生物筛选

生物筛选（精选11篇）

生物筛选 篇1

生物表面活性剂(Biosurfactants)是表面活性剂家族中的后起之秀,它是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质[1]。与化学合成的表面活性剂相比,生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外,还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、可生物降解等优点[2]。生物表面活性剂的这些特性尤其适用于石油工业和环境工程,如石油的生物降粘、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修复等。另外,生物表面活性剂作为天然添加剂,在食品工业、精细化工、医药和农业等工农业方面也愈来愈受到人们的青睐[3]。随着人们崇尚自然和环保意识的增强,生物表面活性剂将有更加广阔的应用前景,并有可能成为化学合成表面活性剂的替代品或升级换代品。

本文旨在从长期受石油污染的环境中分离筛选高产生物表面活性剂的菌种,优化培养后进行产物特性分析,以期寻找到高产生物表面活性剂的菌株为以后进一步开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样

土样来自为威海市文登地区某一加油站石油储罐旁,此加油站建站5年,土壤上层微黑,下层土黄。

1.1.2 培养基

富集培养基和筛选培养基根据文献[3,4,6,8]中具体的培养基配方配制。

1.1.3 试剂与仪器

HZQ-F160全温振荡培养箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);WFJ7200型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司);JK9913型全自动张力仪(上海中晨数字技术设备有限公司生产);Nicolet-380傅立叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher公司生产)。试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 前处理

取土样10g置于装有90mL无菌水的250mL三角瓶中振荡20min,静止30min。

1.2.2 富集培养

吸取1mL土壤悬液接种于50mL细菌富集培养基中,在28℃、220r/min恒温摇床上培养3~5d。

1.2.3 筛选

取出1mL富集菌液涂布接种于筛选培养基中,在30℃恒温培养箱中培养。72h之后,将筛选培养基上分离的菌种用平板划线法接种于筛选培养基中,目的是纯化单菌。此实验共筛选出12株菌种。

接种上述纯化的菌株于发酵培养基中,以200r/min、30℃培养,96h以后,采用排油圈[5]法(在培养皿中倒入20mL无菌水,在表层滴入5滴液体石蜡,使石蜡在水层表面均匀铺开,然后加1滴发酵液与培养皿中央,记录排油圈大小)测定发酵液离心后上清液的排油圈直径[6],锁定排油圈最大的菌株进行优化培养。

1.2.4 目的菌株的优化培养

1.2.4.1 pH的优化试验

取6个150mL三角瓶,每瓶加入约50mL发酵培养基,分别用pH计调节初始pH 6、6.5、7、7.5、8、8.5[7]。将BSF8#接种与不同pH的培养基中。放在200r/min、30℃的恒温摇床中培养。每隔24h测定发酵液的600nm OD值,连续测定96h,在120h后测定排油圈的直径。

1.2.4.2 碳源优化试验

取4个三角瓶,每瓶内装入约50mL缺碳培养基,分别加入葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、乳糖10g/L、可溶性淀粉10g/L作为惟一碳源。接种培养,测定初始及72h后的OD值,通过OD值的增加量确定菌种的生长情况。在96h后测定排油圈的直径。

1.2.4.3 氮源优化试验

取4个三角瓶,每瓶内装入约50mL缺氮培养基,分别加入硝酸铵、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨各5g/L作为主要氮源。其他操作同碳源优化实验。

1.2.4.4 NaCl优化试验

取5个三角瓶,每瓶内装入约50mL营养培养基,分别加入不同浓度的NaCl(1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L),接种培养。每隔24h测定发酵液的OD值,连续测定96h,确定菌种在不同NaCl浓度下菌种的生长曲线,在120h后测定排油圈的直径。

1.2.5 产物特性分析

1.2.5.1 表面张力的测定

取出培养120h后的发酵液,4 000r/min离心30min,去除发酵液里的菌体和杂质。将离心后的上清液在JK9913型全自动张力仪上测定表面张力。上清液用6mol/L HCl调pH至2.0,会出现絮状沉淀,4℃静置12h;10 000r/min、4℃离心30min收集沉淀;用少量的pH 2的HCl洗涤沉淀,1mol/L NaOH将沉淀调至pH 7.0,然后用CH2Cl2萃取,振荡20min后静置12h,取出下层溶液即产物[8]。每个样取出0.5mL粗品回溶至50mL蒸馏水中,再次测定表面张力。

1.2.5.2 红外色谱分析

取出发酵产物用二氯甲烷抽提后用傅立叶变换红外光谱仪初步分析产物成分。

2 结果与分析

2.1 pH优化试验结果

由图1、2可知,BSF8#培养的最佳pH为7.5。

2.2 碳源优化实验结果

由图3、4可知,BSF8#培养的最佳碳源为葡萄糖。

2.3 氮源优化实验结果

由图5、图6可知,BSF8#的最佳氮源为蛋白胨。

2.4 NaCl优化试验结果

由图7、8可知,BSF8#菌种的最适NaCl浓度为2g/L。

2.6 表面张力的测定结果

由表1、 2可知,BSF8#的降低表面张力能力很强,BSF8#菌株可将发酵液的表面张力由最初的48.29mN/m降到27.79mN/m,0.5mL的二氯甲烷抽体液回溶到50mL的纯水体系里,可以把纯水的表面张力由72.14mN/m降到52.12mN/m,同时观察发酵液也可发现,BSF8#菌液表面始终漂浮一层乳白色细小泡沫,经排油圈测定发现此泡沫排油能力很强,可以形成最大7.5cm以上的排油圈。

2.7 红外色谱分析结果

生物表面活性剂的成分包括糖、脂和肽,大多数产物为任意两种成分的混合物。由图9表明,通过红外色谱分析BSF8#产物在3 494cm-1处有吸收峰,位于-N-H键3 500~3 300cm-1和-O-H键3 600~3 200cm-1范围内;同时在羧酸2 500~3 600cm-1内有4处吸收峰;在1 031cm-1处有吸收峰,位于C-O 1 080~1 030cm-1范围内;在1 724cm-1 处有吸收峰,位于羧酸1 725~1 700cm-1内。推测BSF8#产物为糖肽类化合物。

3 讨论

目前,生物表面活性剂只有少数产品走向市场,大多数品种处于实验研究阶段,还没有进行大规模的工业化生产,这主要是由于它的生产成本较高。据估计生物表面活性剂是化学生物表面活性剂成本的3~10倍。为了开发生物表面活性剂的应用潜力,降低其生产成本是当前研究开发的热点和主要目标。决定生物表面活性剂生产成本的主要因素有菌种、原料、发酵工艺和下游技术等。因此解决问题的途径有如下三种:(1)通过选育高产菌株或进一步构建基因工程高产菌,发展快速检测表面活性剂高产菌株并评价其潜力的方法;(2)找到廉价发酵原料、改进发酵工艺、用先进的下游技术等方法提高生物表面活性剂的发酵产率和提取得率,从而大大降低它的生产成本;(3)利用生物表面活性剂的特殊性,开发出它的二次产品,提高其附加值。如用于化妆品、食品、制药等行业。

本研究经过分离筛选出的BSF8#菌株的最佳培养基(g/L)为:葡萄糖10.0,NaNO3 2.5,K2HPO4 1.0,NaCl 2.0,MgCl2 l.0,MgSO4 0.2,蛋白胨5.0,pH 7.5。菌株生长的最适温度为30℃,200r/min下培养效果较好。BSF8#菌株效果非常突出,可以将石蜡完全乳化,降低表面活性能力和乳化能力很强,属于高效表面活性剂产生菌。产生的生物表面活性物质可以把发酵液的表面张力降低将近一半,抽提后的抽提物,取0.5mL回溶到50mL水中,可以把水的表面张力由72.14 mN/m降至52.12 mN/m。经过FTIR分析表明,BSF8#菌株产生的是一种糖肽类高效表面活性剂。BSF8#菌株有较大的开发潜力。

摘要：目的:获得产高效生物表面活性剂的菌株并获得优化培养基。方法:通过从山东文登某加油站附近长期污染富含油质的土壤中逐步采用富集培养基和平板筛选培养基分离筛选菌株并进行优化培养寻找最优生长培养和高产生物表面活性剂的条件。结果:筛选出产表面活性剂的微生物12株,分别命名为BSF1#-BSF12#,从中筛选出1株高效表面活性剂产生菌BSF8#,优化培养结果表明BSF8#的最佳生长pH在7.5左右,最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨,BSF8#培养基中最佳NaCl浓度为2g/L。BSF8#菌株可将发酵液的表面张力由最初的48.29mN/m降到27.79 mN/m,上层乳化状发酵液的排油圈最大直径超过7.5cm,并经红外光谱分析确定其生物表面活性剂为1个糖肽类化合物。结论:BSF8#菌株产生的生物表面活性剂活性突出,有较大的开发潜力。

关键词：生物表面活性剂,优化培养,表面张力,傅立叶变换红外

参考文献

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[8]伏亚萍,李鱼.稠油降解菌的筛选及其生物表面活性剂的特性[J].吉林大学学报:理学版,2005,45(1):148-152.

生物筛选 篇2

生物絮凝剂产生菌的筛选鉴定及其絮凝活性

摘要：从污水处理厂活性污泥中富集及筛选得到一株有絮凝活性的细菌Bf-09.采用16S rDNA序列分析法并结合传统细菌分类,确认Bf-09为芽孢杆菌(Bacillus sp.).通过单因子优化法试验,得出Bf-09菌株降解处理制药厂废水的最适条件为:温度32 ℃、 pH7.0,当废水体积分数为60%时,制药废水的`COD去除率可达 80.4%,脱色率可达80.2%.作 者：吴培诚    龚水明    杜林    WU Pei-cheng    GONG Shui-ming    DU Lin  作者单位：吴培诚,龚水明,WU Pei-cheng,GONG Shui-ming(广东药学院,基础学院,广东,广州,510006)

杜林,DU Lin(仲恺农业工程学院,轻工食品学院,广东,广州,510225)

期 刊：仲恺农业工程学院学报   Journal：JOURNAL OF ZHONGKAI UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND TECHNOLOGY 年，卷(期)：, 23(2) 分类号：X52 关键词：生物絮凝剂    制药废水    芽孢杆菌   

耐镉菌株的筛选及生物学特性 篇3

关键词：筛选；耐镉菌株；生物学特性

中图分类号： X131.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0317-02

收稿日期：2014-04-02

基金項目：广东省科技计划（编号：2011B010500018）；广东省韶关市科技计划（编号：313-140513）。

作者简介：许钦坤（1977—），男，山东单县人，硕士，讲师，主要从事资源微生物利用研究。

通信作者：赵翠燕。E-mail：bethzhao2003@163.com。镉（Cd）是严重危害人类健康的重金属元素，极微量就会对人体造成危害，镉进入人体后，可对肾脏、骨骼、肺部、心血管等器官造成危害。许多农村、城市的土壤和水资源受到不同程度的镉污染，用受污染的水灌溉时，可使灌区和下游地区的农作物受镉污染，并富集于农作物中，从而进一步危害人体健康。另外，自然环境一旦被镉污染，消除其影响是很困难的。生物修复技术是重金属污染土壤治理的重要手段之一，具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，目前，利用微生物进行重金属污染土壤的修复是近几年国内外研究的热点。微生物是通过代谢活动及其产物来促进重金属的溶解，从而提高重金属在土壤中的生物有效性[1]，微生物还能促进植物旺盛生长，增大植物生物量，通过强化植物来修复重金属污染土壤。本研究从镉污染土壤中分离耐镉细菌，对其进行初步研究，以期为该细菌在镉污染治理中的应用提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1土壤样品采自广东某铅锌矿区周围土壤。

