温培养48 h后,分别挑取形态特征一 致的优势 菌XJA80601和XJB80603进行纯培养,转接斜面保存备用。分离菌培养20~24 h,用0.75%无菌生理盐水制成浓度约为107cfu/ml的菌悬液,菌悬液细菌量按Mc F浊度管结合活菌计数方法确定。
1.4 人工感染试验
试验分两 大组 ,A组为XJA80601菌,B组为XJB80603菌,在里石门水库渔林场养殖池塘内2 m×1 m×1m水体的小网箱内进行。每大组又分肌肉注射感染组、肌肉注射对照组、创伤浸泡感染组、创伤浸泡对照组、单纯浸泡感染组、单纯浸泡对照组。每组放养体重250~300 g的健康鱼10尾,暂养2 d后进行试验。注射组采用肌肉注射法,每尾注射菌量为0.2 ml,对照组注射同量无菌生理盐水。创伤浸泡组用小刀刮去健康鱼体表鳞片制造创伤,然后于稀释菌液中浸泡30 min,自来水清洗后放入小网箱暂养,对照组用小刀刮去鱼体表鳞片制造创伤后,自来水清洗后再放入小网箱暂养。单纯创伤浸泡组将健康鱼于稀释菌液中浸泡30min,自来水清洗后放入小网箱暂养,对照组直接放入小网箱暂养。试验水温27~28℃,p H 7.0±0.3,试验期间正常投饵,开增氧机。试验过程中,密切关注试验鱼的活力、水质等。发现濒死鱼,立即取出解剖,观察症状,并取组织用普通营养琼脂培养基进行细菌分离。
1.5 病原菌的形态观察及鉴定
取1.3纯培养的细菌转接普通营养琼脂斜面,经28℃培养20~24 h后作革兰氏染色和鞭毛染色。细菌鉴定采用法国生物梅里埃(biomerieux)公司的API 20E细菌鉴定系统和编码手册及有关资料[4,5,6]进行。
1.6 药物筛选试验
以涂布法接种0.1ml病原菌于普通营养琼脂平板培养基上,贴上药敏纸片,28℃恒温培养24 h后,测抑菌圈直径。
2 结果与分析
2.1 病鱼症状
患病初期,病鱼体表无明显症状,仅反应迟钝,食欲下降,有的上浮水面并沿池塘四周离群独游。随着病情加重,病鱼体色变深,体表出现充血出血,头部和胸鳍充血较重,躯干和尾柄稍轻;有的体表鳞片不规则脱落,有的体表溃烂和蛀鳍,腹部膨大,肛门红肿;鳃部颜色有的变浅,有的有大量黏液和污浊物;解剖鱼体可见有的肝组织糊化严重,偶有出血、腹水。
采用光镜和电镜技术对病鱼病变组织、体表、鳃等部位检查未发现寄生虫和病毒。取病鱼血液、肝、肾、脾等组织进行平板划线,获得XJA80601和XJB80603两株优势生长菌。
2.2 病原菌的致病性
XJA80601菌株和XJB80603菌株人工感染试验结果显示,这两株菌对健康鲫都有明显的致病性,肌肉注射感染和创伤浸泡感染的致死率均为100%(表1)。两株菌感染后鱼体表均呈现注射部位和创伤处鳞囊红肿,伤口脱鳞溃烂,肝组织变软,有的肝糊化、肾肿大。此外,XJA80601菌感染组只在病程后期鱼体表有出血现象,而XJB80603菌感染组病鱼头部和胸鳍基部充血出血严重,有的肠道充血。对感染发病鱼体内的主要组织进行细菌分离,又可分别分离到与XJA80601菌株和XJB80603菌株形态、特征完全一致的菌株,而对照组仅偶有死亡,也无任何症状,说明XJA80601菌株和XJB80603菌株确实均为湘云鲫的致病菌。
2.3 菌株形态及API 20E系统鉴定结果