1.1.2培养基和试剂牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、NaCl 3 g、琼脂粉12.0 g、水600 mL，pH值为7.0～7.2；液体培养基：不加琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基；筛选培养基：在固体牛肉膏蛋白胨培养基中，加人不同浓度的Cd2+溶液。硝酸镉、牛肉膏、蛋白胨、琼脂等试剂，化学纯，均为国产；细菌基因组DNA小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒等，均购于大连宝生物工程有限公司；Goldview，购于广州瑞真公司。

1.1.3主要仪器手提式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；MAKE KA-1000型低速离心机，海安亭科学仪器厂生产；恒温振荡培养箱，金坛市晶玻实验仪器厂生产；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司生产。

1.2试验方法

1.2.1菌种的培养及分离纯化试验选用稀释平板法[2]，在无菌条件下，将一定量的土样放入一定体积的无菌水中，用移液管反复吹洗，直至颗粒状样品打散，摇匀，分别配制10-2、10-3、10-4、10-5菌悬液；分别吸取0.1 mL菌液，置于含有40 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培养基内，涂布均匀，倒置于37 ℃培养箱中培养24 h；待长出菌落后，挑取光滑透明、湿润的单菌落划线分离，在37 ℃下倒置培养24 h，获得其纯培养；进一步转接到含有100 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培养基中，选用长势较好的菌作斜面，4 ℃冰箱内保存。

1.2.2菌株常规生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[3]，对菌株进行系列生理生化特性试验，主要包括甲基红试验、乙酰甲基醇试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验及吲哚试验等，每组2个平行。

1.2.3耐镉菌株16S rRNA 基因序列分析将筛选到的菌株接种到培养基平板上，倒置于37 ℃培养箱中培养24 h；取单菌落到液体培养基中摇床培养过夜；用细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取总DNA为模板，进行16S rRNA 基因PCR 扩增，所用引物为27 F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R1492：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。PCR总反应体系为：10×buffer 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去离子水补至50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。取 5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，由上海生工公司测序；将16S rDNA的测序结果输入基因库（GenBank）进行序列比对。

1.2.4菌株对镉的耐受性配制含Cd2+浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养液；将斜面保存的菌株在无镉液体培养基中活化24 h，以2%接种量接入培养液中，37 ℃振荡培养24 h，观察菌株生长情况。

1.2.5菌株对镉的吸收性能将斜面保存的菌株转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃振荡培养24 h；吸取菌液 0.5 mL 接入50 mL灭菌、含Cd2+100 mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基，以不加菌株、直接加入0.5 mL无菌水为对照培养基，于37 ℃下振荡培养24 h；细菌悬浮液经12 000 r/min离心5 min，取其上清液；用原子吸收仪测定上清液中镉的浓度，计算菌株对培养液中有效镉的吸附率：吸附率=（C0-C1）/C0×100%，式中，C0为对照的镉浓度（mg/L ），C1为吸附后上清液的镉浓度（mg/L）[5]。试验重复3 次。

2结果与分析

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2.1耐镉菌株的筛选

从含Cd2+100 mg/L的培养基中分离得到1株耐镉细菌，菌落乳白色，表面粗糙，不透明，经革兰氏染色呈阴性；菌体杆状，命名为S-1。经生理生化试验分析，结果表明，菌株S-1甲基红、乙酰甲基甲醇、淀粉酶、过氧化氢酶、明胶液化试验检测均呈阳性，吲哚试验检测呈阴性。

利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1 500 bp的扩增产物（图1）。Blast比对分析显示，菌株S-1与Bacillus cereus AF290547的16S rDNA 序列同源性高达97%，结合形态观察和生理生化试验结果，表明 S-1菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

2.2菌株对镉的耐受性

菌株S-1在含Cd2+浓度范围0～200 mg/L的液体培养基中生长良好；Cd2+浓度超过300 mg/L时，菌株S-1的生长受到抑制；当Cd2+浓度增加到超过700 mg/L时，菌株S-1的生长完全被抑制。这说明菌株S-1对Cd2+的最大耐受浓度为600 mg/L。

2.3菌株对镉的吸收性能

菌株S-1在含Cd2+100 mg/L的培养基37 ℃下振荡培养24 h，离心，收集上清液，过原子吸收仪测定上清液中Cd2+的浓度，结果表明，菌株S-1对Cd2+的吸附率为75.4%。

3结论

试验筛选到1株耐镉菌株S-1，经生理生化试验和16S rRNA序列分析，鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；菌株S-1的Cd2+最大耐受浓度为600 mg/L，对Cd2+的吸附率为75.4%。菌株S-1对镉具有较强的抗性和富集能力，在镉污染治理中有良好的应用前景。

参考文献：

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生物筛选 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

木薯渣:由广西一酒精发酵厂提供。

内生真菌:由作者实验小组从海菜花等水生植物中分离纯化得到;酵母菌:季也蒙假丝酵母(C. guilliermondii)和郎比可假丝酵母(C. lambica)由云南大学生物资源保护与利用重点实验室提供。

1.1.2 试剂

尿素(H2NCONH2)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、无水硫酸钾,分析纯,广州化学试剂厂;浓硫酸(H2SO4)、盐酸(HCl)、正辛醇(C8H17OH),分析纯,广东汕头市西陇化工厂;氢氧化钠(NaOH)、无水乙醇(CH3CH2OH),分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;硼酸(H3BO3),分析纯,上海试四赫维化工有限公司;无水乙醚(CH3CH2)O,分析纯,天津市化学试剂六厂三分厂。

1.1.3 仪器

立式压力蒸汽灭菌锅(型号:LDZX-50KBS,上海申安医疗器械厂),隔水式恒温培养箱(型号:GHP-9160,上海—恒科技有限公司),无菌操作台(型号:HT6029,苏州净化设备有限公司),台式恒温振荡器(型号:THZ-D,太仓市试验设备厂),电子天平(型号:AL204,梅特勒-托利多仪器上海有限公司),电热式恒温干燥箱(型号:DHG-9070A,上海-恒科技有限公司),凯氏定氮消化装置,凯氏定氮蒸馏装置。

1.1.4 培养基

斜面培养基:马铃薯固体培养基(PDA):马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,琼脂粉15~20g,水1L,pH自然。

摇瓶培养基:马铃薯液体培养基(PDB):马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,水1L,pH自然。

木薯酒精渣固态培养基:木薯酒精干渣250g,适量尿素,水1L,pH自然,混合均匀后分装入500ml的三角瓶中,装量为200ml。

以上培养基所用化学药剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选

1.2.1.1 菌株初筛

将保存于斜面的菌种进行活化后接入装有100ml马铃薯液体培养基的三角瓶中,于28℃、140r/min的摇床上震荡培养48h,再接入已灭菌的木薯渣培养基中,混合均匀后置于28℃恒温培养箱中发酵48~72h。挑选在木薯酒精渣培养基中长势良好的菌株作为混菌发酵的出发菌株。

1.2.1.2 混菌发酵菌株的确定

将上述初筛获得的菌株根据分类单元不同(不同属)的原则进行两两组合混菌发酵,以不接种菌株的培养基作为阴性对照,每个样品3个重复,测定粗蛋白和粗纤维含量,找出能显著降低产物中粗纤维、提高产物中粗蛋白含量的混菌发酵菌株组合。

1.2.1.3 添加酵母混菌发酵

往上述筛选获得的混菌组合中分别添加两种酵母,以不添加酵母的混菌培养物为阴性对照,观察各组生长情况,对生长良好的组合进行粗蛋白和粗纤维的测定,确定添加酵母的最佳混菌组合。

1.2.2 菌株鉴定

初筛得到的菌株根据其菌落形态、产孢方式、孢子大小及其形态特征进行种属鉴定[6]。

1.2.3 粗蛋白(真蛋白)的测定[7]

样品处理:取样3g(干重)加40ml 75%的乙醇提取1h,充分搅拌,于400r/min下离心10min,弃取上清液,再用75%的乙醇40ml反复洗涤2次,沉淀于105℃干燥至恒重,称取一定量的样品进行消化,微量凯式定氮法测定。每个样品重复两次,取平均值。

1.2.4 粗纤维的测定[8]

用酸碱处理法。准确称取2~5g样品于消煮器中,用准确浓度的酸和碱,在特定条件下消煮样品,除去溶于酸碱的含氮物质和可溶性碳水化合物,再用有机溶剂除去醚浸岀物,经高温灼烧扣除矿物质的量,剩余的量为粗纤维,称量至恒重。每个样品重复2次,取平均值。

1.2.5 水分的测定[8]

水分的测定用恒重法,用电子天平在已烘干并恒重的水分皿中精确称取2~5g样品(精确至0.000 2),放入恒温干燥箱中在(105±2) ℃烘干3h,取出后在干燥器中冷却至室温,称重,之后每次烘干1h,冷却,称重,直至两次质量之差小于0.002g为恒重。每个样品重复2次,取平均值。

2 结果与分析

2.1 初筛及菌株鉴定结果

对保存于实验室的共70株植物内生真菌进行了初筛,结果表明共有22株菌能在简单的木薯酒精渣培养基中生长,其中A38、G4和C15等10株菌的长势最好,1d后可见培养基表面布满白色菌丝,因此选作混菌发酵的出发菌株。

由于长期生活在植物组织内部,植物内生真菌的生活史其实就是一个水解植物纤维素和木质素,在植物组织间蔓延和繁殖的过程。因此,许多植物内生真菌的纤维素酶活性较高,对纤维有着较强的分解能力[9,10,11]。本研究结果表明,约32%的植物内生真菌能有效分解利用木薯酒精渣中的粗纤维进行生长,且1.4%的菌株长势非常好。

经鉴定,长势最好的10株菌分别为:Gr7和C32为青霉(Penicillium sp.),A38、G4、Q4和R18为黑曲霉(Aspergillus niger),Gr8和Gr9为木霉(Trichoderma sp.),而B5为毛霉(Mucor sp.),C15为白地霉(Geotrichum sp.)(表1)。它们都是已报道的产纤维素酶活力高、发酵后菌丝蛋白质含量丰富、有的还能产B族维生素和矿物质等,有助于提高饲料营养价值的真菌[12,13,14]。

2.2 混菌发酵结果

将初筛获得的10株菌按照分类单元的不同两两组合进行混菌发酵,结果发现只有菌株G4与C15、Q4与C32组合长势良好,第2d可见木薯酒精渣培养基的表面布满白色菌丝。而菌株C15与gr7、G4与gr7组合虽能生长,但长势不好,第2d木薯渣培养基表面只有稀疏的白色菌丝,其他大部分组合不生长(见表1)。

纤维素酶一般是多酶体系,酶组分间存在明显的协同作用,混合菌株可以相互补充,从而可以促进纤维素类物质的分解[14],但有的菌株间也可能会存在一定程度的拮抗作用。本研究结果支持了这一论断。如菌株G4与C15, Q4与C32之间存在协同作用,混菌培养优于单菌培养。而菌株A38与Gr8,G4与Gr9,Gr8与C32等之间可能存在拮抗作用,原本能单独在木薯酒精渣培养基中良好生长的菌株,混合培养后却不生长了。尤其值得注意的是本实验中的木霉菌株Gr8和Gr9,它们与其他任何一株菌混合都不生长,而在以往的报道中,木霉能很好地与黑曲霉和产朊假丝酵母等其他属的真菌混和培养[12,14,15],这说明我们所筛选到的木霉与其他植物内生真菌之间可能存在较强的拮抗作用,在生防上有潜价值,值得进一步研究。

2.3 添加酵母混菌发酵结果

菌株G4与C15,Q4与C32混菌培养后可将底物的粗蛋白含量从1.42%提高到16.08%与18.54%(干基),将粗纤维含量从底物的32.41%降低到27.57%与26.59%(表2)。蛋白提高显著,而纤维的降解则不够理想。酵母菌体蛋白含量高,利用酵母和其他真菌混菌培养不仅有利于进一步提高产物中的粗蛋白含量[13,15],还可通过酵母对底物中糖类物质的消耗,解除糖类对真菌产生纤维素酶的抑制[15],从而提高粗纤维的降解率。因此,我们进一步测定了添加郎比可假丝酵母与季也蒙假丝酵母的G4、C15,Q4、C32组合,结果显示,产物中粗蛋白质含量可进一步提高到21.79%与23.56%(干基),而粗纤维的变化不大(表2)。

可以看出,与不添加酵母的混菌发酵相比,添加酵母后产物的真蛋白含量有较大提高,说明郎比可假丝酵母和季也蒙假丝酵母与G4、C15和Q4、C32之间无明显拮抗作用,互生效果较好。这是由于黑曲霉、白地霉产生纤维素酶,降解木薯渣中的纤维素,使培养基中可溶性糖类物质逐渐增加,糖类物质被假丝酵母利用后,提高了发酵产物中蛋白质含量。与蛋白的大幅度提高相比,添加酵母和不添加酵母的混菌发酵,木薯渣中粗纤维的降解提高不大,有待于通过正交实验对发酵条件进行优化,这不仅可以提高粗纤维的降解率,还可进一步提高蛋白含量。

3 讨论

随着木薯发酵酒精行业的发展,如何利用木薯酒精渣以降低生产成本、减少环境污染成为国内外的研究热点之一。本研究从植物内生真菌中筛选获得菌株G4(黑曲霉)、C15(白地酶)、Q4(黑曲霉)和C32(青霉),当G4、C15与郎比可假丝酵母,Q4、C32与季也蒙假丝酵母混菌培养时,可将底物的粗蛋白含量从1.42%提高到产物的21.79%、23.56%,高于C Sriherwanto等用单一菌种根霉发酵木薯渣生产动物饲料产物中10%的蛋白含量[16]和管军军等利用霉菌和酵母混菌发酵产物中15.68%的蛋白含量[17],而略低于刘琨等用工业糖化酶和产朊假丝酵母固态发酵产物中28.28%的粗蛋白质含量[2]。

当然,研究中两个菌剂混菌发酵前后纤维的降解率并不十分理想,下一步准备通过正交试验,优化发酵条件,进一步提高纤维的降解率和产物中蛋白含量,为这两个菌剂的开发利用奠定基础。

摘要：目的:筛选获得能混合固态发酵木薯酒精渣生产生物饲料的真菌组合。方法:利用木薯酒精渣培养基,初筛能在其上良好生长的植物内生真菌菌株,再将这些菌株两两组合进行固态混菌发酵、添加酵母混菌发酵,测定产物中粗蛋白和粗纤维的含量,获得能有效降低木薯酒精渣中粗纤维、提高粗蛋白含量的菌株组合。结果:菌株G4与C15、Q4与C32混菌发酵效果最好,可将粗蛋白质含量从底物的1.42%分别提高到产物的16.08%与18.54%(干基),粗纤维含量从底物的32.41%降低到27.57%与26.59%。添加酵母培养后,两个组合产物中粗蛋白质含量可进一步提高到21.79%与23.56%,而粗纤维含量几乎无变化。结论:菌株G4(黑曲霉)、C15(白地霉)与郎比可假丝酵母,Q4(黑曲霉)、C32(青霉)与季也蒙假丝酵母可用作混菌固态发酵木薯酒精渣生产生物饲料的菌种。

生物筛选 篇5

微生物絮凝剂产生菌的筛选及絮凝因素研究

摘要：用常规的细菌分离纯化法从株洲清水塘地区的土壤、污泥初步筛选了9株絮凝活性较高的菌株.在不同培养基中的培养筛选并经过多次隔代培养,得菌种B212和B233对高岭土悬液的絮凝活性较高.在相对接种量为10%,温度30℃,摇床转速120r/min的`情况下,实验结果表明:B212处理高岭土悬液时的最佳投加量为1mL/100mL,最佳絮凝环境pH值为7,产生高絮凝活性物质的最佳培养时间为29h,最高絮凝率达92%;B233处理高岭土悬液的最佳投加量为2mL/100mL,最佳絮凝环境pH值为8,产生高絮凝活性物质的最佳培养时间为35h,最高絮凝率达91%.作 者：柯芝兰    李科林    郭帅    黄忠良    邹益雄  作者单位：柯芝兰,李科林,黄忠良,邹益雄(中南林业科技大学资源与环境学院,长沙,410012)

郭帅(湖南大学环境科学与工程学院,长沙,410012)

期 刊：环境科学与技术  ISTICPKU  Journal：ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY 年，卷(期)：, 30(z1) 分类号：X172 关键词：微生物絮凝剂    筛选    絮凝因素   

生物筛选 篇6

关键词 胡椒瘟病病原菌 ；生物农药 ；敏感性

中图分类号 S482.2 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.010

Abstract Back pepper Phytophthora foot rot is the most serious disease of the black pepper in China. At present， the control of this disease depends on the use of chemical fungicides， and the screening and using of biological fungicides is an effective way to reduce the dosage of chemical fungicides. Phytophthora capsici was treated with 12 biofungicides and low toxic chemical fungicides to test its sensitivity to the fungicides by using the mycelium growth rate method. The results showed that these 12 fungicides displayed various inhibition effects on mycelium growth of P. capsici， while Enoyl Azoxystrobin WG 70%， Trichoderma WP and Bacillus subtilis WP proved to be the most effective fungicides with EC50 values of 0.2113 μg/mL， 0.49μg/mL and 0.78 μg/mL respectively to control the Phytophthora foot rot.

Keywords Phytophthora capsici ； Biological fungicide ； Sensitivity

胡椒（Piper nigrum）是一种热带特色香辛作物，也是一种深受人们喜爱的调味品，在食品、医疗保健等领域用途广泛，产品附加值高。海南是中国胡椒的主产地，其种植面积和产量均占全国总量的98%以上，目前种植面积达26 667 hm2，年产值约30亿元，已成为近百万热区农民致富的特色优势作物。胡椒瘟病是危害我国胡椒生产的首要病害。该病是由疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染引起的一种传染性很强的土传性病害，病情严重的胡椒园损失达90%以上，甚至全园毁灭[1]。目前，该病害防治多依赖化学农药，出现农药越打越多、病害防治越难的问题。应用生物农药替代化学农药，是实现农药减量的主要途径。本文通过药剂的毒力测定，筛选出防治胡椒瘟病的生物农药和高效低毒低残留农药，提高绿色防控技术水平，为促进我国胡椒产业绿色可持续发展提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与药剂

辣椒疫霉（Phytophthora capsici），2013年11月由笔者从香饮所胡椒种植基地采集的叶片中分离、鉴定所得。供试药剂见表1。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖16 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸0.5 h，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1 000 mL。1.05 kg/cm2，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

首先，通过预实验确定不同供试药剂的浓度梯度，将不同浓度梯度的供试药剂溶液加入PDA培养基中，各供试药剂有效成分在PDA培养基中含量见表1。采用生长速率法[2]，测定供试药剂对胡椒瘟病菌的抑制作用。培养72 h后检查各处理菌的生长情况，十字交叉法测量菌落直径，计算抑制生长率，抑制生长率/%=（A-B）-（C-B）/（A-B）×100%，其中A为对照菌落直径，B为菌饼直径，C为处理菌落直径。将抑制率转化为几率值，将剂量取对数，求出毒力回归方程，进一步算出EC50[3]。

2 结果与分析

2.1 不同供试药剂对胡椒瘟病菌的EC50值比较

各供试药剂的毒力回归方程、相关系数R2、斜率值和EC50，见表2。

供试药剂按照EC50基本上可以归为4类：70%烯酰·嘧菌酯WG、木霉菌WP和枯草芽孢杆菌WP，EC50介于0.21～0.78 μg/mL，EC50非常小，说明这三种药剂抑菌效果最好；芽孢杆菌/淡紫拟青霉WP和75%肟菌·戊唑醇WG，EC50介于18.62～89.13 μg/mL，这两种药剂抑菌效果较好；20%嘧菌酯WG、和30%苯甲·嘧菌酯SC的EC50分别为190.5和213.8 μg/mL，说明这2种药剂抑菌效果一般；2%武夷菌素AS、哈茨木霉WP、1.5%苦参·蛇麻素AS、45%异菌脲SC、和24%腈苯唑SC，EC50介于2 691.5～7 762.5 μg/mL，这五种药剂抑菌效果较差。

nlc202309090127

2.2 胡椒瘟病菌对供试药剂的敏感性比较

通过对试验结果进行回归分析，得出各供试药剂的回归方程和斜率K（见表2）。回归方程的斜率与病菌对杀菌剂的敏感性成正比[4]。按回归方程的斜率K，供试药剂可以分为3类：2%武夷菌素AS、70%烯酰·嘧菌酯WG、1.5%苦参·蛇麻素AS和哈茨木霉WP，斜率K在1.032 7～1.212 4，是供试药剂中斜率K较大的，说明胡椒瘟病菌对这4种药剂的敏感性较高；20%嘧菌酯WG、45%异菌脲SC、和24%腈苯唑SC的斜率K介于0.822 2～0.970 5，在供试药剂中斜率K属中等，胡椒瘟病菌对这3种药剂的敏感性一般；枯草芽孢杆菌WP、30%苯甲·嘧菌酯SC、木霉菌WP、芽孢杆菌/淡紫拟青霉WP和75%肟菌·戊唑醇WG，斜率K介于0.377 3～0.583 7，在供试药剂中斜率K较小，胡椒瘟病菌对这五种药剂的敏感性较差。

3 结论

在不同药剂毒力测定中，EC50越小、斜率值越大，说明病原菌对药剂的反应灵敏度越高，即随着浓度的增加，抑菌率明显增大。在试验中，EC50低的药剂其毒力回归方程斜率值往往也较小。综合分析供试药剂的EC50和斜率值，结果表明，70%烯酰·嘧菌酯WG、木霉菌WP和枯草芽孢杆菌WP对胡椒瘟病菌的抑菌效果非常好。

2009年，刘爱勤等测定了胡椒瘟病病原菌对常用的12种杀菌剂的敏感性。试验结果表明：69%烯酰吗啉·锰锌WP、25%甲霜·霜霉WP、50%烯酰吗啉WP和36%霜休锰锌WP对病原菌的抑菌效果好且敏感性高，EC50分别为1.862 1、1.129 8、3.419 8和6.309 6 μg/mL。2015年，农业部提出到2020年，我国农业要实现“一控两减三基本”，主要农作物病虫害绿色防控覆盖率达到30%，化学农药使用量实现零增长。推广应用生物农药或高效低毒低残留农药替代化学农药，是实现化学农药减量的主要途径。本文筛选出70%烯酰·嘧菌酯WG、木霉菌WP和枯草芽孢杆菌WP对胡椒瘟病菌的抑菌效果非常好，EC50介于0.21～0.78 μg/mL，比69%烯酰吗啉·锰锌WP、25%甲霜·霜霉WP等的EC50小很多，说明对胡椒瘟病菌的抑制效果更显著。推广应用70%烯酰·嘧菌酯WG、木霉菌WP和枯草芽孢杆菌WP替代生产中长期使用的69%烯酰吗啉·锰锌WP、25%甲霜·霜霉WP等化学药剂，将为实现胡椒产业到2020年化学农药使用量零增长的目标提供技术保障。

药剂毒力测定试验只说明在离体条件下对胡椒瘟病菌的直接活性，田间防治效果受到很多因素影响，有待于试验进一步证实。上述抑菌效果较好的供试药剂，可进一步在田间进行药效比较，结合室内、室外效果，选择优良的杀菌剂，在胡椒生产中进行合理的应用。

参考文献

[1] 桑利伟，刘爱勤，谭乐和，等. 海南省胡椒瘟病病原鉴定及发生规律[J]. 植物保护，2011，37（6）：168-171.