革兰氏染 色和鞭毛 染色显示 ,XJA80601菌株为革兰氏阴性直杆菌,两端钝圆,大小约为 (0.4~0.6)μm×(1.0~2.5)μm,大多单个散在,无荚膜和芽孢,周生鞭毛,能运动,在普通营养琼脂培养基平板上能做环形运动形成同心环或扩散成均匀的薄层,菌落无色。XJB80603菌株为革兰氏阴性短杆菌,菌体两端钝圆,大小约为(0.3~0.5)μm×(1.0~2.3)μm,大多单个散在,极生单鞭毛,能运动,无荚膜和芽孢。在普通营养琼脂培养基平板上培养24 h,菌落为圆形,直径约1~2 mm,边缘整齐,呈半透明淡白色,不产色素。
两株菌API 20E系统测定的生理生化特性见表2,根据其结果,XJA80601的API20E鉴定代码为0476020,XJB80603的API20E鉴定代码为3246136,经查阅API 20E系统菌株鉴定编码手册及相关资料,可知XJA80601菌株为普通变形菌(Pro-teus vulgaris),XJB80603菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。
2.4 药敏试验结果
XJA80601菌和XJB80603菌对34种化学疗剂的药物敏感性试验结果见表3。从表中可见,XJA80601菌和XJB80603菌对恩诺沙星、氟苯尼考、头孢唑肟、头孢他啶、头孢西丁、丁胺卡那6种化学疗剂敏感,可作为治疗湘云鲫皮肤出血溃烂病的首选药物。
注:* 表示浸泡 30 min。
注: + 阳性, - 阴性。
3 结论与讨论
由于湘云鲫抗病力强,且养殖历史相对较短,因此关于湘云鲫疾病方面的资料很少,仅黄林峰等报道的细菌性败血症,周工健报道的竖鳞病,王世荣报道的烂鳃病和细菌性出血病等,但以上作者均未对具体的病原进行研究。该次试验通过对患病湘云鲫进行病原分离、鉴定及人工感染试验,确定天台发生的养殖湘云鲫皮肤出血溃烂病的病原菌XJA80601和XJB80603分别为普通变形菌(P.vulgaris)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。
据资料显示,变形菌广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中,为条件致病菌,多为继发感染。变形菌属包括普通变形菌(P.vul-garis)、奇异变形菌(P.mirabilis)、产黏变形菌(P.myrabilis)和彭氏变形菌(P.penneri),其中普通变形菌和奇异变形菌已被证实是水产动物的致病菌,可引起鱼类[7,8,9,10]、中华鳖[11,12,13]、虾[14]、牛蛙等多种水产动物疾病。该次试验结果显示 , 分离出的 普通变形 菌菌株XJA80601具有强毒性,主要通过皮肤伤口侵入鱼体内,引起的主要症状为皮肤溃疡,这与杨霞、王高学[13]和许兵[14]等对其他水产动物的研究一致。嗜水气单胞菌是水产养殖动物的重要致病菌,可引起众多水产动物的肠炎病、腹水病、溃疡病、出血病、败血症等多种疾病[4,15,16]。此外,试验还证实,分离出的嗜水气单胞菌菌株XJB80603具有强致病性,既可通过皮肤伤口侵入鱼体内,也可通过鳃、肠道等途径侵入鱼体内,引起的主要症状为皮肤溃烂和出血。
药物敏感性试验表明,恩诺沙星、氟苯尼考、头孢唑肟、头孢他啶、头孢西丁、丁胺卡那6种化学疗剂对普通变形菌和嗜水气单胞菌具有显著的抑杀菌作用,可作为治疗湘云鲫皮肤出血溃烂病的首选药物。但是化学药物大量的使用不仅会造成病原菌产生耐药性,而且污染环境,甚至危害人类食品安全,所以在使用化学药物防治鱼类病害时一定要慎重。由于湘云鲫皮肤出血溃烂病发生在夏季高温季节,因此,笔者建议该病应以防为主,合理控制养殖密度、投喂新鲜饵料,在发病季节要加强养殖管理,每隔20 d左右采用外消内服的原则,定期对养殖水域进行消毒,并适当在饵料中添加维生素、大蒜素和氟苯尼考等抗菌药物,一旦发现病鱼要及时隔离并预防用药,才能有效防治该病的发生。
药物筛选 篇7
1 材料和方法
1.1 试验动物
选择70~75日龄左右生长育肥猪120头, 分别饲养在同排的12间猪舍中。
1.2 试验材料
驱虫药物有敌百虫、双甲脒乳油、左旋咪唑、阿苯达唑、阿维菌素、伊维菌素。
1.3 试验分组
将试验猪只随机分为5个试验组和1个对照组, 每组20头猪。
1.4 试验方法与步骤
1.4.1 驱虫前试验猪只寄生虫检查
包括粪便抽检和体表检查。每试验组抽检2头猪只粪便做样本, 分别用“1”“2”表示样本1、样本2, 用麦克马斯特氏虫卵计数法, 计数每份样本每克粪便中的虫卵数目。全部猪只进行体表寄生虫检查。
1.4.2 各试验组处理情况
试验1组, 按每千克体重80 mg给猪只混料投服敌百虫, 用按1%浓度的敌百虫喷淋猪只体表。试验2组, 将双甲脒乳油配成0.05%溶液喷洒试验猪只体表, 同时按每千克体重7.5 mg的剂量内服左旋咪唑。试验3组, 将双甲脒乳油配成0.05%溶液喷洒试验猪只体表, 同时按每千克体重10 mg剂量内服阿苯达唑, 连用5 d。试验4组, 给试验猪只按每千克体重20 mg的剂量内服阿苯达唑和按每千克体重0.1 mg内服阿维菌素, 连用7 d。试验5组, 给试验猪只按每千克体重20 mg剂量内服阿苯达唑和按每千克体重0.1 mg剂量内服伊维菌素, 连用7 d。
1.4.3 驱虫后试验猪只寄生虫检查
驱虫后的第7天, 各试验组抽检2头猪只粪便进行粪便检查, 同1.4.1法计数每份样本每克粪便中虫卵数目;同时, 检查全部猪只体表寄生虫。
2 结果
试验猪只粪便及体表寄生虫检查结果见表1和表2。
个·g-1
头
由表1、表2可见, 试验4, 5组效果最好。均可驱杀猪体内外的全部寄生虫。
3 讨论
敌百虫为广谱驱虫药, 对猪多种消化道线虫均有驱除作用, 外用还可杀灭疥螨、血虱等体外寄生虫, 但其毒性较大, 安全范围窄, 使用时不能超量, 并且孕猪及胃肠炎患猪禁用;双甲脒对各种螨、虱、蜱、蝇等均有杀灭作用, 且能影响虫卵活力, 对人、畜无害, 但该类药物不易溶于水, 使用不方便;左旋咪唑是一种水溶性药物, 属广谱、高效、低毒的驱虫药, 对线虫的成虫有驱杀作用, 但对线虫的幼虫、绦虫、吸虫和节肢类昆虫无效, 注射对局部有刺激性, 同时常引起不良反应;阿苯达唑为广谱、高效、低毒的驱虫药, 对线虫、吸虫和绦虫的幼虫和成虫都有高度杀灭作用, 对虫卵的孵化有抑制作用, 但是适口性较差, 投药时应少量多次投服, 且该药有致畸的可能性, 应避免大量连续应用;阿维菌素或伊维菌素属于较新的广谱、低毒、高效的驱虫药物, 其突出优点在于它对线虫、昆虫等3纲12目72种寄生虫都有杀灭作用, 尤其是对猪蛔虫及猪疥螨同时具有很强的驱杀作用, 对公、母猪繁殖性能也无不良影响, 对人畜也安全, 但对绦虫和吸虫、结肠小袋纤毛虫、猪球虫等没有作用, 并且可以产生交叉抗药性。所以, 使用时必须与阿苯达唑配伍应用, 以杀灭猪体内、外的全部寄生虫。