[2] 黄圣明，郭少贞，刘秀娟，等. 咪鲜安等八种杀菌剂对芒果炭疽菌的毒性比较[J]. 热带作物学报，1992，13（1）：67-70.

[3] 刘爱勤，桑利伟，孙世伟，等. 胡椒瘟病病原菌对12种杀菌剂的敏感性测定[J]. 热带农业工程，2009，33（2）：11-13.

[4] 刘爱勤，桑利伟，孙世伟，等. 香草兰疫霉菌对9种杀菌剂的敏感性测定[J]. 农药，2008，47（11）：847-848.

耐重金属铅和镉微生物的筛选 篇7

在长期受某种或多种重金属污染的土壤上,有一定数量的、能抗或耐重金属污染并能富集、氧化或还原重金属的微生物类群。因此,在污染区往往可以发现大量的耐受微生物群体。

在As、Cd、Cr、Cu、Pb、Ni、Zn复合污染土壤中,重金属总量达到658mg·kg-1时,细菌和真菌数量分别为对照(1210mg·kg-1)的29%和45%,当重金属总量为3447mg·kg-1时,其分别下降为81%和85%。而且不同类群微生物对重金属污染的耐性也不一样,通常由大到小为真菌>细菌>放线菌。目前大部分研究都是从水体和有机污染的土壤中筛选,从重金属污染的土壤中筛选耐高浓度且高效富集的菌株很少,且耐重金属浓度仍需提高。

2 材料与设计

2.1 实验材料

2.1.1 土壤

筛选菌种的土样取自湖南株洲,铅(全量)为132.5mg·kg-1,镉(全量)为4.56mg·kg-1。

2.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨(分离细菌)和PDA马铃薯蔗糖培养基(分离真菌)。

2.1.3 溶液

Pb(NO3)2溶液,Cd(NO3)2溶液(采用分析纯Cd(NO3)2试剂)在121℃下灭菌30min,备用。

2.2 方法

2.2.1 测定方法

采用稀释平板涂布法和液体培养法,用火焰原子吸收分光光度法测定Pb、Cd;。重金属去除率的计算公式如下:

采用火焰原子吸收分光光度法测定Pb、Cd。

2.2.2 试验方法

称取新鲜土样10g,加入到90mL的无菌水中,在室温下振荡30min,制备成土悬液,吸取0.1mL土悬液涂布在Pb浓度为300mg·kg-1、Cd浓度为200mg·kg-1及Pb和Cd浓度分别为300mg·kg-1和200mg·kg-1的牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上,30℃下培养,经过多次划线纯化后,转接到Pb浓度依次为500、700、900、1200、1500mg·kg-1的培养基上,Cd浓度依次为300、500、600、700、900mg·kg-1的培养基上,Pb和Cd混合浓度为500和300、700和300、700和500、900和500、900和700、1200和600、1200和900、1500和700、1500和900mg·kg-1的培养基,多次划线纯化菌株,同时做镜检,直到获得纯的菌株。

取1mL菌悬液(待分析菌株)加入到49mL含重金属(Pb、Cd)的液体培养基中,液体培养基中Pb、Cd浓度分别为500mg·L-1、5mg·L-1及同时Pb和Cd浓度为500mg·L-1和5mg·L-1,在恒温摇床上培养(160r·1min-1,28℃,细菌培养3d,真菌培养7d,4500r·min-1离心20min,上清液直接测定Pb、Cd含量,菌体经去离子水洗涤两次离心,再经70℃烘干磨细,称取0.01g干菌体于瓷坩埚中,加5mL浓HNO3消化至澄清,定容至10mL的容量瓶,测定其体内Pb、Cd的含量。通过液体培养基和菌体内Pb、Cd的含量来分析不同菌株对重金属的去除效果。

3 结果分析

3.1 耐重金属Pb、Cd微生物状况

经过固体培养及多次划线纯化后得到22株耐重金属Pb、Cd微生物。真菌编号为1～10,其中耐Pb、Cd浓度分别达到了1500和600mg·kg-1,耐Pb和Cd复合污染的浓度达到(1200+600) mg·kg-1;细菌编号为11～22,其中耐Pb、Cd浓度分别达到了500和700mg·kg-1,耐Pb和Cd复合污染的浓度达到(1200+600)mg·kg-1。

3.2 真菌对重金属Pb、Cd的去除效果及菌丝体内重金属状况

图1是真菌经过液体培养7d后对培养液中有效Pb、Cd去除率的影响。由图1可以看出,各菌株对培养液中Pb、Cd都有去除效果。其中有3株菌的去除率达到了60%以上,1号菌和9号菌(复合菌)对重金属Pb的降低率分别达到了72.45%、54.82%,1号菌的降低效果最好;而6号菌和9号菌(复合菌)对重金属Cd的降低率分别达到了61.74%、20.86%,这是因为不同菌株对重金属的吸附富集机制不同影响重金属在细胞内的分布和累积。

图2是真菌菌丝体内Pb、Cd的含量。由图2可以看出,菌株均能富集重金属Pb、Cd,其中富集Pb能力较富集Cd能力强,1号、4号和9号菌株菌丝体内Pb的含量分别达到了22.52mg·kg-1、19.49mg·kg-1和18.46mg·kg-1,1号菌富集Pb能力最强;6号、7号和9号菌株(复合菌)菌丝体内Cd含量分别达到了0.4mg·kg-1、0.37mg·kg-1和0.21mg·kg-1,单一菌较复合菌富集重金属能力强,可能是Pb和Cd在与微生物吸附点位上存在竞争作用。

3.3 重金属去除效果及菌体内重金属状况

图3是细菌经过液体培养3d后对重金属Pb、Cd的去除率。由图3可以看出,细菌均对重金属Pb、Cd有旧布新的效果,去除率均在60%以下,对重金属Pb去除顺序为11号、14号、12号、21号(复合菌)、15号、13号、20号(复合菌)、19号(复合菌)、22号(复合菌),其中11号、14号、12号和21号菌株对重金属Pb的去除率分别达到了53.47%、52.11%、47.87%、38.88%;对重金属Cd去除由大到小为17号、16号、18号、20号(复合菌)、19号(复合菌)、22号(复合菌)、21号(复合菌),其中17号菌株、16号菌株和18号菌株对重金属Cd的去除率分别达到了52.0%、46.76%和42.26%。细菌较真菌对重金属的去除率低。

图4是细菌菌丝体内重金属Pb、Cd的含量。由图4可以看出,各菌株均对重金属Pb、Cd有累积效果,其中14号、11号和12号菌株体内重金属Pb的含量分别达到了16.98mg·kg-1、12.67mg·kg-1和10.99mg·kg-1,22号、21号和20号菌株体内重金属Cd的含量分别达到了0.61mg·kg-1、0.6mg·kg-1和0.36mg·kg-1,细菌菌丝体内重金属含量较真菌低,且去除率也较真菌低,这可能是由细菌和真菌与重金属的作用机理不同引起,不同类群微生物对重金属污染的耐性也不一样,通常由大到小为真菌、细菌、放线菌,研究指出,细菌与Pb、Cd形成难溶性沉淀物,而真菌能够固定Pb、Cd,从而降低其移动性,具体机理有待进一步的研究。

4 结语

本试验从Pb、Cd污染的土壤中共筛选出22株耐高浓度的细菌和真菌,其中细菌12号菌株耐Pb、Cd浓度分别为500、700mg·kg-1,耐Pb、Cd复合污染的浓度为(1200+600)mg·kg-1,真菌10号菌株耐Pb、Cd浓度分别为(1500+600)mg·kg-1,耐Pb、Cd复合污染的浓度达到了(1200+600)mg·kg-1),说明在长期污染土壤中真菌和细菌对重金属Pb、Cd产生了不同的抗性,可能是长期受重金属胁迫,微生物基因发生了突变,能够更好的适应污染环境,这有助于为修复土壤重金属污染提供高效菌株。

在试验中发现耐单一重金属的菌株要比同时耐两种重金属菌株的去除率高,真菌对重金属的去除率较细菌高,说明不同类群的微生物对重金属的耐性不同,与重金属的作用机制也不同,真菌的细胞壁对金属有吸附作用,在重金属污染环境中,真菌采用细胞内和细胞外的熬合物固定重金属,这种熬合物主要是重金属与低分子有机酸、金属络合因子等形成的。

对重金属去除率高的真菌,其菌丝体内重金属的含量也高,而细菌呈现不完全相同的变化,对重金属去除率高的细菌,其菌丝体内重金属含量不一定很高,可能是不同微生物在相同时间内其生长量不同,对重金属的吸附与解吸动力学过程产生差异。

参考文献

[1]杜立栋,王有年,李奕松,等.微生物对土壤中铅富集作用的研究[J].北京农学院学报,2008,23(1):39-40.

[2]蒋先军,骆永明,赵其国.重金属污染土壤的微生物学评价[J].土壤,2000,32(3):130-134.

[3]许华夏,张春桂,姜晴楠,等.用微生物法固定重金属镉和铅的研究[J].环境科技,2007,13(2):51-55.

[4]Kuperman R G,Carreiro M.Soil heavy metal concentrations [J].Mi-crobial Biomass and Enzyme Activities in a Contaminated Grassland Ecosystem,1997(29):179- 190.

生物筛选 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

病原菌为哈尔滨市农业科学院实验室分离鉴定的芫荽软腐病病原菌菌株。NA培养基为牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂15~20g,蒸馏水1000 mL,pH 7.2±0.2。0.100 MPa灭菌20min。NA培养液为牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,蒸馏水1 000 mL,pH7.2±0.2。0.100 MPa灭菌20min。LB培养基为胰蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g,琼脂16~18g,蒸馏水1 000 mL,pH7.2~7.4。0.100 MPa灭菌20min。LB培养液:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g,蒸馏水1 000 mL,PH7.2~7.4。0.100 MPa灭菌20min[3]。药剂筛选所用农药有72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂(石家庄通泰生化有限公司)、3%噻霉酮(细刹)可湿性粉剂(陕西西大华特科技实业有限公司)、53.8%氢氧化铜(可杀得贰千)水分散粒剂(上海杜邦农化有限公司)、20%噻菌铜悬浮剂(浙江龙湾化工有限公司)、33.5%喹啉铜(海正必绿)悬浮剂(浙江海正化工股份有限公司)、2%春雷毒素+45%王铜(春雷王铜)(华北制药股份有限公司)

1.2 方法

1.2.1 不同pH对病原菌生长的影响

将NA培养液分装在灭菌带塞试管中,每瓶20mL,分别配制pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11等9种NA培养液,每瓶接种一环软腐病菌,每处理3次重复,24~48h后用紫外分光光度计测其菌液的OD620值,由于吸光度与菌液浓度呈正比,即可得菌液浓度。

1.2.2 不同温度对病原菌生长的影响

挑取幼龄菌于NA固体培养基平板上接种单菌落,于4、16、25、28、37、40、45、50℃下培养,每处理3次重复,24~48h后观察菌株生长,用游标卡尺十字交叉法测量菌落直径,最后确定细菌生长最适温度[4]。

1.2.3 药剂筛选

根据测定抑菌圈直径大小筛选有效抑菌药剂。LB培养基倒平板,取用无菌生理盐水稀释在LB培养液中培养36h浓度为106~108cfu·mL-1菌液0.2mL于平板上,用三角涂布棒涂抹均匀。在平板中央打直径1.0cm的小孔,取药液0.2mL滴于小孔中,置于28℃恒温箱中培养36h,每种待测药剂均稀释5、10、50、100、500、1 000倍6个梯度,每种试剂每个梯度均做3个平行样。用游标卡尺按十字交叉法测量抑菌圈直径,取平均值[5]。以在培养皿中央孔中加入无菌水作为对照。根据抑菌圈大小可划分为:直径16~20mm为高度抑菌;11~15mm为中度抑菌;10mm为轻度抑菌;在6~10mm,说明该药剂具有抑菌性[5]。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)测定

采用二倍稀释方法测定药剂的最小抑菌浓度[6]。将供试菌种接种LB培养液中,28℃培养36h后,用无菌生理盐水稀释浓度106~108cfu·mL-1。取2 mL LB培养液装至试管中,7支为1组。先用生理盐水将药剂浓度稀释为2%,取适量加入每组的第1支试管中,摇匀后从第1支试管中取2mL至第2支试管中,如此稀释每操作1次,试剂就被稀释1倍,形成7个浓度梯度。不加菌液作为对照。将稀释后的供试菌接种0.2mL于各试管中。接种菌悬液,于28℃培养箱内培养36h。取出试管,充分震荡,并对各试管进行逐个检查,用肉眼并结镜检观察其混浊度,从而判断有无菌生长。每处理3次重复,以完全无菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓度。确定是否为无菌生长,可取适量菌悬液倒入LB平板涂匀培养,观察看是否有菌生长。

2 结果与分析

2.1 不同pH对芫荽软腐病菌生长的影响

由图1可看出,供试菌株在不同pH下生长24h后,在pH为7.0时菌液OD620值为0.183,48h后OD620值为0.290,均高于其它pH生长条件的OD620值,为菌体生长最旺盛,由此可知,在pH中性条件下最适合软腐病菌生长。

2.2 不同温度对芫荽软腐病菌生长的影响

由图2可看出,随着培养温度的升高,芫荽软腐病菌生长趋势是先增长后降低,其中在37℃下菌落直径最大,分别是24h后为7.39 mm,48h后为9.92mm,说明此温度为软腐病菌生长最快温度,在4、45、50℃条件下此菌停止生长。

2.3 药剂筛选结果

由表1可看出,供试的6种药剂中,72%硫酸链霉素可溶性粉剂在稀释不同倍液时均表现高度抑菌,抑菌作用强烈;3%噻霉酮可湿性粉剂稀释5倍~100倍液时表现高度抑菌,抑菌作用强烈,500~1 000倍时为中度抑菌;53.8%氢氧化铜水分散粒剂在稀释不同倍液表现不同抑菌作用,当稀释至500~1 000倍时无明显抑菌作用;20%噻菌铜悬浮剂稀释倍数大于50倍时无抑菌作用;33.5%喹啉铜是浮剂和2%春雷毒素+45%王铜可湿性粉剂均表现无抑菌效果或表现极弱。由此可知,在不同稀释浓度下72%硫酸链霉素可溶性粉剂抑菌圈直径都是最大的,表现强烈的抑菌效果,且与稀释倍数呈反比,可作为此病害的有效杀菌剂。

图1 分离菌在不同pH下的生长情况Fig.1 Growth of Erwinia caratovora subsp.caratovora at different pH

图2 分离菌在不同温度下的生长情况Fig.2 Growth of Erwinia caratovora subsp.caratovora at different temperatures

2.4 最小抑菌浓度测定结果

由表2可知,72%硫酸链霉素可溶性粉剂的最小抑菌浓度为0.031%,3%噻霉酮可湿性粉剂最小抑菌浓度为0.063%,53.8%氢氧化铜水分散粒剂的最小抑菌浓度为0.25%。20%噻菌铜悬浮剂最小抑菌浓度是2%。由此可知,72%硫酸链霉素可溶性粉剂抑菌效果最好,对细菌性软腐病菌有强烈杀菌作用,其浓度越高抑菌作用越强,从而防治病害的能力越强。其次为3%噻霉酮可湿性粉剂。

表1 不同药剂不同稀释倍数抑菌效果Table 1 Effect of different bactericides and dilution ratios on pathogens

表2 有效药剂最低抑菌浓度Table 2 Minimum inhibitory concentration of bactericides to pathogens

“-”:完全抑菌;“+”:不完全抑菌。“-”:complete restrain;“+”:incomplete restrain.

3 结论与讨论

芫荽软腐病可使芫荽生长受阻,失去商品价值,不能完成整个生育期,因而很难采收到种子,造成绝产和绝种,因而针对此病害进行有效药剂防治的研究与利用。软腐病菌适宜的生长环境条件与其致病性的上升相关,从田间芫荽植株发病情况看,高温条件,土壤pH中性导致芫荽植株发病加速,这与病菌室内测定生长温度与pH结果相吻合。在24℃以上是芫荽软腐病在田间的发生高峰期。因而针对此病菌,在药剂筛选试验中,采用抑菌圈法,测得结果为72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂抑菌效果最好,其次为3%噻霉酮可湿性粉剂。药剂的抑菌效果有时因为生产厂家或施用地理位置气候因素不同而不同,本试验药剂筛选为实际应用提供理论参考。目前就软腐病的防治来说,应用化学杀菌剂还是软腐病防治的主要方法。但是农药会造成自然环境的污染及土壤残留[7]。所以,除了使用农药抑制病害发生外,如何采取更加环保的方法控制病害是重中之重。目前国际上对生物农药和和基因工程的研究越来越多,对软腐病进行生物防治的研究既环保又有前景,如Sang-Tae等人从软腐菌中筛选的Ecc32能产生一种专门抵抗软腐致病菌的化合物[8]。但若要将生物防治技术大范围推广尚需一定时间。

本研究对所鉴定菌株通过抑菌圈法进行有效药剂筛选可知,72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂、3%噻霉酮可湿性粉剂、53.8%氢氧化铜水分散粒剂、20%噻菌铜悬浮剂均有明显抑菌作用。72%硫酸链霉素可溶性粉剂的抑菌作用最强,最小抑菌浓度为0.031%。

参考文献

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[2]Pérombelon M C M,Salmond G P C.Bacterial soft rots[M]//Singh U S,Singh R P,Kohmoto K.Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases.Oxford:Pergamon,1995:1-20.

[3]许文耀.普通植物病理学[M].北京:科学出版社,2006.

[4]袁尚勇.魔芋软腐菌生物学特性测定及软腐病防治方法研究[D].武汉:华中农业大学,2007:22.

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[6]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学(2)[M].北京:北京人民卫生出版社,1991:1340-1350.

[7]张玉明,孟明明,雷清江.农药对环境的危害及预防措施[J].林业勘察设计,2010(3):33.

生物筛选 篇9

类异戊二烯醌组分测定通常需要以标准品或从标准菌株中提取醌样品为参照进行比较分析,从而判定不同类型的醌。由于醌标准品价格昂贵、种类不足且化学性质不稳定[10],筛选一套涵盖多种不同醌组分的参比菌株,可一定程度上替代标准品,解决参照问题。与醌标准品相比,参比菌株的选择还具有许多明显的优势。如菌株易保存,可以传代培养,可与实验菌株同时进行醌的提取、测定、分析,作为整个试验过程的参照等。此外,还可根据试验需要选择所需相应醌型的一株或多株菌株,将从中提取到的醌单独或混合使用作为参照。

本试验旨在首次构建一套甲基萘醌参比菌株,取代标准品提供醌组分测定的参照。以《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》第2版[11]以及International journal of systematic and evolutionary microbiology(IJSEM)更新的菌株信息为主要参考依据,首先确定MK-6、MK-7、MK-8和MK-9四种待选甲基萘醌,再对应选择以上述醌型为主成分的3株供试菌株。以前期建立的HPLC分析方法以及基于该方法确定的醌组分保留时间为依据,结合菌株的生长状况对同醌型菌株进行综合比较,从中筛选具有较高含量、单一(>90%)甲基萘醌成分,且易培养、易提取的菌株,构成一套甲基萘醌参比菌株,用于细菌常规鉴定及新种分类鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

12株供试菌株,详细见表1。所有供试菌株均由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供。

1.1.2 试剂

氯仿、丙酮、甲苯均为分析纯,购自北京化工厂;甲醇、异丙醇均为色谱纯,分别购自美国Fisher Scientific公司、J.T.Baker公司。

1.1.3 仪器

恒温培养箱(IFA-110T-8,新加坡艺思高科技有限公司);恒温培养振荡器(ZHWY-103D,上海智城分析仪器制造仪器有限公司);可见分光光度计(WFJ 2000,尤尼柯上海仪器有限公司);高速冷冻离心机(20PR-52D,日本日立集团);超低温冰箱(702,美国Thermo Fisher Scientific公司);真空冷冻干燥机(GAMMA 1-16 LSC,德国CHRIST公司);旋转蒸发仪(RVIO,德国IKA公司);真空离心浓缩仪(SPD2010,美国Thermo Fisher Scientific公司);暗箱式三用紫外分析仪(WFH-203B,上海精科实业有限公司);TLC硅胶薄层板GF254(1.05554.0001,德国Merck公司);高效液相色谱仪(LC-20AT,日本SHIMADZU公司)。

1.1.4 培养基

营养肉汤(Nutrient Broth,NB)、胰蛋白胨大豆肉汤(Trypticase Soy Broth,TSB)、LB肉汤(LB)、海生菌肉汤2216(Marine Broth 2216,MB)均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 供试菌株的选择

对文献信息进行整理,统计不同醌类型在菌株中的分布情况。再以MK-6、MK-7、MK-8、MK-9四种醌组分为选择依据,各挑选3株(至少有2株为同属)以上述组分为唯一或主要醌型,且来源方式简单,生长温度适度,菌体富集时间短的菌株。

1.2.2 菌体培养与收集

将供试菌株分别接种于相应的液体培养基中,在各自的培养温度下,采用200 r/min摇瓶培养24 h。以比浊法测定菌体是否生长,即采用可见分光光度计测定OD600值,确定菌株生长量满足试验需求。随后采用革兰氏染色,检查菌体无污染后,离心收集菌体,用蒸馏水洗涤2次后,将湿菌体于-20℃预冻1 h,-80℃预冻1 h,真空冷冻干燥18 h。将冻干菌体置于干燥器中备用。

1.2.3 醌的提取与纯化

醌的提取:取冻干菌体,转入30 ml氯仿:甲醇(2∶1,V/V)的溶液中,再添加少量玻璃珠,于黑暗处摇瓶过夜12 h。用滤纸过滤收集滤液于干净、干燥的100 ml旋蒸瓶中,于37℃减压蒸馏至干燥。用适量(约5 ml)丙酮重新溶解干燥物,12 000 r/min离心3 min,再采用真空离心浓缩仪将其浓缩至40μl左右,得到醌的粗提样品。

薄层层析(TLC)纯化:倒入适量展层剂甲苯于层析缸(20×10×10 cm)中,深度约5~6 mm,盖上盖子,放置1 h,使缸内甲苯气体达到饱和状态。硅胶薄层板GF254(10×5 cm)于65℃活化0.5 h。将醌的粗提样品,长条状点样于GF254硅胶板上。吹干后将硅胶板置于层析缸中,在样品距顶边1 cm时取板,风干。将硅胶板置于254 nm紫外灯下观察。绿色荧光背景下,比移值Rf=0.8的位置有暗褐色的带则为甲基萘醌组分。

将醌组分条带刮下,收集硅胶粉,用1 ml丙酮溶解后采用疏水性注射过滤器过滤,使用真空冷冻浓缩仪将滤液浓缩至干燥,得到醌纯化样品,置于-20℃黑暗处保存备用。

1.2.4 供试菌株甲基萘醌组分分析及含量比较

采用HPLC对得到的醌纯化样品进行组分分析。分析条件如下:仪器为岛津高效液相色谱仪,色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(5μm,250×4.6mm i.d.),流动相为甲醇:异丙醇(2∶1,V/V),流速为1.0 ml/min,柱温为40℃,检测器为光电二极管阵列检测器(PDA),甲基萘醌检测波长为269 nm。HPLC上样前用200μl(或300μl)丙酮重新溶解醌纯化样品,12 000 r/min离心3 min,取上清,液转移至HPLC专用样品瓶中,进样量为20μl。

HPLC定量分析甲基萘醌组分,通常采用外标法,根据峰面积来定量[14]。因为本试验为定性分析试验,所以将相对峰面积值作为指标,比较不同菌株间醌组分相对含量。具体是将每1 mg干菌体所对应醌组分出峰面积值进行比较,即

其中,峰面积单位:AU×min;进样量单位:μl;总样量单位:μl;干重单位:g。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的选择

以《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》第2版及International journal of systematic and evolutionary microbiology(IJSEM)为主要参考依据进行检索,在属水平上,分别统计以MK-6、MK-7、MK-8和MK-9为主要或唯一醌型的菌株,结果如表2所示。

根据上述整理结果,对应选择具有相应醌型的代表属的菌株,对其培养条件(培养基、培养温度、需氧性)以及培养时间进行初步筛选,从中选择所需培养基成分简单、不嗜热和不嗜冷、好氧生长的供试菌株。菌株信息见表1。

2.2 菌体培养与收集

所有供试菌株,在对应的培养条件下正常生长,OD600值均较高说明菌体浓度较高,检测后也未发现有污染,详见表3。

2.3 醌的提取与纯化

氯仿和甲醇的混合有机溶剂提取法,可以较好地提取到甲基萘醌组分。经TLC处理后,可在比移值Rf=0.8左右的位置观察到暗褐色条带。

2.4 供试菌株甲基萘醌组分分析及含量比较

2.4.1 供试菌株甲基萘醌组分分析

根据1.2.4所述HPLC分析条件,对上述12株供试菌株的醌组分进行测定。以相同条件下前期研究中所确定的不同醌组分保留时间表为判定依据为,见表4。

供试菌株的HPLC测定结果见表5。根据甲基萘醌组分的特征性光谱吸收以及表4所示保留时间表可准确判定醌组分,并根据峰面积确定其百分含量。

可以看出,CICC 10651和CICC 10675均含有两种醌组分,且次要组分的含量均低于10%;CICC10365含有3种醌组分,其中2种次要组分的含量均高于10%,此外该菌主成分为MK-8而非预期的MK-9,因此不将其作为MK-9参比菌株的选择对象;CICC 10962含有5种醌组分,其中3种组分的百分含量高于10%;除上述4株菌之外,其余所有供试菌株均只含1种醌组分。

2.4.2 供试菌株甲基萘醌主成分含量比较

根据1.2.4所述方法,比较供试菌株间相同主成分的相对峰面积值,结果见图1。其中以MK-6为主成分的供试菌株相对含量比较结果显示,CICC23883值最高,CICC 10657最低。以MK-7为唯一成分的供试菌株相对含量比较结果显示,CICC23881值最高,CICC 23880最低。以MK-8为唯一成分的供试菌株相对含量比较结果显示,三者含量接近。以MK-9为主成分的供试菌株相对含量比较结果显示,CICC 10675的值低于CICC 10962,但根据2.4.1可知,CICC 10675除了MK-9外含少量MK-8,而CICC 10962醌组分种类多达5种。

2.5 参比菌株的确定

试验过程中,所有菌株在其相应培养条件下,均能快速生长,培养时间均不超过24 h。所有菌株在生长性能方面间无明显差异。因此结合供试菌株甲基萘醌主成分含量比较结果确定参比菌株,MK-6、MK-7、MK-8和MK-9每种醌型分别对应确定一株参比菌株(见表6),其中MK-6醌型菌株为台中金黄杆菌(Chryseobacterium taichungense)CICC23883,MK-7醌型菌株为Bacillus oceanisediminis CICC 23881,MK-8醌型菌株为Deinococcus depolymerans CICC 10360,MK-9醌型菌株为柠檬色短小杆菌(Curtobacterium citreum)CICC 10675。

3 讨论

微生物的类异戊二烯醌种类多样,甲基萘醌和泛醌是其中研究最为广泛的两类呼吸醌。甲基萘醌仅分布于细菌中,而泛醌在细菌和酵母[15]中均有分布。本试验以甲基萘醌为选择对象,筛选具有MK-6、MK-7、MK-8或MK-9四种醌组分的参比菌株,提供细菌甲基萘醌测定的参照,用于细菌尤其是新种的分类鉴定。

目前新种发表的文献中,呼吸醌的测定是较为基础的化学分析项之一[16,17],其选用的参比菌株多为同属的模式菌株。通常模式菌株是细菌种内最具代表性的菌株,但由于其醌组分含量、培养条件或提取效果等并不一定满足试验所需,进而提供醌组分测定的参照,所以对菌株进行筛选从而确定参比菌株具有必要性。此外,由于菌株中所含醌组分种类多样,因此以多株不同醌型的菌株为筛选对象,从而构建一套覆盖多种醌组分的参比菌株,可增加其适用范围。

本试验所建立的该套菌株具有单一(>90%)的醌型以及明确的分类地位,可应用于细菌的常规鉴定及新种的分类鉴定。包括某些同属菌株的区分,如尿素芽胞杆菌属(Ureibacillus)这类属内之间的标志性差异[18]体现在醌组分上的菌株:部分菌株主要醌组分为MK-8和MK-9;也可用于某些不同属菌株的区分,如岩石单胞菌属(Petrimonas;主成分MK-8,少量MK-7和MK-9)其醌型以MK-8为主是区别于其他与之系统发育相近[19]菌株菌株坦纳氏菌属(Tannerella;MK-10、MK-11)、拟杆菌属(Bacteroides;MK-10、MK-11)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas;MK-9、MK-10)的特征。

除了作为醌测定的参比菌株,部分菌株还具有良好的农业应用前景。如台中金黄杆菌(Chryseobacterium taichungense)是杨秋忠等[20]首次分离自油污土壤的台湾本土菌株,具有多种植物生长促进的相关特性,可用于微生物肥料的开发。许明双等[21]自水稻种子中分离得到了一株具有一定的促生特性,能够促进水稻种子的萌发和幼苗生长的植物内生菌柠檬色短小杆菌(Curtobacterium citreum),可作为微生物肥料的开发资源。充分体现了菌种的实用价值。因此可以综合研究菌株的性能,从而为科研、生产提供有力的支持。

4 结论

生物筛选 篇10

目前阿拉伯糖的制备通常采用酸水解玉米芯半纤维素的方法,玉米半纤维素中聚糖链的单糖以木糖为主,占80%以上,其次为阿拉伯糖,占10%左右[2],可以从提取木糖后母液中回收阿拉伯糖。虽然酸(碱)分解法提取 L -阿拉伯糖的工艺已较为成熟、收率较高,但是在高温酸(碱)水解时可能会产生致癌物质,对后续分离纯化提出了更高的要求,同时酸碱处理会产生大量的废液,对三废处理有较高的要求。而使用微生物发酵酶解的方法具有反应条件温和、污染小等优点,通过固定化细胞技术等还可实现酶的重复利用,降低生产成本,代表了当前绿色工业的方向。本文报道了从土壤微生物中快速筛选半纤维素降解菌的方法,得到一株分解半纤维素能力较强的菌株,其发酵产物中以木糖和阿拉伯糖为主,为微生物发酵法制备阿拉伯糖奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

ITS区PCR引物由上海生工合成,DNA抽提试剂盒、DNA聚合酶、连接酶等试剂购自宝生物工程有限公司,克隆载体pUCm-T购于上海生工,其他化学试剂均为国产分析纯。DNA序列测定由上海生工完成。大肠杆菌E.coli DH5α为本实验室保存。

1.2 培养基

1.2.1分离培养基:

为PDA培养基[3]。

1.2.2 筛选培养基(g/L):

葡萄糖0.5,KH2PO4 2.0,NH4NO3 2.0,MgSO4·7H2O 0.2,酵母膏 5,半纤维素 20,琼脂 20,pH 6.0。

1.2.3 筛选用双层平板:

在直径为9 cm的平皿中倒双层平板,下层为2%琼脂10 mL,上层为10 mL筛选培养基。

1.2.4 发酵培养基(g/L):

半纤维素20,葡萄糖0.5,(NH4)2SO4 10,KH2PO4 4,MgSO4·7H2O 0.15,CaCl2 0.15,pH 6.0。

1.3 产酶菌株的分离筛选

1.3.1 菌株的分离

从南京市玄武公园、中国药科大学江宁校区等地采集土样,自然风干保存。称取土样1.0 g, 加入20 mL无菌水,振摇15 min后静置分层, 取上层悬液10倍比稀释。将稀释度为10-2、10-4、10-6、10-8 的菌液涂布分离培养基上28℃培养5 d。

1.3.2 初筛

挑取分离平板上单菌落接种于筛选用双层平板上,28℃培养5 d,观察透明圈。

1.3.3 复筛

挑取初筛中产生透明圈的菌落接种于发酵培养基中,28℃,220 r·min-1震荡培养5 d,测定发酵液中还原糖含量。

1.4 还原糖含量测定

发酵液过滤后,取1 mL滤液加入1 mL DNS试剂,置25 mL容量瓶中,混匀,沸水浴2 min,立即用流水冷却,定容至25 mL,于540 nm处以可见光测其吸光度。

1.5 发酵产物中单糖检测

使用PMP柱前衍生化HPLC法[4]测定:发酵液4000 r·min-1离心15 min,取上清液25 μL,加入0.4 mol·L-1 PMP溶液50 μL,0.6 mol·L-1 NaOH溶液25 μL混匀,70℃水浴100 min,取出反应物,冷至室温,加入0.3 mol·L-1 HCl溶液50 μL中和,再加水850 μL,加氯仿萃取3次,弃去下层,取上层用0.45 μm滤膜过滤后HPLC检测。色谱条件:Agilent 1200高效液相色谱仪,色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×50 mm,5 μm),流动相:0.1 mol·L-1 的磷酸盐缓冲液(pH 6.7)-乙腈(83∶17);流速:1.5 ml·min-1;检测波长:245 nm;进样量:5 μL。同时取标准阿拉伯糖、葡萄糖和木糖溶液各25 μL,同上法衍生后HPLC测定。

1.6 真菌形态观察[5]

挑取菌落尖端菌丝接种于PDA培养基,28℃下倒置培养,待刚长出菌丝时,将无菌的盖玻片斜插入平板内,继续培养至菌丝爬满盖玻片,将玻片取出, 在显微镜下观察。

1.7 ITS序列测定

采用CTAB方法进行细胞总DNA的提取,用真菌通用引物扩增ITS 序列[6]。引物为ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 反应体系为25 μL 体系:基因组DNA 1 μL,ITS1 1 μL,ITS4 1 μL,10×PCR buffer (Mg2+) 2.5 μL,dNTP 1 μL, Taq DNA Polymerase 1 μL,ddH2O 16.0 μL。PCR 反应条件:94℃预变性 4 min;94℃变性 40 s,55℃退火50 s,72℃延伸1 min,30 个循环;72℃延伸 7 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,用上海生工公司的“DNA 纯化试剂盒”回收目的DNA 片段。回收方法及步骤参见试剂盒说明书。

2 结果及分析

2.1 半纤维素分解菌的筛选

2.1.1 初筛

在筛选平板中含有半纤维素,呈乳白色。当半纤维素被降解后,会形成透明圈,透明圈大小与细菌降解半纤维能力正相关。使用这一筛选方法获得28株产半纤维素酶的菌株。如图1所示20、22、23、26号菌周围都有较明显的透明圈。

2.1.2 复筛

DNS试剂与还原糖反应后生成棕红色产物,发酵产物中还原糖量和A540 nm吸光度呈正相关,可用于测定各菌发酵产物中还原糖的量,结果如图2所示。其中2号菌、16号菌、23号菌发酵产物中还原糖含量较高,表明这3株菌分解半纤维素的能力较强。

2.2 发酵产物中单糖检测

对各菌株发酵产物进行柱前衍生化,使用HPLC法测定其中单糖组成,其中2号菌发酵产物中木糖和阿拉伯糖含量较高,而葡萄糖含量较低(图3所示),适合用于联产阿拉伯糖和木糖。结合该菌的形态特征,将该菌命名为DHC。

2.3 DHC菌的形态特征

在PDA培养基上28℃ 培养5 d,菌株DHC生长较快,菌落直径达3 cm~4 cm,质地致密, 菌落平展,营养菌丝体淡色。菌丝有横隔,分生孢子梗无横隔,光滑,无色。基部无足细胞,顶端不形成膨大的顶囊,其分生孢子梗经过多次分支,产生几轮对称或不对称的小梗,形如扫帚,称为帚状体。分生孢子球形、椭圆形。从镜检结果初步判定该菌株为亮白曲霉。

2.4 ITS 序列分析

利用ITS 通用引物(ITS1,ITS4)对半纤维素分解菌的ITS 序列进行PCR扩增,获得一约600 bp的单一DNA 条带,对纯化的DNA 产物进行测序分析,DHC的ITS序列长为613 bp。序列提交GenBank 数据库并进行BLAST 检索,下载同源性较高的数据,与DHC的ITS序列组成一套数据集, 用Clustal X软件进行多序列比对并进行人工校正, 运用统计分析和系统发育分析软件MEGA4.1按照N-J法聚类构建系统发育树, 经自举法检验(1000 次重复), 得到进化树,见图4。DHC和亮白曲霉菌 (Aspergillus candidus)的ITS序列BLAST比对相似性高达98%以上,进化树图上两者也在最近的分支上。该结果支持形态鉴定的结果,即DHC为亮白曲霉。

3 讨论

目前工业上使用的酸解半纤维素生产阿拉伯糖的方法具有污染大,产物为多种单糖混合物纯化较困难等缺点。利用微生物酶解法条件温和,对环境污染小,通过选育高产酶菌株、将酶固定化等方法可大幅度降低生产成本,具有良好的工业应用前景。本文使用双层平板筛选法,利用半纤维素降解后形成透明圈可快速筛选半纤维素降解菌,从中可望筛选到能降解半纤维素生产阿拉伯糖的菌株。

透明圈仅表明该菌株能降解半纤维素,并不代表产物中一定有阿拉伯糖生成或积累,有的菌株可能会消耗降解生成的单糖,用作菌体生长的碳源,因此双层平板法仅能作为初筛的手段,还需要对发酵产物中单糖含量及单糖组成进行分析。利用柱前PMP衍生,然后进行HPLC分析可以准确测定发酵产物中还原糖的组成和含量,但是由于木糖和阿拉伯糖的性质比较接近,HPLC分离时需要较长的时间才能获得很好的分离度,对于样品量较大时筛选速度较慢。因此实验中先利用DNS试剂与还原性单糖的反应,快速测定产物中还原糖的量,然后再使用HPLC方法对其生成的多糖进行分析,可以起到快速筛选的目的。

自然界中分离到半纤维素降解菌多为真菌[7],其中产半纤维素酶较高,尤其是阿拉伯糖-木聚糖酶活力较高的主要有黑曲霉、米曲霉、土曲霉等[1]。本实验从土壤中分离到一株能高效降解半纤维素的菌株,其特点是利用发酵培养基中的葡萄糖以及半纤维素降解的葡萄糖生长,但不利用降解产物中的木糖和阿拉伯糖,因此,发酵产物中可积累木糖和阿拉伯糖,为发酵法联产阿拉伯糖和木糖奠定了基础。对该菌通过形态观察、ITS序列分析初步鉴定为亮白曲霉 (Aspergillus candidus)。关于亮白曲霉产生的半纤维素降解酶,国内外尚较少研究报道,本研究对土壤中新型微生物资源的分离和开发利用具有重要参考价值。

参考文献

[1]方永亮,郑珩,余江河.功能性甜味剂L-阿拉伯糖的研究进展[J].氨基酸和生物资源2009,31(1)8~12

[2]Seri K,Sanai K,Matsuo N,et al.L-arabinose selec-tively inhibits intestinal sucrose in an uncompetitive man-ner and suppresses glycemic response after sucrose ingest-ion in animals[J].Metabolism,1996,45(11):1368~1374

[3]郑珩,廖建民,王鲁燕等.不同营养物质对脱落酸液体发酵产量的影响[J].氨基酸和生物资源2002,24(4):25~27

[4]高金波,孙丽娜.柱前衍生化HPLC分析蒲公英多糖的单糖组成[J].中国现代应用药学2010,27(1):53~56

[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979

[6]陈剑山,郑服.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农业科学,2007,35(13):3785~3786

生物筛选 篇11

关键词：微生物絮凝剂,筛选,培养条件,絮凝剂活性

0 引言

微生物絮凝剂是由一类微生物产生的天然代谢产物, 它是由微生物发酵、提取、精制而得的, 是一种能够在自然条件下降解、安全高效的新型水处理剂, 其主要成分为多糖、蛋白质、纤维素和DNA等[1]。微生物絮凝剂具有易分离、沉降效率高、无毒无害、无二次污染、脱色效果独特、来源广泛且生产周期短的特点, 可用于畜牧渔业废水的有机物的去除、生产和生活废水化学需氧量 (COD) 和生物需氧量 (BOD) 的去除、印染废水的脱色、工业废水重金属离子的脱除以及乳浊液中的油水分离等[2,3,4]。自1935年美国科学家Butterfield首先从活性污泥中筛选到絮凝剂产生菌以来, 至今已从土壤和活性污泥中筛选到50多种絮凝剂产生菌, 包括细菌、真菌、放线菌和藻类等[5,6,7]。近年来, 我国微生物絮凝剂相关研究报道也不少, 但由于研究起步晚, 目前主要存在微生物絮凝剂生产成本高、产量低、活体絮凝剂保存困难以及处理功能单一的缺点, 大多数未达到大规模工业化生产和应用的水平[8,9,10]。因此, 从不同环境中筛选高效微生物絮凝剂产生菌、探索最佳的絮凝剂产生条件以及降低絮凝剂生产成本对实现微生物絮凝剂的工业化生产和应用尤为重要。

海南岛位于我国最南端, 具有典型的热带季风气候特征, 同时拥有丰富的微生物资源。然而, 目前海南尚未见有关微生物絮凝剂产生菌的相关报道。本研究从海口市白沙门污水处理厂污泥中筛选得到9株具有絮凝活性微生物絮凝剂产生菌, 并以其中絮凝活性及稳定性较高的2株菌XN-6和XN-8为研究对象, 以高岭土悬浊液为处理体系, 探讨了菌株XN-6和XN-8的絮凝特性, 以期为进一步开发和利用该微生物奠定理论基础, 为解决“海岛热区”的污水处理问题提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

于2011年7、8、9月分别取海口市白沙门污水处理厂曝气池水下约0.5m处的活性淤泥。

1.1.2 试剂

Na Cl (AR) 、Ca Cl2 (AR) 、高岭土 (CP) 、中性红 (BR) 、甲基红 (BR) 、牛肉膏 (BR) 、酵母粉 (BR) 、蛋白胨 (BR) 、琼脂粉 (BR) 、葡萄糖 (BR) 、KH2PO4 (AR) 、K2HPO4 (AR) 、 (NH4) 2SO4 (AR) 、尿素 (AR) , 国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器

电热恒温鼓风干燥箱 (DHG9038A, 上海一恒) ;高压蒸汽灭菌锅 (CR-3560, 台湾CIRRUS) ;紫外分光光度计 (UV-2802, 上海尤尼科有限公司) ;恒温水浴锅 (HH-W600, 金坛市金南仪器制造有限公司) ;恒温振荡摇床 (SHA-B, 金坛市金南仪器制造有限公司) 。

1.1.4 培养基

1.1.4. 1 分离培养基 (g·L-1) :牛肉膏5, 蛋白胨10, 氯化钠5, 琼脂15, 水1L, p H值7.0;

1.1.4. 2 筛选培养基 (g·L-1) :葡萄糖20, KH2PO42, K2HPO45, (NH4) 2SO42 Na Cl 1, 尿素5, 酵母膏5, 水1L, p H值7.0。

以上培养基均在0.1Mpa、121℃条件下灭菌20min, 备用。

1.2 方法

1.2.1 微生物絮凝剂产生菌的筛选

1.2.1. 1 菌种的分离

取活性污泥10g加入装有90m L无菌水并加有玻璃珠的灭菌三角瓶内, 160r/min摇床振荡10min, 使其打散成均匀的悬液, 后用无菌水稀释至10-4、10-5、10-6梯度, 各取0.2m L的稀释液均匀涂布在分离培养基的平板上, 30℃恒温倒置培养2~3d, 挑取单菌落, 连续划线分离纯化得到纯菌种[11]。

1.2.1. 2 菌种的筛选

初筛:取分离纯化的菌种接种到筛选培养基中, 160r/min、30℃恒温振荡培养30h备用。取培养液1m L加入到装有5m L高岭土悬浊液的试管中, 充分摇匀, 静置5min。目测高岭土悬浊液的情况, 若能使高岭土悬浊液絮凝成大颗粒且快速形成沉淀, 可初步判断该菌悬液具有絮凝性, 即该菌为产絮凝剂菌株, 保存备用。

复筛:接种产絮凝剂菌株 (初筛) 于筛选培养基中, 160r/min、30℃恒温振荡培养30h备用。复筛以絮凝率的高低为判断标准。絮凝率的测定以高岭土悬浮液模拟实际废水为絮凝对象[12]。取2m L培养液于装有95m L高岭土悬浊液, 5m L 1%Ca Cl2溶液的150m L烧杯中, 磁力搅拌器充分搅拌混匀后静置5min, 取液面下2cm处样取样于550nm处测定吸光度, 以同样方式处理的, 加等量蒸馏水的高岭土悬浊液作为对照, 来确定培养液的絮凝活性。絮凝活性用絮凝率来表示, 絮凝率计算公式如下:

絮凝率 (%) = (A-B) /A×100%, 式中A为对照组在550nm处的吸光度, B为样品组在550nm处的吸光度。每个样品重复3次, 取平均值。

1.2.2 微生物絮凝剂产生菌的生理生化试验

分别划线接种微生物絮凝剂产生菌于苯丙氨酸琼脂培养基斜面、葡萄糖蛋白胨水试管、明胶液化培养基平板、淀粉培养基平板、油脂培养基平板上, 详细操作参见文献[13]。

1.2.3 培养时间对菌体生物量、产絮凝剂及培养液p H值变化的影响试验

将微生物絮凝剂产生菌接种到筛选培养基中, 于30℃、160r/min恒温振荡培养, 每2h取混匀的菌悬液, 以未接种菌种的培养基作参比调零, 测定培养OD660, 同时测定培养液对高岭土悬浊液的絮凝活性及培养液的p H值。

1.2.4 微生物絮凝剂产生菌培养条件的优化试验

采用单因子试验方法, 分别测定微生物絮凝剂产生菌在不同培养基初始p H值 (5、6、7、8、9) 、不同培养温度 (24、26、28、30、32、34、36℃) 、不同培养转速 (40、80、120、160、200r/min) 培养30h下的培养液对高岭土悬浊液的絮凝活性, 确定微生物絮凝剂产生的最优培养条件。

1.2.5 絮凝剂活性成分分布及热稳定试验

接种微生物絮凝剂产生菌于筛选培养基中, 160r/min、30℃恒温振荡培养24h, 取部分培养液, 3 000r/min离心30min收集上清液。分别测定菌株培养液、菌悬液及上清液的絮凝率, 分析絮凝剂活性成分的分布情况;同时取上清液在不同恒温温度水浴中 (30、40、50、60、70、80℃) 处理20min, 测定不同温度处理下上清液的絮凝率, 确定絮凝剂的热稳定性。

1.2.6 絮凝剂絮凝时间与絮凝效果试验

接种微生物絮凝剂产生菌于筛选培养基中, 160r/min、30℃恒温振荡培养30h, 取部分培养液, 3 000r/min离心30min收集上清液。取上清液于高岭土悬浊液中, 分别与高岭土悬浊液作用10、20、30、40、50min, 测定不同絮凝时间下的絮凝率, 确定絮凝剂的最佳絮凝时间。

1.2.7 菌株不同培养方式下的絮凝能力试验

在同一生活污水中, 分别加入微生物絮凝剂产生菌单独培养及混合培养培养液, 测定其絮凝效果, 分析菌株XN-6和XN-8单独培养及联合培养下对高岭土悬浊液的絮凝性能。

1.2.8 微生物絮凝剂的应用试验

以不同来源生活污水, 分别源于海口市白沙门污水处理厂、海南师范大学教职工生活区、海口市红城湖污水、海口市红城湖淤泥悬浊液和花园苗圃栽培土悬浊液, 分别在上述生活废水中加入菌株培养液, 测定其絮凝率。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离与鉴定

注:“+”表示阳性反应, “﹣”表示阴性反应。

通过涂布平板法, 经初筛和复筛从海口市白沙门污水处理厂的污泥中筛选得到9株有絮凝活性的菌株, 其中以编号为XN-6及XN-8的絮凝率及稳定性最好, 将这两株菌作为出发菌株进行研究。经过在固体培养基上30℃倒置培养48h后, 观察其菌落特征, 并对其进行生理生化试验, 具体结果见表1。根据伯杰氏细菌鉴定手册初步将XN-6菌株鉴定为乳杆菌属 (Lactobacillus sp.) , XN-8菌株鉴定为不动杆菌属 (Acinetobater sp.)

2.2 培养时间对菌体生物量、产絮凝剂及培养液p H值变化的影响

测定不同培养时间下菌株XN-6和XN-8的生物量、产絮凝剂变化如图1所示。图1所示菌株XN-6和XN-8的絮凝活性随培养时间的不同而变化, 两株菌均在培养24h时达到最大絮凝率, 分别为42.91%和55.93%, 但存在不同的变化趋势。菌株XN-6在培养8~16h内的絮凝率变化较小, 培养16h后出现迅速增长;菌株XN-8则在培养8~24h内的絮凝率逐渐增长。从图2中可知, 菌株XN-6和XN-8在不同的培养时间内培养液p H值均有下降。菌株XN-6在培养8~16h内p H值逐渐下降, 随后处于较稳定状态;菌株XN-8则在培养8~16h内p H值逐渐下降, 16~32h内p H值逐渐上升, 最后处于较稳定状态。

2.3 培养条件优化

p H值是影响微生物生长和代谢的重要因素, 过高或过低的p H值均不利于细菌的生长, 从而影响微生物产生絮凝剂。不同初始p H条件下菌株产微生物絮凝剂絮凝效果如图3所示。从图3中我们可以看出, 菌株XN-6和XN-8最佳产微生物絮凝剂并起絮凝活性的p H值分别为7.0和8.0左右。

不同培养温度对菌株XN-6和XN-8所产生的微生物絮凝剂絮凝效果的影响如图4所示。菌株XN-6在26~30℃温度之间时产絮凝剂速率随温度升高逐渐增大, 随后絮凝剂产生速率逐渐下降;菌株XN-8在26~32℃温度之间时产絮凝剂速率随温度升高逐渐增大, 随后絮凝剂产生速率逐渐下降。因此, 菌株XN-6的最适培养温度为30℃, 菌株XN-6的最适培养温度为32℃。

不同培养转速会影响通气量, 培养震荡的速度对菌株XN-6和XN-8所产生的微生物絮凝剂絮凝效果的影响如图5所示。菌株XN-6和XN-8均在120r/min转速时培养对高岭土悬浊液的絮凝率最高。

2.4 絮凝剂活性成分的分布与热稳定性

2.4.1 絮凝剂活性成分的分布

发酵液、菌悬液及上清液对高领土悬浊液的絮凝效果如图6所示, 菌株XN-6和XN-8发酵液和上清液的絮凝活性较高, 且均大于菌悬液的絮凝活性。

2.4.2 絮凝剂活性成分的热稳定性

分别取上清液于30、40、50、60、70、80℃恒温水浴中处理20min后, 测定絮凝率, 具体结果见图7。从图7中可以看出, 随着处理温度的升高, 絮凝活性逐渐降低。其中, 菌株XN-8在40~70℃的处理温度下的絮凝效果下降, 说明高温对絮凝剂成分破坏作用较强, 絮凝剂活性成分热稳定性较差。

2.5 菌株絮凝效果测定

培养液对高岭土悬浊液不同处理时间下的絮凝效果随处理时间的增加而增加, 菌株XN-6、XN-8对高岭土悬浊液的最在处理40min时絮凝效果达到最高, 分别为81.01%和76.78% (图8) 。菌株XN-6和XN-8不同培养方式下的培养液对高岭土悬浊液的絮凝比较结果见表2。从表2中可知菌株混合培养对高岭土悬浊液的絮凝率处于单独培养的絮凝率之间, 因此两菌株不存在协同作用。

2.6 微生物絮凝剂应用结果

菌株XN-6和XN-8培养液对不同来源生活污水的絮凝效果及染色液的脱色效果。从表3中可以看出两菌株培养液对不同来源生活污水均存在一定的絮凝效果, 总体而言菌株XN-6处理偏酸性的污水的絮凝效果较好, XN-8菌株处理偏碱性的污水的絮凝效果较好。

3 讨论

根据菌株培养过程的生物量和培养液p H值的变化, 我们推测菌株XN-6产絮凝剂主要在细胞衰亡期, 释放的絮凝剂可能为酸性物质, 导致培养基内的p H值逐渐下降;当絮凝剂释放完全后, p H值趋于平衡。这一p H值变化趋势与马晓娜等人[14]的研究结果基本相同, 他们的研究表明, 在无人为因素调节的情况下, 随着时间的延长, 培养基p H值逐渐降低, 在某一时间点时达到最低, 之后有所回升。菌株XN-8产絮凝剂主要处于细胞平稳期和衰亡期之间, 释放的絮凝剂可能为碱性物质, 导致培养基内的p H值逐渐升高;当絮凝剂释放完全后, p H值趋于平衡。

通过单因素法, 分别考察了p H值、培养温度、培养时间及摇床转速等因素对微生物絮凝剂活性的影响。微生物絮凝剂的活性随p H值的变化而变化, 因为酸碱度的变化影响微生物絮凝剂及其被絮凝物表面电荷、带电状态及中和电荷的能力[15]。菌株XN-6和XN-8分别在p H为7和8时, 其微生物絮凝剂表现出良好的絮凝活性, 这和余郭丽等[16]研究报道的絮凝微生物QM-1絮凝体系p H值大于8.0时絮凝活性高不同;菌株XN-6和XN-8的最适培养温度分别为30℃和32℃, 高低温均不利于筛选菌株生长和絮凝剂的积累, 这和李博等[17]研究报道的生物絮凝剂产生菌BJ-1产絮的最适培养温度60℃较温和。菌株在培养24h时絮凝活性达到最高, 这比田连生[18]研究报道的培养48h絮凝率最高不同, 说明本研究筛选的菌株代谢快;菌株在转速120r/min时絮凝率达到最高, 这和刘刚磊等[19]研究报道的摇床转速200r/min时菌株絮凝率最高转速较慢, 说明筛选菌株对氧的需求较低。

据报道, 微生物絮凝剂的组成成分一般为多糖、脂类、蛋白质、糖蛋白等。若以多糖构成的絮凝剂, 其耐热性通常较好, 基本不受温度的影响;若以蛋白质构成的絮凝剂, 容易受高温变性影响散失部分絮凝能力, 其耐热性较差。若为糖蛋白, 则其耐热性取决于絮凝剂中糖和蛋白的含量[20]。本研究菌株发酵获得的絮凝剂活性成分热稳定性较差, 因此我们推断菌株产生的絮凝剂均可能是蛋白质、或蛋白质和多糖的混合物。另外, 活性成分的分布研究表明絮凝物质主要存在发酵液和上清液中, 说明絮凝活性物质由菌株发酵过程中产生并分泌到胞外获得的[21]。

4 结论